BIOTECNOLOXÍA 1. A xenómica e a proteómica. 2. Proxecto Xenoma Humano. 3. Enxeñaría xenética e aplicacións. 3.1 Técnicas da enxeñaría xenética. 3.2 Aplicacións da enxeñaría xenética. A biotecnoloxía é, sen dúbida, a rama da bioloxía que máis espetacularmente avanzou nas últimas décadas. Nesta carreira desenfreada tivo un papel relevante e central o Proxecto Xenoma Humano, que supuxo, quizais o maior e máis rápido avance científico-tecnolóxico logrado ata a data, e que servirá, ademais, de base a toda unha nova xeración de desenvolvementos científicos. A utilización de organismos vivos ou dos seus compoñentes na obtención de produtos útiles para as persoas é a base da biotecnoloxía. A biotecnoloxía é un campo interdisciplinar que traballa con seres vivos, os seus compoñentes moleculares ou as súas funcións biolóxicas e que ten como obxectivo final obter un produto (alimenticio, farmacéutico, bioquímico, etc) ou un servizo (terapia, depuración de augas…) que sexan útiles á humanidade. Son moitas as esperanzas e as expectativas que a sociedade actual ten postas no desenvolvemento da biotecnoloxía. Non obstante, os termos enxeñería xenética e biotecnoloxía suscitan tamén na poboación risco, desconfianza e medo ao descoñecido.
1. A XENÓMICA E A PROTEÓMICA A xenómica é a disciplina que estuda o xenoma dos seres vivos. Entre os seus obxectivos atópanse: a catalogación de todos os xenes dun organismo; a determinación da súa organización, estrutura e función; o coñecemento do modo en que interaccionan uns con outros, etc. As aplicacións da xenómica esténdense a todos os campos da actividade humana: medicina, gandería, agricultura, medio, etc. O maior campo na xenómica constitúeo o Proxecto Xenoma Humano. Actualmente coñécense ou están en proceso de determinación os xenomas de centos de organismos uni e pluricelulares.
A proteómica ten como obxectivo estudar o conxunto de proteínas expresadas por un xenoma, unha célula ou un tecido. Este conxunto de proteínas denomínase proteoma (PROTEínas dun xenOMA). O proteoma, a diferenza do xenoma, presenta unha gran variabilidade, que depende do individuo, do seu estado de desenvolvemento, do tecido estudado e, incluso, das condicións ambientais. A análise desta variabilidade ten grande interese, pois vai asociado tanto ao funcionamento normal do organismo coma a moitas das súas patoloxías.
1
A proteómica ten un enorme interese no campo da medicina para a identificación de marcadores para o diagnóstico de enfermidades, para a identificación de novos fármacos, etc.
2. PROXECTO XENOMA HUMANO O Proxecto Xenoma Humano (PXH) inclúe unha serie de iniciativas destinadas a coñecer os xenes contidos nos 23 pares de cromosomas humanos: a súa localización, a súa secuenciación e a función que desempeñan. O proxecto iniciouse en 1990 baixo a dirección de Watson e no ano 2000 anunciouse a obtención do primeiro borrador da secuencia do xenoma humano. No 2003, coincidindo coa celebración do 50º aniversario do descubrimento da estrutura don DNA anúnciase que o PXH concluíu e que a secuencia do xenoma humano foi descifrada completamente. A partir deste traballo pódese concluír que: •
O xenoma contén entre 20 000 – 25 000 xenes codificadores de proteínas, cantidade moito menor da esperada. Máis do 40% dos xenes non teñen función coñecida.
•
Os seres humanos somos idénticos nun 99,9% e diferenciámonos en apenas tres millóns de nucleótidos dos máis de 3000 millóns que compoñen o xenoma.
•
A maior parte destas diferenzas atópanse localizadas nos chamados polimorfismos dun único nucleótido (SNP), que son variacións que afectan a un só par de bases nitroxenadas; calcúlase que existen unhas 500000 unidades SNP.
•
O DNA non codificante, que é a maior parte do xenoma, denomínase DNA lixo porque se creu que non tiña ningunha función; estudos recentes cren que regula a expresión diferencial dos xenes. En setembro de 2008, investigadores da universidade de Yale afirmaron que
2
descubriran unha secuencia de DNA lixo, responsable de que os humanos desenvolvesen a capacidade para agarrar ou manipular obxectos ou ferramentas. •
Permite estudar a base xenética de cerca de 4000 enfermidades xenéticas coñecidas.
•
Permite avanzar no coñecemento da evolución, por comparación de xenomas en distintas especies: 98% idénticos aos chimpacés, 70% idénticos aos ratos, 60% idénticos á mosca da froita, 20% idénticos a o verme Caenorhabditis elegans…
3. ENXEÑARÍA XENÉTICA E APLICACIÓNS. O pan, o viño, o iogur, etc. son produtos fabricados desde a máis remota antigüidade, utilizando técnicas de biotecnoloxía, concretamente, todos eles se obteñen por procesos de fermentación microbiana. Actualmente, os antibióticos, as vacinas e moitos outros medicamentos obtéñense utilizando microorganismos; son, por tanto, procesos biotecnolóxicos. O paso da biotecnoloxía tradicional á biotecnoloxía moderna xorde na década de 1970 co desenvolvemento da tecnoloxía do DNA recombinante, que inclúe un conxunto de técnicas que permitiron obter DNA a partir de secuencias de nucleótidos que, de maneira natural, non se atopan xuntos, e que se combinan in vitro para formar unha nova molécula de DNA.
3.1 TÉCNICAS DA ENXEÑARÍA XENÉTICA O conxunto de métodos e técnicas que permiten o acceso e a manipulación do DNA denomínase enxeñaría xenética que difire da biotecnoloxía tradicional en que lles permite aos científicos manipular xenes, podendo modificalos e incluso introducilos noutro organismo distinto. Os organismos que foron modificados por enxeñaría xenética denomínanse organismos transxénicos. De entre as moitas técnicas que se utilizan en enxeñaría xenética, destacan as seguintes: •
Tecnoloxía do ADN recombinante.
•
Clonación do ADN.
•
Reacción en cadea da polimerasa (PCR)
•
Secuenciación do ADN
TECNOLOXÍA DO ADN RECOMBINANTE O primeiro paso en todo proceso de enxeñaría xenética é a obtención do xene ou do fragmento de ADN que ten interese, e isto pódese facer mediante a tecnoloxía do ADN recombinante, que permite cortar a molécula de ADN por lugares concretos, para posteriormente unir os fragmentos obtidos cun ADN procedente dunha fonte diferente, ou incluso de especie distinta. Esta tecnoloxía desenvolveuse a partir do descubrimento dos enzimas de restricción que son enzimas específicos que recoñecen no ADN unha pequena secuencia de bases determinada (entre catro e oito nucleótidos) para logo cortar as dúas cadeas dentro deste sitio. Este tipo de 3
secuencias de corte son palindrómicas (lense da mesma maneira nas dúas febras). Moléculas de ADN de distinta orixe, cortadas co mesmo enzima de restrición producen fragmentos ou extremos cohesivos ou pegañentos formados por secuencias complementarias, por tanto, poden unirse. A unión do ADN procedente de dúas orixes distintas produce una molécula de ADN recombinante. Mediante esta tecnoloxía pódense obter fragmentos de ADN que leven incorporados un xene ou xenes de interese, por exemplo, como o que codifica para a insulina humana ou para a hormona do crecemento. Este ADN recombinante pode incorporarse ás células doutros organismos, en que poderá expresar a información xenética nel contida.
CLONACIÓN DO ADN A clonación é un proceso que consiste na produción de individuos xeneticamente idénticos mediante reprodución asexual. Referido ao ADN, a clonación consiste en producir múltiples copias dun xene específico ou dun fragmento de ADN no interior dun organismo que fai de hospedador. Para incorporar o xene ou fragmento de ADN que se quere clonar no hospedador utilízanse vectores de clonación, que son moléculas de ADN que permiten a transferencia de xenes dun organismo a outro. Os máis utilizados son: plásmidos e virus bacteriófagos. •
Plásmidos: pequenas moléculas de ADN bicatenario e circular das bacterias que non forman parte do cromosoma bacteriano e teñen a capacidade para replicarse independentemente, ademais moitos lles confiren ás bacterias resistencia a algúns antibióticos.
•
Virus bacteriófagos: que infectan bacterias e algúns xenes da bacteria hóspede poden incorporarse ao seu xenoma. Cando o fago infecte a outra bacteria pode transferirlle xenes da primeira.
A continuación, os plásmidos recombinantes, introdúcense en bacterias por diversas técnicas. O plásmido replícase dentro da bacteria e, cando a bacteria se divide, algunhas das copias pasan ás células fillas. Como as bacterias se dividen rapidamente, en moi pouco tempo orixínanse miles de bacterias que conteñen o xene. O xene someteuse a clonación.
4
As bacterias cultívanse no medio adecuado e de todas elas haberá que seleccionar as que conteñen os plásmidos recombinantes, o que pode facerse someténdoas á acción do antibiótico para o que son resistentes (mentres as demais morren). As bacterias que conteñen o xene transcríbeno e tradúceno, polo que se poden utilizar como fábricas de proteínas útiles, moitas delas proteínas humanas, con fins terapéuticos. A insulina, a hormona do crecemento, os factores de coagulación, etc. son algunhas proteínas que hoxe se producen con esta tecnoloxía. Seleccionada a cepa bacteriana correcta pódese ir formando unha xenoteca na que se van coleccionando clons de bacterias que conteñen cada un certo xene, e que se poden cultivar en condicións apropiadas, cando se crea conveniente. A clonación é un proceso que permite obter unha ou máis copias exactas dun individuo por medio de mecanismos propios da reprodución sexual. Existen dúas modalidades de clonación: •
Clonación reprodutiva: consiste na introdución do núcleo diploide (2n) dunha célula somática adulta nun ovocito (óvulo inmaturo) ao que previamente se lle retirou o núcleo e que, por tanto, non conserva o seu ADN. Despois de activar a división do ovocito para conseguir un embrión, este implántase no útero onde o embarazo se levará a termo. En xuño de 1997 anunciouse o nacemento de Dolly, a primeira ovella clónica, este acontecemento impulsou novas liñas de traballo en clonación animal cuxas aplicacións reprodutivas e terapéuticas están aínda en desenvolvemento e forte controversia.
•
Clonación terapéutica: o procedemento é similar ao anterior ata a obtención do embrión, pero en vez de implantarse no útero, é cultivado in vitro para obter células nai embrionarias que, ao ser estimuladas convenientemente, se diferenciarán en distintos tipos celulares susceptibles de ser utilizados con fins terapéuticos.
REACCIÓN EN CADEA DA POLIMERASA (PCR) 5
Aínda que a clonación do ADN nas células, fundamentalmente bacterias, é o mellor método de obtención de grandes cantidades dun determinado xene ou dunha secuencia de ADN, é un método que non serve cando a mostra de ADN é moi escasa (unha gota de sangue, cabelo, esperma…). Neses casos, utilízase outra técnica, a chamada reacción en cadea da polimerasa (PCR: polimerase chain reaction). A PCR permite amplificar (copiar millóns de veces) unha mostra pequena de ADN. Os materiais necesarios para levar a cabo o procedemento son: • •
A mostra de ADN que se quere amplificar. Moléculas de ADN cebador: pequena secuencia de nucleótidos que fai de cebador (inicio da duplicación) • Fonte de calor: necesaria para a desnaturalización do ADN. • Grandes cantidades de nucleótidos trifosfato. • Enzima resistente ao calor: Taq polimerasa, extraída da bacteria Thermus aquaticus (que vive en augas termais), que actúa a unha temperatura moi elevada (72ºC) A PCR é un proceso que se realiza automaticamente, e en pouco tempo pódese amplificar unha molécula de ADN e conseguir ata 100 000 millóns de copias O ADN que se amplifica pode proceder de fontes diversas: • • • •
Fragmentos de ADN antigos: momias de antigas civilizacións, animais extinguidos (mamut lanudo…) Esta técnica aplícase actualmente na medicina forense coa finalidade de identificar a os autores dun delito, ou ben para realizar probas de paternidade. ADN de células embrionarias: permite realizar un diagnóstico prenatal de trastornos xenéticos. ADN de xenes virais: obtense de células infectadas con virus difíciles de detectar como, por exemplo, o VIH.
SECUENCIACIÓN DO ADN Permite ordear os xenes nos cromosomas e saber a secuencia de nucleótidos do ADN. Actualmente realízase nuns aparatos, denominados secuenciadores, que permitiron que se convertese nunha tarefa rutineira desenvolvida por numerosos laboratorios. Utilizando como base a secuenciación dos xenes, conseguíronse reconstruír xenomas de organismos moi diversos e cada vez máis complexos; con iso aparece a xenómica e, máis tarde, a proteómica. Para chegar a secuenciar todo o xenoma humano (PXH) foi necesario desenvolver tecnoloxías de secuenciación máis rápidas, combinadas con programas informáticos sofisticados. 6
3.2 APLICACIÓNS DA ENXEÑARÍA XENÉTICA Dende que se iniciaron os estudios de Enxeñaría Xenética, aló polos anos setenta, foron moitos os avances obtidos e moitas as aplicacións prácticas levadas a cabo. As principias serían: •
Creación de organismos transxénicos. Os organismos transxénicos son seres vivos que conteñen material hereditario de outros seres vivos. Aínda que a súa creación suscita algúns problemas éticos, o certo é que supón unha mellora xenética para moitas especies. Existen no mercado numerosas variedades de plantas modificadas xeneticamente (gramíneas, oleaxinosas, pataca, etc.) e algúns animais como salmón, robaliza, carpa, etc. Os animais transxénicos tamén se poden empregar para realizar xenotransplantes, é dicir, transplantes de células ou órganos de animais modificados xeneticamente a pacientes humanos.
•
Diagnóstico precoz de enfermidades xenéticas, das que se coñece a localización dos xenes implicados: fibrose quística, fenilcetonuria, distrofia muscular, hemofilia, etc. Pódese detectar a súa presenza mediante sondas de ADN en mostras de células fetais (líquido amniótico, por exemplo), ou tamén para diagnóstico destas no adulto, posible portador dun xene recesivo que non se manifesta.
•
Terapias xénicas. Trátase de substituír nas células humanas un xene anómalo polo normal, ou modifica-la expresión daquel para que realice a función correcta. Os ensaios de terapia xénica foron, ata agora, moi desiguais: xunto a notables fracasos aparecen outros prometedores. Así, atópanse sometidas a ensaios de terapia xénica diversas formas de cancro que teñen orixe xenética: fibrose quística, hemofilia, artrite reumatoide, hipercolesterolemia familiar, etc.
•
Estudios de relacións filoxenéticas. Ó comparar as secuencias de ADN entre especies de grupos taxonómicos diferentes, pódese comparar o grao de parentesco evolutivo e axudar así na taxonomía ou clasificacións dos seres vivos.
Medicina legal. Mediante as técnicas do ADN pódese a partir de pequenas mostras de ADN (cabelos, seme, sangue, etc) obter grandes cantidades do mesmo e logo esclarecer a identidade de persoas que, por diversos motivos se descoñece: corpos atopados en catástrofes, sospeitosos de asasinatos ou violacións, casos de paternidade dubidosa, etc.
•
Obtención biotecnolóxica de produtos médicos e farmacéuticos de interese para os humanos, mediante a implantación de xenes humanos en microorganismos nos que se expresan correctamente dando os seus produtos en cantidades suficientes para ser aproveitados pola industria farmacéutica. Así obtense a insulina, hormona do crecemento, interferón, vacina da hepatite B, factores de coagulación, etc. 7
•
Melloras na agricultura e gandería, pois as técnicas da enxeñaría xenética permiten obter plantas resistentes a herbicidas, resistentes a insectos, protección das plantas fronte a infeccións microbianas e víricas e melloras do produto (por exemplo, tomates que non podrecen tan rapidamente), ademais de substancias de interese obtidas de plantas transxénicas (interferón, anticorpos animais, vacinas...). Ademais, na gandería, a partir de animais transxénicos poden producirse proteínas de utilidade farmacolóxica e proteínas humanas. Mediante a alteración xenética dos animais poderíase mellorar a produción gandeira: incrementando a produción, o peso e a produción leiteira, á vez que se eliminan os riscos das técnicas de engorde artificial.
•
Investigación biomédica. As técnicas de enxeñaría xenética posibilitan grandes avances nas investigacións biomédicas, en enfermidades tan importantes como o cancro, SIDA, etc.
•
Biorremediación. Actualmente utilízanse microorganismos capaces de consumir diversas substancias tóxicas que poden utilizarse para descontaminar áreas da superficie do subsolo ou das augas subterráneas. A enxeñaría xenética está empezando a prestar atención a diversas bacterias procedentes de medios naturais, nas que se detectou a existencia de xenes para a biodegradación de refugallos tóxicos, como pesticidas clorados, clorobencenos e clorofenólicos afíns, naftalenos, hidrocarburos... Os xenes desexados íllanse de especies (Pseudomonas, Alcalígenes) e posteriormente clónanse en plásmidos. Estas técnicas permiten: biodegradación do petróleo, tratamento microbiolóxico de augas residuais e remediación de vertidos tóxicos.
•
Melloras da biotecnoloxía industrial. O aporte tecnolóxico trata de aumentar a produción do composto de interese nos procesos microbiolóxicos industriais. Para iso procúrase potenciar as reaccións metabólicas dos microorganismos, modificándoos, en moitas ocasións, mediante métodos xenéticos. Destas modificacións resultan cepas que melloran sensiblemente o rendemento do proceso.
8