Volumen 2 Revista Biotecnología by Community Manager Dirección Investigación UNL

Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013

Revista Centro de Biotecnología Vol. 2 Nro. 1. 2013 Revista científica sobre temas de biotecnología de plantas, animales y microorganismos. Editada anualmente por el Centro de Biotecnología y la Dirección de Investigación de la Universidad Nacional de Loja, Ecuador. Comité Editorial

Comité de Arbitraje

Director General Dr. Rómulo Chávez Valdivieso, Ph.D. DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA ECUADOR

Evaluadores internos Ph.D. Roldán Torres Gutiérrez Ph.D. Nikolay A. Aguirre Mendoza Dr. Luis Alberto Morocho Yaguana Ph.D. Zhofre Aguirre Mendoza

Editor Responsable Dr. Tito Ramiro Muñoz Guarnizo DIRECTOR DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA, UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA ECUADOR

Evaluadores externos Ph.D. Carla Snoeck Ph.D. Bettina Eichler-Loebermann Ph.D. María Caridad Nápoles García Ph.D. Aminael Sánchez Rodríguez Ph.D. Joaquín Machado de Armas Ph.D. Edilberto Pozo Velázquez Ph.D. Raúl López Sánchez

Editor Ejecutivo Ph.D. Roldán Torres Gutiérrez PROYECTO PROMETEO-SENESCYT. Ph.D. Masao Nishikawa COOPERACIÓN JAPONESA (JICA). JAPÓN Revisión de Texto

Dirección:

Dr. Yovanny Salazar Estrada, Mg.Sc. ISSN: 1390-75-73

Revista Biotecnología Ciudad Universitaria “Pío Jaramillo Alvarado”, Sector La Argelia. Teléfono: 00-590-07-2547057 Email: titoflaco@yahoo.com

Unidad de Difusión y Transferencia de Conocimiento e Innovación Dra. Cecilia Ruiz Toledo

Loja-Ecuador

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EDITORIAL Con mucho beneplácito el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja, presenta ante la comunidad científica nacional e internacional, el segundo número de su Revista anual, en donde se exponen importantes temas inherentes al quehacer biotecnológico, como producto de las investigaciones científicas que se están desarrollando en el mismo. Una de las principales aspiraciones de la Universidad Nacional de Loja es el desarrollo de la ciencia, con las ventajas de la Biotecnología, que permite aprovechar los mecanismos e interacciones biológicas de los seres vivos, especialmente de los unicelulares, en pro de: la agricultura, la agroindustria, la farmacia, la medicina y dentro de ésta, especialmente el diagnóstico de enfermedades, que aquejan a los seres vivos. Basándonos en esta premisa, nuestro Centro se encuentra desarrollando una serie de investigaciones, que pretenden, por una parte: enriquecer los conocimientos científicos de los investigadores, generar ciencia y tecnología a partir de éstos y, por otra, dar solución a diversas problemáticas agrarias existentes en la Región Sur del Ecuador. El presente número contiene artículos revisados de investigaciones que revelan importantes datos científicos preliminares de proyectos que están ejecutándose a lo interno de nuestro Centro, como también resultados de investigaciones realizadas en el norte del Perú, país con el que, en alianza estratégica, a través de la Asociación de Universidades del Sur del Ecuador y Norte del Perú (AUSENP), pretendemos lograr un desarrollo científico sostenido en ambos lados de la línea de frontera. Consideramos que la institución universitaria, a través de la Dirección de Investigación y el Centro de Biotecnología, ha dado un importante paso en la generación de conocimientos y más aún, en la divulgación de los resultados de su quehacer científico, a través de las diferentes revistas, como la forma exclusiva de sacar del anonimato y dar a la luz el producto de la su experiencia, en el maravilloso mundo de la ciencia. Con afecto,

Tito Muñoz Guarnizo DIRECTOR DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA

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Contenido ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN Variabilidad de aislados diazotróficos simbióticos en diferentes condiciones agroecológicas del Sur del Ecuador…………………….. 6 Kléver Granda Mora, Holger Paccha Chamba, Carlos Campoverde Sozoranga y Roldán Torres Gutiérrez.

Diagnóstico de signos visibles de la presencia de enfermedades infecciosas reproductivas en el ganado bovino del Cantón Loja…… 16 Franklin Román-Cárdenas, Jhuliana Luna-Herrera,

Determinación de la concentración letal media en Artemia salina de diez extractos hidroetanólicos de especies de plantas de Zamora Chinchipe ……………………………………………………………..…….. 25 Luis Alberto Morocho Yaguana, Claudia Teresa Cruz Erazo

Estudio de la variabilidad morfológica de aislados fúngicos asociados con la enfermedad de la Marchitez Vascular del Babaco (Vasconcellea heilbornii var. pentagona) en Loja, Ecuador. ………… 34 Ángel Robles-Carrión, Darío Salinas-Serrano, Wilman Armijos-Armijos, Aminael SánchezRodríguez y Roldán Torres-Gutiérrez

Prevalencia de la anaplasmosis bovina en el Cantón Yantzaza, provincia Zamora Chinchipe ………………………………………………. 45 Tito Muñoz Guarnizo, Patricia Ayora Fernándezy Segundo Chamba Puglla

Adaptación, micropropagación y conservación de orquídeas (Cattleya spp) nativas de clima tropicalhúmedolluvioso. Lambayeque–Perú…………...……… ……………………………………...... 53 JaimeTirado R.,CésarArellano S.,Carlos VillanuevaA.

ARTICULOS DE REVISION Características a seleccionar en bovinos tipo leche para las ganaderías de la Región Sur del Ecuador…………………………….….. 60 Lenin Aguirre Riofrío

INFORMES DE PROYECTOS Conservación ex situ de recursos fitogenéticos de leguminosas de la Zona 7 del Ecuador……………………………………..………………. 68 Aníbal Ruiz–Sánchez y Franco Loján-Labanda

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES…………………………………

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Contentent RESEARCH ARTICLES Variability of symbiotic diazotrophic isolates at different agroecological conditions of Southern Ecuador……………………….. 6 Kléver Granda Mora, Holger Paccha Chamba, Carlos Campoverde Sozoranga y Roldán Torres Gutiérrez.

Visiblesigns diagnosis of reproductiveinfectious diseasesincattle of Loja Canton…………………………………………………………. 16 Franklin Román-Cárdenas, Jhuliana Luna-Herrera,

Determination ofmedian lethal concentrationin Artemiasalina hydroethanolic extracts from plants of Zamora Chinchipe…....…

ten

Luis Alberto Morocho Yaguana, Claudia Teresa Cruz Erazo

Morphological variability study offungal isolatesassociated with Vascular Wilt Babaco (VasconcelleaHeilbornii Var. Pentagona) disease in Loja, Ecuador. …………………………………...……………… 34 Ángel Robles-Carrión, Darío Salinas-Serrano, Wilman Armijos-Armijos, Aminael SánchezRodríguez y Roldán Torres-Gutiérrez

Prevalence of bovine anaplasmosis in Yantzaza Canton,Zamora Chinchipe province.………………………………………………………….. 45 Tito Muñoz Guarnizo, Patricia Ayora Fernándezy Segundo Chamba Puglla

Adaptation, micropropagation and conservation of native orchids (Cattleya sp.) from humid rain tropical climate. Lambayeque-Peru… 53 JaimeTirado R.,CésarArellano S.,Carlos VillanuevaA.

REVIEW ARTICLES Characteristics to Select in dairy cattle forlifestock in Southern Region of Ecuador …………………………………………………………… 60 Lenin Aguirre Riofrío

PROJECTS REPORT Ex situ conservation of legumes plant genetic resources of Zone 7 in Ecuador……………………………………………………………………… 68 Aníbal Ruiz–Sánchez y Franco Loján-Labanda

AUTHORS INSTRUCTIONS………………………………………………….

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VARIABILIDAD DE AISLADOS DIAZOTRÓFICOS SIMBIÓTICOS EN DIFERENTES CONDICIONES AGROECOLÓGICAS DEL SUR DEL ECUADOR VARIABILITY OF SYMBIOTIC DIAZOTROPHIC ISOLATES AT DIFFERENT AGROECOLOGICAL CONDITIONS OF SOUTHERN ECUADOR Kléver Granda Mora1, Holger Paccha Chamba2, Carlos Campoverde Sozoranga2 y Roldán Torres Gutiérrez3* Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Ciudadela Guillermo Falconí. “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S”, Loja-ECUADOR. ivang100@gmail.com 2 Carrera de Ingeniería Agronómica. Universidad Nacional de Loja. Ciudadela Guillermo Falconí. “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S”, Loja-ECUADOR. holgereduar@ yahoo.es 1

Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Proyecto. “Prometeo Viejos Sabios”. SENESCYT-Ecuador. roldantg@gmail.com 3

*Autor para correspondencia. Resumen El estudio consistió en la determinación de la variabilidad de aislados diazotróficos simbióticos procedentes del cultivo de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en diferentes zonas agroecológicas de la provincia de Loja, Ecuador. Se muestrearon un total de 9 cantones con diferentes zonas agroclimáticas, las cuales se geo-referenciaron mediante el Sistema de Posicionamiento Global. La determinación de la variabilidad de los aislados se realizó mediante caracterización morfológica de las colonias obtenidas, donde se evaluó la tinción al Gram, crecimiento, color, producción de mucus, bordes y elevación. La caracterización bioquímica se llevó a cabo mediante el crecimiento de los aislados en medios selectivos: Mac Conkey, Agar Kligler, Extracto de Levadura Manitol Agar-Rojo Congo y Peptona Glucosa Agar. Los resultados mostraron una alta variabilidad de los parámetros morfológicos evaluados en las diferentes condiciones agroclimáticas. De un total de 45 aislados iniciales, 24 de ellos presentaron diferencias en al menos un parámetro evaluado, con características que concuerdan con aquellas pertenecientes al género Rhizobium. El análisis bioquímico corroboró los requerimientos nutricionales de las bacterias pertenecientes al género Rhizobium, tanto en la fermentación de lactosa en medio Mac Conkey como el crecimiento en los medios Kligler y Peptona Glucosa Agar. El crecimiento en medio Extracto de Levadura Manitol Agar-Rojo Congo demostró la pureza de los aislados. Estos resultados sientan las bases para ulteriores estudios moleculares de identificación genética y análisis fenotípicos de cepas nativas en interacción con frijol común para elevar la eficiencia del proceso de fijación simbiótica del nitrógeno en este cultivo. Palabras claves: aislamientos, morfología, pruebas bioquímicas, Rhizobium, Phaseolus vulgaris. Abstract The study consistedin determiningthe variability ofsymbioticdiazotrophics isolatesfrom common bean(Phaseolus vulgarisL.) in several agro-ecological zonesof Loja province,

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Ecuador. We sampleda total of 9cantonswith differentagro-climatic zones, which were geo-referenced using theGlobalPositioning System. Thevariabilityof the isolates was determined by morphological characterization ofthe colonies,where Gramstain, growth, color, mucus production, edges and elevation of the colonies were evaluated. Biochemical characterizationwas carried outby growing the isolates on selective media: Mac Conkey,KliglerAgar, Yeast Extract Mannitol-Congo RedAgarandPeptoneGlucose Agar. The results showeda high variabilityofmorphological parametersevaluatedin differentagroclimaticconditions. From a total of45initial isolates, 24 of them differed inat least one parameterassessed, withsimilar characteristicswiththoseof Rhizobium genus. Biochemical analysisconfirmedthe nutritional requirements ofthe bacteriabelonging to Rhizobium genus, for lactosefermentation in MacConkeymediaas for the growth in PeptoneGlucoseAgar and Kligler Agar media. The growthon Yeast Extract Mannitol Agar-Congo Red showedthe purity ofthe isolates.These resultsprovide the basisfor furthermolecular studiesofgenetic ntificationandphenotypicanalysisofinterplay within native strainsandcommonbeanto raise theefficiency of thesymbiotic nitrogen fixationin this crop. Keywords: isolation, morphology, biochemical tests, Rhizobium, Phaseolus vulgaris. Introducción Los procesos naturales de fijación biológica del nitrógeno (FBN) juegan un importante rol en la activación de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental (Beever, 2007). El incremento de su aplicación puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguiente efecto benéfico al ciclo del nitrógeno (N), el calentamiento global y el saneamiento de las aguas subterráneas y superficiales (Cerón et al., 2012). Este proceso depende básicamente de la acción de los microorganismos en conjunto con las plantas. Existen algunas especies de microorganismos que poseen la habilidad de convertir el dinitrógeno (N2) atmosférico a amonio (NH4+) mediante la acción del complejo enzimático nitrogenasa (Martínez, 2000). Estas especies son denominados diazótrofos y requieren de energía para realizar su metabolismo (Martínez-Romero, 2003). Dentro de los diazótrofos capaces de realizar este proceso se encuentran los denominados fijadores simbióticos, los cuales fijan N2 atmosférico en interacción con organismos superiores, siendo la familia Rhizobiaceae la que agrupa los géneros más importantes utilizados en la biofertilización en diferentes cultivos, conociéndose genéricamente como rizobia. (Bauer, 2001). Entre los diferentes sistemas biológicos

capaces de fijar N2 atmosférico, la simbiosis Rhizobium-leguminosa constituye con la mayor cantidad de N aportada al ecosistema y a la producción de alimentos (Lindström, 2010). Se estima que esta puede oscilar entre 200 y 250 kg N ha-1 año (Cerón et al., 2012) constituyendo la asociación más elaborada y eficiente entre plantas y microorganismos (Olivares et al., 2013). En Ecuador, leguminosas como el frijol común (Phaseolus vulgaris), constituyen un alimento básico para el consumo humano directo, no solamente por el aporte de proteínas y minerales, sino a la vez por la superficie cultivada que garantiza la seguridad y soberanía alimentaria. El área cultivada de este grano en el país supera las 400 000 ha año-1 (INEC, 2012). A pesar de la importancia de este cultivo para el país, los estudios relacionados con la interacción Rhizobium-frejol común para incrementar los rendimientos agrícolas mediante esta asociación son muy escasos (Bernal, 2004). Según Michiels et al. (1998), el frijol común es una leguminosa promiscua, la cual interacciona con diferentes especies del género Rhizobium, disminuyendo de forma sustancial la eficiencia del proceso simbiótico. Estos aspectos ponen en evidencia que se hace imprescindible el conocimiento de los géneros y especies de microsimbiontes en diferentes condiciones

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agroecológicas del Sur del Ecuador. Por tal motivo nos proponemos mediante este estudio, dilucidar la variabilidad de bacterias diazotróficas simbióticas en diferentes condiciones agroclimáticas de la provincia de Loja, mediante el análisis morfológico y bioquímico de aislados procedentes de nódulos de frijol común. Materiales y métodos Se colectaron de forma aleatoria muestras de plantas de frijol común con presencia de nódulos en sus raíces en diferentes zonas agroclimáticas de la provincia de Loja. No se tuvo en cuenta la edad de los cultivos de frijol ni el tipo de suelo, solo la presencia de nódulos en sus raíces. Los puntos de muestreos se ubicaron según las zonas más productoras de esta leguminosa (ver figura 1). Estas áreas fueron geo-referenciadas mediante la utilización del Sistema de Posicionamiento Global (GPS). Luego de la obtención de las muestras, éstas se acondicionaron en bolsas ziploc y llevadas al laboratorio para su procesamiento antes de las 24 horas. En todos los casos se comprobó la actividad de los nódulos mediante la escisión de los mismos con el objetivo de observar la pigmentación de la leghemoglobina, lo cual indica la viabilidad de los bacteroides dentro del nódulo y por consiguiente la vitalidad de estos para su posterior aislamiento.

nódulos en 500 µl de agua destilada estéril en microtubos de 2ml. De la suspensión obtenida del macerado en cada muestra se sembró por estrías en placas Petri conteniendo medio Agar Triptona Extracto de Levadura (ATEL) e incubadas a 28ºC durante 3 días. Al finalizar el periodo de incubación todas las colonias crecidas se purificaron mediante la siembra repetida en medio Extracto de Levadura Manitol Agar (ELMA) e incubadas a 28°C durante 72 horas (Remans et al., 2007). Luego del periodo de incubación las cepas se conservaron a -80°C en glicerol (50% v/v). Caracterización morfológica y bioquímica de los aislados Todos los aislados obtenidos mediante el proceso de aislamiento se caracterizaron morfológicamente mediante la diferenciación de las colonias respecto a: tinción al Gram, tipo de crecimiento, color, producción de mucus, bordes y elevación de las colonias (Torres Gutiérrez et al., 2009). La caracterización bioquímica consistió en determinar el crecimiento de los aislados en los medios selectivos Peptona Glucosa Agar (PGA), Mc Conkey, Agar Kligler y ELMA con adición de Rojo Congo (ELMA-RC). Resultados

Preparación de las muestras y aislamiento de colonias bacterianas

Geo-localización muestreadas

Las muestras se procesaron mediante el método de siembra en placas Petri y agotamiento por estrías (Torres-Gutiérrez, 2008). Se tomaron entre 15-20 nódulos por cada muestra para realizar la esterilización de los mismos mediante la inmersión 1 minuto en etanol 70% y 3 minutos en hipoclorito de sodio (NaOCl) al 3%. Posteriormente se procedió al lavado intenso de los nódulos (hasta 10 veces) con agua destilada estéril, con el propósito de eliminar todo resto de sustancia tóxica a las bacterias. Luego del lavado se realizó la maceración de los

Un amplio muestreo se llevó a cabo en la investigación para obtener la mayor representatividad de localidades de la provincia de Loja. El muestreo se realizó en cuarenta y cinco localidades abarcando nueve cantones de la provincia de Loja (ver Cuadro 1) con alturas que fluctuaban entre los 1032 hasta 2060 msnm.

las

zonas

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Figura 1. Geolocalización de las zonas muestreadas ( ). Se evaluaron un total de nueve cantones de la provincia Loja repartidos entre las áreas de mayor producción de frijol común. Cuadro 1. Geo-referenciación de las zonas muestreadas en diferentes condiciones agroclimáticas de la provincia de Loja. Zonas de muestreo Catamayo Calvas Paltas Gonzanamá Celica Espíndola Olmedo Chaguarpamba Loja

Latitud

Longitud

Altitud (msnm)

04°05’20” 04o27´17´´ 04o02´06´´ 04o07´55´´ 04o06´35´´ 04o25´36´´ 03o56´12´´ 03o78´22´´ 03°57´20´´

79°18’53” 79o36´07´´ 79o44´41´´ 79o25´44´´ 79o57´11´´ 79o26´17´´ 79o39´08´´ 79o56´38´´ 79° 12´47´´

1 032 1 100 1 173 1 680 2 015 1 243 1 187 1 050 2 060

Estas zonas, en su mayoría, se encuentran ubicadas entre las estribaciones de 700 a 2400 msnm en las latitudes 03°19’49” y 04°45’00” al Sur del Ecuador, con una temperatura media anual de 13°C-24ºC, precipitaciones media anual de 950 mm, suelos generalmente arcillosos, con pH que oscilan entre neutro a alcalino (7-8). La disponibilidad de materia orgánica y N es media, contenidos de fósforo bajo y potasio alto, especialmente en áreas secas y tropicales. Se presentan suelos aluviales bien desarrollados y entisoles e inceptisoles que representan suelos jóvenes carentes de características pedogenéticas. De aproximadamente 1 200 000 ha, que posee la provincia de Loja, 110 000 se han destinado para cultivos, 420 000 a pastos y el resto son terrenos con forestación, terrenos gravemente erosionados y altas montañas. La producción de cultivos importantes como el frijol, maíz y algunas hortalizas se realizan mayormente en estos sectores por ser representativos y que de una u otra forma aportan ingresos económicos para los agricultores (Peralta et al., 2012).

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Caracterización morfológica Un total de cuarenta y cinco aislados se obtuvieron del procesamiento de las muestras. De ellos treinta y tres contaron con características morfológicas pertenecientes al género Rhizobium. La variabilidad de los caracteres morfológicos de las bacterias diazotróficas se evidenció teniendo en cuenta que de los treinta y tres aislados seleccionados, veinte y cuatro (Cuadro 2) presentaron características diferentes en al menos un parámetro morfológico evaluado. El resto de aislados (12 aislados de diferentes localidades) analizados presentaron características en su crecimiento colonial que no corresponden a las descritas para el género Rhizobium. Estos aislados por no ser parte de nuestros estudios no se presentan en resultados. En la figura 2, se muestran algunos ejemplos de imágenes de las tinciones de Gram y el crecimiento de las colonias purificadas. Cuadro 2. Caracterización morfológica de los aislados de nódulos de frijol común con diferencia en al menos un parámetro morfológico evaluado. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Crec.a

Colorb

Mucusc

Borded

Elevac.e

Gramf

Morfol.g

Form. crec. estrías h

V.P 1

V.P 2

+++

V.P 3

+++

V.P 4

R.C 1

+++

R.C 2

Tur 1

Tur 2

+++

Cañ 1

Cañ 2

+++

Rai 1

+++

Rai 2

+++

Tabl 1

+++

Tabl 2

Namb 1

Namb 2

+++

Tamb 1

+++

Tamb 2

+++

C.B 1

+++

C.B 2

+++

Nar 1

+++

Nar 2

+++

L.P 1

L.P 2

+++

Código

a: Crecimiento: (+) ligero, (++) moderado; (+++) abundante; b: Color: (2) traslúcido, (3) opaco, (4) blanco opaco, (5) crema; c: Mucosidad: (+) ligero, (++) moderado, (+++) abundante; d: Bordes: (1) liso, (2) ondulado, (3) lobulado; e: Elevación: (+) plana, (++) elevado f: Gram: (-) negativo; g: Morfología: BC (bacilo corto), BL (bacilo largo), CB (coco-

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bacilo); h: Forma de crecimiento en siembra por estrías: (1) Continua en línea recta, (2) Continua con bordes filiforme, (3) Espinoso, (4) Punteado, (5) rizoide. Abreviaturas de las localidades de aislamientos: V.P: Virgen Pamba, R.C: Reina del Cisne, Tur: Turopamba, Cañ: Cañaro, Rai: Raiminche, Tabl: Tabloncillo, Namb: Nambacola, Tamb: El Tambo, C.B: Capilla Baja, Nar: Naranjo, L.P: Los Pinos.

Figura 2. Representación de la tinción al Gram y caracterización morfológica de los aislados. Con excepción de la localidad de Virgen Pamba, donde se obtuvieron cuatro aislados, en el resto de las localidades se obtuvo dos aislados. Se destaca de las características morfológicas la producción de mucus de los aislados obtenidos. En un total de nueve cepas la producción de mucus es abundante, aspecto esto que se pudo corroborar en el crecimiento al cabo de las 72 h de incubación. Caracterización bioquímica En el Cuadro 3 y la Figura 3 se presentan los resultados de las pruebas bioquímicas para determinar la pureza de los aislados de Rhizobium. En este análisis se determinó el crecimiento de las bacterias en los medios PGA, Agar Mac Conkey, Agar Kligler y ELMA-RC.

algunos de los aislados en los medios Mc Conkey (Fig. A) y PGA (Fig. B), donde no se observa crecimiento colonial de los aislados diazotróficos. En el panel C se observa el crecimiento en estrías de las colonias bacterianas en medio ELMA-Rojo Congo. Los tubos del crecimiento en Agar Kligler no muestran cambio de coloración en el medio, evidenciando que no se fermenta glucosa ni lactosa.

La Figura 3 muestra el crecimiento de

Figura 3. Pruebas bioquímica de los aislados. A: Cultivo en medio Mac Conkey. B: Cultivo en medio PGA. C: Cultivo en medio Kliger. D: Cultivo en medio ELMA-Rojo Congo.

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Cuadro 3. Caracterización bioquímica de los aislados obtenidos de nódulos de frijol común. Aislados

Crecimiento PGA

Crecimiento Mac Conkey

Crecimiento ELMA-RC

Crecimiento agar Kligler Glucosa

Lactosa

Sulfhídrico

V.P 1

V.P 2

V.P 3

V.P 4

R.C 1

R.C 2

Tur 1

Tur 2

Cañ 1

Cañ 2

Rai 1

Rai 2

Tabl 1

Tabl 2

Namb 1

Namb 2

Tamb 1

Tamb 2

C.B 1

C.B 2

Nar 1

Nar 2

L.P 1

L.P 2

Leyenda: Crecimiento en medio PGA (peptona-glucosa-agar): - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio Mac Conkey: - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio ELMA suplementado con Rojo Congo: - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio Klligler (fermentación de glucosa, lactosa o producción de ácido sulfhídrico): - (negativo), + (positivo). Abreviaturas de las localidades de aislamientos: V.P: Virgen Pamba, R.C: Reina del Cisne, Tur: Turopamba, Cañ: Cañaro, Rai: Raiminche, Tabl: Tabloncillo, Namb: Nambacola, Tamb: El Tambo, C.B: Capilla Baja, Nar: Naranjo, L.P: Los Pinos. Como se aprecia en el Cuadro 3, con excepción de los aislados de la localidad de Raiminche y Naranjo 1, todas las demás bacterias diazotróficas tuvieron comportamientos según su crecimiento en los medios de cultivos que corroboran las características del desarrollo del género Rhizobium en estos medios. Al analizar estos resultados nos encontramos con poca variabilidad entre los aislados, aspecto este de gran importancia, ya que demuestra que

la gran mayoría de los aislados diazotróficos obtenidos concuerdan con las características deseadas para este tipo de estudio. Discusión En el Cuadro 2 se muestran los resultados obtenidos en la variabilidad morfológica de cada uno de los aislados, donde se observa que del total veinte cuatro presentaron características diferentes en al menos un

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parámetro analizado, aunque de los treinta y tres aislados obtenidos con características que corresponden al género Rhizobium todos respondieron a rasgos distintivos de este género (Torres-Gutiérrez, 2008). Se destaca que en todos los muestreos realizados se obtuvieron más de un aislado diferente, lo cual demuestra la diversidad morfológica de las bacterias. Del total de aislados veinte tres tuvieron morfología de bacilo corto siendo característico de este género. Tanto la elevación como los bordes son parámetros muy dependientes del medio de cultivo, no obstante con la utilización de medio ELMA todas las colonias crecieron con elevación y bordes regulares. Ambas morfologías pueden encontrarse en la agrupación del género Rhizobium (Varma y Oelmöler, 2007). En todos los casos se observaron bacterias Gram negativas y coloración opaca, así como el crecimiento de moderado a abundante. Como se evidencia en el cuadro 3 el crecimiento de los aislados bacterianos en el medio PGA no tuvieron incidencia alguna, a excepción de los aislados Rai 1, Rai 2 y Nar 1, esto puede deberse que a pesar de que los rizobios no se desarrollan bien en este medio, indica la presencia de algún contaminante. Los contaminantes no crecen bien en medio ELMA ideal para Rhizobium, lo cual puede entenderse equivocadamente que el cultivo está puro cuando se usa solo ELMA, lo que podría asumirse que estos aislados (Rai 1, Rai 2 y Nar 1) podrían ser ácidos productores (Somasegaran y Hoben, 1994). En el medio MacConkey de 24 aislados posibles de Rhizobium, 21 de ellos (87,5%) no fueron capaces de fermentar lactosa (-) y los restantes tuvieron un crecimiento positivo color violeta (fermentadoras de lactosa) produciendo en el medio un cambio de pH por la liberación de productos ácidos. A partir de los resultados en Agar Mac Conkey se realizó la prueba en Agar Kligler, medio para confirmar la fermentación a la lactosa y glucosa, en este medio la mayoría de los aislados no producen un cambio de coloración rojo del medio (característica

importante de este grupo de bacterias aerobias). En este caso los azucares son respirados degradándose completamente a CO2 que se elimina y no modifica el pH del medio lo cual no ocurrió en los aislados Rai 1 y Rai 2 que generaron un viraje en el medio de rojo a amarillento en la superficie y fondo de los tubos de cultivos. En todos los casos se comprobó que estos aislados 24 en total no produjeron ácido sulfhídrico, ya que no se evidencio en ningún momento algún un precipitado de color negro en el fondo de la placa. Finalmente en el medio ELMA-RC las colonias de Rhizobium se observaron todas blancas o rosadas, debido a que no absorben el colorante rojo; sin embargo (Rojas et al., 2009), señala que toman color rojo intenso luego de 8 días de incubación; evento que se registró al realizar las caracterizaciones bioquímicas con los aislados Rai 1, Rai 2 y Nar 1, los cuales presentaron un color rojo intenso característico del género Agrobacterium sp., muy cercano filogenéticamente a Rhizobium sp. (Kuykendall et al., 2005). Los resultados de estas pruebas preliminares, nos indican que en un mismo nódulo, existe además del rizobio otras bacterias que contaminan el medio de crecimiento. Esto es importante en la pureza del aislamiento con fines de uso como inoculante, toda vez que la fijación biológica del nitrógeno es un proceso de alta especificidad entre la cepa bacterial (rizobio) y el cultivar de plantas leguminosas, lo que está estrechamente relacionado con la rizósfera de la planta. Varios son los estudios en los cuales estas rizobacterias han mostrado el incremento de los parámetros de crecimiento y rendimiento de las plantas. En estudios en condiciones controladas, Granda-Mora et al., (2009) reportan la variabilidad genotípica de diferentes aislados de Rhizobium provenientes de nódulos de fréjol común en la zona central de Cuba. Los resultados demostraron que todas las cepas fueron capaces de establecer adecuadas relaciones simbióticas con el macro simbionte, observándose que muchas de estas cepas

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superaron los parámetros de nodulación (número de nódulos totales y peso fresco y seco de los nódulos) en comparación con la cepa tipo de R. etli CNPAF512. Conclusiones De un total de 45 aislados iniciales procedentes de nódulos de frijol común, 24 correspondieron a bacterias diazotróficas que correspondían con características morfológicas y bioquímicas al género Rhizobium, lo que demuestra la diversidad de estas bacterias en las diferentes condiciones agroclimáticas muestreadas en la provincia de Loja. Dichos aislados sin duda presentan una alta variabilidad genotípica y su especial crecimiento en diferentes zonas climáticas que de acuerdo a cada lugar de aislamiento estos se ubicaron desde los 1000 a 2700 msnm. Estos resultados iniciales brindan una valiosa herramienta para el desarrollo de investigaciones de las comunidades microbianas en Ecuador, así como sientan las bases para los estudios moleculares de estos aislados y ulteriores análisis de la variabilidad genotípica entre cepas nativas y genotipos de frijol común en diferentes localidades de la esta Región Sur del país. Agradecimientos Los autores agradecen a la Universidad Nacional de Loja, por el financiamiento a los proyectos desarrollados en el año 2012 y 2013, así como al personal técnico que laboró en la realización de las investigaciones. Se brinda un especial agradecimiento a la SENESCYT por la aprobación de la beca doctoral y la concesión del proyecto Prometeo Viejos Sabios a los autores de esta investigación. Referencias bibliográficas Bauer, T. 2001. Microorganismos Fijadores de Nitrógeno: (http://www.microbiologia.com.ar/suelo/ rhizobium.html). Beever, D.; Brentrup, F.; Eveillard, P.; Fixen, P., Heffer, P.; Herz, B.; Larson, R.; Pallière

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DIAGNÓSTICO DE SIGNOS VISIBLES DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS REPRODUCTIVAS EN EL GANADO BOVINO DEL CANTÓN LOJA VISIBLE SIGNS DIAGNOSIS OF REPRODUCTIVE INFECTIOUS DISEASESINCATTLE OF LOJA CANTON Franklin Román-Cárdenas1*, Jhuliana Luna-Herrera1, Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudadela universitaria Guillermo Falconí, Loja, Ecuador. franklinroman11@gmail.com, jhuly-kath@hotmail.com 1

*Autor para correspondencia Resumen El presente trabajo tuvo como objetivo la realización de una encuesta epidemiológica para identificar los sistemas de producción; manejo reproductivo y manejo sanitario de las ganaderías bovinas del cantón Loja. El tamaño de la muestra lo constituye el 2,4% de las Unidades Productivas Agropecuarias bovinas de las parroquias urbanas y rurales, donde se aplicaron ciento veinte encuestas de treinta y cinco preguntas cada una de carácter cerrado. Las áreas de muestreos se georreferenciaron con la utilización del Sistema de Posicionamiento Global. Los resultados arrojaron que el 88% de las ganaderías son productoras de leche, mientras que el 86% no tienen certificado sanitario. La reproducción se da por monta natural en un 95%, la que presenta presencia de piometra postcoital en un 8%. Se presentan abortos en el 19% de las ganaderías, abortando una, dos y hasta tres vacas, generalmente entre el 6to y 7mo mes de gestación. Se registran partos prematuros con nacimientos de terneros débiles, mortinatos y fetos macerados, retenciones placentarias, animales adultos con higromas, orina con sangre, piel y mucosas amarillas. En terneros recién nacidos se detecta la presencia de órbitas oculares salidas, incoordinación y parálisis muscular. La presencia de signos visibles de posibles enfermedades infecciosas es alta por lo que se continúa con la etapa de Inmunodiagnóstico de brucelosis, leptospirosis, neosporosis y tuberculosis bovina.Este estudio permite plantear medidas preventivas y de control de las bacterias y parásitos que podrían repercutir en pérdidas económicas, ocasionar enfermedades al personal de las instalaciones y consumidores de los derivados. Palabras claves: brucelosis, leptospirosis, neosporosis, zoonosis, aborto. Abstract This study aimed to carry out an epidemiological survey to identify production systems, reproductive management and health management of cattle in Loja Canton. The sample size were 2.4% of bovine Agricultural Production Units of urban and rural parishes, where one hundred and twenty surveys were applied including thirty-five questions for each one with closed nature. Sampling areas were georeferenced with the use of the Global Positioning System. The results showed that 88% of herds are milk producers, while 86% have no health certificate. Reproduction occurs by natural mating in 95%, which shows the presence of 8% postcoital pyometra. Abortions are presented in 19% of herds, aborting one, two or three cows, usually between the 6th and 7th month of pregnancy. Preterm births are registered with weak calf births, stillbirths and macerated fetuses, placental retention, adult animals with hygromas, bloody urine, yellow skin and mucous membranes. In newborn calves outputs of eye sockets is detected, muscular incoordination and paralysis. The

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presence of visible signs of possible infectious disease is high, so that we continue with immunodiagnostic step of brucellosis, leptospirosis, neosporosis and bovine tuberculosis. This study allows proposing preventive measures and control of bacteria and parasites that could affect economic losses, cause illness to facilities staff and consumers of derivatives. Key words: brucellosis,leptospirosis,neosporosis, zoonoses, abortion Introducción Los trastornos reproductivos en el ganado bovino en un 50% de los casos son de origen infeccioso (Durán, 2004), pueden ser de tipo bacteriano, vírico o parasitario. En la ganadería ecuatoriana entre las enfermedades de la reproducción bovina que han sido diagnosticadas están brucelosis (Benítez, 2011) leptospirosis (Baquero, 2011) neosporosis (Lozada, 2004) y tuberculosis bovina (Herrera, 2011), que sin ser enfermedad exclusiva de la reproducción ha adquirido importancia sanitaria. Las patologías brucelosis, leptospirosis y tuberculosis bovina alcanzan mayor relevancia por ser transmisibles al hombre (Who, 2013). La brucelosis es una enfermedad principalmente deganado vacuno, cerdos, cabras, ovejas y perros, el crecimiento más agudo en número de casos se está registrando en países de Asia Central y Sudoriental. (OIE, 2013). La infección setransmite a los humanospor los animalesa través del contactodirecto conmaterial infectado, por la ingestión deproductos de origen animaly por inhalaciónde agentestransportados por el aire (OIE, 2008). El consumo de lechecruda yquesoelaborado con leche cruda(quesofresco)es la principal fuentedeinfecciónen el hombre (Who, 2013). El agente etiológico Brucella abortus es una bacteria con morfología de cocos,gramnegativos, aeróbicos, no móviles (Phac, 2001). En el Ecuador entre 1979 y 2008 se registra una prevalencia del 5% de brucelosis bovina. La provincia de Loja ha sido clasificada en la región epidemiológica 3 de baja prevalencia, con una prevalencia de la enfermedad del 1,3 al 2,6 % (Agrocalidad, 2009).

La leptospirosises una enfermedad bacterianaque afecta tanto aseres humanos como a animales. Los seres humanosse infectanpor contacto directo conla orina de animalesinfectados oun ambientecontaminado conorina (Ops, 2008). Esta bacteria perteneciente al género Leptospira spp es parecida a un sacacorcho y difiere de otras espiroquetas por tener ganchos en los extremos (Ops, 2008). En Ecuador el diagnóstico rutinario de leptospirosis bovina se basa en la prueba de microaglutinación microscópica. En base a este diagnóstico se tiene establecido que el serovar que más afecta a la ganadería lechera de la zona interandina es principalmente el serovar L. wolffi seguido de los serovares L. hardjo, L. canicola, L. pomona, L. icterohaemorrhagiae, L.bratislava entre otros (Carmona, 2010). En el año 2007 se reportaron 195 casos confirmados de leptospirosis bovina, para un total de 6652 casos entre los años 2000 y 2007 (Inhtm, 2010). El único signo clínico de neosporosis observado en la vaca adulta es el aborto, ya sea esporádico, endémico o epidémico. La mayoría de abortos ocurre entre los 5 a 6 meses de gestación (Anderson, et al., 1994). Esta enfermedad es producida por Neospora caninum, un parásito protozoario del Phylum Apicomplexa,cuyo hospedero definitivo es el perro y el coyote (Gondim, et al., 2004) fue aislado por primera vez en 1988 a partir de tejidos de cachorros de perros (Dubey, et al., 1988). La infección por transmisión horizontal del ganado bovino adulto posiblemente tendría lugar por la ruta orofecal (McAllister et al., 1998). En un estudio realizado en Suecia muestreando solo las hembras de un hato lechero desde

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1994 a 1999 encontraron un incremento de seropositivas de 63% a 87%, (Stenlund, et al., 2003). En lo que se refiere al Ecuador, en estudios realizados en el cantón Mejía se reportó el 30% de seropositivos en 1240 muestras (Ortiz, 2002) y en la zona centro norte de la sierra el 42% de animales seropositivos (Lozada, 2004). La tuberculosis bovina es una enfermedad bacteriana crónica que en ocasiones, afecta a otras especies de mamíferos. Puede afectar a los humanos en general, por inhalación de aerosoles o ingestión de leche no pasteurizada. (The Center for Food Security and Public Health, 2010). La situación de la TBB en el Ecuador no está documentada ni cuantificada claramente (Proaño, 2011). Estudios de la Asociación Holstein Frissian del Ecuador reportó para el 2010 en base a un total de 16838 muestras, 36 positivos y una prevalencia de 0,214%, utilizando la prueba diagnóstica PPD con una cobertura nacional del 70,8%, para Loja el diagnóstico reportó entre los años 2006 y 2010, 292 animales infectados con la utilización de la misma prueba (AHF, 2011). El objetivo general de la investigación es “Estudiar la epidemiología y caracterizar los microorganismos que afectan la reproducción del ganado bovino en las ganaderías del Cantón Loja”. Materiales y métodos El cantón Loja tiene 13 parroquias rurales y 4 parroquias urbanas con gran diversidad geográfica, lo que evidencia distintas prácticas en el manejo del ganado bovino, necesitándose hacer este estudio para tener información epidemiológica de todo el cantón. Para realizar el trabajo se aplicaron 120 encuestas epidemiológicas de treinta y cinco preguntas cada una y de carácter cerrado repartidas en las parroquias rurales y urbanas. Cada unidad agropecuaria bovina fue georreferenciada y posteriormente a través del Centro de Investigación territorial

fue levantado el respectivo mapa. La información de las encuestas fue ingresada en una plantilla Excel para ser tabulada e interpretada, los principales parámetros evaluados fueron; datos generales de la explotación, sistema de reproducción, signos observados que afectan la reproducción bovina, diagnóstico de enfermedades en los animales, diagnóstico de enfermedades en el personal, programas de vacunación. Resultados Utilizando el Sistema de Posicionamiento Global las Unidades productivas agropecuarias bovinas del cantón Loja están ubicadas entre los 1674 y 2935 msnm. La imagen 1 muestra los sitios de la aplicación de las encuestas epidemiológicas. Constituyéndose en la primera vez que se realiza un mapa de los sistemas de producción; manejo reproductivo y manejo sanitario de las ganaderías bovinas del cantón Loja.

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1. Mapa de aplicación de las encuestas epidemiológicas. El análisis de las encuestas aplicadas en las diferentes áreas ganaderas arrojó que la ganadería bovina del cantón Loja se constituye en una ganadería con tres tipos de explotación, el 88% para producción de leche, el 3% para producción de carne y una ganadería de producción mixta del 9%. El 86% de estas ganaderías no tienen certificación sanitaria, los remplazos se realizan con los mismos animales, se adquieren en las ferias locales (feria de Loja 28%) de Quito y provincias aledañas como Zamora Chinchipe y el Oro. Es frecuente la movilización de animales a las partes altas y a la provincia de Zamora Chinchipe y el Oro. El 36% de la producción se destina a consumo interno, el 41% venta a la localidad y el 23% de venta a empresas lácteas. El consumo de agua de los semovientes es el 70% a través de vertientes naturales. En el 78% de las ganaderías se registra la presencia de roedores, de las cuales solo

se realiza control en el 30%. El 92% de los ganaderos utilizan el estiércol para abono de los pastos. La reproducción en un 95% se da por monta natural, en la que se registra un 8% de piometra post coital. El 57% las ganaderías disponen de un lugar específico para el parto que generalmente es un potrero en la parte plana y semiplana. Las ganaderías de la parte alta son menos susceptibles a las enfermedades. El 4% de las ganaderías registran la presencia de partos prematuros, tienen presencia de abortos el 19%. En estas ganaderías han abortado una, dos y hasta tres vacas.

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La Figura 2 muestra los porcentajes de abortos de acuerdo al mes en el periodo de gestación. Es representativo el porcentaje de ganaderos que no saben en qué periodo de la gestación abortó la vaca ya que no manejan registros.

Figura 2. Presentación de abortos por mes de gestación Los abortos son enterrados o dejados en el campo en 35% en cada caso, los consumen los perros en un 26% y un 4 % los consumen los humanos. La Figura 3 nos ilustra los porcentajes de algunos signos relacionados al parto, tales como; retención de placenta, nacimiento de terneros débiles, mortinatos y presencia de maceración fetal en las ganaderías del cantón Loja.

Figura 3. Algunos signos presentes en las ganaderías relacionados al parto

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La Figura 4 nos muestra la presencia de otros tipos de signos observados en los animales adultos expresados en porcentaje.

Figura 4. Otros signos observados en animales adultos de ganado bovino En terneros recién nacidos también ha sido observado el 9% de incoordinación muscular, el 5% de parálisis muscular y en un 1% orbitas oculares salidas. El 79% de los ganaderos vacunan para fiebre aftosa, el 49% la triple bovina, el 2% para brucelosis y leptospirosis y el 1% para neosporosis. El 23% de los ganaderos se realizan chequeos periódicos los mismos que manifiestan no han sido diagnosticados de enfermedades zoonósicas. Discusión La presencia de signos clínicos como abortos, retenciones de placenta, nacimiento de terneros débiles, mortinatos, maceración fetal en las hembras en etapa reproductiva hacen suponer que en el cantón Loja se están registrando enfermedades de tipo infeccioso. Los signos que observan los ganaderos en sus animales inducen pensar en enfermedades de la reproducción como

brucelosis que causa en hembras bovinas abortos, retención de placenta con la subsiguiente metritis; lesiones generales en el útero e infertilidad, mastitis, disminución de la producción láctea (Cevallos, 2007) otra enfermedad que cursa con signos parecidos es leptospirosis que se caracteriza en los bovinos por producir septicemia, abortos, mastitis, mortinatos y nacimiento de crías débiles que mueren al poco tiempo de nacidos (Rodríguez, 2010) la enfermedad neosporosis causa aborto en vacas de todos los continentes (Anderson et al., 2000). Sin descartar otras enfermedades que cursan con signos parecidos. (Rivera, 2004). Otros signos observados por los ganaderos del cantón Loja en sus animales son Higromas, orina con sangre, piel y mucosas amarillentas, tos suave y persistente, aumento de ganglios linfáticos, enflaquecimiento progresivo, tumefacción de la glándula mamaria, con algunos de estos signos también pueden cursar brucelosis, leptospirosis, neosporosis, mientras que los signos clínicos de tuberculosis bovina generalmente se manifiestan con signos inespecíficos como caída de la producción

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lechera y deterioro del estado general de salud con debilidad progresiva, pérdida de apetito, pérdida de peso, tos seca intermitente, diarreas frecuentes (Cano, 2011) . Estos signos también son indicio de la posible presencia de enfermedades infecciosas en el ganado bovino. La Organización Mundial de Sanidad Animal clasifica a las enfermedades brucelosis y tuberculosis bovina dentro de las enfermedades de declaración obligatoria (OIE, 2013) por ser enfermedades transmisibles y que se consideran importantes desde el punto de vista socioeconómico y/o sanitario; mientras que leptospirosis forma parte de la antigua clasificación categorizada en la lista B que son enfermedades de declaración obligatoria (OIE, 2013). Estas enfermedades (brucelosis, leptospirosis, neosporosis, tuberculosis bovina) pudieran diseminarse porque no existen procedimientos implementados para realizar la certificación sanitaria de las ganaderías de bovinos en el país, son pocos los ganaderos que realizan una certificación sanitaria de su predio, no existe petición de certificado sanitario al momento de comprar los animales de remplazo. Estos animales son adquiridos por lo general en las ferias locales sin realizar una revisión general del bovino, son llevados a los predios sin someterlos a periodos de cuarentena. Hay que considerar que a pesar de que el porcentaje de remplazos es mínimo desde ganaderías de la provincia de Pichincha se debe tomar en cuenta que en esta zona se han realizado múltiples estudios y se han diagnosticado estas enfermedades (Agrocalidad, 2009). Para la compra y venta de animales, se debería presentar un certificado de salud de los animales donde conste, pruebas de las enfermedades reproductivas y de tuberculosis bovina (Herrera, 2011)

Conclusiones En el cantón Loja se han podido identificar mediante la aplicación de la encuesta epidemiológica la posible presencia de enfermedades infecciosas en las hembras bovinas en edad reproductiva ocasionada en su mayoría por el poco conocimiento de parámetros reproductivos, medidas sanitarias, planes y programas de vacunación. Con esta investigación se ha podido establecer un mapa de los sistemas de producción, manejo reproductivo y manejo sanitario de las ganaderías bovinas del cantón Loja, el cual servirá de guía para futuras investigaciones de las enfermedades de la reproducción bovina. Este trabajo nos permite continuar con la siguiente fase de la investigación que es la realización de Inmunodiagnóstico, para brucelosis, leptospirosis, neosporosis y tuberculosis bovina. Agradecimientos Expresamos nuestros sinceros agradecimientos a la Universidad Nacional de Loja, al personal de la Dirección de Investigación y del Centro de Biotecnología, por el apoyo al financiamiento del proyecto de investigación. Al Centro Internacional de Zoonosis de la Universidad Central del Ecuador. Dr. Ramiro Córdova Técnico de la UNL, al Ing. Fabián Sotomayor del Centro de Investigación Territorial de la UNL, por su colaboración y apoyo brindado en esta fase de la investigación y nuestro especial agradecimiento a los señores ganaderos del cantón Loja.

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DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA EN ARTEMIA SALINA DE DIEZ EXTRACTOS HIDROETANÓLICOS DE ESPECIES DE PLANTAS DE ZAMORA CHINCHIPE DETERMINATION OFMEDIAN LETHAL CONCENTRATIONIN ARTEMIASALINA OF TEN HYDROETHANOLIC EXTRACTS FROM PLANTS OF ZAMORA CHINCHIPE Claudia Teresa Cruz Erazo 1, Luis Alberto Morocho Yaguana1*. 1Técnica investigadora, Unidad de Fitoquímica del Laboratorio de Análisis Químico, Universidad Nacional de Loja, Ciudadela Universitaria Guillermo Falconí, La Argelia. Loja. Ecuador. claudiacruzerazo@ hotmail.com,luismorocho02@gmail.com *

Autor para correspondencia

Resumen El presente estudio se realizó con el propósito de investigar la composición fitoquímica y toxicidad de las plantas de uso medicinal en la Región Sur del Ecuador, las cuales son usadas frecuentemente por sanadores de las etnias Shuar y Saraguro para tratar padecimientos de tipo infeccioso. Según la metodología propuesta por Schabra, a partir de los extractos hidroetanólicos enteros y liofilizados de 10 especies de plantas medicinales de Zamora Chinchipe se pudo identificar doce metabolitos secundarios.Con los extractos enteros se realizó el ensayo de letalidad sobre Artemia salina por medio de la técnica de micropocillos, para lo cual se tomaron de 8-20 náuplios y se pusieron en contacto con diluciones crecientes de los extractos por 24 horas a 25-30 ºC y con iluminación permanente. Se contaron los náuplios muertos en cada pocillo al cabo de las 24 horas, luego agregó metanol y se determinó el número total de náuplios. Las lecturas se procesaron según el método de Probit usando el programa estadístico SPSS v.18. De los 10 extractos evaluados 3 tuvieron reacciones positivas para alcaloides, 10 para triterpenos y esteroides, 8 para flavonoides, 10 para lactonas y cumarinas, 9 para saponinas, 10 para taninos y fenoles, 10 para azúcares reductores, 8 para aminoácidos y 2 para resinas, concluyéndose además que tres extractos presentaron una toxicidad moderada con valores entre 100 y 1000 ugml-1 y siete no son tóxicas con valores de CL50 superiores a 1000 ug ml-1. Palabras claves: toxicidad, plantas medicinales, metabolitos secundarios, Artemia salina, CL50, dimetilsulfóxido. Abstract The present study was carried out to investigate the phytochemical composition and toxicity of medicinal plants in the Southern Region of Ecuador, which are often used by healers of Saraguro and Shuar ethnic groups to treat an infectious type. According to the methodology proposed by Schabra, from whole hydroetanolics extracts and lyophilized of 10 species of medicinal plants from Zamora Chinchipe,twelve secondary metabolites were identified. With whole extracts the lethality assay was conducted on Artemia salinathrough microwell technique, for which 8-20 nauplii were taken and placed in contact with increasing dilutions of the extracts for 24 hours at 25-30 ° C with continuous illumination. Dead nauplii were counted in each well after 24 hours, then methanol was added and total numbers of nauplii were determined. The readings were processed according to the method of Probit using SPSS v.18 statistical software. From 10 extracts evaluated 3 of them had positive reactions for alkaloids, 10 for triterpenes and steroids, 8 for flavonoids, 10 for lactones and coumarins, 9 for saponins, 10 for tannins and phenols, 10 for reducers sugar, 8 for amino acids and 2 for resins, concluding that three extracts also showed a moderate toxicity values between 100

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and 1000ug ml-1 and seven non-toxic with LC50 values above 1000 ug ml-1. Key words: toxicity, medicinal salina,CL50,dimethylsulfoxide.

plants,

Introducción En América Latina las plantas son parte fundamental del entorno, especialmente de las comunidades indígenas y campesinas (Ansaloni et al. 2010). En Ecuador más del 80 % de la población, recurre a la medicina tradicional, en especial a las plantas medicinales y los productos provenientes de ellas para curar sus dolencias, esto es debido a la tradición heredada de sus ancestros, e incrementado por el difícil acceso de la población a la atención médica y a medicamentos (Buitrón 1999). Muchas veces la medicina tradicional y el uso de plantas medicinales son la única fuente asequible de atención sanitaria, en especial en las comunidades más pobres que carecen de atención por un sistema oficial poco efectivo (OMS 2005). El uso de las plantas medicinales como parte de la medicina tradicional, en los últimos años se ha incrementado rápidamente viéndose favorecido en países en vías de desarrollo, en donde el uso se ha extendido al sector urbano y en los países desarrollados se hace cada vez más popular (OMS 2005;Ramachandran et al. 2011), como consecuencia crece la demanda de datos sobre la eficacia de los tratamientos y prácticas tradicionales. Sin embargo, las investigaciones que se realizan sobre medicina tradicional en cuanto a eficacia y seguridad son insuficientes para respaldar científicamente su uso (OMS 2005). Compuestos químicos como glucósidos, esteroides, terpenos, flavonoides, alcaloides, saponinas, cardiotónicos, fenoles, cumarinas, antocianinas, taninos, quinonas, antracenósidos, constituyen un amplio grupo de metabolitos secundarios, que al tener actividad farmacológica se denominan principios activos (Kuklinski 2000). Las plantas contienen principios activos que pueden presentar una notable actividad fisiológica en el ser humano y por

secondary

metabolites,

Artemia

ello pueden constituirse en un importante aliado parala prevención y tratamiento de ciertas patologías. No obstante, se conoce que muchas plantas pueden ocasionar reacciones tóxicas a quienes las utilizan, estas reacciones tóxicas se deben a la presencia de algunos metabolitos (Kuklinski 2000). Por esta razón, se llevan a cabo investigaciones con el propósito de determinar la presencia de metabolitos secundarios, bioactividad y toxicidad de las plantas medicinales (Fidalgo & Ramos 2009). La evaluación de la toxicidad es importante cuando se quiere valorar la seguridad de una planta medicinal para su uso tradicional o con fines de elaboración de fitofármacos (Zhang 2000). El ensayo de letalidad de Artemia salinaes considerado como una de las herramientas más útiles para una evaluación preliminar de toxicidad de extractos de plantas, detección de toxinas de hongos, metales pesados, cianobacterias y algas y resulta poco oneroso y con favorables consideraciones bioéticas (Fernández-Calienes Valdés et al. 2009). Determina el valor de la concentración letal media (CL50) de un pequeño crustáceo conocido comúnmente como el camarón de salmuera (Molina S. & Said F. 2006). En las provincias de Loja y Zamora Chinchipe, al Sur del Ecuador, se presenta una considerable variabilidad de microclimas, encontrándose desde clima tropical seco, subtropicalhúmedo y templadoandino en la provincia de Loja; mientras que en la provincia deZamoraChinchipe se cuenta con un climatemplado, que cambia dehúmedoasemi-húmedo, por lo que la vegetación es abundante (SENPLADES 2010). En estas zonas se reporta la existencia de 275 especies de plantas, de las cuales 152 son nativas, 57 introducidas, 8 son endémicas. Estas plantas son utilizadas para tratar diversas patologías desde dolores de estómago

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hasta malaria (Tene et al. 2007). El presente estudio se llevó a cabo con el objetivo de evaluar la toxicidad de 10 extractos de plantas medicinales que son utilizadas frecuentemente por los sanadores de la Etnia Shuar de la provincia de Zamora Chinchipe, para el tratamiento de enfermedades frecuentes. Utilizando para el screening fitoquímico el método de Schabra(Schabra 1984) y para la determinación de la CL50 el método modificado de citotoxicidad en microplaca con A. Salina. Materiales y métodos Selección y colecta de plantas Para la selección de las plantas y sus partes

que se incluyeron en el estudio, se realizaron encuestas desarrolladas en la provincia de Zamora Chinchipe durante los años 2008 y 2009, las cuales indagaron sobre qué plantas utilizan para tratar los padecimientos comunes, especialmente enfermedades infecciosas de la zona de estudio, qué partes, cómo la preparaban y con qué, la forma de administración y las precauciones para usarla. Durante el mes de noviembre de 2010, se colectaron partes de 10 plantas, las mismas que fueron seleccionadas por la frecuencia de uso por sanadores de las Etnias Saraguro y Shuar de la provincia de Zamora Chinchipe, según se exponen en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Nombre común, científico y partes usadas de las especies analizadas

Nº 1 2 3 4 5

Parte usada Raíces Raíces Hojas Hojas Hojas

7 8

Nombre común Nombre científico Muka chiank Renealmia sp.(Zingiberaceae) Piri piri Cyperus sp3.(Cyperaceae) Tacup Solanumoccultum Bohs (Solanaceae) Parabra Brunfelsia grandiflora D. Don (Solanaceae) Winchiq Bidens pilosa L. (Asteraceae) Valeriana chaerophylloides Sm. (ValerianaceCulantrillo ae) Begonia Begoniafischeri Schrank (Begoniaceae) Lancetilla Iresineherbstii Hook. (Amaranthaceae)

Malva

Hojas y tallos

Malachraruderalis Gürke (Malvaceae) Principio del formulario

Hojas y flores Hojas y flores Hojas y tallos

Caña agria de Final del formulario Hojas, flores y tallos bejuco Arthrostemaciliatum Ruiz & Pav. (Melastomataceae)

Las colectas se realizaron en varias comunidades nativas de los cantones El Pangui, Yacuambi y Centinela del Cóndor, de acuerdo al Instructivo para la colecta de drogas del Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Nacional de Loja (UNL). De los ejemplares colectados se prepararon dos muestras, una para su siembra en la Estación El Padmi de la UNL y otra para su identificación en el Herbario Reinaldo Espinosa de la UNL.

El lavado del material colectado se realizó con agua potable y se desinfectó por inmersión en solución acuosa de hipoclorito de sodio al 0,5 % (Acosta de la Luz 2002). El secado de hojas, flores y tallos se realizó a temperatura ambiente y protegido de la luz solar. Las raíces fueron troceadas y secadas en estufa a 45 ºC. La molienda se realizó en molino de cuchillas con tamiz de 2 mm.

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Preparación de extractos y diluciones de ensayo Los extractos se prepararon por maceración, para lo cual se pesó 30 g de hojas y 50 g de raíces de cada planta, se colocó en un Erlenmeyer con tapa de cierre hermético y seagregó etanol 70 % v/v en agua en pequeñas cantidades hasta 2 cm por sobre la superficie de la droga; se dejó reposar por 48 horas, agitando eventualmente. Transcurrido el tiempo indicado se realizó la filtración por gasa y papel filtro respectivamente. Los filtrados se concentraron en rotavapor a 45 ºC, el solvente recuperado se usó para sucesivas extracciones, haciéndose las correcciones de concentración y dejándolo en contacto con la planta por 4 horas con eventual agitación. Este proceso se repitió hasta que el filtrado cuando el filtrado quedó sin color y translúcido. El extracto concentrado fue secado en estufa a 45 ºC y luego liofilizado. A partir de los liofilizados se preparó una solución madre de cada extracto con una concentración final de 1 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO)al 25 % (Atta-ur-Rahman et al. 2005) en agua de mar artificial (Prefectura Naval Argentina 1998). A partir de esta solución se prepararon otras diluciones conteniendo 50, 150, 350, 550 y 750 µg/mL de liofilizado. Estas soluciones se conservaron a 4 °C hasta su utilización. Tamizaje fitoquímico El tamizaje fitoquímico se realizó siguiendo la metodología propuesta por Schabra (1984), habiéndose realizado las pruebas cualitativas para los metabolitos señalados en el Cuadro 2. Cultivo de A. salina En un Erlenmeyer de 250 mL se depositaron 0,25 g de quistes de A. salina, se agregaron 250 mL de agua de mar artificial y 6 mgl-1 de levadura (Prefectura Naval Argentina 1998), se incubó a 27,5 ± 2,5 ºC por 48 horas, con aireación e iluminación permanentes. Al mismo tiempo, en un Erlenmeyer de 50 mL se oxigenó agua de mar artificial por 24

horas. Al cabo de cuarenta y ocho horas se suspendió la aireación, iluminación y se revistió el Erlenmeyer con una envoltura negra, dejando descubierta solo la parte inferior del Erlenmeyer. Por sifonamiento se tomaron 50 mL de agua de mar con náuplios y se mantuvieron suspendidos por agitación manual. Ensayo de letalidad Se rotularon placas de 96 micropocillos (Solis et al., 1993) de fondo plano con el nombre de la planta y las diluciones, al control negativo (blanco) le correspondió el número cero. A partir de la solución madre se procedió a depositar en los pocillos el equivalente a 50, 150, 350, 550 y 750 µg/ mL de extracto, 50 µL de agua de mar con náuplios de A. salina y agua de mar artificial aireada hasta completar 200 µL. La determinación se realizó por triplicado para cada dilución. Paralelamente se realizó la prueba utilizando el patrón de dicromato de potasio como referencia (González Pérez & Aportela Gilling 2001), para validar la técnica. Los micropocillos fueron incubados luego por veinte y cuatro horas a 27,5 ± 2,5 ºC, con intensa iluminación (Atta-ur-Rahman et al., 2005). Una vez transcurrido el período de incubación se examinaron las placas realizando el recuento de náuplios muertos. Se consideraron náuplios muertos a aquellos que no presentaron movimiento por más de 5 segundos, luego se adicionó 100 µL de metanol a todos los micropocillos, se dejó reposar por 15 minutos y se realizó un nuevo recuento. Para la valoración de la CL50 se consideró las siguientes categorías: extremadamente tóxico (CL50< 10 μg/mL), muy tóxico (entre 10 y 100 μg/mL), moderadamente tóxico (entre 100 y 1 000 μg/mL) y no tóxico (CL50 > 1 000 μg/mL). (Valdés-iglesias et al. 2003). Análisis estadístico Para la determinación de la CL50 se siguió el método Probit que es una regresión lineal

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desarrollada para establecer la relación existente entre la concentración de una sustancia tóxica y la respuesta de la especie ensayada expuesta al tóxico por un tiempo determinado (24 horas) (Vincent 1980). La respuestade los organismos se transforma a unidades Probit en el eje Y y el logaritmo decimal de la concentración de tóxico en el eje X. Los datos obtenidos de las lecturas fueron procesados en el programa SPSS versión 18, desarrollando un análisis de regresión y fijándose los valores de CL50.

Cuadro 1, indicando la intensidad de las reacciones presentadas, así mismo en el Cuadro 3 se muestran los valores de CL50 para las diez plantas estudiadas de las cuales Cyperus sp3, S. occultum y Begonia fischeri, resultaron moderadamente tóxicas, con concentraciones de 459, 676 y 650 ug/ mL respectivamente; es decir, valores entre los 100 y 1000 ug/mL. Los siete extractos restantes: Renealmia sp. B. grandiflora, Bidens pilosa, V. cherophylloides, I. herbstii, M. ruderalis, A. ciliatum, se encuentran en la categoría de no toxicas.

Resultados Los metabolitos identificados en las diferentes especies se exponen en el

En el Cuadro 3 se detallan los valores de la CL50 para las plantas estudiadas.

Cuadro 3. Determinación de CL50 Nº Nombre CL50 μg/mL 1 Renealmia sp. >40000 2 Cyperus. sp3. 429 3 S.occultum 676 4 B. grandiflora 1244 5 Bidens pilosa >40000 6 V. chaerophylloides 1106 7 Begoniafischeri 650 8 I.herbstii 39512 9 M.ruderalis 38151 Principio del formulario 10 Final del formulario A. ciliatum

2295

Escala No tóxica Moderadamente tóxica Moderadamente tóxica No tóxica No tóxica No tóxica Moderadamente tóxica No tóxica No tóxica No tóxica

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Discusión La determinación de la letalidad en A. salina ha sido utilizada con eficiencia para detectar componente tóxicos en plantas (FernándezCalienes Valdés et al. 2009; Solis et al. 1993;Meyer et al. 1982) y en base a ella, evaluar los posibles usos terapéuticos, considerándose, además que existe una buena correlación entre los realizados en Artemia salina con la toxicidad en ratones (Lagarto Parra et al. 2001), estableciéndose para tal fin una escala (Valdés-iglesias et al. 2003) en base a la cual se puede clasificar a los extractos estudiados por su toxicidad. Los resultados obtenidos indican que los extractos hidroetanólicos de tres especies pueden ser consideradas medianamente tóxicas, sin haberse establecido una relación causal con los resultados del tamizaje fitoquímico, el cual es necesario profundizar. Las tres especies mencionadas se utilizan comúnmente para tratar diversas patologías; de este modo Cyperus sp3 es usadacomo purgante, en reumatismo, mordedura de serpiente e infecciones respiratorias (Proyecto Plantas Medicinales 2009). S. occultum es utilizada para quemaduras, infecciones intestinales (Contento G. & Andrade 2008)y Begonia fischeri para diarreas e infecciones respiratorias (Proyecto Plantas Medicinales 2009), afecciones comunes en la zona de estudio y por ello también son usadas frecuentemente. Los resultados del presente trabajo confirman que las especies evaluadas son seguras para su uso, aunque se debe profundizar en la evaluación las bioactividades atribuidas, que no se abordan aquí, pero que sin duda permitirán justificar su uso con mayor criterio científico. Conclusiones Se determina la toxicidad moderada de tres plantas medicinales utilizadas frecuentemente por los sanadores de la provincia de Zamora Chinchipe para tratar patologías humanas principalmente de origen infeccioso.

Los extractos evaluados mostraron mayoritariamente baja toxicidad mediante el ensayo de letalidad sobre Artemia salina, lo que permite respaldar el uso tradicional de estas plantas. Las especies de plantas cuyos resultados mostraron baja toxicidad de los extractos tienen la posibilidad de continuar otros estudios de bioactividad, los cuales sientan las bases para el desarrollo de fitofármacos. Agradecimientos Queremos expresar nuestros sinceros agradecimientos a los sanadores de las diversas comunidades Shuar y Saraguro de la zona de estudio por hacernos partícipes de su sabiduría; a la Dra. Ruth Sigüenza, Directora Provincial de Salud de Zamora Chinchipe; al Dr. Rumi Contento, Coordinador del Subproceso de Medicina Intercultural de la Dirección de Salud de Zamora Chinchipe, por su apoyo incondicional al proyecto y a la labor investigativa de la UNL. A los directivos de la UNL, al Dr. Max González Merizalde, Rector UNL periodo 2003-2008; al Dr. Gustavo Villacís Rivas Rector de la UNL periodo 2008-2013, 20132018 y al Dr. Rómulo Chávez, Director de Investigaciones UNL, motivadores y convencidos impulsadores del proyecto.

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ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD MORFOLÓGICA DE AISLADOS FÚNGICOS ASOCIADOS CON LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR DEL BABACO (Vasconcellea heilbornii var. pentagona) EN LOJA, ECUADOR MORPHOLOGICAL VARIABILITY STUDY OF FUNGAL ISOLATES ASSOCIATED WITH VASCULAR WILT BABACO (VASCONCELLEAHEILBORNII VAR. PENTAGONA) DISEASE IN LOJA, ECUADOR Ángel Robles-Carrión1, Darío Salinas-Serrano2, Wilman Armijos-Armijos2, Aminael SánchezRodríguez3 y Roldán Torres-Gutiérrez4* Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S”. Loja-ECUADOR. aroblescarrion@gmail.com 1

Carrerade Ingeniería Agronómica. Universidad Nacional de Loja-ECUADOR.

Centro de Genética Microbiana y de Plantas. Universidad Católica de Lovaina-BÉLGICA. aminael.iv@gmail.com 3

Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Proyecto “Prometeo Viejos Sabios”. SENESCYT-ECUADOR. roldantg@gmail.com 4

*Autor para correspondencia. Resumen La Marchitez Vascular del Babaco (MVB), causado por Fusariumoxysporum es una enfermedad de gran importancia debido a las severas pérdidas que produce en el cultivo de Babaco. El objetivo de esta investigación fue estudiar la variabilidad morfológica de once aislados fúngicos asociados a la MVB en la provincia de Loja, Ecuador. Las muestras se colectaron en los cantones de Saraguro y Loja. Se seleccionaron plantas con clorosis de hojas inferiores y pudrición de la base del tallo. De las muestras infectadas se sembraron secciones de 0.3 a 0.5 cm de longitud en papa-dextrosa-agar, de las cuales se obtuvieron cultivos puros de los aislados. Estos aislados se caracterizaron morfo-culturalmente, teniendo en cuenta: tipo de micelio, color de la colonia, medición del crecimiento radial, cuantificación y medición de las estructuras reproductivas (macro y microconidias) y el conteo de conidios. Los once aislados obtenidos presentaron características morfo-culturales indicativas del género Fusarium. Se observó una alta variabilidad entre los aislados en diferentes sitios de colecta, respecto a la pigmentación de las colonias, tipo de micelio y en la medición de las estructuras reproductivas. Según el crecimiento radial se identificaron tres categorías de clasificación: tres aislados con crecimiento lento, cinco de crecimiento medio y tres de con crecimiento rápido. Conocer el potencial de patogenicidad de inóculo de los once aislados puede ser importante para predecir la colonización y la infectividad del patógeno y de este modo la posible incidencia o severidad de MVB. Estos resultados sientan precedentes en el estudio de la variabilidad genética de agentes causales asociados a la MVB en la Región Sur del Ecuador. Palabras claves: Marchitez Vascular del Babaco, Fusariumoxysporum estructuras

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reproductivas, variabilidad Abstract VascularWiltBabaco(MVB), caused byFusariumoxysporumisa disease of greatimportance due tothe severelosses thatoccurin growingBabaco. The objective ofthis researchwas to study themorphological variability of elevenfungal isolatesassociated withMVBin the province ofLoja, Ecuador. Sampleswere collected atthe cantons ofSaraguroandLoja. Plantswere selectedwith lowerleaf chlorosis androtstem base.Infectedsamplesectionswere sown0.3 to 0.5cm in potato dextroseagar,whichwere obtainedpure cultures ofthe isolates. The isolateswere morpho-culturally characterized, taking into account:type ofmycelium, color of the colonyradialgrowth measurement, quantificationand measurementof reproductive structures(macroandmicroconidia) and the counting ofconidia.The elevenisolates obtainedshowedmorphological and culturalcharacteristicsindicativeof Fusarium genus. High variability among the isolates were observedat different collected sites with respect to the colonies pigmentation, type of myceliumand measurementof reproductive structures. According to theradialgrowththreeclassification categories were identified: three isolateswithslow growth,average growthfiveand threerapidly growing. Know the potentialpathogenicity ofinoculumof the elevenisolatesmaybe important for predictingthe colonizationand infectivityof the pathogenand thustheincidence or severity ofpossibleMVB. Theseresults could be the base to study the geneticvariabilityassociatedcausalagents of MVBinSouthern region ofEcuador. Key words: Babaco Vascular Wilt, Fusarium oxysporum reproductive structures, variability Introducción En la actualidad en el Ecuador la actividad agrícola y la seguridad alimentaria se proyectan como actividades principales dentro de la economía nacional. En este contexto cabe mencionar el nuevo auge que existe en la producción de cultivos agrícolas exóticos y ancestrales, uno de éstos es el Babaco (Vasconcellea heilbornii var. pentagona), considerado desde épocas pasadas como una fruta de óptimas características para la exportación, por poseer dentro de otras ventajas la ausencia de semillas, tener una cutícula delgada y el agradable sabor de su pulpa (Uzcátegui, 2007). Desde finales de la década de 1990 el Ecuador experimentó un acelerado crecimiento de las exportaciones de Babaco al mercado internacional, especialmente dirigidas hacia la Unión Europea, en particular a Holanda y Alemania (Uzcátegui, 2007; Cueva, 2007; Tobar, 2008). Sin embargo, después de casi 10 años de exportación del Babaco se observó una estrepitosa caída

de la producción y comercialización de esta fruta, debido a la presencia de la enfermedad de la marchitez vascular del Babaco (MVB) causada por el hongo Fusariumoxysporum (Ochoa y Fonseca 2000). Esta enfermedad se diseminó a lo largo y ancho del territorio ecuatoriano, consecuentemente que muchos agricultores optaran por no seguir cultivando esta fruta (Tobar, 2008). Los hongos pertenecientes al género Fusarium, incluidos en la división Ascomycota, Clase Euascomycetes, Orden Hypocreales, se caracterizan por producir colonias de crecimiento rápido, su micelio es generalmente aéreo, abundante, algodonoso, con diferentes coloraciones tales como blanca, durazno, salmón, dependiendo de la especie (Estupiñan, 2007). La marcada variabilidad de las características morfológicas de especies del género Fusarium podría explicar su capacidad para colonizar diversos hospederos. Esta variabilidad, la cual es especie-dependiente se evidencia

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principalmente en el potencial colonizador y la tasa de crecimiento de las estructuras somáticas y reproductivas (Agrios, 2005). Recientes estudios realizados en trigo (Spanic etal., 2010) y remolacha (Hill etal., 2011) ponen de manifiesto la marcada influencia que tiene la variabilidad en las características morfológicas y genéticas de las especies, formas especiales y razas, en los niveles de patogenicidad dentro de este género. En el Babaco la infección por F. oxysporum se inicia con la presencia del inóculo en el suelo o en residuos de cosecha y está constituido por hifas, esporas o clamidosporas que germinan cuando son activadas por los exudados producidos en las raíces fibrosas de la planta. Los tubos germinativos del hongo penetran la epidermis de las raíces directamente o a través de daños mecánicos, pasan a la corteza y a la endodermis. Una vez dentro del hospedante se mueven para colonizar los vasos del xilema produciendo la oclusión del sistema vascular de la planta. Su diseminación se produce a través de material de propagación contaminado, fragmentos de plantas enfermas y transportación de suelo infestado con clamidosporas del hongo (Leslie y Summerell, 2006). Dependiendo de la tasa de velocidad de infección, el hongo puede ocasionar pudrición radicular e incluso la muerte (Agrios, 2005). Hasta hoy el control de la MVB se ha fundamentado en la aplicación de grandes cantidades de productos químicos, los cuales en ocasiones resultan ineficientes, incrementan los costos de producción y contribuyen a la contaminación ambiental (Cueva, 2007). Una alternativa a esta problemática sería el desarrollo de una estrategia de biocontrol, las cuales han demostrado ser efectivas, mediante la utilización tanto de bacterias (Bacillus, Pseudomonas y Rhizobium) como de hongos antagonistas (Trichoderma, Glomus yGigaspora)en el control biológico de F. oxysporum en diversos cultivos (Akhtar et al., 2008; Matarese et al., 2012; Hernández-Montiel, 2013). Sin embargo,

ello requiere de un detallado estudio de los aislados patogénicoscon mayor incidencia en el cultivo de interés, su variabilidad genotípica y fenotípica, pues cualquier agente biocontrolador deberá ser capaz de anular el efecto de no solo un aislado patogénico, sino de todos aquellos que son predomiantes en una determinada región geográfica (Hernández-Montiel, 2013). En el presente trabajo estudiamos la variabilidad morfológica de once aislados fúngicos asociados a la MVB en diferentes puntos de la geografía de la provincia de Loja, Ecuador. Esta investigación es el primer paso en el desarrollo de una estrategia de biocontrol de la enfermedad. Materiales y métodos Colecta de muestras Las muestras se colectaron durante los meses de enero a marzo de 2013 en las zonas de mayor producción de Babaco en la provincia de Loja (Figura 1). Cada zona de recolección se georeferenció con la utilización del Sistema de Posicionamiento Global (GPS). Las muestras se tomaron en los cantones: Loja (localidades: Amable María, El Carmelo, Chantaco, Reymincha, Gonzabal, La Retama), con una altitud entre 2100 a 2160 msnm y temperatura promedio de 16 a 28°C; cantón Saraguro (localidades: Cochapamba, Tuncarta, Quisquinchir, Las Lagunas), con una altitud entre 2000 a 3500 msnm y temperatura promedio de 12 a 20°C. Los elementos que se tuvieron en cuenta para la selección de las plantas fueron: clorosis de las hojas inferiores y pudrición de la base del tallo o el resto de este (Agrios, 2005). Se realizó un corte transversal para comprobar la decoloración vascular del tallo (color vinoso). Se tomaron muestras de raíces y tallos sintomáticos, las cuales se acondicionaron en bolsas ziploc para el transporte con el fin de realizar el análisis fitopatológico.

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Procesamiento de las muestras Las raíces de las plantas fueron lavadas con agua corriente hasta que éstas quedaron limpias de contaminación con suelo del área de colecta. Posteriormente se seleccionaron partes del tejido vegetal afectado de tallos y raíces, los cuales se cortaron en secciones de 0.3 a 0.5 cm de longitud (Ochoa y Fonseca, 2000). Aislamiento de microorganismos El aislamiento se realizó según la metodología propuesta por Leslie y Summerell (2006), el cual comenzó con la desinfección de las muestras en hipoclorito de sodio (NaOCl) al 2.5 % por un minuto y alcohol al 70% durante tres minutos. Este procedimiento tiene como objetivo la eliminación de todos aquellos agentes contaminantes que se encuentran en la superficie del tejido vegetal. Posteriormente se realizó un lavado intenso con agua destilada estéril durante diez minutos. De cuatro a cinco secciones del material se pasaron a una placa Petri de 90 X 15 mm con medio PDA (PapaDextrosa-Agar) a pH 5.5. Las placas se sellaron e incubaron por 48 horas a 28°C. El medio de cultivo fue preparado siguiendo los procedimientos propuestos por Ochoa y Fonseca (2000). Luego de la purificación de los cultivos fúngicos se realizaron pases de estructuras somáticas a nuevas placas Petri con medio PDA. Muestras de dichos cultivos se pasaron a tubos con igual medio para su conservación a 4ºC. Identificación morfológica de microorganismos Para la identificación morfológica de los aislados fúngicos se realizaron diferentes análisis tales como: características morfológicas, teniendo en cuenta el tipo de micelio (TDM), color de la colonia (CDC), medición del crecimiento radial y la observación, cuantificación y medición de las estructuras reproductivas.

Para la medición del crecimiento radial se sembraron cuatro placas Petri con medio PDA por cada aislado, transfiriendo asépticamente un disco del cultivo fúngico (con sacabocado número 2 (2 mm de radio)) con estructuras vegetativas en medio PDA. Las placas se sellaron e incubaron a 28°C en incubadora digital (Poleko Serie: SN5SE111205, Polonia). El cálculo de la tasa de crecimiento radial (TCR mm día1 ) se realizó comparando el crecimiento a los cuatro días con el de tres días, el de seis días con el de cinco días y el de ocho días con el de siete días. La TCR se calculó según la fórmula propuesta por Mead et al. (1993): Dónde: TCR: Tasa de crecimiento radial; Cf: Crecimiento final (diámetro en mm); Ci: Crecimiento inicial (diámetro en mm); Tf: Tiempo final (días); Ti: Tiempo inicial (días). Los valores de crecimiento inicial (Ci) y final (Cf), así como el tiempo inicial (Ti) y final (Tf) correspondieron a la diferencia de un día en crecimiento y tiempo transcurrido. Las mediciones se realizaron por 8 días, ya que a partir de este tiempo varios de los aislados cubrieron toda la superficie de la placa. Los aislados se agruparon teniendo en cuenta las categorías de crecimiento: lento (10 mm de crecimiento por día), medio (>10-12 mm de crecimiento por día) y rápido (>12 mm de crecimiento por día) (Dubey et al., 2010). Para la medición y caracterización de las estructuras reproductivas (micro y macroconidias) se realizaron microcultivos de cada uno de los aislados en medio PDA, los cuales se incubaron a 28°C por 72 horas. Transcurrido el tiempo de incubación se observaron las muestras al microscopio óptico (Olympus Serie: 1D81617, Alemania). El valor micrométrico usado fue de 1 μm en el objetivo de 40X y de esta forma se determinó el tamaño de las estructuras reproductivas. Se realizaron mediciones de 100 microconidas y 100 macroconidias elegidas al azar para determinar el tamaño promedio de las mismas (Castaño-Zapata, 1998). Además de estas mediciones se realizó el conteo de conidios en cada uno

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de los aislados, llevándose a cabo mediante el método de conteo por cuadrantes en cámara Neubauer, con un aumento de 40X. Para el cálculo de la concentración final de unidades formadoras de colonias (UFC) se utilizó la fórmula descrita por Rojas-Triviño, (2011): La identidad a nivel de género de los aislados fúngicos fue establecida teniendo en cuenta los parámetros expuestos en párrafos anteriores. Además se utilizaron las claves detalladas de: Barnett y Hunter (1987); Watanabe, (2003); Leslie y Summerell (2006) para las especies fitopatógenas del género Fusarium. El análisis estadístico se realizó con la utilización del paquete Statgraphic Centurion v.16.1. Para el análisis de la TCR, cuantificación y mediciones de las estructuras reproductivas se realizaron diseños experimentales totalmente aleatorizados con cuatro réplicas. Las diferencias entre aislados se analizó mediante el estadístico One Way Anova y la prueba de Tuckey HSD con intervalo de confianza de p<0.05. Resultados El cultivo del Babaco en la provincia de Loja, se encuentra mayoritariamente en los cantones de Loja y Saraguro, siendo este

último el de mayor producción en todo el Sur del Ecuador (Ampuero, 2004). En la Figura 1 se muestra el origen de los aislados fúngicos potencialmente asociados a la enfermedad de la MVB en la provincia de Loja. Se hace alusión a que estos aislados son potenciales agentes causales de la MVB ya que su afirmación requerirá del desarrollo de pruebas de patogenicidad. El muestreo para la obtención de los aislados fúngicos asociados a la MVB se realizó en los dos cantones ya mencionados, Loja y Saraguro. El cantón Loja se encuentra situado entre las coordenadas geográficas 03°39’55” a 04°30’38” de latitud sur y 79°05’58” a 79°05’58” de longitud oeste, con una altitud de 2 100 msnm, la temperatura varia de 16 y 21°C. En esta localidad se obtuvieron nueve aislados fúngicos en la parte norte del cantón. El cantón Saraguro se encuentra ubicado entre las coordenadas geográficas 03°31’38’’ a 04°30’20’’ de latitud sur y de 79°43’41’’ a 80°60’30’’, con una altitud entre 2 000 a 3 500 msnm, la temperatura varía entre 15 y 20°C. En esta localidad solo se obtuvieron dos aislados fúngicos asociados a la MVB. Es significativo destacar que en el cantón Loja se obtuvo el 81.8% de los aislamientos realizados, lo que pone de manifiesto una posible epifitotia causada por la enfermedad en esta localidad.

Leyenda: X = lugar de muestreo para la obtención de los aislados fúngicos del Babaco.

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Figura 1. Zonas de muestreos donde se obtuvieron los aislados fúngicos para la caracterización morfo-cultural. Los 11 aislados obtenidos presentaron características morfológicas y culturales indicativas del género Fusarium según lo reportado por Watanabe (2003) y Leslie y Summerell (2006). En la Tabla 1 se exponen las características morfológicas de los aislados obtenidos, donde se observa la variabilidad de la pigmentación de las colonias y el tipo de micelio. La coloración de las colonias va de violáceo, púrpura a amarillo claro o

blanquecino, predominando los micelios púrpuras y violáceos en comparación con el resto de las pigmentaciones. El tipo de micelio en la mayoría de los aislamientos es copioso o flocoso. Son notables los resultados obtenidos en la variabilidad de los aislamientos realizados en el cantón Loja, donde de nueve aislados el 44.4% (4 aislados) presentan micelios púrpuras copiosos, 22.2% (2 aislados) violáceos copiosos, 22.2% (2 aislados) amarillo blanquecinos lanosos y 11.1% (1 aislado) amarillo claro lanoso.

Cuadro 1. Características culturales de 11 aislados fúngicos potencialmente asociados a la MVB. Asilados

Característica morfológica

AML 1

AML 2

ECM 1

ECM REY CHA COC COC COC QUI 2 1 1 1 2 3 1

QUI 2

CDC

PUR

AMC

AMB

PUR AMB

VIO

PUR

VIO

TDM

COF

LOH

COF LOH COF

COF

COF COF COF

VIO

Leyenda: Amable María (AML), El Carmelo (ECM), Reymincha (REY), Chantaco (CHA), Cochapamba (COC) y Quisquinchir (QUI). Color de la Colonia (CDC): Púrpura (PUR), Amarillo Claro (AMC), Amarillo Blanquecino (AMB), Violáceo (VIO). Tipo de micelio (TDM): COF = Copioso o Flocoso, LOH = Lanoso o húmedo. La Figura 2 muestra la variabilidad de las características morfológicas de los micelios en los aislados por cada una de las localidades de aislamientos, especialmente los obtenidos en el cantón Loja. Es significativo destacar la variabilidad que existe entre estos aislados y los sitios de colecta. Con excepción de las localidades Reymincha y Chantaco, en las cuales se obtuvo un solo aislado, en todas las demás localidades se observó una alta variabilidad en las características al analizar la pigmentación de las colonias y el tipo de micelio.

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Figura 2. Variabilidad de los tipos de micelios y características culturales de los aislados obtenidos de muestras de Babaco en el cantón Loja. A: Amable María, pigmentación púrpura (A-1) y amarillo claro (A-2); B: El Carmelo, pigmentación púrpura (B-1) y amarillo blanquecina (B-2); C: Cochapamba, pigmentación púrpura (C-1 y C2) y violácea (C-3); D: Reymincha, pigmentación Amarillo blanquecina; E: Chantaco, pigmentación violácea. En la Figura 3 se representa la tasa de crecimiento radial (Panel A) y el conteo de conidios (Panel B) realizado a los aislados. La TCR se refiere al aumento en milímetros radial micelial entre los intervalos de tiempos (en días) señalados. Cada valor representa el promedio de la medición radial en mm de los dos días comparados.

Figura 3. Tasa de crecimiento radial (TCR) y conteo de conidios de los aislados fúngicos. Leyenda: Amable María (AML), El Carmelo (ECM), Reymincha (REY), Chantaco (CHA), Cochapamba (COC) y Quisquinchir (QUI). Error Estándar: EE. Medias con letras desiguales difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD. En el Panel A se observa la variabilidad de los aislados respecto a la TCR, donde a excepción de aquellos obtenidos en Reymincha (aislado 1), Quisquinchir (aislado 2) y el Carmelo (aislado 1) se evidencia una estrecha correlación del crecimiento en el resto de estos. El agrupamiento de los aislados según las categorías de crecimiento logró identificar: tres aislados que correspondieron a crecimiento lento (COC1, QUI1 y QUI2), cinco a crecimiento medio (AML2, CHA1, COC3, ECM2 y REY1) y tres a crecimiento rápido (AML1, COC2 y ECM1). Ambos aislados procedentes de Saraguro se ubicaron en la clasificación de lento crecimiento. En el Panel B se muestra la cuantificación del número de conidios. Los mejores resultados estadísticos corresponden a los aislados procedentes del cantón Saraguro (Quisquinchir 2) y del cantón Loja (Amable María 2 y Reymincha 1), lo que evidencia la variabilidad en este parámetro entre los aislados obtenidos. Al analizar ambos paneles de la Figura 3 se demuestra que el número de estructuras reproductivas no depende de la tasa de crecimiento radial de los aislados, sin embargo, es evidente la variabilidad existente en ambas evaluaciones realizadas en cada localidad de aislamiento.

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La variabilidad morfológica también se observó en las mediciones de las estructuras reproductivas (micro y macroconidas). La Tabla 2 muestra los valores medios de las dimensiones de micro y macroconidios en microcultivos realizados. Cuadro 2. Medición de las estructuras reproductivas de los aislados fúngicos potencialmente asociados a la MVB.

Aislados AML 1 AML 2 CHA 1 COC 1 COC 2 COC 3 ECM 1 ECM 2 QUI 1 QUI 2 REY 1 EE

Localidad de aislamiento Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Loja Saraguro Saraguro Loja -

Valores medios de conidios (µm) Microconidias Macroconidias (Largo x ancho) 2.31 X 1.02 d 2.64 X 1.02 bcd 2.48 X 1.15 bc 2.50 X 1.05 cd 2.10 X 1.06 d 2.77 X 1.00 bcd 2.44 X 1.00 d 4.23 X 1.03 a 2.41 X 1.02 cd 2.38 X 1.00 d 3.22 X 1.04 b 0.12

(Largo x ancho) 11.31 X 1.77 cd 16.18 X 2.01 a 10.92 x 196 c 11.07 X 2.01 c 11.75 X 2.00 c 10.98 X 1.94 cd 10.08 X 1.27 e 11.12 X 1.92 cd 9.35 X 2.01 d 11.02 x 2.57 b 11.28 X 1.97 c 0.71

Leyenda: Amable María (AML), El Carmelo (ECM), Reymincha (REY), Chantaco (CHA), Cochapamba (COC) y Quisquinchir (QUI). Error Estándar: EE. Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD. Al igual que los demás parámetros analizados, la medición de las estructuras reproductivas evidenció una alta variabilidad respecto a los diferentes aislados. El mejor valor estadístico para los microconidios correspondió al aislado procedente de la localidad de El Carmelo 2 (cantón Loja), mientras que para los macroconidios el aislado de Amable María 2 (cantón Loja) obtuvo los mejores resultados estadísticos. Discusión Los resultados presentados evidencian una alta variabilidad de los aislados obtenidos en las diferentes condiciones agroclimáticas muestreadas. Un aspecto muy notable respecto a esta variabilidad se demuestra al comparar los once aislados fúngicos potencialmente asociados a la MVB de ambos cantones en la provincia de Loja. Es

significativo destacar que todos los aislados difirieron en al menos un parámetro evaluado, ya sea en la pigmentación, clasificación del agrupamiento según el crecimiento, número de conidios o dimensiones de sus estructuras reproductivas. Independientemente de la certeza que podamos tener sobre el género al cual pertenecen los aislados en nuestro estudio (Fusarium en este caso), establecer la especie de los mismos resulta mucho más difícil. Según Leslie y Summerell, (2006) F. oxysporum produce un micelio de color púrpura o violáceo intenso, nunca un color amarillo claro o blanquecino. Por su parte Ochoa y Fonseca (2000), reporta que F. oxysporum aislado del tejido del Babaco posee un micelio de aspecto blanco algodonoso que al cabo de cierto tiempo

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se torna de una coloración rosado-pálido a violácea, típico de la especie cuando esporula. Nuestro estudio coincide con lo reportado por este último autor, donde se observan varias tonalidades en los micelios fúngicos de los diferentes aislados con un predominio de las coloraciones púrpura (41.7%) y violácea (33.3%) (ver. Tabla 1). Según Ochoa y Fonseca (2000) y Alvarado (2005) F. oxysporum es el agente causal de la enfermedad MVB, el cual posee un micelio copioso (algodonoso o flocoso), tal como se ha demostrado en varios de los aislados obtenidos en nuestra investigación. Sin embargo, Solano etal. (2011), reporta que la especie F. solani presenta un micelio de aspecto lanoso (húmedo). Los resultados de la diversidad morfológica de los aislados obtenidos en el presente estudio nos podría hacer pensar sobre la presencia de F. solani entre ellos, en adición a la especie F. oxysporum. Ello concuerda con los resultados reportados por Hill etal. (2010), sobre la variabilidad genética entre aislados de Fusarium procedentes de remolacha (Beta vulgaris). En dicho estudio se colectaron 20 aislados en diferentes zonas geográficas de los Estados Unidos y encontraron las siguientes especies: F. oxysporum, F. solani, F. proliferatum y F. avenaceum. Otro parámetro donde se observó variabilidad entre los aislados en nuestra investigación fue en la TCR, la cual se refiere al crecimiento diario del hongo. Este puede ser un parámetro muy importante a la hora de clasificar los aislados y determinar la variabilidad de especies de Fusarium. Muchos de los aislados normalmente crecen entre los días 4 y 6, al cabo del día 7 el crecimiento comienza a disminuir. Esto se debe a que cuando el cultivo fúngico es joven hay un mayor aprovechamiento de los nutrientes (Agrios, 2005). Se pudo constatar una gran variabilidad en la medición de las estructuras reproductivas. Los macroconidios fueron poco abundantes en comparación con los microconidios.

La morfología de estas estructuras se observaron ovaladas con presencia de uno a cinco septos, lo característico fue observar tres septos y excepcionalmente cinco. Los microconidios se presentaron de forma ovalada con ausencia de septos. Las dimensiones de los macro y microconidios se encuentran fuera del rango expuesto por Watanabe (2003) y de Leslie y Summerell (2006) (29.1–45 X 2.9–4.7 µm) para F. oxysporum, lo que hace suponer la presencia de otras especies de este este género. Conocer el potencial de patogenicidad de inóculo de los 11 aislados podría ser importante para predecir la colonización y la infectividad del patógeno y de este modo la posible incidencia o severidad de MVB. Por otra parte, un alto número de colonias fúngicas indica que se requerirá menor cantidad de inóculo para infectar las plantas de Babaco, es decir este es un parámetro muy importante para realizar las pruebas de patogenicidad según Lara (2009). Conclusiones El estudio morfológico y cultural de los aislados fúngicos procedentes de plantas de Babaco permitió concluir que estos pertenecen al género Fusarium. La significativa variabilidad morfológica encontrada entre aislados según los parámetros evaluados: coloraciones miceliales, dimensiones de las estructuras somáticas y reproductivas; sugiere la presencia de más de una especie de Fusarium en este patosistema. La variabilidad obtenida en las estructuras reproductivas de los aislados así como las tasas de crecimiento, pudieran sugerir diferencias en la patogenicidad de los mismos, lo cual será objeto de ulteriores investigaciones. Estos resultados sientan precedentes para el estudio de la variabilidad genética de agentes causales asociados a la MVB en la Región Sur del Ecuador, así como contribuir

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al diseño de estrategias de biocontrol para los microorganismos patogénicos causantes de la MBV. Agradecimientos Los autores agradecen a la Universidad Nacional de Loja, al Consejo de Universidades Flamencas (VLIR) de Bélgica y el Proyecto Prometeo de la SENESCYT, por el financiamiento otorgado para la realización del presente estudio. A Klever Iván Granda Mora y Masao Nishikawa por el aporte a la realización de las investigaciones. Referencias bibliográficas Agrios, G. 2005. Plant Pathology. (5th ed.) Published Elsevier. United States of America. 948 p. Akhtar, M.; Shakeel U.; Siddiqui Z. 2008. Biocontrol of Fusarium wilt by Bacilluspumilus, Pseudomonasalcaligenes, and Rhizobium sp. on lentil. Turk J Biol. 34. 1-7. Alvarado P. 2005. Identificación de cepas patógenas de Fusarium Link. Causantes de nueva patología en el cultivo de calas de colores bajo condiciones productivas de invernadero en Chile. Tesis de Ingeniera Agrónoma. Facultad de Ciencias Agrarias. Escuela de Agronomía. Valdivia, Chile. 118 p. Ampuero, P. 2004. Elaboración de mermelada de babaco como producto no tradicional de exportación al mercado Europeo. Tesis de Economista con Mención en Gestión Empresarial Especialización Marketing. Instituto de Ciencias Humanísticas y Económicas, Escuela Superior Politécnica del Litoral. Ecuador. Barhate, B.; Dake, G.; Game, B.; Padule D. 2006. Variability for virulence in Fusariumoxysporum f. sp. ciceri causing wilt of chickpea. Legume Res., 29 (4): 308 – 310. Barnett, H. Hunter, B. 1987 Illustrated Genera of Imperfect Fungi. (4th ed.). Publishing, MacMillan Publishing Company. United States of America. 218 p. Castaño-Zapata, J. 1998. Prácticas de laboratorio de fitopatología. Práctica (20).

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PREVALENCIA DE ANAPLASMOSIS BOVINA EN EL CANTÓN YANTZAZA, PROVINCIA DEZAMORA CHINCHIPE PREVALENCE OF BOVINE ANAPLASMOSIS IN YANTZAZA CANTON, ZAMORA CHINCHIPE PROVINCE Tito Muñoz Guarnizo1*, Patricia Ayora Fernández2 y Segundo Chamba Puglla3 Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Ciudadela Universitaria “La Argelia”-PBX: 072547252 – Casilla Letra “S”, Loja-ECUADOR. titoflaco@yahoo.com 1

Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Loja. Ciudadela Universitaria “La Argelia”-PBX: 072547252 – Casilla Letra “S”, Loja-ECUADOR. jasielantonio@hotmail.com 2

Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Loja. Ciudadela Universitaria “La Argelia”-PBX: 072547252 – Casilla Letra “S”, Loja-ECUADOR. segundovicente1988@yahoo.es 3

*Autor para correspondencia. Resumen Se analizaron 200 muestras de sangre tomadas de bovinos asintomáticos mediante frotis sanguíneos teñidos con Giemsa, para evidenciar la prevalencia de anaplasmosis bovina en el cantón Yantzaza de la provincia de Zamora Chinchipe. Se recolectaron muestras de garrapatas con la finalidad de identificar los géneros existentes y se aplicaron encuestas para determinar la epidemiología de la enfermedad. La prevalencia de la anaplasmosis bovina en dicho cantón, arroja valores elevados que ascienden a 82 %. El 100 % de garrapatas colectadas pertenecen al género Boophilus. Los mecanismos de transmisión están dados por la presencia de garrapatas y tábanos, así como por la utilización masiva de agujas hipodérmicas sin esterilizar de un animal a otro. El 90 % de los ganaderos del cantón manifiestan conocer y tener presente la enfermedad en su finca, siendo la época de verano cuando con mayor frecuencia se presenta. La mayoría de los ganaderos conoce los síntomas de la enfermedad, aunque un reducido grupo no discrimina con los síntomas de otra enfermedad hematozoárica como la babesiosis. La morbilidad va de media a elevada, pudiendo llegar hasta un 20 % y la mortalidad hasta un 10 %. El control de las garrapatas se hace regularmente a través de baños garrapaticidas y sustancias endectocidas como la ivermectina, constituyéndose el uso de estos últimos, en un problema de salud pública, toda vez que ningún ganadero respeta el tiempo de retiro de este producto en ganado lechero. Palabras Clave: Prevalencia de anplasmosis, Yantzaza, garrapatas, encuestas Abstract We analyzed 200 blood samples taken from asymptomatic cattle by Giemsa stained blood smears, to demonstrate the prevalence of bovine anaplasmosis in the Canton Yantzaza from Zamora Chinchipe province.Samples of ticks were collected in order to identify existing gender and surveys were conducted to determine the epidemiology of the disease. The prevalence of bovine anaplasmosis in that district shows high values amounting 82 %. The 100% of ticks collected belonged to Boophilusgenus. Transmission mechanisms are given by the presence of ticks and tabanids, as well as the widespread use of unsterilized needles

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from one animal to another. The 90% of farmers in the Canton manifested known and be aware of the disease on his farm, being the summer when most often occurs. Most of the farmers know the symptoms of the disease, although a small group does not discriminate on the symptoms of other hematozoaric diseases such as babesiosis. Morbidity is medium to high and can reach up to 20% and mortality to 10%. The ticks control is done regularly through dip tanks and endectocides substances as ivermectin, becoming the latter’s use in a public health problem, since any farmer respect the recall time of this product in dairy cattle. Keywords: anaplasmosis prevalence, Yantzaza, ticks, surveys Introducción La Anaplasmosis bovina es una enfermedad endémica infecciosa que parasita los eritrocitos maduros del ganado bovino y causa anemia aguda, ictericia, fiebre, así como severas pérdidas económicas fundamentalmente en las zonas tropicales y subtropicales (Palmer et al; 1999). Es causada por A. marginale, que es la más patógena para los bovinos y A. centrale, causante de una relativa forma benigna de Anaplasmosis en bovinos (Ristic et al, 1984). Esta enfermedad tiene un curso agudo, sobreagudo o crónico, variando su gravedad de acuerdo a la edad del animal, generalmente moderada en becerros de hasta un año de edad; aguda, pero no fatal en animales de hasta dos años de edad; aguda y ocasionalmente fatal en bovinos de hasta tres años de edad e hiperaguda y frecuentemente fatal en animales de tres años en adelante (Bautista, 1996). A. marginale una Rickettsia intra-eritrocitaria Gram negativa que al microscopio ofrece el aspecto de una inclusión redondeada, basófila, pequeña (0,3-1μm), única o doble, generalmente localizada a lo largo del margen del eritrocito; consta de un cuerpo inicial, que invade el eritrocito y posteriormente se multiplica para formar inclusiones con 4 a 8 cuerpos iniciales (Del Cura, 2003), se caracteriza como todas las Rickettsias, por no tener su cromatina organizada en un núcleo con membrana limitante y por carecer de retículo endoplásmico (Rodríguez et al., 2003). Después que el parásito entra al huésped el número de eritrocitos infectados se

duplica entre las 24 y 48 horas siguientes. El período prepatente durante la incubación de la enfermedad, es de dos a tres semanas y la duración depende de la cantidad de organismo infectante. La infección puede detectarse por microscopía entre 20 y 40 días después de la transmisión, dependiendo del número de microorganismos transmitidos y de la virulencia (Bautista, 1996). La transmisión de la Anaplasmosis, se realiza por medio de vectores biológicos y mecánicos el Anaplasmaes transmitido por la introducción o por el contacto de sangre fresca de un animalenfermo o portador de Anaplasmosis con la sangre de un animal sano en este proceso intervienen, además de la garrapata Boophilusmicroplus, otros insectos hematófagos. Existen una gran variedad de artrópodos que viven de vectores de la enfermedad entre ellos los más importantes son las garrapatas Boophilus y Dermacentor, Boophilusmicroplus; es capaz de transmitir tanto Anaplasma como Babesia (Martínez et al., 2002). Un animal infectado no presenta síntomas clínicos al inicio de la infección, solamente cuando más del 15 % de los eritrocitos han sido parasitados o infectados, se presentan síntomas. En ese período, la parasitemia comienza a desarrollarse y posteriormente los eritrocitos infectados se eliminan del torrente circulatorio mediante fagocitosis por las células del retículo endotelial del bazo, hígado y nódulos linfáticos; induciéndose el desarrollo de una fase de inflamación aguda (Richey, et al., 1990). Cuando la infección se produce en animales de hasta 10 meses, los síntomas son leves, siendo poco frecuente la presentación de anaplasmosis clínica en vacunos de esta

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edad. La observación de frotis sanguíneo es el método más preciso para el diagnóstico; sin embargo la sola presencia de los mismos no es indicativo de enfermedad, ya que en los animales portadores crónicos puede observarse el microorganismo y no significa que estén enfermos. En caso de hallar más del 3 % de eritrocitos infectados con Anaplasmamarginale en frotis de sangre lo asociamos como causal de enfermedad. Debido a que los síntomas comunes de estas enfermedades anémicas se observan también en otras enfermedades que afectan a los bovinos es indispensable para obtener un diagnóstico preciso la correlación de datos anamnésicos, diagnóstico clínico y resultados de análisis de laboratorio (extendidos de sangre y volumen globular tinción de Giemsa o Romanowsky(SENASA, 2006). Las medidas de control para la anaplasmosis no han cambiado marcadamente durante los últimos 50 años, e incluyen el control de los artrópodos vectores mediante la aplicación de acaricidas, la quimioprofilaxis y la vacunación (Corona et al., 2004). La aplicación de acaricidas para eliminar el transmisor (garrapata), no es factible para muchos productores, por su elevado costo y su prolongado uso, crea una población de ganado susceptible, cuando se interrumpe la aplicación del acaricida y ocurre la resistencia a las garrapatas. La vacuna recombinante Gavac permite una significativa mejora en el control de las poblaciones de garrapatas Boophilusmicroplus, en condiciones de campo, pero no tiene efecto para otras especies como Amblyommaspp, también transmisoras de Anaplasmosis (Ortiz et al., 2000). La vacunación contempla el uso de cepas vivas atenuadas sean de A. marginaleo A. centrale, considerada estás últimas como de menor virulencia. La vacunación con este tipo de cepas, particularmente las de A. céntrale, aunque ha sido muy exitosa, dependerá en gran medida de una supervisión gubernamental estricta. El uso de agentes vivos conlleva también el riesgo de transmisión de otros patógenos

que pueden traer graves consecuencias a programas de control y/o erradicación a nivel nacional (Rodríguez et al., 2003). Materiales ymétodos Se muestrearon 200 bovinos de diferente raza, sexo y edad, correspondientes a 20 fincas ganaderas del cantón Yantzaza, mediante muestra sanguínea tomada de la vena yugular en tubos vacutainer con anticoagulante; asimismo en cada finca se extrajo del cuerpo de los animales 100 garrapatas en diferente estadio de desarrollo y de diversas partes del cuerpo y se aplicaron encuestas a los ganaderos para el análisis epidemiológico de la enfermedad. Las muestras sanguíneas fueron analizadas mediante la coloración de Giemsa en el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Loja. Las garrapatas fueron analizadas mediante el uso de un estereoscopio utilizando un esquema de Solari et al, 2006; y, las encuestas fueron tabuladas y sus resultados colocados en cuadros para facilitar su interpretación. Resultados Cuadro 1. Porcentaje de bovinos positivos a anaplasmosis por Giemsa (%) CanResultados % tidad Positivo 165 82,5 Negativo 35 17,5 TOTAL 200 100 Existe un elevado índice de prevalencia de anaplasmosis bovina en el cantón Yantzaza, dado especialmente por la presencia de vectores y las malas prácticas vacunales, con equipo sin previa esterilización entre aplicaciones de un animal a otro.

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Cuadro 2. Prevalencia de la anaplasmosis bovina por edad (%) Grupo Muestras Positivos % Etario Menores 46 30 18 a 1 año De 1 a 2 38 33 20 años De 2 a 4 50 44 27 años Mayores 66 58 35 a 4 años Total 200 165 100 El mayor porcentaje de animales infectados, corresponde a la categoría mayores a 4 años; lo que demuestra que los animales adultos tienen mayor predisposición y hay quienes indican que presentan mayores tasas de prevalencia que los jóvenes. Cuadro 3. Prevalencia de la anaplasmosis bovina por sexo (%) Total de Sexo Positivas % muestras Hembra 159 130 78,79 Macho 41 35 21,21 Total 200 165 100,00 De 165 casos positivos (82,5 %); el 78,79 % son hembras, mientras que el restante 21,21 % son machos; esto supone que la sensibilidad de las hembras está ligado a un estado fisiológico productivo y al estrés del parto. Cuadro 4. Prevalencia de la anaplasmosis bovina por raza (%) Total de Raza Positivos % muestras Holstein 132 105 64 Charolaise 30 24 15 Brownswiss 25 24 15 Otras 13 12 7 Total 200 165 100 De 165 casos positivos, el 64% son de la raza Holstein friesian; el 15% pertenecen a la raza Charolaisey a la raza Brown swiss respectivamente; y, el 7% restante a otras razas, en las que se incluye la raza criolla; dándonos como resultado que el ganado de leche por su estado fisiológico es más susceptible a la enfermedad principalmente por su producción láctea, ya que en los partos se producen situaciones de estrés y disminuyen sus defensas. En lo que respecta a los géneros de garrapatas encontrados, todos los especímenes analizados corresponden al género Boophilus.Este dato concuerda con lo reportado por Chamba, 2011; quien en el cantón Centinela del Cóndor también encontró un 100 % del género Boophilusssp.

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Figura 1. Glóbulos rojos de bovino, infectados con A. marginale y teñidos con Giemsa Discusión El mayor porcentaje de animales infectados, corresponde a la categoría mayores a 4 años, lo que coincide con lo manifestado por Mora, 1993 (citado por Díaz, 2003), en el que detalla que los bovinos jóvenes son más resistentes a los efectos de una primo-infección por A. marginale, disminuyendo en estos casos los cuadros clínicos de la enfermedad y desarrollando una larga inmunidad; sin embargo, un curso agudo, sobreagudo o crónico, varía su gravedad de acuerdo a la edad del animal, generalmente moderada en becerros de hasta un año de edad; aguda, pero no fatal en animales de hasta dos años de edad; aguda y ocasionalmente fatal en bovinos de hasta tres años de edad e hiper-aguda y frecuentemente fatal en animales de tres años en adelante (Bautista, 1996). El sexo más sensible son las hembras. Al respecto, Alfaro et al, 1998, señala que en los animales machos y hembras, no se observan diferencias significativas entre los valores de sero-prevalencias. El sexo está ligado a un estado fisiológico productivo, las vacas en producción láctea tienen mayor número de garrapatas que las secas

y el stress del parto reduce las defensas del organismo, facilitando la infección o la recaída (Mora, 1993; citado por Díaz, 2003). En lo que respecta a la raza, Guglielmone, 1992, señala que la raza es un factor importante en la infección con hemoparásitos; los bovinos dedicados a la explotación de leche y sus cruces son más susceptibles que las razas tipo carne, debido a una mayor susceptibilidad de animales con genes lecheros a las garrapatas, vectores y al parásito. De la información obtenida, la mayoría de los ganaderos conoce los síntomas de la enfermedad, aunque un reducido grupo no discrimina con los síntomas de otra enfermedad hematozoaria como la Babesiosis, que también es transmitida por la garrapata; considerándose como principal vector biológico a las garrapatas; y, mecánicamente a los tábanos y agujas hipodérmicas usadas sin esterilizar, en vacunaciones masivas. La enfermedadpor lo regular es diagnosticada clínicamente y tratada por profesionales veterinarios, utilizándose de preferencia productos a base de tetraciclinas para su tratamiento; sin considerarse la toma de muestras para su diagnóstico.La morbilidad

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va de media a elevada pudiendo llegar hasta un 20 %; y la mortalidad hasta un 10 %; lo que genera elevadas pérdidas económicas al ganadero. El grado de infestación con garrapatas va de medio elevado, cuyo control se hace regularmente a través de baños garrapaticidas (amitraz, piretroides y organofosforados), y también mediante el uso de sustancias endectocidas como la ivermectina, constituyéndose el uso de estos últimos, en un problema de salud pública, toda vez que ningún ganadero respeta el tiempo de retiro de este producto en ganado lechero. Conclusiones En el cantón Yantzaza existe un alto índice de prevalencia de Anaplasmosis bovina (82,5 %), determinado por Giemsa; haciéndose necesario el empleo de técnicas más precisas y sensibles para el diagnóstico de la enfermedad, tales como Fijación de Complemento, Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), ELISA e Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Los principales mecanismos de transmisión están dados por la presencia de vectores hematófagos como las garrapatas del género Boophilus y tábanos; pero principalmente, por la trasmisión mecánica de los ganaderos al utilizar agujas hipodérmicas sin esterilizar cuando se hacen tratamientos masivos al ganado. El sexo más sensible a la enfermedad son las hembras, ya que está ligado a un estado fisiológico productivo que reduce las defensas del organismo, facilitando la infección por Anaplasmosis. La raza es un factor importante en la infección con hemoparásitos, ya que los bovinos dedicados a la explotación lechera, ya sea por su manejo y producción, son sometidos a situaciones de estrés que producen una disminución en sus defensas y por ende, el aparecimiento de la enfermedad.

En todas las fincas del cantón Yantzaza existe un 100 % de infestación con garrapatas del género Boophilus. Agradecimientos Al Laboratorio de Diagnóstico de la Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecniade la Universidad Nacional de Loja,por permitir el uso de sus instalaciones, reactivos y equipos, así como el apoyo del personal técnico, en el diagnóstico de la enfermedad.

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Estudio

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ADAPTACIÓN, MICROPROPAGACIÓN Y CONSERVACIÓN DE ORQUÍDEAS (Cattleya sp.) NATIVAS DE CLIMA TROPICAL HÚMEDO LLUVIOSO. LAMBAYEQUE – PERÚ ADAPTATION, MICROPROPAGATION AND CONSERVATION OF NATIVES ORCHIDS (Cattleya sp.) FROM HUMID RAIN TROPICAL CLIMAT. LAMBAYEQUE-PERU Villanueva A. Carlos E. 1, Arellano C. Sánchez O. 1 y Flores C. Rene 1 Laboratorio de Biotecnología y Control Integrado de Plagas (LABCIP) – Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo” Emiliano Niño 410, Lambayeque – Perú. villabal53@gmail.com 1

Resumen Las orquídeas constituyen una de las familias de plantas de mayor demanda entre las ornamentales. La explotación irracional a que son sometidas,más sus exigencias medioambientalesparasu reproduccióny desarrollonaturalhancontribuidoa quemuchas especies se encuentren amenazadas y en peligro de extinción. El Centro de Investigación en Biotecnología(CIBdelaUniversidadNacionalPedroRuizGallo,Lambayeque,Perúllevóacabo elpresenteestudiodeaclimatación,micropropagaciónyconservacióndeespeciesdeorquídeas procedentes del Departamento de San Martín ubicado en la región Nor Oriental del Perú. De su habitad natural,serecolectaronlasespeciesCattleyasimbodium,C. rexyC.máxima.Losespecímenes fueron aclimatadosen vivero y sus semillas micro propagadasen el Medio Base Murashige& Skoog(macroymicronutrientes) másvitaminas(mio-inositol100mg,piridoxinaHCL0,5mg,ac nicotínico0,5mg,ac. pantoténicodecalcio2mgytiamina0,1mg),aguadecoco100ml,azúcar20 g,agar5,6g,carbónactivo2mgporlitroapH5,5yácidogiberélico,BAP,ANA,comoreguladores de crecimiento según fase de micropropagación. Se conservaron e incubaron a condiciones de orioymedioambientalespropiosdelaregióncosteraNorEstedelDepartamentodeLambayeque, Perú. Las especiesCattleya maxima y C. rex fueron las que se adaptarona las condiciones climáticas costeras, mostrando viabilidad en la micropropagación y conservación a nivel de Laboratorio,siendoaptasparasumultiplicaciónyfactiblesdecomercialización. Palabras claves: adaptación, micropropagación, conservación, orquídeas Abstract Orchids are one of the largest plant families demanded among ornamentals. The irrational exploitation they experience over their environmental requirements for reproduction and natural development, have contributed to many species are threatened and endangered. The Biotechnology Research Center (BRC) belonging to the Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque, Peru undertook this study of acclimatization, micropropagation and conservation of species of orchids from the Department of San Martin, located at the North Eastern region of Peru. In their natural habitat the species Cattleya simbodium, C. rex and C. maxima were collected. The specimens were acclimated in nurseries and seed micro propagated in Murashige & Skoog Base Medium (macro and micronutrients) plus vitamins (100 mg myo- inositol, pyridoxine HCl 0.5 mg, 0.5 mg nicotinic acid, calcium pantothenic acid 2 mg and thiamine 0.1 mg), coconut water 100 ml, sugar 20 g, agar 5.6 g, activated carbon 2 mg per liter at pH 5.5 and gibberellic acid, BAP, NAA, as growth regulators as micropropagation phase. Plants were stored and incubated at laboratory conditions and environmental characteristic of the North East coastal region of Lambayeque. The species Cattleya maxima and C. rex were those adapted to coastal weather conditions, showing

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viability for micropropagation and conservation at laboratory level, being ready for their multiplication and marketing feasible. Keywords: Orchidsmicropropagation, conservation, adaptation, Introducción Las orquídeas constituyen una de las familias de plantas de mayor demanda entre las ornamentales. La explotación irracional a que han sido sometidas unido a sus exigencias medioambientales para su reproducción y desarrollo natural han contribuido a que muchas especies se encuentren amenazadas y en peligro de extinción. En el Perú, se distribuye una rica diversidad de orquídeas algunas restringidas al Bosque Húmedo Tropical donde su normal crecimiento en forma natural es epifita, generalmente en los departamentos de San Martín, Cajamarca, entre otros. Crecen entre los 100 y 4.600 m.s.n.m. Muchas de ellas están en peligro de extinción debido al comercio ilegal y la deforestación de su habitad. De las 30.000 especies de orquídeas, en el Perú crecen más de 3.000 repartidas en 750 géneros de orquídeas (1, 10). El Departamento de Lambayeque es una zona costera de clima cálido - seco situado a 46 m.s.n.m, con temperaturas de 15 – 28 °C y cuenta con el Laboratorio de Biotecnología y Control Integrado de Plagas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo – Lambayeque. Su misión es preservar una colección científica de plantas vivas que permita la investigación, enseñanza, difusión y su propagación a fin de contribuir a la conservación y uso sostenible de este tipo de especies en peligro de extinción como lo es la orquídeo flora silvestre de la Región Nororiental del Marañón - Perú. En este sentido el Laboratorio de Biotecnología llevó a cabo el presente estudio de adaptación, micropropagación y conservación de especies de orquídeas Cattleya sp procedentes de los Departamentos de San Martín y Cajamarca ubicados en la región Nor Oriental del Perú con la finalidad de preservar una colección de especímenes ornamentales silvestres en extinción para la

implementación y regeneración de viveros y jardines botánicos así como promover su comercialización como una actividad económica alternativa en la región. Material y métodos El estudio se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología y Control Integrado de Plagas (LABCIP) UNPRG, Lambayeque – Perú., durante el periodo del 2005 – 2012. Colecta de especímenes y cápsulas verdes conteniendo las semillas Se colectaron plantas adultas de orquídeas de las especies Cattleya simbodium y Cattleya rex provenientes de la Provincia de Tarapoto – San Martín (353 m.s.n.m ) de clima tropical húmedo lluvioso con temperaturas de 18 – 29 °C; y la especie Cattleya máxima de la Provincia de San Ignacio (940 m.s.n.m.) de clima lluvioso nublado con temperaturas de 25-32 °C.; situados en la zona Nor Oriental del Perú. Se recolectaron las semillas contenidas en cápsulas no indehiscentes y fueron transportadas para su estudio de viabilidad al Laboratorio de Biotecnología y Control Integrado de Plagas (LABCIP) ubicado en la ciudad de Lambayeque zona Nor Este del Perú, a 46 m.s.n.m, de clima semitropical húmedo escasas precipitaciones seco con temperaturas promedio de 22.5 ºC. Aclimatación de las orquídeas colectadas Las plantas adultas de orquídeas colectadas, previo tratamiento con fungicida (PROTEXIN) a base de carbendazin 511 g/L y aditivos 489 g/L, en dosis de 30 ml/20 L, fueron acondicionadas y mantenidas bajo las condiciones climáticas costeras de Lambayeque, proporcionándoles los sustratos necesarios para su adaptación a

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nivel de vivero con aplicaciones del regulador de crecimiento BIOZYME conteniendo: giberelina, 0.031g/L, auxinas 0.031g/L, citoquininas 0.083g/L en solución acuosa (1 ml/L) . Micropropagación de las semillas de orquídeas colectadas Inducción “in vitro” de la semilla y transferencia de protocormos Las cápsulas se desinfectaron con solución de acaricida (PROTEXIN) al 0.05% durante 15 minutos, luego lavadas con abundante agua. En la cámara de flujo laminar se sumergieron en alcohol etílico al 70%, 30 segundos y luego en Hipoclorito de sodio al 2.5% por 15 minutos. Se lavaron con agua destilada estéril y luego secada. Se extrajeron aprox. 1000 a 1500 semillas (0.5 y 1.20 mm de longitud) realizando dos corteslongitudinales y transversales. Las semillas de cada especie se transfirieron a 10 frascos de 350 ml en partes proporcionales conteniendo 25 ml del Medio Base Murashige & Skoog (macro y micro nutrientes) más vitaminas (mioinositol 100 mg, piridoxina HCL 0.5 mg, ac nicotínico 0.5 mg, ac. Pantotenico de calcio 2 mg y tiamina 0.1 mg), ácido giberelico 30.35 mg, agua de coco 100 ml, azúcar 20 g, agar 5.6 g, carbón activo 2 mg por litro, a pH 5.5. Se incubaron los frascos a 16 ºC con foto períodos de 16 - 8 horas luz, proporcionado por 4 fluorescentes de 40 W, equivalente a 50 μmol/m/s. Se evaluó número de semillas germinadas y tiempo de germinación. De las semillas germinadas (fase de protocormo), se seleccionaron los mejores protocormos de 3 a4 mm de diámetro y se sembraron 5 explantes por frasco conteniendo 30 ml de medio semisólido base Murashige & Skoog (concentración x 1 L) mas vitaminas (mioinositol 100 mg, piridoxina HCL 0.5 mg, ac. nicotínico 0.5 mg, ac. pantotenico de calcio 2 mg y tiamina 0.1 mg), BAP 10 mg/L, agua de coco 100 ml, azúcar 20 mg/L. Se incubó a 16 ºC con foto períodos de 16 - 8 horas luz, proporcionado por 4 fluorescentes de 40 W, equivalente a 50 μmol/m/s. Se evaluó el crecimiento de los protocormos y

tiempo de crecimiento Multiplicación y enraizamiento de plántulas La multiplicación se inició de las plántulas resultantes, tomando yemas terminales y laterales (explantes) sembrando por separado en frascos con 30 ml de Medio Base Murashige & Skoog (concentración x 1 L), mas vitaminas, agar, agua de coco, azúcar, BAP, ANA, CA a pH 5.6. Se evaluó el crecimiento de los explantes y tiempo de crecimiento. Luego fueron conservadas “in vitro” en medio de mantenimiento y aclimatadas en invernadero. Mantenimiento de las plántulas Los mejores plántulas multiplicadas (yemas terminales) se transfirieron al Medio Base Murashige & Skoog (concentración x 1 L) más vitaminas, agua de coco, extracto de malta, agar, azúcar, CA a pH. 5.5 para el mantenimiento de las plántulas por periodos largos (1 - 2 años). Resultados Aclimatación de las orquídeas colectadas De las tres especies colectadas, se aclimataron a las condiciones climáticas costeras de la ciudad de Lambayeque – Perú las especies Cattleya máxima y Cattleya rex a nivel de vivero (Fig. 1 y 2) presentando floración bianual y manteniendo su viabilidad en su condición nativa durante 7 años consecutivos. La especie Cattleya máxima presentó un mayor periodo de floración de aproximadamente 60 días sin formación de cápsulas conteniendo semillas debido a la ausencia de condiciones favorables para la polinización. (Figura 3 y 4).

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Figura 1. Especie de Orquídea Cattleya máxima adaptada en ambiente de costa Lambayeque -Perú

Figura 2. Especie de Orquídea Cattleya rex sdaptada en ambiente de costa Lambayeque -Perú

Figura 3. Floración de Orquídea Cattleya Figura 4. Floración de Orquídea Cattleya rex máxima en ambiente de costa. Lambayeque en ambiente de costa. Lambayeque - Perú. -Perú.

Micropropagación de las semillas La germinación de las semillas se consideró al observar que los embriones rompieron la testa. Para la especie Cattleya máxima se obtuvo un promedio de 150 semillas germinadas / cm2 y el crecimiento de los protocormos alcanzó una altura de 5 a6 cm. Las plántulas de Cattleya máximapresentaron una mejor multiplicación, crecimiento, enraizamiento y número de brotes a los 6 meses (Cuadro 1 y 2).

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Se han logrado establecer las mejores condiciones para la micropropagación “in vitro”de solo dos especies bajo estudio. De manera general el empleo del Medio Base Murashige & Skoog con los reguladores de crecimiento gliberelina, BAP y ANA favorecieron la inducción “in vitro” de la semillas, crecimiento de los protocormos, multiplicación y enraizamiento de plántulas de las especies de Cattleya máxima y Cattleya rex respectivamente. Por lo que la sobrevivencia “in vitro” al parecer estuvo influenciada por el medio de cultivo; es decir, las plántulas obtenidas a partir de medio de cultivo MS presentaron porcentajes de germinación del 15 % en Cattleya, máxima y 10 % en Cattleya rex Mantenimiento de las plántulas de orquídeas C. máxima y C. rex Los mejores plántulas multiplicadas (yemas terminales) se lograron conservar “in vitro” demostrando su efectividad para el mantenimiento de orquídeas durante periodos largos (1 - 2 años) en el Medio Base Murashige & Skoog (concentración x 1 L) mas vitaminas, agua de coco, extracto de malta, agar, azúcar, CA a pH. 5.5. (Fig, 5, 6, 7, 8 y 9)

Figura 5. Orquídea Catleya máxima conser- Figura 6. Orquídea Catleya rex conservada vada “in vitro”. 17 /02/2011. Lambayeque “in vitro”. 17 /02/2011. Lambayeque -Perú. -Perú.

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Figura 7. Conservación de orquídeas Cattleya máxima y Cattleya rex “in vitro”. 17 /02/2011. Lambayeque -Perú.

Figura 8. Banco de germoplasma de orquídeas Lambayeque -Perú.

Figura 9. Banco de germoplasma de orquídeas Lambayeque –Perú.

Discusión El presente estudio demuestra la alta capacidad de adaptación de las especies de orquídeas estudiadas en ambientes diferentes a su nicho ecológico propio de clima húmedo tropical lluvioso de la selva norperuana. La ciudad de Lambayeque no tiene flora autóctona de orquídeas pero se demuestra que tiene factores climáticos que permiten la adaptación con floración subsiguiente de especies de orquídeas que se constituyen en un potencial ornamental innovativo para su producción y comercialización industrial en la ciudad costera de Lambayeque. El haber logrado establecer protocolos de cultivo “in vitro” de dos de las 3 especies estudiadas, con alto potencial ornamental, es una de las principales aportaciones del presente trabajo, además

de ofrecer una alternativa económica real de este recurso poco explotado y crear conciencia sobre la importancia de mantener y cuidar los ecosistemas que albergan esta riqueza. Es conocido que el empleo de la micropropagación de especies, tales como las orquídeas, representa uno de los medios más efectivos para conservar y salvaguardar las poblaciones silvestres, por lo que el desarrollo de paquetes tecnológicos, que puedan ser adoptados por horticultores, comunidades organizadas e interesadas en la explotación racional de sus recursos, contribuye directamente a su conservación, disminuyendo en gran medida la presión de colecta de poblaciones silvestres (Koopowitz 1996).

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Conclusiones Las especies de orquídeas Cattleya máxima y Cattleya rex fueron las que se adaptaron a las condiciones climáticas costeras de la ciudad de Lambayeque – Perú, mostrando viabilidad en la micropropagación y conservación a nivel de Laboratorio siendo aptas para su multiplicación masiva y factibles de comercialización. Referencias bibliográficas UNALAM. 2012. Centro de Datos para la Conservación – Universidad Nacional Agraria - La Molina. http://cdc.lamolina.edu. pe/Quienes_Somos/cdcunalm.htm. Espejo, S.A., C.J. García, F.A.R. López, M.R. Jiménez y S.L. Sánchez. 2002. Orquídeas de Morelos. Herbario AMO y Universidad Autónoma MetropolitanaIztapalapa. México. 315 p.152 LANKESTERIANA Nº 7. Hágsater E. & M.A. Soto Arenas. 2001. Orchid conservation in Mexico. In W.E. Higgins y Walsh (eds.), Orchid Conservation Proceedings, Selby Botanical Gardens Press, Sarasota. p. 18-22. Knudson L. 1946. A new nutrient solution for germination of orchid seed. Amer. Orch. Soc. Bull. 15: 214 – 217. Koopowitz H. 1996. Conservation Strategy. In E. Hágsater y V. Dumont (eds.), Orchids– Status Survey and Consevation Action Plan. IUCN, Gland, Switzerland and Cambridge, UK. 11-47. Mejía Rubino. 1994. Propagación Comercial 312 especies de plantas por cultivo in vitro. INIA. Soto A., M.A. 1994. Listado actualizado de las orquídeas de México. Orquídea (Méx) 11: 233-277. Salazar V. R. & Mata M. R. 2003. Micropropagación y conservación de orquídeas Mexicanas en el Jardín Botánico Clavijero. Lankesteriana 7: 151-153. 2003. Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero, Instituto de Ecología, A.C. México. Sagawa Y., J. T. Kunisaki. 1982. Clonal propagation of orchids by tissue culture. Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue & Cell

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ARTICULOS DE REVISION CARACTERÍSTICAS A SELECCIONAR EN BOVINOS TIPO LECHE PARA LAS GANADERÍAS DE LA REGIÓN SUR DEL ECUADOR CHARACTERISTICS TO SELECT IN DAIRY CATTLE FOR LIFESTOCK IN SOUTHERN REGION OF ECUADOR Lenin Aguirre Riofrio1 Docente-Investigador. Centro de Biotecnología Reproductiva Animal CEBIREA-UNL. leninaguirrer@yahoo.es 1

Resumen El presente artículo, recopila las experiencias y prácticas profesionales que el autor posee dentro del campo de la ganadería bovina en la Región Sur del Ecuador y tiene el objetivo de servir de guía en la selección de características fenotípicas a considerar en programas de mejoramiento genético para nuestra región. Estas experiencias nos permiten disponer de animales funcionales para nuestro agroecosistema, con rendimientos productivos acordes al sistema de manejo al pastoreo que se emplea y produciendo leche de calidad, donde la longevidad, productividad y calidad de lo producido, sean las características de nuestra población. Para ello el ir considerando en un proceso de selección paulatino, uno, varios o todos los aspectos señalados y analizados, nos permitirá en un corto plazo alcanzar los objetivos y meta señalados y contar con un eco tipo especial para la producción de leche en nuestra Región Sur del Ecuador. Palabras claves: bovinos de leche, selección fenotípica, mejoramiento genético, Sur del Ecuador. Abstract This articlecompilesthe experiencesand professional practicesin bovine husbandry at Southern Region ofEcuadorandintended toprovide guidancein the selection ofphenotypic characteristicsto be considered inbreeding programsfor ourregion.These experiencesallow us to havefunctionalanimals for ouragroecosystem, withconsistent yields according to the managementsystemthat usedfor grazingand producingquality milk, where longevity, productivity and quality of the produced, will be the characteristicsof our population. For that propose togoingconsideringagradualselection process, one, several orall the points raisedand analyzed,will allow us in a shorttermachieve the objectives andidentified goals andto have aspecialmilk productionecotypein our SouthernRegion ofEcuador. Key words: dairy cattle, phenotypic selection, breeding, Southern Ecuador

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Introducción La Región Sur del Ecuador y concretamente la Provincia de Loja, presenta características topográficas y geográficas particulares que la hacen distinta del resto de regiones del país, las ganaderías en su mayoría poseen suelos con una topografía entre ondulada e irregular lo que dificulta la disponibilidad de riego, esto sumado a que poseen suelos con un Ph ácido, hace que las pasturas y cultivos estén supeditados al agua de lluvia para su crecimiento y utilización, a más de esto las escasas labores culturales que se llevan como: fertilización, limpieza, dispersión de heces, una elevada carga animal y menor capacidad receptiva, ha traído consigo escasa biomasa forrajera y degradación paulatina de las pasturas. En este panorama tienen que vivir y producir los bovinos en Loja.Como vemos es un ambiente totalmente distinto a lo que sucede a nivel del resto del país y de las regiones de donde proviene el material genético (semen) que importamos (EE UU, Canadá, Europa, New Zelanda, etc.). Ante ello debemos los técnicos y ganaderos, seleccionar animales o ir mejorando genéticamente los mismos, capaz de disponer de individuos que soporten dicho ambiente y rindan un mejor perfomance y longevidad; por ello propongo tomar en consideración algunos aspectos que nos permitirán ir de a poco disponiendo de un eco tipo bovino ideal para nuestras zonas agroecológicas, el orden de estos aspectos no son indicativo de mayor o menor importancia, pues todos ellos van a contribuir al objetivo señalado. Aspectos a considerar para un bovino ideal para la Región Sur del Ecuador Color del pelaje Este aspecto influye en el perfomance del animal, pues el pelaje negro (Holstein manto negro) en climas cálido húmedo y/o seco, como es el caso de Zamora y parte baja de la provincia de Loja, actúa como

una “esponja” que absorbe el calor solar que sumado al calor ambiental, provoca y en esto lo corrobora De Alba (2009) y Mellado, M. (1995), un estrés o golpe de calor, disminuyendo el consumo de alimento en las horas pico del día y aumentando la incidencia de ectoparásitos con una mayor utilización de sustancias químicas (residuales en la leche) para el control de los mismos. En la parte alta o sierra el manto blanco o claro en los animales, actúa como un espejo que refracta y “quema” (no absorbe), trayendo consigo problemas de piel, animales más susceptibles a problemas respiratorios; a esto hay que considerar en ambos casos que el color del manto influye directamente en la calidad de la leche, por la particularidad de la piel de sintetizar la LipoVitamina D por acción de los rayos solares. También vale señalar los estudios realizados sobre este aspecto por King et al. (1988), Hansen, P.J. (1990) y Becerril et al. (1993), quienes manifiestan que en el subtrópico, vacas de manto claro mantenidas sin sombra produjeron más leche, tuvieron menos días abiertos y servicios por concepción que vacas compañeras de hato de manto predominantemente negro. Por ello la recomendación sería: seleccionar o introducir animales o razas de pelaje claro para el trópico bajo y de pelaje negro u obscuro para la sierra. Angularidad vs Fortaleza Por la experiencia y estudios se ha probado que las vacas lecheras son angulosas y de pecho estrecho (figura 1), siendo más propensas a enfermedades metabólicas e infecciosas, porque ellas sacrifican condición corporal por producción, trayendo consigo problemas reproductivos e incluso una supervivencia o longevidad deprimida. Concuerdo con lo manifestado por Jaramillo A. (2004), de que las vacas angulosas son “buenas” para condiciones de estabulación o semiestabulación donde el alimento y la mayoría de lo que necesitan en requerimientos es dada en el corral o establo, por lo que su condición corporal

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no desmejora o se recupera rápidamente. En nuestra región donde el manejo es al pastoreo en sus diversas formas, debemos seleccionar animales más “fuertes” de pecho ancho (figura 1) y profundo (figura 2), sin mucho carácter lechero, un animal doble propósito, pues estos no sacrifican excesivamente su condición corporal para

poder producir o la misma no baja tanto o se recupera más rápidamente, pero hay que considerar que si no se les da de comer bien tampoco producirán leche, pues estos animales que fenotípicamente son más rústicos van a sacrificar muy poco su condición corporal por la producción.

Figura 1. Pecho o fortaleza en el animal; de izq. A der.: estrecho, intermedio y ancho.

Figura 2. Profundidad en el animal de izq. A der.: poco profundo, intermedio y profundo. Resumiendo este aspecto para nuestro medio, las vacas que tienen todas las características lecheras (angulosas), son más propensas a enfermedades, problemas reproductivos y menos probabilidades de durar que sus compañeras de hato más fornidas y otro punto a considerar es que un animal con fortaleza es útil en la tracción animal en zonas donde la mecanización del suelo no es posible por diversas causas. Estatura Según Almeyda, 2005 y citado por Vargas, se considera un animal grande, aquel que supera los 135 cm de altura a la cruz o a la grupa (tuberosidades ileacas, figura 3), este tipo de animal necesita de un mayor consumo de alimento y de requerimientos, pues hay una correlación genética positiva y alta entre la estatura y consumo de alimento

(Veerkamp, 1996), que para las condiciones nuestras van a tardar más tiempo en alcanzar la madurez física para la reproducción, mantener su condición corporal y producir una cría al año, también hay que considerar que los potreros o invernas deben soportar un mayor peso y dadas las condiciones de pastoreo extensivo y topografía del terreno, se va a tender a una mayor compactación del suelo y erosión progresiva.

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También en este punto vale señalar lo manifestado por Hansen, et al. (1999), que las vacas pesadas son menos longevas que las livianas, siendo los problemas podales la principal causa de descarte.

Figura 3. Altura del animal a la grapa

En este aspecto la recomendación sería seleccionar animales de estatura intermedia (130 – 135 cm) o pequeña (<125 cm) ó si seleccionamos toros para inseminación artificial (IA), que su Habilidad de Trasmisión Predicha (HTP Tipo), sea negativo para estatura. Esto es muy importante considerar si estamos trabajando con vacas pequeñas o vacunas para evitar partos distócicos. Sistema mamario El sistema mamario está dado por la ubre y es sin duda la parte más importante de la vaca de leche para el ganadero, por tanto se debe poner especial énfasis en ir mejorando paulatinamente los aspectos negativos, en cuanto a profundidad, inserción y altura posterior, inserción anterior, tamaño y posición de los pezones, anchura de la ubre, presencia de ligamento intermedio;

se tiene que evaluar cada uno de estos componentes y determinar cuál de ellos es deficiente y merece ser mejorado, para sobre esa base seleccionar toros que vayan a mejorar dichas características. Pues vacas con ubres descolgadas, muy profundas y de pezones largos tienden a tener una vida productiva corta, pues son más predisponentes a infecciones, laceraciones y pérdida de cuartos (Pérez I. 1998).

Figura 4. Inserción anterior de la ubre; de izq. a der.: corta, intermedia y adelante

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Figura 5. Altura o inserción posterior de la ubre; de izq. a der.: baja, intermedia y alta.

Figura 6. Ligamento suspensorio intermedio de izq. a der.: débil notorio y fuerte. Dadas las condiciones de pastoreo y topografía irregular de nuestros terrenos y en donde el animal tiene que saltar y caminar bastante diariamente, debemos buscar ubres poco profundas (máximo a nivel de corvejones, figura 7), altas y anchas en su parte posterior (mayor almacenamiento de leche, figuras 5), con una inserción anterior fuerte y lo más adelante posible (hacia el vientre, figura 4), lo que evitará que la ubre se mueva como péndulo cuando camina, un ligamento intermedio bastante notorio y que divide longitudinalmente a la ubre en dos partes (figura 6) y que va a ayudar a sostener a la misma y finalmente los pezones que deben ser pigmentados (negros) para resistir mejor las heladas del medio y no muy largos (no más de 6 cm).

Figura 7. Profundidad de la ubre; de izq. a der.: profunda, normal y poco profunda

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Animales con buenas patas y pezuñas Esto es indudable, pues nuestros animales deben caminar mucho y por terrenos pedregosos, rocosos, con lastre, fangosos con material orgánico en descomposición y si a esto se suma que sean animales pesados; las pezuñas de los mismos serán más predisponentes a laceraciones e infecciones que afectan en mayor o menor medida la producción, reproducción y longevidad

del animal. Por ello la recomendación con respecto a esto sería: poner un mayor énfasis en observar la posición de las patas traseras pues éstas son las que soportan el peso de la ubre y ayudarán a una mayor o menor movilidad y manifestación de celos (montar y dejarse montar). Por tanto vistas de atrás las patas traseras deben ser rectas y abiertas para permitir un mayor espacio para la ubre (figura 8).

Figura 8. Patas vistas de atrás; de izq. a der.: Cerrada de corvejones (patizamba), Intermedia, Patas rectas y abiertas (ideales) Vistas lateralmente y guiándose en la figura 9, se debe preferir animales que sean parados de garrones antes que sentados o dicho de otra forma, que sean corto de cuartillas antes que largos de cuartillas, pues el defecto segundo en ambos casos provoca que los animales se desplacen pisando con los talones, el cual posee tejido blando, que ante terrenos duros o húmedos van a provocar lo ya manifestado anteriormente.

Figura 9. Patas vistas lateral; de izq. a der.: Parada de garrones o nudos, posición deseable, sentada de garrones ó nudos

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Seleccionar animales que posean pezuñas pigmentadas (negras), pues éstas son más resistente a la humedad y dureza del terreno. La característica conformación de patas y pezuñas tiene una heredabilidad baja, por tanto el mejoramiento de la misma no es de una generación a otra, sino debe ser un proceso continuo y permanente y si estamos trabajando con inseminación debemos buscar toros positivos (>1,5) para esta característica. Producción de leche en niveles no muy altos Es una práctica muy común el querer incrementar la producción, importando material genético (animales o semen), sin considerar que la genética apenas aporta entre el 20 y 30% de la productividad y es el 70% restante, dado por la alimentación, manejo y ambiente a lo que hay que darle un mayor énfasis. Ante ello lo primero es mejorar el ambiente en donde se o van a desenvolver nuestros animales y siendo la alimentación el factor más importante de la producción, es donde se debe enfocar los esfuerzos y considerando que el pasto es el alimento más barato, se le debe dar un especial cuidado y manejo, para que el animal coma diariamente la cantidad que necesita (10% del peso vivo) y que la capacidad receptiva siempre sea mayor que la carga animal existente, lo que equilibraría algún desfase de escases por cambios medioambientales inesperados. De acuerdo a lo manifestado por Rosero, J. Et Al (2005), en pasturas de clima templado, como es en nuestro medio, una vaca comiendo la cantidad requerida de los pastos existentes, está en capacidad de producir entre 3000 y 4500 kg/lactancia (10 a 15 ltr/día), sobre esos niveles productivos si se requiere una sobrealimentación. Si consideramos que vacas de alta producción y con poca disponibilidad de pasto, no van a manifestar todo su potencial lechero o el mismo van a tratar de manifestarlo a costa de su CC. La recomendación sería disponer de vacas con producciones en los rangos

antes señalados o si se dispone de animales de baja calidad genética, seleccionar toros con niveles de producción de leche no muy altos, HTPMilk, no mayor a 1200 lb, esto nos llevará a tener con el tiempo animales con un potencial genético de nivel moderado, balanceado para el medio y que pueda llenar los requerimientos en base a pastoreo. Sobre este punto, vale señalar lo manifestado por Marini et al. (2011) de que no hay asociación entre la estatura y la producción, por tanto el escoger animales grandes no es una garantía de buena producción. Sólidos totales en la leche (grasa y proteína) Otro aspecto que debemos considerar al seleccionar animales para tal o cual medio, surgirá al formular la siguiente pregunta: ¿Cuál es el objetivo productivo que persigue tal ganadería o zona en particular?; a partir de aquí, surgirán otras inquietudes: vamos a vender directamente la leche y si es así, nos están pagando en base a la calidad?; o vamos a procesar y producir productos derivados de la leche, como el yogurt, queso, quesillo, mantequilla, etc. Esto nos permitirá seleccionar animales que produzcan leche con altos o bajos % de sólidos de acuerdo al objetivo productivo y se puede mejorar la calidad de la leche a más de considerar el color del pelaje (punto 1), seleccionando toros positivos en grasa y proteína (HTP Producción) y que al ser características de heredabilidad media (0,25 a 0,3), su mejoramiento será notorio desde la primera generación. Así mismo hay que tener presente que las características grasa y proteína de la leche, tienen una correlación negativa con la producción de leche, es decir si se mejora los niveles productivos, la calidad de la leche va a disminuir (Bowman, J. 1983). Consideraciones finales Se puede decir que los objetivos de la ganadería en la Región Sur del Ecuador, debe ser el disponer de animales funcionales

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para nuestro medio, con rendimientos productivos acordes al sistema de manejo empleado y produciendo leche de calidad; de tal manera que podamos ir alcanzando la meta planteada al inicio del presente artículo, que es el de contar con un eco tipo especial para nuestro agro ecosistema, en donde la longevidad, productividad y calidad de lo producido, sean las características de nuestra población y para ello el ir considerando en un proceso de selección paulatino, uno, varios o todos los aspectos señalados y analizados, nos permitirá en un corto plazo alcanzar los objetivos y meta señalados. Referencias bibliográficas Becerril, C; Wilcox, C; Lawlor, T; Wiggans, G and Webb, D. 1993. Effect of percentage of whitw color on Holstein productionand reproduction in a subtropical environment. Journal Dairy Science; 76: 2286-2291. Bowman J. 1983. An Introduction to Animal Breeding. Editorial Edagricole. Bologna, Italia. 21-22. De Alba M.J. 2009. El libro de los bovinos criollos de América. Ed. Papiro Omega S.A. México. 425. Hansen, L. B., Cole, J.B., Marx, G.D. and Seykora, A.J. 1999. Longevity of Holstein cows bred to be large versus small for body size. Adv. Dairy Technol., 11: 3949. Hansen, P.J. 1990. Effect of coat color on physiological responses to solar radiation in Holsteins. Vet. Rec. 127: 333-334. Jaramillo A. 2004. Características deseables en un toro, para la ganadería de la sierra ecuatoriana. Revista Razas Lecheras Nº 16: 41-43. King,V; Denise, S; Armstrong, D; Torabi, M and Wiersma, F. 1988. Effect of a hot climate on the performance of first lactation Holstein cows grouped by coat color. Journal Dairy Science. 71: 1093-1096. Marini, P; Charmandarian, A; Krupick, M y Di Masso, R. 2011. Altura a la cadera e indicadores productivos y reproductivos en vacas lecheras en pastoreo. Rev. Archivos de Zootecnia. 60 (232): 1181-1189. Mellado, M. 1995. Respuesta fisiológica,

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INFORME DE PROYECTOS CONSERVACIÓN EX SITU DE RECURSOS FITOGENÉTICOS DE LEGUMINOSAS DE LA ZONA 7 DEL ECUADOR EX SITU CONSERVATION OF LEGUMES PLANT GENETIC RESOURCES OF ZONE 7 IN ECUADOR Aníbal Ruiz–Sánchez1* y Franco Loján-Labanda1 Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa. Loja, Ecuador. agroruiz1@yahoo.com. franco.lojan@hotmail.com 1

Resumen El proyecto se enmarca en garantizar la sobrevivencia del recurso fitogenético de leguminosas de la zona 7 del Ecuador, con miras a desarrollar investigación en la Universidad Nacional de Loja. El problema identificado es la pérdida de un gran potencial de genes necesarios para emprender con programas de mejora genética, ocasionado por el aumento masivo de monocultivos y acompañado por el uso excesivo de agroquímicos, lo que genera erosión genética de especies autóctonas tanto silvestres como cultivadas. La metodología empleada básicamente se centra en el equipamiento del banco tanto en infraestructura, equipos e instrumental; requeridos para un óptimo manejo del germoplasma; así también la colecta de nuevos materiales, caracterización morfológica, empacado, codificación, almacenamiento a bajas temperaturas -15°c y generación de base de datos. Entre los resultados obtenidos hasta la fecha se encuentra la consolidación de un nuevo banco de germoplasma de leguminosas, con accesiones entre el 7 y 10% de humedad y con rangos mayores al 50% de viabilidad. En conclusión se viene trabajando en la sistematización de los recursos filogenéticos para una adecuada conservación ex situ. Palabras clave: Recurso fitogenético; erosión genética; conservación ex situ; Abstract The project is part of ensuring the survival of the legume plant genetic resource zone 7 of Ecuador, in order to develop research in the National University of Loja. The problem identified is the potential loss of a gene required to undertake breeding programs, caused by the massive increase in monocultures and accompanied by excessive use of agrochemicals, leading to genetic erosion of native species both wild and cultivated. The methodology basically focuses on the bank’s equipment both in infrastructure, equipment and instrumentation; required for optimal germplasm management, so the collection of new material, morphological, packaging, encoding, storage at low temperatures -15 ° c database generation. Among the results obtained to date is the consolidation of a new legume germplasm bank, with accessions between 7 and 10% humidity ranges and with greater than 50% viability. In conclusion, it has been working on the systematization of plant genetic resources for adequate ex situ conservation. Key words:genetic resources, genetic erosion, conservation exsitu

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Introducción La Universidad Nacional de Loja, comprometida con la investigación científica, formación profesional y al desarrollo y transferencia de nuevas tecnologías, se ve en la obligación de generar propuestas orientadas a resolver los problemas de la biodiversidad de la zona 7 del Ecuador; mediante la consolidación de un Banco de Germoplasma de leguminosas que almacene un promedio de cuatro variedades diferentes de cada especie. El proyecto se enmarca en el establecimiento de un Banco de Germoplasma con infraestructura y equipamiento adecuado para el tratamiento y almacenamiento de semillas ortodoxas colectadas en la zona 7 del Ecuador; así como también la evaluación y generación de información de los materiales colectados. La propuesta está encaminada a la tecnificación de los Recursos Filogenéticos en la Universidad Nacional de Loja, partiendo con el rescate de las accesiones del antiguo Banco de Germoplasma para el almacenamiento y conservación a bajas temperaturas, que permita disponer de semillas con características de elevados porcentajes de viabilidad, contenidos de humedad entre el 7 y 10% y libre de agentes patógenos. Con este proyecto se pretende el fortalecimiento del Banco de Germoplasma de la Universidad Nacional de Loja, que a su vez sea un referente de colecciones de leguminosas autóctonas y el epicentro de la investigación biotecnológica; a través del uso de estos materiales con miras a solucionar los problemas alimentarios de la población. El objetivo propuesto es “Establecer un Banco de Germoplasma de Leguminosas para la Universidad Nacional de Loja”.

Materiales y Métodos Materiales Materiales de Laboratorio - - - - - - - - - - - - - -

Cámaras frías -15ºC Estereoscopio Balanza de precisión Estufa Medidores de humedad Calibradores Termohigrometros Estación climática portátil Vidriería Instrumental de laboratorio Cajas plásticas Bolsas aluminadas y metalizadas Máquina selladora de bolsas Etiquetas

- Materiales de campo - Invernaderos - Sistemas de riego por goteo nebulización - Desbrozadora - Motobomba fumigadora - Herramientas de mano - Biofertilizantes - Formatos de colecta - Descriptores agromorfológicos

Metodología La metodología básicamente se centró en dos parámetros fundamentales: - El mejoramiento de la infraestructura como invernaderos y sistemas de riego necesarios para actividades de regeneración de semillas; a esto se suma el equipamiento detallado en la sección de materiales, y que se ubica en las instalaciones del Centro de Biotecnología. - La identificación y valoración técnica de las accesiones de leguminosas del Banco antiguo de Germoplasma, iniciando con un inventario global del número real de accesiones almacenadas y sus duplicados. Seguidamente pruebas de germinación y humedad con el fin de determinar la viabilidad del material para su uso posterior, a esto se suma una

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nueva clasificación, recodificación y almacenamiento del material germoplásmico viable. Resultados - Considerando que un Banco de Germoplasma requiere de infraestructura adecuada para el almacenamiento de las semillas; al respecto se logró la readecuación de espacios logísticos del Banco de Germoplasma; entre ellos, cambio de cubierta, puntos de luz y toma de agua (ver anexo 1). Montaje de invernadero de plástico destinado para actividades de experimentación y regeneración de semillas ortodoxas (ver anexo 2). Sistemas de riego por nebulización con fines de propagación de especies vegetativas a través de semilleros (ver anexo 3). Cámaras frías a -15ºc para el almacenamiento de las accesiones (ver anexo 4). - En cuanto al manejo del germoplasma se efectuó un inventario global de las accesiones de leguminosas del antiguo Banco de Germoplasma, en el mismo se identificaron replicaciones de cada una de ellas (ver cuadro 1 y anexo 5). - Cuadro 1. Número real de accesiones por género GÉNERO Phaseolus Dolichus Arachis Vicia Pisum Glycine TOTAL

TOTAL INVENTARIO

TOTAL DUPLICACIÓN

2344 80 263 25 6 9 2727

2163 58 221 21 4 3 2470

TOTAL REAL ACCESIONE 181 22 42 4 2 6 257

Fuente: Inventario 2011-Banco de germoplasma Se efectuaron pruebas de germinaciòn en laboratorio de los géneros Phaseolus, Dolichus y Arachis; el objetivo determinar el porcentaje de viavilidad del material para actividades de refrescamiento en una segunda etapa (Figura 1).

Figura 1. Porcentajes de viabilidad de los géneros Phaseolus, Dolichus y Arachis.

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Se realizó la medición de los porcentajes de humedad de los géneros Phaseolus, Pisum y Vicia; el fin establecer el contenido de humedad de las semillas para el almacenamiento (Figura 2).

Figura 2. Porcentajes de humedad de los géneros Phaseolus, Pisum y Vicia. Se clasificó y recodificó todas las colecciones de leguminosas, utilizando el código institucional (UNL-0000); así mismo se procedió con un nuevo sistema de empacado de accesiones viables; que consistió en la utilización de bolsas de aluminio y metalizadas, las mismas que no permiten el paso de la humedad a la semilla. Se empacó al vacío un promedio de 50 a 100 semillas por accesión (ver anexo 8); adicional a esto el etiquetado y ubicación en gavetas plásticas para el ingreso a cámara fría (ver anexo 9 y 10). Discusión - En relación al cuadro 1 se puede evidenciar que la colección de Phaseolus es la más numerosa y con un número mayor de replicaciones de 2163, para esto fue necesario la unificación inmediata del material. - En la figura 1 se observa que la colección de Phaseolus se encuentra en un promedio de 51% de viabilidad, lo que nos indica que debe ser sometida a refrescamiento para la obtención de nueva semilla; de igual manera se identifica un 0,0% de viabilidad para la colección de Arachis, misma que en base a los resultados obtenidos debe ser dada de baja. - Según Tapia et al., (2008), los porcentajes de humedad de las semillas para el almacenamiento a bajas temperaturas, deben fluctuar entre un 7 y 10%. En la figura 2 se ilustra que la colección de Pisum se encuentra en un 12,9%, lo que significa que debe reducirse el porcentaje hasta un 2,9% para ajustarse a lo recomendado. No obstante la colección de Vicia se encuentra en un rango óptimo de 7,7% de humedad que puede ser almacenada a bajas temperaturas. - El sistema de empaco de las accesiones para una adecuada conservación es de suma importancia; en la actualidad nos encontramos en un proceso de transición, pasando del viejo sistema de empacado en frascos de vidrio al nuevo sistema en bolsas de aluminio y sobre gavetas plásticas.

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Conclusiones El Banco de Germoplasma en la actualidad dispone de un total de 257 accesiones, entre ellos los géneros Phaseolus, Dolichus, Arachis, Vicia, Pisum y Glycine. La viabilidad de las accesiones en su totalidad es baja, debido a deficientes sistemas de conservación implementados en tiempos anteriores que generan periodos cortos de vida de las mismas. Hasta el momento se ha logrado rescatar un 60% del total de la colección de leguminosas, mediante protocolos para semillas ortodoxas tomados del IPGRI, actualmente Bioversity International. Agradecimientos Al Dr. Rómulo ChavesPh.D. Director del Centro de Biotecnología en el año 2011, quien apoyó en la gestión del mejoramiento de la infraestructura del Banco. Al Dr. César Tapia Ph.D. Líder del Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos del INIAP, quien asesoró en la parte de equipamiento y metodologías de trabajo. A los Ingenieros Marlon Pineda e Iván Granda, quienes apoyaron con la ejecución inventario global del Banco. Referencias bibliográficas FAO. 2007. La comisión de recursos genéticos para la alimentación y la agricultura. FAO. 2010. Segundo Informe sobre el estado de los Recursos Fitogenéticos para la alimentación y la agricultura en el mundo. 402p. INIA. 2001. Introducción a la colecta de germoplasma. 25p. Jaramillo, S; Baena, M. 2000. Conservación ex situ de Recursos Fitogenéticos. IPGRI – España. 105p.

Kameswara, N; Hanson, J.; et.al. 2007. Manual para el Manejo de semillas en Bancos de Germoplasma. Bioversity International. Roma - Italia. 167p. Leipzig, 1996. Biodiversidad en Ecuador. Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias. QuitoEcuador. 137p. Martin, I. Conservación de Fitogenéticos. Centro de Fitogenéticos (CRF) – Instituto de Investigaciones y Tecnología Alimenticia (INIA).

Recursos Recursos Nacional Agraria y

Pérez, M. Recursos Fitogenéticos. Área de Genética, fac. de biología y E.S. y T. de Ing. Agraria, Universidad de León. PROCISUR. 2010. Estrategia en los Recursos Fitogenéticos para los países del Cono Sur. 162p. Rodríguez, C. 2009. Conservación y Producción de Recursos Fitogenéticos – Maestría en Agricultura sostenible. Universidad de las Villas. Cuba. Tapia, C.; Zambrano, E.; Monteros, A. 2008. Estado de los recursos Fitogenéticos para la Agricultura y la Alimentación en Ecuador. INIAP. Quito – Ecuador. 101p.

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Anexos:

Anexo 1. Infraestructura del Banco de Germoplasma

Anexo 6. Pruebas de germinación

Anexo 2. Montaje Invernadero

Anexo 7. Pruebas de humedad

Anexo 3. Sistema de Riego nebulización

Anexo 8. Empacado

Anexo 4. Cámaras frías

Anexo 9. Etiquetado

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Anexo 5. Replicaciones

Anexo 10. Ubicación en gavetas plásticas

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES Los manuscritos serán enviados, vía correo electrónico al Editor Responsable de la Revista Centro de Biotecnología (titoflaco@yahoo.com). El formato para la escritura de los artículos será en el editor de texto Microsoft Word, letra Arial 12 puntos normal e interlineado 1.15 y párrafos justificados. La extensión de los artículos serán máximo de 15 páginas para artículos de investigación y 20 páginas para los artículos de revisión, informes y reportes, incluyendo imágenes, cuadros y figuras. Una vez recibido el manuscrito se realizará acuse de recibo vía electrónica por parte del Editor Responsable. El arbitraje se basará en el sistema doble a ciegas, el cual consiste en la evaluación del manuscrito por dos árbitros nacionales o extranjeros altamente calificados. Terminado el proceso de arbitraje se dará a conocer a los autores el resultado de la valoración del manuscrito. Estructura de los manuscritos Título: Debe identificar al trabajo que se presenta en forma precisa, breve y reflejar el contenido del artículo en un máximo de 15 palabras.No debe contener abreviaturas, fórmulas, jerga ni siglas. Autor (es) y afiliación: Se escribirán los nombres y apellidos de los autores completos, excluyéndose los grados académicos o científicos. Si hay dos o más autores, se separan por “,” y el nombre del segundo o del último autor, respectivamente, debe estar separado por la letra “y”. Debe mencionarse la institución, país y dirección electrónica de todos los autores. Se debe marcar el autor para correspondencia con el símbolo “*”, indicando después de los autores el respectivo superíndice. Resumen y Abstract: Cada artículo contará con un resumen en idioma español y un Abastract en idioma inglés. Estos deben hacerse en forma de bloque y No deben exceder las 250 palabras. Palabras claves y Key words: Al final del Resumen y del Abstract, seguido de un espacio, debe indicarse las Palabras Claves o Key Words respectivamente. Estas no deben exceder de 7 palabras únicas, evitando que estén contenidas en el título. Se dispondrán alfabéticamente. Las partes del manuscrito para artículos de investigación estarán conformadas por:Introducción, Materiales y métodos, Resultados, Discusión, Conclusiones,

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Agradecimientos y Referencias bibliográficas. Para artículos de revisión, informes y reportes estarán conformadas por: Introducción y encabezados definidos y organizados por los autores de acuerdo a los objetivos y contenidos del trabajo. Requisitos a tener en cuenta para redactar las referencias bibliográficas Se utilizará el estilo APA 16th de los gestores de referencias bibliográficas EndNote, Mendeley, RefWorks o Zotero o del editor de texto Microsoft Word. Se recomienda cotejar todas las partes de cada referencia contra la publicación original antes de someter el manuscrito a arbitraje. Todas las referencias deben estar ubicadas alfabéticamente. SUSCRIPCIONES Para hacer efectiva su suscripción a la Revista Centro de Biotecnología, debe comunicarse a: Revista Centro Biotecnología Dra. Cecilia Ruiz Toledo. Unidad de Difusión y Transferencia de Conocimiento e Innovación. Dirección de Investigación. Universidad Nacional de Loja. Ciudad Universitaria. Sector La Argelia Teléfono: 593-7-2545100, Ext. 106 Email: ceroruto64@gmail.com Precio por ejemplar: USD 10.00 $ Luego de enviar sus datos y realizar el pago, envíe el siguiente cupón a la Dirección anterior por correo postal. CUPÓN DE SUSCRIPCIÓN