Stražar M. Vrednotenje zaviranja razgradnje odpadne vode z respirometrijo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, odd. za biologijo, 2003
3.2.9
60
Dolo itev koli ine biomase z ATP bioluminiscen nim preskusom
Dolo itev koli ine ATP, ki je merilo za koli ino prisotne aktivne biomase, smo izvajali z ATP bioluminscen no metodo po postopku Sigma, ZDA (ATP bioluminscent assay kit), ki se uporablja za kvantitativno bioluminiscentno dolo itev ATP v vzorcih, ki vsebujejo od 2 x 10-12 do 8 x 10-5 mola/l (ali 10-12 do 4 x 10-5 g/ml, glede na molekulsko težo 507 g/mol proste kisline). Metoda temelji na porabi ATP in emisiji svetlobe, ko luciferaza katalizira oksidacijo luciferina. 3.2.9.1
Ekstrakcija ATP iz bakterijskih celic
Uporabimo pufer: 100 mM Tris-HCl – 2 mM EDTA, pH 7.8. Ekstrahiramo z vrelim pufrom. EDTA povzro i razpad celi nih ovojev bakterij (predvsem zunanje membrane pri G- vrstah). Vrednost pH okoli 7.8 je optimalni pH za encim luciferazo. Detekcija ATP iz bakterijskih celic
3.2.9.2
Merili smo koli ino ATP v vzorcih, ki smo jih odvzeli periodi no ob so asni meritvi porabe kisika in sicer na vsakih 5 ur meritve. Vzorce smo obdelali po posebnem postopku (uporabili smo reagente SIGMA: Stock No. FL-AA; Adenosine 5´- triphosphate (ATP) bioluminescent assay kit), merili svetlobo, ki nastaja pri reakciji z luminometrom in nato s pomo jo umeritvene krivulje izra unali koncentracijo ATP v vzorcih. Reakcija: •
ATP + luciferin + Mg2+ + kresni ja luciferaza → adenil-luciferin + PPi
•
adenil-luciferin + O2 → oksiluciferin + AMP + CO2 + svetloba
Za razred evanje smo uporabili sterilno deionizirano vodo. Vsa steklovina in plastika, ki bo prišla v kontakt z vzorci ali reagenti mora biti popolnoma ista oz. ne sme biti prisotnega ATP. Priporo eno je namakanje v 1N HCl preko no i, nato spiranje z s sterilno milli Q vodo oz. sterilno deionizirano vodo in sterilizacija (s sušenjem). Pipetni nastavki se smejo uporabiti le po enkrat in predhodno ne smejo priti v kontakt s kožo ali kontaminiranimi površinami. Optimalni pogoji: • pHopt = 7,8 (v mejah od 7,4 do 7,8) • C(Mg2+)opt = 10-3 – 10-2 M • Topt = sobna temperatura Reagente (Sigma) pripravimo po naslednjem postopku: