BIOLOGÍA MOLECULAR Diana María Gualtero Leal BIOL 3051L
Objetivos Analizar el ADN Conocer los principios básicos de la técnica de electroforesis y aplicarla al análisis del ADN Describir cómo funcionan las enzimas de restricción para cortar el ADN
Biología Molecular Estudia el ADN y los genes que contiene El ADN muestra algunas similitudes entre organismos debido a que evolutivamente han partido de un ancestro común La Biología Molecular permite estudiar las relaciones evolutivas entre los organismos
Tecnología del recombinante:
ADN
Permite obtener copias de un segmento específico del ADN Se introduce ADN foráneo en las células de un microorganismo Una secuencia de ADN es amplificada o clonada El ADN es cortado mediante enzimas de restricción
Enzimas de Restricción También llamadas endonucleasas Enzimas bacterianas empleadas para cortar el ADN en sitios específicos En las bacterias actúan como mecanismo de defensa para degradar el material genético extraño que entra a la célula
Secuencias Palindrómicas: son secuencias reconocidas por las enzimas de restricción que se leen igual en ambas hebras del ADN en la dirección 5'→3‘ El nombre de las endonucleasas proviene de la bacteria de la cual fue aislada: EcoRI→E= género Escherichia co= especie coli R= cepa RV 13 I= primera endonucleasa aislada de esta cepa
HindIII: es derivada de Hemophilus influenzae Tipos de Corte: Cohesivos (pegajosos): cortan la doble hebra del ADN de manera escalonada
5‘-GAATTC-3‘ 3‘-CTTAAG-5‘
5‘-GGATC-3‘ 3‘-CCTAGG-5‘
EcoRI
BamHI
Abruptos: cortan las dos hebras del ADN en la misma posición
5‘-AAT AAT-3‘ 3‘-TTA TAA-5‘
SspI
5‘-CCC GGG-3‘ 3‘-GGG CCC-5‘
SmaI
Factores que afectan a las enzimas de restricción Pureza del ADN: proteínas y altas concentraciones de sal Temperatura y pH Amortiguador (buffer) adecuado: provee el ambiente necesario para que la enzima trabaje adecuadamente
Electroforesis
Esta técnica permite separar macromoléculas (proteínas, polipéptidos, fragmentos de ADN o ARN) a través de un flujo de corriente eléctrico Permite determinar el tamaño de los fragmentos de ADN El ADN y el ARN migran hacia el polo positivo del campo eléctrico debido a que están negativamente cargado, debido sus grupos fosfato
Los fragmentos del ADN se separan de acuerdo con: El tamaño de la molécula o masa Forma o conformación del ADN Tamaño o poro del gel Magnitud de la carga neta de la molécula Los fragmentos del ADN migran inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño o peso molecular
El movimiento de los fragmentos del ADN genera un patrón de bandas Cada banda corresponde a un fragmento de ADN de un tamaño particular El tamaño de cada fragmento se determina por un marcador cuyos fragmentos tienen pesos moleculares conocidos
Los fragmentos separados por electroforesis pueden: Analizarse empleando otras técnicas Ser comparados con diferentes organismos Insertarse en genomas de otros organismos para crear un ADN Recombinante
Tipos de Gel Agarosa
Poliacrilamida
Polisacárido extraído de algas
Se generan al mezclar polímeros de acrilamida y bisacrilamida
No tóxico
Tóxico
Se puede variar el tamaño del poro ajustando la concentración de agarosa
El tamaño de los poros depende de la concentración de acrilamida y bisacrilamida
Separa fragmentos de ADN de 200 a 50 mil pb
Separa mezclas de proteínas y fragmentos de ADN de menos de 500 pb y
Ejercicio 1. Preparación del Gel para Electroforesis Materiales: Gel de Agarosa 100 ml de TBE (Tris base,ácido bórico, EDTA) Guantes resistentes al calor Erlenmeyer de 250 ml Bandejas para gel
Procedimiento  1. 2. 3. 4.
PreparaciĂłn de la bandeja: Prepare la bandeja de electroforesis primero y luego Suba las tapas de los lados de la bandeja Coloque la peinilla en la bandeja de electroforesis Mezcle 1 g de agarosa con 100 ml de TBE 1X en un Erlenmeyer limpio y caliĂŠntelo en una hornilla. Use guantes resistentes al calor
5. Agite girando la mezcla de vez en cuando. Cuando empiece a burbujear y aclare, agite constantemente hasta que hierva y se vean burbujas en la superficie 6. Remueva de la hornilla y deje enfriar hasta que lo pueda agarrar sin quemarse 7. Vierta la mezcla en la bandeja de electroforesis empezando en una esquina y rompa las burbujas con una aguja de disecciรณn
Ejercicio 2. Practicando el Uso de las Micropipetas 1.
2.
3.
Escoja un plato Petri ya preparado con gel solidificado que contiene fosas Escoja una micropipeta y apoye el brazo que estĂŠ agarrando la micropipeta en una superficie firme Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta
4. Con su micropipeta, obtenga un poco de la mezcla (agua, glicerina y tinte azul) 5. Coloque la punta de la micropipeta encima de la fosa, sin tocar el gel 6. Vierta el contenido en la fosa, presionando despacio el botรณn de la pipeta hasta el primer punto de resistencia 7. Practique este procedimiento varias veces
Ejercicio 3. Corrida del gel de Electroforesis Materiales Aparato de electroforesis Fuente de energía Micropipetas y micropuntas Muestras de ADN TBE 1X Gel Tinte (loading die)
Procedimiento 1.
2.
3.
A cada microtubo que contiene ADN añada 2 µl de tinte. El volumen total de cada microtubo es ahora de 12 µl Con el gel solidificado,ponga la bandeja en cámara de manera que las fosas queden en el lado negativo (cátodo). Esto asegura que las muestras migren del cátodo hacia el ánodo Añada TBE 1X hasta que cubra el gel
4. Remueva con cuidado la peinilla del gel 5. Utilizando una micropipeta coloque 12 µl del tinte en la primera fosa. Para las demás muestras coloque de cada una 12 µl en las fosas correspondientes. Para cada muestra utilice una micropunta diferente 6. Coloque la tapa sobre la cámara de electroforesis teniendo cuidado de no moverla para que no se salgan las muestras de las fosas
7. Para correr el gel a. Conecte la cámara a una fuente de energía y encienda el aparato a una razón de 10 V por cada cm del gel (80V) b. Asegúrese que el aparato esté leyendo en voltímetros y NO en miliamperios c. Verifique que vea burbujas formándose en el amortiguador, y que NO se esté calentando
e. Deje migrar las muestras hasta que la lĂnea del tinte se encuentre aproximadamente a un centĂmetro y medio del extremo positivo f. Apague el equipo
8. Para teñir el gel: a. Saque el gel y colóquelo en la bandeja de tinción b. Cubra el gel con tinte c. Deje por media hora y agite de vez en cuando d. Saque el gel usando guantes desechabes y colóquelo en agua para lavar hasta que se destiña. NO BOTE EL TINTE e. Saque el gel y colóquelo en el iluminador
Electroforesis