PHỤ LỤC

Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM Khoa Công nghệ Hóa học DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL PHỤ LỤC BỘ Y TẾ ----Số: 3113/1999/QĐ-BYT

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc ------Hà Nội, ngày 11 tháng 10 năm 1999

QUYẾT ĐỊNH

BAN HÀNH TIÊU CHUẨN GIỚI HẠN VI KHUẨN, NẤM MỐC TRONG MỸ PHẨM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỬ KÍCH ỨNG TRÊN DA.

BỘ TRƢỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ Luật bảo vệ sức khỏe nhân dân ban hành ngày 11/7/1989 và Điều lệ thuốc phòng bệnh, chữa bệnh ban hành kèm theo Nghị định số 23/HĐBT ngày 24/01/1991 của Hội đồng Bộ trƣởng (nay là Chính phủ); Căn cứ Pháp lệnh chất lƣợng hàng hóa ngày 27/12/1990 của Chủ tịch Hội đồng Nhà nƣớc và Nghị định số 327/HĐBT ngày 19/10/1991 của Hội đồng Bộ trƣởng (nay là Chính phủ) qui định thi hành Pháp lệnh chất lƣợng hàng hóa; Căn cứ Nghị định số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng nhiệm vụ, quyền hạn và tổ chức bộ máy Bộ Y tế; Căn cứ Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ quy định phân công trách nhiệm quản lý nhà nƣớc về chất lƣợng hàng hoá; Xét đề nghị của Cục trƣởng Cục Quản lý dƣợc Việt Nam;

QUYẾT ĐỊNH

Điều 1: Nay ban hành kèm theo Quyết định này : 1- Tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm 2- Phƣơng pháp thử Kích ứng trên da (áp dụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm) Điều 2: Quyết định này có hiệu lực sau 15 ngày kểtừ ngày ký ban hành. Các quy địnhtrƣớc đây trái với quy định trong Quyết định này đều bị bãi bỏ. Điều 3:Các Ông, Bà Chánh văn phòng, Chánh Thanh tra, Vụ trƣởng Vụ điều trị, Vụtrƣởng Vụ Khoa học -Đào tạo - Bộ Y tế, Cục trƣởng Cục Quản lý dƣợc Việt Nam, Viện trƣởng Viện Kiểm nghiệm, Thủ trƣởng các đơn vị trực thuộc Bộ, Giám đốc Sở y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ƣơng, Y tế ngành chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này.

THỨ TRƢỞNG BỘ Y TẾ Lê Văn Truyền

Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM Khoa Công nghệ Hóa học

TIÊU CHUẨN

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL GIỚI HẠN VI KHUẨN, NẤM MỐC TRONG MỸ PHẨM (Ban hành kèm theo Quyết định số 3113/1999/QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ trƣởng Bộ Y tế) Tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm là văn bản qui định về số lƣợng tối đa vi khuẩn, nấm mốc không đƣợc phép vƣợt quá trong mỹ phẩm và phƣơng pháp thử để xác định vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm. 1 Giới hạn vi khuẩn và nấm mốc: 1.1. Trong mỹ phẩm, không đƣợc có các vi khuẩn sau: - Staphylococcus aureus - Candida albicans - Pseudomonas aeruginosa 1.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đƣợc không đƣợc lớn hơn 1000/1g hoặc 1 ml sản phẩm 1.3. Tổng số nấm mốc sống lại đƣợc không đƣợc lớn hơn 100/1g hoặc 1ml sản phẩm 1.4. Số lƣợng Enterobacteria và các vi khuẩn Gram âm khác không đƣợc lớn hơn 10/1g hoặc 1ml sản phẩm. 2 Phƣơng Pháp thử 2.1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử nghiệm. 2.1.1. Lấy mẫu. Theo tiêu chuẩn lấy mẫu kiểm nghiệm, một mẫu đem thử phải làm ít nhất trên 03 đơn vị đóng gói nhỏ nhất. 2.1.2. Pha chế mẫu thử nghiệm. Tuỳ theo từng sản phẩm, lấy một lƣợng sản phẩm đại diện từ các đơn vị đóng gói (khoảng từ 10-50 g hoặc 10-50 ml sản phẩm) vào bình nón, thêm dung môi pha loãng thích hợp để pha loãng sản phẩm thành các nồng độ đem thử nghiệm thích hợp nhƣ: 10-1, 10-2, 10-3 hoặc 1/2; 1/5; 1/20; 1/40 vv... sao cho khi đếm khuẩn lạc trên đĩa Petri có đƣờng kính 90-100 mm, số lƣợng khuẩn lạc không vƣợt quá 300 trong một đĩa. 2.2. Dụng cụ và phƣơng tiện thử nghiệm. Thử nghiệm đƣợc tiến hành trong các điều kiện vô trùng, đảm bảo không có sự lây nhiễm các vi khuẩn từ ngoài vào mẫu thử. Các phƣơng tiện và dụng cụ cần dùng gồm: - Hộp Petri thuỷ tinh có đƣờng kính 90- 100 mm - Pipét chia vạch có thể tích 1; 5 và 10 mL. - Bình nón dung tích 100; 250 và 500 mL. - Ống nghiệm các loại 16- 160 mm; 18- 200 mm. - Nồi cách thuỷ ổn định đƣợc nhiệt độ trong khoảng 35 - 450C. - Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 32⁰ C 1⁰ C. SVTH: Lê Thị Quỳnh Nhƣ 74

Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM Khoa Công nghệ Hóa học - Tủ sấy. DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL - Nồi hấp tiệt trùng - Máy đo pH. 2.3. Hoá chất. - Thạch dùng cho vi sinh vật - Pepton dùng cho vi sinh vật. - Natri clorid tinh khiết (NaCl) - Glucose tinh khiết - Di natri hydrophosphat tinh khiết - Natri dihydrophosphat - Kali dihydrophosphat tinh khiết - Di kali hydrophosphat tinh khiết - Acid lactic : dung dịch 20 % hoặc 30%. - Acid citric : dung dịch 20%. - Natri hydroxyd tinh khiết (NaOH) - Dung dịch natri hydroxyd 0,1N - N- dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid - Magnesi clorid - Cetrimid (Cetyl trimethyl amoni bromid) - Magnesi sulfat ngậm nƣớc (MgSO4. 7H2O) - Glycerin - Tween 80. - Đỏ trung tính. - Tím tinh thể - Xanh Brilliant. 2.4. Môi trƣờng 2.4.1. Các môi trƣờng dùng để pha loãng, đếm các vi khuẩn , nấm mốc. 2.4.1.1. Nƣớc Pepton - Pepton: 1g -Natri clorid: 8,5g -Nƣớc cất: 1000 mL 2.4.1.2. Nƣớc muối sinh lý -Natri clorid: 8,5 g -Nƣớc cất: 1000 mL 2.4.1.2. Môi trƣờng thạch Sabouraud -Pepton: 10g -Glucose: 40g -Thạch: 15-20 g -Nƣớc cất: 1000 mL SVTH: Lê Thị Quỳnh Nhƣ 75

Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM Khoa Công nghệ Hóa học -pH sau khi tiệt trùng: 5,6 0,2 DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Cách pha: Hoà tan các chất trong nƣớc, đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan hoàn toàn. Đóng vào các bình dung tích 250 ml, mỗi bình 150 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp 1100C trong thời gian 15-20 phút. Môi trƣờng có thể bảo quản ở 4 0C và sử dụng trong vòng 30 ngày. 2.4.1.3. Môi trƣờng thạch thƣờng -Pepton: 10 g -Natri clorid: 5 g -Thạch: 15-20 g -Nƣớc cất: 1000 mL -pH sau khi hấp tiệt trùng: 7,4 -7,6 2.4.2 . Các môi trƣờng dùng để phân lập vi khuẩn, nấm mốc. 2.4.2.1. Môi trƣờng thạch Cetrimid -Gelatin pancreatic: 20,0 g -Magnesi clorid: 1,4 g -Glycerin: 10,0 mL -Cetrimid: 0,3 g -Thạch: 13,6 g -Nƣớc cất: 1000 mL Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nƣớc, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều; đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. 2.4.2.2. Môi trƣờng thạch để phát hiện Fluorescin của Pseudomonas -Casein pancreatic: 10,0 g -Pepton: 10,0 g -Dikali hydrophosphat khan: 1,5 g -Magnesi sulfat ngậm nƣớc: 1,5 g -Thạch: 15,0 g -Glycerin: 10,0 g -Nƣớc cất : 1000 mL. Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nƣớc, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều; đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng. 2.4.2.3. Môi trƣờng thạch để phát hiện Pyocyanin của Pseudomonas. -Gelatin pancreatic: 20,0 g -Magnesi clorid khan: 1,4 g -Kali sulfat khan: 10,0g -Thạch : 15,0g -Glycerin: 10,0 mL -Nƣớc cất: 1000 mL SVTH: Lê Thị Quỳnh Nhƣ 76

Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM Khoa Công nghệ Hóa học Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nƣớc, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL đều, đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. 2.4.2.4. Môi trƣờng RAT. -Bột gạo: 15,0g -Tween 80: 10 mL -Thạch : 13,5 g -Nƣớc cất : 1000 mL -pH sau khi tiệt trùng : 4,5- 5,5 2.4.2.5. Môi trƣờng thạch muối mật có lactose và glucose, chỉ thị tím tinh thể, đỏ trung tính -Cao men bia: 3,0 g -Gelatin pancreatic : 7,0 g -Muối mật: 1,5 g -Lactose: 10,0 g -Natri clorid: 5,0 g -D- glucose monohydrat: 10,0 g -Thạch : 15,0 g -Đỏ trung tính: 30 mg -Tím tinh thể: 2 mg -Nƣớc cất: 1000 mL. -Điều chỉ ới sôi, nhƣng không đun trong nồi hấp. 2.4.2.6. Canh thang làm giầu Enterobacteriaceae -Mossel -Gelatin pancreatic : 10,0 g -D-glucose monohydrat: 5,0 g -Mật bò khô: 20,0 g -Kali dihydrophosphat: 2,0 g -Di natri hydrophosphat: 8,0 g -Xanh Brilliant: 15 mg -Nƣớc cất: 1000 mL. -Điều chỉ ở 1000C trong 30 phút và làm lạnh ngay. 2.4.2.7. Môi trƣờng thạch Manitol-muối. -Casein pancreatic: 5,0 g -Pepton: 5,0 g -Cao thịt: 1,0 g -Natri clorid: 75,0g -D-manitol: 10,0 g -Đỏ phenol: 25 mg -Thạch: 15,0 g SVTH: Lê Thị Quỳnh Nhƣ 77

Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM Khoa Công nghệ Hóa học Cách pha: Trộn, đun nóng, khuấy đều, sau đó đun sôi 1phút để hoà tan hoàn toàn. 0 DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL pH sau khi tiệt trùng : 7,4 0,2 2.4.2.8. Môi trƣờng lỏng Casein đậu tƣơng. -Casein pancreatic: 5,0 g -Bột đậu tƣơng (thuỷ phân bởi papain) : 3,0 g -Natri clorid: 5,0 g -Dikali hydrophosphat: 2,5 g -Glucose: 2,5 g -Nƣớc cất 1000 mL Cách pha: Hoà tan các chất rắn vào nƣớc, đun nóng nhẹ cho tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp, đem tiệt trùng. pH sau khi tiệt trùng 7,3 - 0,2. 2.5. Tiến hành nuôi cấy, xác định và phân lập 2.5.1. Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc sống lại đƣợc 2.5.1.1. Pha loãng sản phẩm: tiến hành theo mục 2.1.2 2.5.1.2. Cấy truyền: - Trƣớc tiên cấy kiểm tra pipet trên một đĩa môi trƣờng phát hiện vi khuẩn và một đĩa môi trƣờng phát hiện nấm mốc. - Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi hộp Petri 1ml sản phẩm đã pha loãng, mỗi độ pha loãng cấy vào 2 hộp để xác định số lƣợng vi khuẩn hiếu khí sống lại đƣợc và 2 hộp để xác định số lƣợng nấm mốc sống lại đƣợc. 2.5.1.3. Đổ đĩa: Đun nóng chảy hoàn toàn các loại môi trƣờng dùng để đếm vi khuẩn, nấm mốc, để nguội đến 45oC, rót vào các hộp Petri (đã cấy sẵn trong mỗi hộp 1ml của một độ pha loãng của sản phẩm) mỗi hộp 15- 20 ml môi trƣờng; trộn đều sản phẩm đã pha loãng với môi trƣờng bằng cách xoay hộp Petri qua phải và qua trái mỗi chiều 2-3 lần. Để đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang. Thƣờng dùng môi trƣờng thạch thƣờng để đếm vi khuẩn hiếu khí. Thƣờng dùng môi trƣờng Sabouraud để đếm nấm mốc 2.5.1.4. Ủ ấm: Sau khi các đĩa thạch đã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, lật ngƣợc đĩa thạch, đem ủ. - Những đĩa thạch dùng để đếm vi khuẩn đƣợc ủ ở 32 - 35 0C, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa sau khi ủ 48 - 72 h. - Những đĩa thạch dùng để đếm nấm mốc ủ ở 25 2 C, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa sau khi ủ từ 3 - 5 ngày. 2.5.1.5. Tính kết quả: Số lƣợng vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc sống lại đƣợc có trong 1 g hoặc 1ml sản phẩm đƣợc tính theo công thức sau:Trong đó: SVTH: Lê Thị Quỳnh Nhƣ 78

Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM Khoa Công nghệ Hóa học M= Số lƣợng vi khuẩn, nấm mốc sống lại đƣợc có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL C = Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc ở các đĩa Petri cùng một độ pha loãng n = Số đĩa trong một độ pha loãng d = Độ pha loãng N = Số độ pha loãng ( thí dụ đếm hai độ pha loãng 101 và 102: N=2; đếm ở những độ pha loãng 2,5 & 10 thì N= 3 v.v...) 2.5.2. Phân lập vi khuẩn 2.5.2.1. Tìm Staphylococcus aureus Cho chế phẩm vào 100 mL môi trƣờng lỏng casein đậu tƣơng, ủ ấm 35 oC trong khoảng 24-48 h. Quan sát môi trƣờng, nếu thấy vi khuẩn mọc, dùng que cấy lấy một quai cấy, cấy lên một đĩa thạch Mannitol- muối. Đậy đĩa, lật ngƣợc hộp Petri, đem ủ ấm ở 35⁰ C trong 24 h. Sau khi ủ ấm, kiểm tra nếu thấy: Trên đĩa thạch Manitol - muối có thấy những khuẩn lạc màu vàng cùng với một vùng màu vàng xung quanh, dùng que cấy lấy khuẩn lạc điển hình, đem nhuộm Gram, soi kính thấy tụ cầu khuẩn hình chùm nho, bắt màu gram dƣơng, tiếp tục làm các phản ứng sinh vật hoá học của Staphylococcus aureus. Chuyển một khuẩn lạc nghi ngờ đặc trƣng vào ống nghiệm nhỏ, sạch vô trùng, thêm vào ống 0,5 ml huyết tƣơng thỏ. Đem ủ ấm cách thuỷ 37 oC; sau 3 giờ ủ ấm, kiểm tra các ống thử, tiếp tục ủ ấm thêm 24 h. Nếu thấy có hiện tƣợng đông huyết tƣơng ở bất kỳ mức độ nào- sản phẩm có Staphylococcus aureus. 2.5.2.2. Tìm Pseudomonas aeruginosa Cho chế phẩm vào 100ml môi trƣờng lỏng casein đậu tƣơng, ủ ấm ở 35 OC trong khoảng 24- 48 h. Quan sát môi trƣờng, nếu thấy vi khuẩn mọc, dùng que cấy lấy một quai cấy, cấy lên một đĩa thạch Cetrimid. Đậy đĩa, lật ngƣợc hộp Petri và đem ủ ấm ở 35⁰ C trong 24h. Sau khi ủ ấm, kiểm tra nếu thấy: Trên môi trƣờng thạch Cetrimid có khuẩn lạc màu lục nhạt, có ánh huỳnh quang màu lục, thì lấy khuẩn lạc, nhuộm gram, và soi kính. Nếu thấy trực khuẩn Gram âm và phản ứng oxydaza dƣơng tính thì tiếp tục cấy truyền trên mặt môi trƣờng thạch Pseudomonas để phát hiện fluorescin và môi trƣờng thạch Pseudomonas để phát hiện pyocyamin trong hộp petri. Đậy và lật ngƣợc hộp môi trƣờng đã cấy truyền, đem ủ ấm ở 320C trong ít nhất 3 ngày, đem kiểm tra các đĩa thạch dƣới ánh đèn tử ngoại, nếu thấy: Trên đĩa thạch Pseudomonas để phát hiện fluorescin có khuẩn lạc không màu đến màu vàng nhạt, có huỳnh quang hơi vàng. Trên đĩa thạch Pseudomonas để phát hiện pyocyamin có khuẩn lạc màu vàng nhạt, có huỳnh quang màu xanh nƣớc biển. Tiếp tục nhuộm gram, soi kính và làm phản ứng oxydaza thấy trực khuẩn gram âm, phản ứng oxydaza dƣơng tính, có thể kết luận có Pseudomonas aeruginosa. Nếu chƣa chắc chắn có thể tiếp tục kiểm tra bằng các phép thử sinh hoá khác. SVTH: Lê Thị Quỳnh Nhƣ 79

Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM Khoa Công nghệ Hóa học Thử phản ứng oxydaza: Chuyển khuẩn lạc vào mẩu giấy đã tẩm trƣớc N-dimethyl DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL phenylen diamin dihydroclorid, nếu thấy hiện màu đỏ hồng, chuyển sang màu tím: phản ứng oxydaza dƣơng tính. 2.5.2.3. Enterobacteriaceae và các vi khuẩn gram âm khác. Làm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách xử lý một lƣợng thích hợp nhƣ đã mô tả ở trên và ủ ấm ở 35-370C trong một thời gian thích hợp để phục hồi lại vi khuẩn, nhƣng không phải làm tăng vi khuẩn (thƣờng từ 2- 5 h). Lắc bình chứa và chuyển một lƣợng chế phẩm đã đồng nhất tƣơng đƣơng với khoảng 1g hoặc 1ml chế phẩm vào 100 ml môi trƣờng canh thang làm giầu Enterobacteriaceae -Mossel và ủ ấm ở 35-370C trong 18-24h. Cấy lên đĩa thạch muối mật có lactose, glucose, chỉ thị tím tinh thể và đỏ trung tính, ủ ấm ở 35-370C trong 18- 48h. Chế phẩm không có Enterobacteriaceae nếu không thấy mọc những khuẩn lạc vi khuẩn gram âm trên thạch đĩa. Đánh giá số lƣợng: ủ ấm một lƣợng thích hợp môi trƣờng canh thang làm giầu Enterobacteriacea -Mossel với những lƣợng chế phẩm đem kiểm tra đã đƣợc làm đồng nhất chứa 1,0 g; 0,1g và 0,01g hoặc 1,0 ml; 0,1 mL và 0,01mL. Chế phẩm có thể đƣợc pha loãng khi cần. ủ ấm ở 35- 370C trong 24-48 h. Sự mọc của các khuẩn lạc đã phát triển tốt thƣờng đỏ hoặc đĩa đỏ, vi khuẩn gram âm chứng tỏ kết quả dƣơng tính. Ghi lƣợng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dƣơng tính và lƣợng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định theo bảng sau số lƣợng Bacteria Bảng tính lƣợng Bacteria trong chế phẩm. 2.5.2.4. Tìm Candida albicans. Tiến hành trên môi trƣờng thạch Sabouraud Vào cuối giai đoạn ủ ấm, kiểm tra bằng kính hiển vi xem có nấm mọc hay không. Kiểm tra sự có khuẩn lạc nghi ngờ Candida albicans. Lấy khuẩn lạc điển hình đem nhuộmgram, soi kính: Candida albicans có hình tròn, bầu dục đƣờng kính 6- ắt màu gram dƣơng. * Thử nghiệm mầm giá đậu: Lấy một giọt huyền dịch nấm đã nuôi cấy sau 24h vào ống nghiệm nhỏ có chứa 1 ml huyết thanh thỏ, ủ ấm ở 370C trong 3 h, sau đó lấy ra soi giữa bản và lá kính. Nếu là nấm Candida albicans thì gần nhƣ toàn bộ số tế bào sẽ nẩy mầm giống nhƣ hình “giá đậu”. * Tìm tế bào vách dày: Cho môi trƣờng RAT lên bản kính vô khuẩn, nhỏ vào một giọt huyền dịch nấm, đậy lá kính, đọc kết quả sau 24-48h ủ ấm ở 300C. SVTH: Lê Thị Quỳnh Nhƣ 80