Estudio de la integridad intestinal mediante biomarcadores (I)

G. Ramis1, A.B. González-Guijarro1, C. de Pascual1 y P. Sánchez-Uribe2

1Departamento de Producción Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia. 2Elanco Animal Health Iberia

Resumen

La integridad intestinal es el mecanismo epitelial que permite controlar las moléculas que van a introducirse en el organismo desde la luz intestinal. Una intrincada red de proteínas hace que las células epiteliales estén firmemente unidas entre sí y controlar de este modo la difusión paracelular de moléculas, mediante las denominadas uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y uniones gap. Pero esta red proteica es muy delicada y está sujeta a la acción de efectos beneficiosos o perjudiciales de toda índole: desde la acción del ambiente, los efectos de factores nutricionales, los antibióticos, la microbiota presente o factores de manejo como el destete. Factores con efectos beneficiosos serían el óxido de cinc, los probióticos o ciertas enzimas añadidas al pienso. Muchos de los factores citados provocan una respuesta inflamatoria en el intestino que termina por producir un círculo vicioso; la pérdida de integridad intestinal detona una respuesta inmunitaria y esta a su vez empeora la integridad intestinal. Por eso, controlar la inflamación del intestino es clave para defender la integridad; que a su vez es crítica para la salud general y el rendimiento de los lechones.

Palabras clave: uniones estrechas, ocludina, zonulina, claudina, difusión paracelular.

Contacto con el autor: Guillermo Ramis: guiramis@um.es

Abstract

Study of intestinal integrity using biomarkers

Intestinal integrity is the epithelial mechanism that controls the molecules that will enter the body from the intestinal lumen. An intricate network of proteins for epithelial cells to bind tightly and thereby control paracellular diffusion of molecules, by means of the so-called tight junctions, adheres junctions, desmosomes, and gap junctions. But this protein net is very delicate and is subject to the action of beneficial or harmful effects of all kinds: from the action of the environment, the effects of nutritional factors, antibiotics, the microbiota present, to management factors such as weaning. Beneficial effect factors would be cinc oxide, probiotics, or some enzymes added to the feed. Many of the aforementioned factors provoke an inflammatory response in the intestine that results in a vicious cycle; loss of intestinal integrity triggers an immune response and this in turn impairs intestinal integrity. Therefore, controlling inflammation of the intestine is key to defending integrity; which at the same time is critical to the overall health and performance of the piglets.

Keywords: tight junctions, occludin, zonulin, claudin, paracellular diffusion

La situación sanitaria de nuestros cerdos ha puesto de rabiosa actualidad la integridad intestinal, entendida como la integridad necesaria para mantener el control de la difusión de moléculas desde el interior a la luz intestinal y viceversa. Este control va a permitir que solo entren aquellos elementos necesarios para la nutrición y crecimiento de los animales e impedir que otros elementos indeseables como virus, bacterias, toxinas o proteínas sin digerir entren sin control al organismo. Hasta ahora, teníamos un elemento experto en mantener la integridad intestinal, que es el óxido de cinc. Pero este elemento dejará de poder utilizarse a finales de junio de 2022, por lo que se

ha convertido en una tarea urgente encontrar otros elementos que nos ayuden a mantener la integridad intestinal de los cerdos y por tanto nos ayuden a que los animales estén sanos y expresen totalmente su potencial de crecimiento. Definamos un poco mejor qué es la integridad intestinal, cómo se mantiene, cuáles son sus funciones y cómo podemos estudiarla.

INTEGRIDAD INTESTINAL La integridad intestinal: una cuestión de proteínas

La integridad intestinal, la entendemos como la unión íntima entre las células de los epitelios para que la difusión de moléculas sea controlada. Los tipos de difusión que podemos definir son la difusión transcelular; se ejerce o bien a través de receptores, canales y bombas de transporte y esto permite controlar exhaustivamente qué entra y qué no, o bien a través de endocitosis/exocitosis a través de la membrana lipídica (Ménard et al., 2010). Y la difusión paracelular, que es aquella que se produce entre las células que conforman el epitelio y que se reduce a ciertas moléculas y cuyo control se ejerce, por ejemplo, mediante el tamaño; cuando la integridad epitelial es adecuada solo pasarán moléculas entre 8-12 nm de tamaño y menos de 600 Daltons de peso molecular (Ménard et al., 2010). Esto reduce mucho el posible paso de sustancias. Es cierto que no todos los poros de las uniones estrechas (TJ por las siglas en inglés de tigth junctions) miden lo mismo, pero en general tienen una media de 8 nm (Watson et al., 2001). Los poros más grandes están en las uniones laterales con 75 nm (Adson et al., 1994), mientras que los poros de las TJ en vellosidades o criptas son de 4-9 nm y 50-60 nm (Tavelin et al., 2003), respectivamente. Las TJ están formadas por un entramado de proteínas que “cose” las células epiteliales entre sí y controla este paso paracelular de sustancias (tabla). Pero ¿cómo se controla este paso de sustancias? A través de un complejo entramado de uniones entre las células epiteliales que son las TJ, por las uniones adherens, por los desmosomas y las uniones gap. Sin embargo, las que realmente ejercen el control más estricto son las TJ, que son las que se sitúan más apicalmente en las células epiteliales. Las TJ están conformadas por diversas proteínas: claudinas, ocludina, zonulina, moléculas de adhesión de las uniones A y B (JAMA y JAM-B), α-catenina, β-catenina y cadherina, entre otras. Mientras que la ocludina es una sola proteína, las zonulinas son 2 (Zo-1 y Zo-2) y las claudinas son una familia de hasta 24 proteínas (Groschwitz et al., 2019). Este complejo de proteínas se relaciona con el citoesqueleto de la célula al estar unido a la actina, y la acción de estas fibras hace que las uniones estén más cerradas o abiertas (figura 1). La unión entre células epiteliales no es lineal, sino que forma un entramado muy complejo, como demuestran las electronografías (Zihni et al., 2016), que ejerce un control muy férreo sobre la difusión paracelular (figura 2). Hay que decir, que estas uniones en absoluto son privativas del epitelio intestinal, sino que se encuentran en todos los epitelios, incluyendo el epitelio urinario o el endotelio vascular (Vermette et al., 2018). Esto es importante, como veremos más adelante, para interpretar ciertas pruebas de integridad intestinal.

Factores que influyen en la integridad intestinal: un equilibrio muy delicado

La integridad intestinal se desempeña en un equilibrio muy delicado; aunque su estructura tisular parezca muy robusta, no lo es; y está sometida a constantes agresiones que pueden alterarla en mayor o menor medida. Desgranaremos algunos de los factores que pueden influir significativamente en la integridad del epitelio del intestino, pero no solo de aquellos que afectan negativamente, sino de los que afectan positivamente a la integridad intestinal.

Destete

Es uno de los factores que tienen una gran influencia en la integridad del intestino. Es bien sabido que el mero hecho de destetar a los lechones supone una agresión para todo el sistema digestivo. Hay motivos sobrados: el animal cambia radicalmente de dieta, pasando de alimentarse prácticamente de leche a una dieta sólida y basada fundamentalmente en materia primas vegetales. Por mucho que le ofrezcamos pienso a los lechones en paridera, la mayoría de las baterías enzimáticas aún no están preparadas para la digestión de los nutrientes de origen vegetal y necesitan un tiempo desde el destete. A esto hay que sumarle que los cambiamos de instalaciones, los mezclamos con animales de otras camadas, cambia el control ambiental e incluso puede cambiar el agua. Todo ello desencadena un proceso inflamatorio transitorio (de Groot et al., 2021) pero duradero que puede alterar la integridad intestinal. Al estrés social que sufren los animales durante el destete (y en realidad toda su vida), habría que prestarle especial atención, ya que se ha demostrado que dicho estrés es capaz de alterar la morfología intestinal, produciendo un acortamiento de las vellosidades, y esto sabemos que altera las proteínas que conforman las TJ (Li et al., 2017). Y cómo olvidar otro de los factores críticos en el destete: la edad de destete. Se ha demostrado, comparando lechones destetados a 21, 28, 35 y 42 días, que cuanta más edad tiene el lechón, mayor expresión de claudinas, ocludina y zonulina una semana después del destete, tanto en el íleon como en el yeyuno (Xin et al., 2018).

Nutrición

Dentro de los factores nutricionales con efecto positivo o negativo en la integridad intestinal se describen en animales y humanos influencias derivadas de la presencia de: ■ Grasa excesiva (negativo), ■ Ácidos grasos (de cadena larga con efecto negativo y de cadena media y corta con efecto positivo), ■ Ciertos oligoelementos (sobre todo el cinc, del que luego hablaremos),

Tabla. Sustancias que difunden de forma paracelular o transcelular.

Moléculas con difusión paracelular

Iones (cationes) Lactulosa Manosa Ramnosa Celobiosa Dextrano Aniones Péptidos Aminoácidos Ácidos grasos de cadena corta Vitaminas liposolubles Antígenos Virus Bacterias

Moléculas con difusión transcelular

Groschwitz et al., 2009; Menard et al., 2010.

■ Vitaminas (A, D, C y E son protectoras de la integridad), ■ Fibra (cantidad y calidad), ■ Polifenoles con influencia positiva (Suzuki, 2020). Otro fenómeno a tener en cuenta es la presencia de factores antinutricionales presentes en las materias primas. Es sabido que ciertos factores como la glicinina, la β-conglicinina o los β-galactomananos son capaces de producir una reacción inmune e incluso alérgica que desencadenará una pérdida de integridad intestinal. La acción de los mastocitos y eosinófilos (ambos implicados en reacciones alérgicas) produce una rotura de las TJ y por tanto una pérdida de integridad. A su vez estos pueden ser estimulados no solo por las moléculas antes mencionadas, sino también por citocinas, proteasa 1 de mastocitos (MCPT-1), histamina o prostaglandinas. La MCPT-1 degrada la ocludina de las TJ y la denominada proteína principal derivada de eosinófilos (BMP1) inhibe su síntesis, lo que produce esa rotura de integridad relacionada con reacciones alérgicas (Groschwitz y Hogan, 2009). Pero, además, la nutrición tiene un papel fundamental en la composición de la microbiota, aunque de eso hablaremos posteriormente.

Condiciones ambientales

Las condiciones ambientales son otro de los factores que más influyen en la integridad intestinal. El ejemplo más conocido y estudiado es el del estrés térmico. Los animales sometidos a calor, sufrirán una pérdida de integridad intestinal en todas las especies de mamíferos (Ortega et al., 2021; Paradis et al., 2021, Gabler et al., 2018). El fenómeno se debería a una reordenación del flujo sanguíneo; con un incremento de la circulación periférica para intentar disipar el calor, una disminución de la circulación esplénica y por consiguiente una hipoxia tisular en el intestino que va a producir una rotura de las TJ y, por tanto, una pérdida de la integridad intestinal (Paradis et al., 2021). De hecho, de forma experimental para los estudios de integridad intestinal en cerdos y pollos, se someten los animales a calor y estos es suficiente para alterar la integridad intestinal (Moustafá et al., 2021; Wang et al., 2021; Nanto-Hara et al., 2020; Abdelqader et al., 2017; Alhenaky et al., 2017; Pearce et al., 2015; Pearce et al., 2013).

Antibióticos

Los antibióticos, pueden tener un doble efecto. Si bien pueden producir disbiosis que conduzcan a la proliferación de especies que puedan alterar la integridad intestinal, es cierto que en algunos estudios se ha demostrado como pueden mantener la integridad intestinal en distintos tramos del intestino, resultando en un mejor rendimiento de los animales, sobre todo cuando se usan a niveles subterapéuticos (Johnson et al., 2021). Esta es la demostración de la acción promotora del crecimiento del uso de antibióticos en pienso de forma subterapéutica, pero desde luego, esta estrategia hoy en día es totalmente inasumible por el efecto que pueden tener en salud pública.

Oligoelementos

Es cierto que hay diversos oligoelementos que potencialmente podrían intervenir en la integridad intestinal. Sin embargo, hablaremos del verdadero experto en influir sobre ella: el cinc, sobre todo en su forma de óxido. Durante décadas hemos estado utilizando este oligoelemento como una pieza clave en la protección de la salud gastrointestinal de los lechones. Sin embargo, por motivos ambientales, el balance riesgo-beneficio de su uso es negativo ya que “los beneficios del óxido de cinc previniendo las diarreas de los cerdos no supera los riesgos medioambientales” (European Medicines Agency -EMA- Committee for Medicinal Products for Veterinary Use -CVMP-, 2016). Por tanto, en junio de 2022 su uso se prohibirá en toda la Unión Europea. Pero ¿por qué se usa de forma masiva el óxido de cinc? Por dos motivos: porque es barato y sobre todo porque es muy eficaz. Y parte de esa eficiencia se debe a que estabiliza las TJ y en consecuencia promueve una buena integridad intestinal, reduce la respuesta inflamatoria en el intestino y remodela la arquitectura del íleon (Grilli et al., 2015). Se ha demostrado que, en los lechones, el óxido de cinc mejora la expresión de zonulina y ocludina en las TJ (Zhang y Guo, 2009).

Microbiota

Dejar este factor para el final no significa que sea el menos importante ni mucho menos. La microbiota es fundamental para mantener la salud intestinal, y hasta ahora solo nos ha preocupado el bienestar y la nutrición del cerdo. Desde hace una década, empieza a preocuparnos la nutrición de los componentes de la microbiota. Es bien conocido que, por ejemplo, la presencia de altas cantidades de proteína

Complejo TJ

Figura 1. Esquema de las TJ del epitelio intestinal.

Espacio paracelular JAM-A

Ocludina

Membrana plasmática Claudinas

Célula 1

Unión adherens Cadherina PALS Crumbs

ZO-2

PATJ

ZO-1 MLCK

ZO-2

ZO-1 RhoA Actina

Célula 2

alfa-catenina beta-catenina

Fuente: http://kovallab.org/ic.html. Donde ZO= zonulina, JAM = Molécula de adhesión de las uniones; por las siglas en inglés de Junctional Adhesion Molecule), MLCK = cinasa de la cadena ligera de la miosina, PALS= moléculas de polaridad celular; por las siglas en inglés de Cell Polarity Molecules, PATJ = activador de la polaridad de las TJ (por las siglas en inglés de Polarity Activator of TJ)

promueve la proliferación de especies proteolíticas; entre las que están Escherichia coli, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Salmonella sp., o Brachyspira hyodysenteriae, y reduce la abundancia de bacterias de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, que son claramente beneficiosas. La proliferación de estas especies desencadena una respuesta inmunitaria e inflamatoria en el intestino que resulta muy lesiva para la integridad intestinal. Desde luego, la integridad intestinal se muestra clave para prevenir la entrada de patógenos a través del epitelio intestinal (Paradis et al., 2021). Se sabe, que uno de los efectos de ciertas especies usadas como probióticos, consiste en mantener intacta la integridad (entre otras accione), preservando la salud intestinal. La administración de Lactobacillus delbrueckii durante la lactación produce una mejoría en la síntesis de ARNm para ocludina y zonulina 1 en yeyuno e íleon en el posdestete (Li et al., 2019), la administración de L. reuteri revierte la acción del lipopolisacárido (LPS) o endotoxina de E. coli incrementando la síntesis de claudina, ocludina y zonulina 1 y la administración de L. plantarum reduce la acción de Escherichia coli enterotoxigénico (ETEC) potenciando la síntesis de estas tres proteínas de las TJ (Wang et al., 2018). Y esto son solo algunos pequeños ejemplos de toda la constelación de acciones descritas para los probióticos con respecto a las TJ.

Respuesta inmunitaria relacionada con la integridad intestinal

La pérdida de integridad intestinal a menudo está relacionada con una respuesta inmunitaria provocada por algún estímulo. Es evidente que los principales estimulantes de la reacción inmune van a ser los patógenos intestinales (víricos, bacterianos o parasitarios), pero también las proteínas que van en el alimento y que en un momento dado se pueden comportar como antígenos. La acción de estos estimulantes inmunitarios suele iniciarse con una acción de macrófagos que captan antígenos y se los presentan a los linfocitos CD4. A partir de ahí, se produce una señalización mediante citocinas que desencadenará distintos tipos de respuesta inmunitaria. Normalmente hay una primera liberación de citocinas proinflamatorias, como TNF-α e IFN-γ. Este último produce una redistribución de JAM-A, ocludina y claudinas; y ambas producen una reducción de la expresión de ocludina (Groschwitz y Hogan, 2009). La acción de patógenos como E. coli (o su LPS) producen una síntesis de IL-6, IL-8, y TNFα con la consiguiente reducción de la síntesis de ocludina, claudina y zonulina-1 (Wang et al., 2018). La presencia de otras citocinas como IL-4 e IL-13 producen un aumento de la permeabilidad intestinal produciendo apoptosis epitelial y una hiperexpresión de la claudina-2; una de las proteínas responsables de la existencia de poros en las TJ; por tanto, exceso conlleva un incremento de la permeabilidad intestinal. Además, estas citocinas desestabilizan la ocludina (Groschwitz y Hogan, 2009). También está bien determinada la acción de virus como el de la Diarrea Vírica Epidémica (PEDv) con respecto al sistema inmunitario, produciendo un incremento significativo de TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL6, IL8 e IL12, con las consecuencias para la integridad intestinal antes mencionadas (Wang et al., 2020). Pero siempre hay una respuesta antiinflamatoria que trata de controlar la respuesta proinflamatoria o al menos modularla. Las dos principales citocinas que intervienen como antiinflamatorias relacionadas con la integridad intestinal son IL10 y TGF-β. Si después de una activación en el intestino del sistema inmunitario, la causa persiste, se produce un incremento de la secreción de TNF-α e IFN-γ y se entra en un círculo vicioso que puede desencadenar una inflamación crónica del intestino con una grave alteración permanente de la integridad. La acción de las citocinas antiinflamatorias contribuirá a reducir este riesgo (Fasano, 2020). Las citocinas antiinflamatorias estimulan la síntesis de proteínas de la TJ y por tanto son claves para la homeostasis de las uniones interepiteliales.

Figura 2. Electronografía de las uniones entre células epiteliales intestinales, que muestra lo intrincado de dichas uniones.

CONCLUSIONES

La integridad intestinal es clave para controlar las moléculas que entran al organismo y su pérdida significa que los animales tendrán problemas de salud y no podrán rendir todo lo que su potencial genético les permitiría. Por tanto, defender la integridad intestinal es crítico para nuestros animales. Evitar los factores que producen pérdida de integridad y, en general, la respuesta inflamatoria en el intestino, formarán las piedras angulares de la defensa de la salud intestinal y evitarán que a través de un intestino con pérdida de integridad se internalicen sin control virus, bacterias, toxinas, fatores antinutricionales o incluso proteínas no digeridas que puedan actuar como antígenos. Otra cuestión es cómo evaluar la integridad intestinal, cosa que trataremos en un próximo artículo.