2.EXPERIMENTALMETHODS
2.1.Preliminarycomments
Theprincipalobservableinasolid-stateNMRexperimentonaquadrupolarnuclide isthequadrupolecouplingconstant, Cq. 17 Thiscouplingconstantisdirectlyproportionaltotheelectricfieldgradient(EFG)atthenuclideofinterestandisgivenby
Here Q isthequadrupolemomentofthenucleusinquestion,and qzz thezzelement ofthefield-gradienttensor.Theatomicconstants(e, a0,and h)havetheirusual meanings.Wecanexperimentallydetermine Cq andcontrastthatvalueagainstthat predictedwith abinitio calculations.Theimportantpointisthatthequadrupole couplingconstantisdirectlyproportionaltotheelectrostaticsaroundthenucleusin question.Hence,thecouplingconstantwillbesensitivetochargedifferencesof variousligandsand/ortheabilityoftheligandtopolarizevariousorbitalsassociatedwiththeZn2+ (orMg2+).ThisiswhyanNMRexperimentonaquadrupolar nuclideisessentialtoaddressthequestionsposedinSection1.Tosecondorder (approximately),thelineshapeforthecentraltransitionforaquadrupolarnuclideis proportionalto
Thatis,thebreadthofthelineshapeisproportionaltothesquareof C q andinverselyproportionaltotheLarmorfrequencyofthenucleusinquestion.Thisfield dependencebecomesanessentialtoolinthedisentanglementofquadrupolarlineshapes.Anotherfactorthatcanbeimportantisthefactor[I(2I 1)]2.Basically,as thevalueofthenuclearspinincreases,thebreadthofthelineshapedecreases.For I valuesof 9 2, 7 2, 5 2,and 3 2 thevalueof[I(2I 1)]2 decreasesdramatically:1296,441,100, and9,respectively.The I valuedependencegivenaboveisapproximatebutreflects thestrongdependenceofthelineshapeonthevalueof I.Forexample,allother factorsbeingequal,thelineshapeforaspin 3 2 nuclideisabout10timesbroaderthan thelineshapefora 5 2 spin.
Beforediscussingthevariousexperimentalmethods,itisimportanttodiscussthe overallapplicabilityoftheapproachsummarizedhere.WhileweutilizeZn2+ and Mg2+ asourexamples,themethodsdiscussedarenotlimitedintheirapplicability totheseionsspecifically.In Table1,wesummarizetheNMRpropertiesofsome representativequadrupolarnucleithatcanbeexploitedbythemethodsdiscussed here.
AtomSpinGammaNatural abundance
9Be1.50 3.759410056.24270.35311.3548
17O2.50 3.62660.03754.25600.17110.1935
23Na1.507.0760100105.86100.69375.7159
25Mg2.50 1.637010.1324.49041.3290.9375
33S1.502.05170.7630.69460.4521.8457
39K1.501.248493.118.67680.3900.1782
43Ca3.50 1.79990.14526.92750.2721.2461
51V3.507.03299.76105.20270.34774.3122
59Co3.506.317110094.50742.80053.8737
63Cu1.507.090469.09106.07641.46776.1791
65Cu1.507.595830.910113.63751.36093.6579
67Zn2.501.67264.1125.02301.0001.0000
73Ge4.50 0.93327.76013.96121.3070.1737
87Sr4.50 1.15947.02017.34532.2330.3331
NMR frequency Relative quadrupole momenta Relativesensitivity equalnumberof spins
95Mo2.50 1.74315.7226.07630.1471.1317 a ThequadrupolemomentscamefromthereviewsofPyykko 113,114 Thereadershouldconsultthese referencesforthesignofanygivenquadrupolemoment.
Iftwonuclideshavethesamenuclearspin,comparablequadrupolemoments, andtheirremainingNMRparametersaresimilar,thentherelativesensitivities shouldgivethereaderanapproximateideaoftherelativedifficultyofexperiments onthetwonuclei,e.g. 67Znand 25Mg.From Table1,weestimatethat 67Znand 25Mgareofcomparabledifficulty.If,however,thenuclearspinsaredifferent,e.g. 67Znand 65Cu,thenapproximatingthedifficultyofagivenexperimentonagiven nucliderelativetoanotherisslightlymorecomplicated.Forexample,ifwehave extensiveexperiencewith 67Znproteinsandwouldliketoexploreananalogous seriesofexperimentsonaCu+ protein,usingenriched 65Cu,thetablecanbeuseful. Ifweassumeforamomentthatwecanexciteandmeasure only the 71 2 transition foraquadrupolarnuclide,thentherelativesensitivityoftwonuclides(asinthecase of 65Cuand 67Zn)losesitsdependenceonthenuclearspinsothattherelative sensitivityforanequalnumberofnuclei, SCutoZn,simplybecomestheratioofthe cubeoftheirrespective g’s,i.e.
Thenumbersreportedin Table1 forrelativesensitivityareforanequalnumberof nuclei.Theproposedselectiveexcitationsmaybedifficulttoaccomplishexperimentally,butthetabulatedrelativesensitivityshouldserveasareasonable Table1. NMRpropertiesofselectquadrupolarnuclidesofbiologicaland/orenvironmental interestat9.4T
S CutoZn ¼ gCu gZn
.(3)
approximationfortherelativeeasewhencomparingoneexperimenttoanother. However,fromtherelationshipdepictedinEq.(2)therearetwootherfactorsthat mustbeincluded:thevalueof Cq andthedependenceofthelineshapeonnuclear spin.Ifweassumethequadrupolecouplingconstantsarecomparable,the 65Cu lineshapeisgoingtoaboutanorderofmagnitudebroaderthanthecorresponding 67Znlineshape.Hence,thefactorof90greatersensitivityof 65Cuover 67Zn(obtainedfrom Table1)reducestoaboutanorderofmagnitudeofgreatersensitivity butstillmakingexperimentsfeasible.
2.2.Cryogenicmethods
AsmentionedinSection1,oneofthebiggestproblemstheNMRexperimentmust overcomeisitslowsensitivity.Recallthatthisincludestheintrinsicsensitivityofthe nuclideandtheconsequencesofthedilutionofthenucleusofinterestintheprotein matrix.Significantgaincanbemadeinsensitivitybycoolingboththesampleand coiltocryogenictemperatures.Whenboththesampleandcoilarecooledthereisa correspondingincreaseinthesignaltonoiseratio(S/N),18–20 i.e.
S
=N / T 3=2 .(4) thisrelationassumesthecoilisthedominatenoisesourceatthistemperature. Hence,areductionintemperaturefromnominally293to10Kcouldleadtoan increaseintheS/Nbyafactorofroughly159oratime-savingsontheorderof 25,000.Wesay‘‘could’’intheprevioussentencebecausetherearefactors,suchas thenoisetemperatureofthepreamplifier,whichcanacttoreducethisfactor.To avoidthisissueinparticular,acryogenicpreamplifiershouldbeemployedinthese experiments.18 Otherfactorsincludeplacementofcapacitors,utilizationofshields, lengthandtemperatureoftheconnectingcables,etc.Thesepracticalissuesare outsidethescopeofthepresentdiscussions.Asweshalldiscussinsubsequent sections,therearestillimpressivegainstobemade,however,itisprudenttodiscuss somedetailsofhowweaccomplishthelowtemperatures.
2.2.1.Cryostats
TheexperimentssummarizedinthisreviewhavebeenperformedusinganOxford Instrumentscontinuousflowcryostat.21 Suchasystemoffersstablecontrolofthe operatingtemperatureoveranextendedrangeaswellasprotectionofthemagnet borefrompotentiallydevastatingconsequencessuchasfreezingthemagnetseals. Theconstraintontheinsideworkingdiameterofthecryostatisdictatedbyboththe cryostatandmagnetbore.Foratypical‘‘widebore’’magnetwithan89mmbore (nominally70mmwithroomtemperatureshims)theinsideworkingdiameterfor thecryostatis50mm.Foramediumboremagnetwithadiameterof63mmroom temperaturebore(nominally50mmwithshims),suchacryostatleavesaworking diameterof 30mm.Usingmagnetswithaboresignificantlysmallerthan63mm is,inallprobability,impracticalforthetypeofexperimentswewilldescribehere.
Theroomtemperatureshimscan,ofcourse,beremovedprovidingalargerworking diameterinsidethecryostatorleavingtheworkingdiameterthesame;allowingthe cryostattobemoreefficient.Undertheheatloadoftheprobeandradiofrequency (RF)heatingweemployaflowratebetween1.5and2.0L/hatapressurebetween 600and800mbar.Undertheseconditionsandusinga250Ldewar,wecanrunfor about7days.
Atacostofabout$4/L,theweeklyoperatingcostofcryogensis$1,000oran annualcostofatleast$50,000/yr.However,thereisanalternativetothisannual expensethatcaneventuallysavepreciousresearchfunds.Thealternativeisto employa‘‘cryogen-free’’cryostat.SuchdevicesarecommoninthephysicsliteratureandcannowbemadetohavesufficientcoolingpowertohandletypicalNMR heat/powerloadsontheorderof1Wat5K.Thistypeofheatdissipationismore thanenoughtohandleasolid-stateNMRexperimentofthetypediscussedhere. TheinterestedreadercansearchtheInternetfortheterm‘‘cryogen-freecryostats’’ tolearnmoreaboutsuchcryostatsandtoidentifypotentialvendorstobuildone.
2.2.2.Probeconsiderations
Thenextpointtoconsideristhenatureoftheprobeusedfortheseexperiments. Thereareseveralvariationsonprobedesignsthatsimplydependonthenatureofa givenexperimentandtheneedsoftheuser.However,wehavemadeafundamental decisionwithrespecttoallofourprobes,i.e.theyare not capableofmagicangle spinning(MAS)experiments.Rather,alloftheprobesarestaticinnature.The reasonsforthisdecisionareeasyandbasicallyrevolvearoundtwopoints:the inherentdifficultyofspinningasampleatcryogenictemperaturesandtheconsequencesofsampledilutiondiscussedabove.Recently,effortshavebeenmadeto spinatthesetemperatures22 andtheseexperimentshaveovercomemanyofthe difficultieswithlow-temperaturespinning.However,todoso,theyhadtoemploy smalldiameterspinnersandthushavehadtosacrificesamplesizeforspinning stability.Therationaleforsuchadecisionisclear,theycouldgainbackthelost signalduetothesmallersamplebythereducedtemperature.Forourapplication, wecannotaffordtogiveawayanythingduetothedilutionofthemetalioninthe samplesthatareofinteresttous.Thereareothertechnicalissuesassociatedwith howfastyouhavetospinforquadrupolecouplingsintherange10–30MHz,but thosedetailsaresecondarytolossesinsensitivity.
Allofourexperimentstodatehaveeitherbeendouble-ortriple-resonanceexperimentsandthecryogenicprobedesignshavebeenpublished.23,24 Tooptimize theNMRsensitivityoflow-gammanuclides,wehavechosentoemployacross-coil designforourprobeswheretheinnercoilistunedtoprotons.Theinsidediameter ofthiscoilis5mm.Anengineeringdrawingofthecoildeckweuseisshownin Fig. 1.Forsimplicitywehaveomittedsomedetailsthatwouldhaveclutteredthediagramoftheprobe.Forexample,omissionsonthecoppershieldweretheholesin thetopandsidesoftheshieldalongwiththethreadsitmountstoontheObserve deck.Otheromissionsaretheinsulator(athinTeflonTM sheet)betweenthecoils andsupporting(andtuning)rods.Allofthecapacitorsareratedforcryogenic
Fig.1. Engineeringcutawayofthetopportionofourlow-temperatureNMRprobewith(a) coppershieldcan,(b)cross-coilassembly,(c)TeflonTM coildeck,(d)copperenclosureforthe CernoxTM resistor,(e)thestainlesssteel 1Hdeck,(f) 1Htuneandmatchcapacitors,(g) stainlesssteelobservedeck,and(h)thetuneandmatchcapacitorsforthelow-andmidfrequencychannels.
temperaturesandhavetheabilitytobetunedatcryogenictemperaturewithout bindingorsimplybreaking.25 ThecoilplatformisconstructedwithTeflonTM,while inpreviousdesignsweusedstainlesssteel.
However,atlowtemperaturesweobservedsignificantshiftsintheresonancedue tothesusceptibilityofthemetaldeck.WiththeTeflonTM deck,theresonancefrequenciesarevirtuallyinvarianttotemperature.Anotherimportantpointinthecoil deckisthelocationofaCernoxTM resistor.26 Theresistorisseatedinacoldfinger madeofcopper.Thepurposeoftheresisteristoprovideameasurementofthetemperatureasclosetothesampleaspossiblewithoutsignificantcouplingtothecoils.
Atfirstthoughttheuseofhigh-powerRFinanHeatmosphereseemslikea recipeforarcing.Thereisnodoubtthatconditionscanbefoundthatwillgenerate coronalarcs,however,thereareabroadrangeofconditionswherethecross-coil structureisstabletotheRFfieldsgenerated.Toavoidgeneratingtoomuchvoltage acrossthecoilstructureyouhavetoreducetheRFpower(whichinturnlimitsthe
availableRFfields).Havingdonethat,youalsohavetoselectthematerialsthatare usedforthecoilscarefully.24 Thereasonforthisisthatatcryogenictemperatures the Q ofthecoilsincreasesdramatically.High Q’saregreatforsensitivitybutifthe Q becomestoolarge(X400),tuninginstabilitiescanarise.Forthesereasons,the solenoidcoildepictedin Fig.1 ismadeoutofbrass.Suchacoilhasa Q ontheorder of150at10K( 70atroomtemperature)andcangenerateRFfieldsof50kHzwith 50Wofpower.27 Theprotoncoil,whilestillmadeofcopper,hasalowtemperature Q of200–300duetothedielectriclossesintroducedbythetuningelementsofthe circuit.Thiscoiltypicallygenerates50kHzwith 65Wofpower(at10K).Once thepowerhasbeenreduced,thecriticalfactorsbecomepressureandflow.
2.3.Polarization-transferexperiments
Asdiscussedabove,cryogenictemperatureshaveprovidedapotentialgaininS/N ontheorderof159overaroomtemperatureexperiment.However,aswepointed outthatgainisnotsufficientforourneeds.Asaresultpolarizationtransferfroman abundantprotonbathisusedasthemeanstocreatetransversemagnetizationin ourexperiments.Specifically,weemploycross-polarization(CP)experimentsto furtherenhanceourS/N.28,29 Inthisexperiment,theenhancementcouldbeashigh as gH/gX (for 25Mgand 67Znthisratioisabout16).Thecombinationoflow temperaturesandCPmethodscanprovideatheoreticalgainof 2,500overa conventionalBlochdecayexperiment(directobservationsinglepulseexperiment with 1Hdecoupling)atroomtemperature.
Weassumeatthispointthatthesampleofinterestisembeddedatthemolecular levelinanenvironmentcontaining 1H’sandthatitcantoleratecryogenictemperatures.Bytolerate,wemeanthesampleisstable(reversible)tothermalcycling. Further,theusermustunderstandthattherearepossiblephasetransitionsthatcan occur,andassuchyoumustbesensitivetotheirpotentialexistence.Whileour potentialtime-savingisnowontheorderof6million,therealityisthattherecycle delayintheexperimentcannotbeignored.Namely,thecryogenictemperatures havesignificantlylengthened T1,thespinlatticerelaxationtimefornucleiinquestion.Owingtothefactthatweareutilizingapolarization-transferexperiment,we needtoonlyreduce T1 fortheprotons.Wefirstaddressissuesassociatedwithspin latticerelaxation,followedbyadiscussionofthemethodsforpolarizationtransfer.
2.3.1.The T1 conundrum
MostchemistswhenintroducedtotheNMRexperimentaretoldthattheyshould avoidparamagneticimpuritiesintheirsamples.However,inourcasethepresence ofsuchan‘‘impurity’’isthemeansbywhichweavoidtheproblemofspinlattice relaxationtimes,whichcanbecomeprohibitivelylongatcryogenictemperatures. Hereweemployaparamagneticdopantasameanstoreducethe 1Hspinlattice relaxationtime.30 Forbiologicalinvestigationsutilizingmetalloproteinsand/or theircomplexesthissolutionisstraightforward.Thatis,dopingthesamplewiththe
sameprotein(oradifferentone)withaparamagneticmetalatitsactivesite. Typicalloadingsareontheorderof5–10%byweight.Sofarwehaveonlyexplored theuseofCo2+-substitutedproteinsasourparamagneticdopant,e.g.Co2+ -substituedcarbonicanhydrase(CA).Underoptimumconditions,wehavebeen abletoemployarecycledelayontheorderof30sformanyofoursamples. However,thereareseveralcaseswherethatsamesampleatonefieldstrengthcan forceustoemployalongerrecycledelayatahigherfield;forexamplegoingfrom 9.4to18.8T.Thereasonforthisismanyfoldandcentraltotheseissuesisthefield dependenceofthespectraldensityfunctionforelectronrelaxation.Theoptimizationofthesedopantswithrespecttometalionisfarfromcompleteandisanarea thatisripeforexploitation.
Ifthesampleisnotaprotein,perhapsaninorganicmodelcompound,thenthe useofparamagneticimpuritiesbecomesmoredifficult.Inthecaseofmodelsfor Zn2+ metalloproteins,theuseofpyrazolylborates31–34 complexesasmodelligand systemshasbeenprofitable.30,35 Inmanyinstances,theZn2+-pyrazolylboratecan bedopedwiththecorrespondingCo2+-pyrazolylborate.Inthissituation,thedopinglevelsaretypically3–5%.Thestrategyfordevelopingdopantsforbioinorganic modelsforMg2+ ismorecomplicated,assubstitutinganotherparamagneticmetal fortheMg2+ oftenyieldsadifferentcompoundfromthedesiredone.Forthe paramagneticdopanttowork,thedopantandthecompoundofinterestmustbe ‘‘mixed’’atthemolecularlevel.Thusaphysicalmixingorgrindingofthetwo compoundstogetherisgenerallynotsufficientforthedopingtowork.Intheabsenceofasuitabledopantthenthepresenceofmethylgroupswillfacilitate 1H relaxationthroughtunneling.36 A T1 minimumcanbefoundundertheseconditions,typicallybetween30and50K.
2.3.2.Polarization-transfermethods
TheCPexperimentofPines etal.28,29 isbeautifulinitssimplicityallowingthe transferofpolarizationfromanabundantspin(usually 1H’s)toararespin.The gaininS/NintheCPexperimentisontheorderof gH/gX.Partofthebeautyofthe experimentisthethermodynamicanalogiesthatcanbedrawnfromthebasicexperiment.Recall,theCPexperimentinvolvesa p/2pulsefollowedbyspinlocking the 1H’sandthenallowingthecontactbetweenthe 1Hsandtherarespins.During thiscontacttime,therarespinmagnetizationgrowsandtheabundantspin’smagnetizationdecreases.Afterthemaximumtransferhasoccurredthecontactisbrokenandtherarespinmagnetizationisdetected.The p/2pulseandspinlockofthe abundantspinisequivalenttocoolingthosespins.Theresultingspintemperatureis equalto T L ðH 1rot =H 0 Þ,where TL isthetemperatureofthelatticeand H1rot and H0 arethestrengthsofthemagneticfieldintherotatingandthelaboratoryframes, respectively.Fortypicalvaluesof H1rot and H0,thespintemperaturecanbecome ontheorderoffewtensofmKonatimescaleofafew ms(whichisontheorderof 1H T2)andbeheldatthistemperaturefortimescomparableto T1r,thespinlattice relaxationtimeintherotatingframe.Atthispoint,therarespinmagnetizationis ‘‘hot’’,correspondingtolittleifanypolarization.Puttingthesetworeservoirsin
‘‘contact’’leadstoacoolingoftherarespinreservoir(anincreaseinmagnetization) andawarmingofthereservoiroftheabundantspins(adecreaseinmagnetization). Theamountofwarmingandcoolingisrelatedtotherelativeheatcapacityofthe tworeservoirs.Thecontactisprovidedbythedipolarinteractionbetweenthe abundantandrarespins.
Thetransferismostefficientundertheconditionwhenthetworotatingframes (oneeachfortheabundantandrarespins)arerotatingatthesamefrequency.This situationisknownastheHartmann–Hahn37 conditionandisgivenby
Here, I referstothenuclearspinofthequadrupolarnuclideXandthequantum number m referstothenatureofthetransitioninthequadrupolarspinsystem. Typically,thetransitionofinterestisthe 71 2 transitionandasaresult m ¼ 1 2
Acloserexaminationofthenatureofthespintemperature38 canbringthereader intosomefascinatingconcepts.Onesuchideaisimportantinthecontextofour discussion,namelytheideaofadiabatictransfers.39–42 Insomeearlypapersfrom thePinesgrouptheyexploredtheideaof‘‘totalcrosspolarization’’(TCP).43 Our interestintheseexperimentsarisesfromthepotentialoffurthergainsoverand abovethoseexpectedbyCPalone.Thepreviousapplicationsoftheseexperiments involvedspin-1 2 systems.Eventhoughthereportedgainshavebeenmodest(somewherebetweenafactoroftwoandthree),44,45 thiscanrepresentasignificanttimesavingofnearlyanorderofmagnitude.IntheTCPexperimentratherthanutilizea spinlockasthemeanstocooltheabundantspins,anadiabaticdemagnetizationin therotatingframe(ADRF)41 isusedinstead.Therespectivepulsesequencesare depictedin Fig.2.
ComparingasinglecontactCP(Fig.2a)withtheTCPexperiment(Fig.2b)yields thefollowingexpressionsforthepotentialgaininS/N:43
SinglecontactCP(undertheHartmann–Hahncondition):
SinglecontactTCP:
Inthesetwoequationswehaveusedthenotationthatthenuclearspinsaredenoted as I and S fortheabundantandrarespins,respectively,and NI and NS denotethe numberof I and S spins,respectively.ThislastfactorinEq.(8)arisesfrom theadiabaticnatureofthetransfer.Itisimportanttonotethatthetransferis doneadiabaticallyandnotundertheconditionsoftheusualisoenergetic Hartmann–Hahnconditions.Hence,thetransferrates(fortheadiabaticcase)are slowerandmoresusceptibletorelaxationeffects,notably T1D,therelaxationtime
Fig.2. Polarization-transferpulsesequences:(a)Hartmann–HahnCP,(b)ADRFsequence where X applicationofpowerissudden(k ¼ 1 2)oradiabatic(k ¼ 1),and(c)adiabaticlaboratoryframetransferwith 1Hfrequencysweptfromoff-toon-resonanceandtheobserve channelsweptfromon-resonancetooff-resonance.
correspondingtothelossofdipolarorder.46 InEq.(8),theterm k is1iftherare spinpoweristurnedonadiabaticallyandisequalto 1 2 ifitisturnedonsuddenly.If werecognizethat S is 5 2 foreither 25Mgor 67Zn,thenEq.(8)becomes
Inaproteinthefactorof NH/NX couldeasilybe 41,000.Combiningthiswiththe numericalfactorleadstoa potential gainbytheadiabaticexperimentsoverthatofa
conventionalCPexperimentofnearlyanorderofmagnitude(with k ¼ 1).Given thispossibilityitisworthwhilecomparingtheadiabaticandnormalCPexperiments for 67Znwiththeaimtoapplythebestmethodtoourproteinsystems.
Anotherversionoftheadiabaticexperimentsisalsosummarizedin Fig.2.This versionoftheexperimentisperformedinthelabframe(asopposedtoarotating coordinatesystem).Thereisacommonalityinallofthepolarization-transferexperimentswehavediscussed.Thefirstphaseinvolvescoolingtheabundantspins(in ourcaseprotons).Thesecondphasereliesontheexistenceofthedipolarcoupling betweentheabundantspinsandthesystemofinterest,therarespins.Thelabframe versionofthisexperimentisnodifferent.Thefirststageisaccomplishedbysweepingthefrequencyoftheabundantspinsfromoff-resonance(inourcaseabout 250kHz)toanon-resonancecondition.ThisprocesswillconvertZeemanmagnetizationintodipolarorderandatthesametimecoolstheabundantspins.Thenext phaseiscreatingZeemanmagnetizationoftherarespin.Toaccomplishthiswe againsweepthefrequencybutnowoftherarespinandwedothisbygoingfroman on-resonanceconditiontooff-resonance.Thenewmagnetizationgrowsalongthe ‘‘offset’’fieldalongthelabframe Z-axis;theeffectivenessofthisprocessdepends uponthelineshapeoftherarespins.45
Infactwhenexperimentsbasedonthepulsesequencesdepictedin Fig.2bandc areperformed,theresultsarenobetterthanthoseobtainedviastandardCPexperiments(Fig.2a).Further,thegainweobservedoesnotdependon k.Atthis pointtheexactreasonforthisfailureisunclearandcouldarisefromseveralfactors, oneofwhichistheselectivenatureofourpulses(adifferencebetweenaspin 1 2 systemandthebroadresonancesassociatedwithquadrupolarspinssystems).Anotherpossibilityisassociatedwithourlineshapeasopposedtothenarrowerand nearGaussian-shapedresonancesobservedpreviously.44,45 Wearestillexploring theseexperiments;however,asaresultoftheseshortcomings,theremainderofthe discussionwillbebasedonthestandardCPexperiment.
Asanaside,thereareseveralothermethodsusedtoenhancethecentraltransition ofaquadrupolarnuclide,notablytherotor-assistedpopulationtransfer(RAPT)47,48 anddoublefrequencysweeps(DFS)49–51 pulsesequences.Areviewofthesemethods isdescribedbySiegal etal.52 Alloftheseexperimentsarevariationsonasimilar theme:namelyperturbthepopulationsoftheoutertransitions,andobservethe consequencesofthisperturbationonthe 71 2 transition,LeChatelier’sprincipalfor spins.Theseexperimentsofferasignificanttime-savingwhenCPisnotavailable, e.g.whentherearenoprotonsinthematerial.WhynotcombinetheselatterexperimentswithCPoronadiabaticvariationstoobtainafurthergaininS/N?Inthe DFSexperiment,rapidsweepisusedtoperturbthepopulationsofoutertransitions whichinturnforcesthepopulationoftheenergylevelsassociatedwith m valuesof 71 2 tochangeyieldinganenhancedpopulationforthistransitionwhichwould correspondtogainafactorof 2.Thisenhancedpopulationcorrespondstomagnetizationalongthe Z-axisforthequadrupolarspin.IneitherthenormalCPorthe adiabaticvariations,themagnetizationfromtheseexperimentscomesaboutfrom thedipolarinteractionbetweentheprotonsandthequadrupole.Hence,asinthe spin-1 2 caseofCPwheretemperaturealternationisneededtopreventspin-locked
‘‘normalmagnetization’’fromcontaminatingthemagnetizationfromthepolarizationtransfer,themagnetizationthatarisesfromtheperturbedoutertransitionswill onlyservetocontaminatethemagnetizationfromthepolarizationtransfer.
Anotherpointofpotentialinterestistheuseofparamagneticsasameansto significantlyenhancethesensitivityinourexperimentviadynamicnuclearpolarizationmethods(orDNP).53,54 ThedetailsoftheDNPexperimentareoutsidethe scopeofthepresentdiscussion.Basically,theexistenceoftheseradicals(different fromthoseemployedatpresent)thatarecoupledtothenuclearspinsprovidea meanstoenhancethenuclearpolarization.Forexample,themaximumgainin 1H polarizationis 660.Thispolarizationcannowbetransferredtotherarespinsof interestviaaCPexperimentyieldingsignificantgainsinsensitivity.Itisanexperimentweareinterestedinpersuinginthefutureasameanstofurtherextendthe applicabilityofNMRmethodstotheinvestigationofmetalsitesinmetalloproteins.
2.4.Spinechomethods
Aswaspreviouslydiscussed,weemploylow-temperatureexperiments(takingadvantageoftheBoltzmannfactor)incombinationwithCPmethodstoovercomethe dilutionofthemetalintheprotein.Thecombinationoflow-temperature(10K)and CPmethodsincreasesourS/Noverconventionalroom-temperatureexperimentsby afactorof 2,000.Theapproximatenaturereflectsdifferencesbetweenidealfactorsandwhatwerealizeexperimentally.However,thiscombinationofmethodsstill hasinsufficientsensitivitytoobtainabroadlineshapethatisreflectiveofthedesired quadrupolecouplings.Wecouldgainperhapsanotherfactorof10(ormore)inS/N ifwecoulduseamethodsuchasMAS.Thisincreasearisesbecausethebroad lineshapeisbrokenintoaseriesofnarrowsidebandsseparatedbythespinning frequency.Theamplitude(andlineshape)ofeachsidebandisencodedwiththe tensorinformation.Ananalysisofthesidebandlineshapesandintensitiesyieldthe desiredcouplings.However,asmentionedabovewehaveavoidedMASmethods dueprincipallytothereducedsamplevolumeandthereforelowernumberofobservablespins.Tocircumventthisproblem,whilestillgainingnearlyafactorof10 (ormore)inS/N,wehavetakenadvantageofsomepropertiesofaspinecho train.55 Thetopofeachechowithinthetrainrefocusesalloftheinhomogeneous(in thesenseofPortis56)interactions(shieldingandquadrupoletensors)andthedecay ofeachhalf-echohasencodedwithinitthedetailsofthesetensorsandtheirrelative orientation.Fouriertransformationoftheechotrainyieldsaspectrum,whichafter analysisyieldsthedesiredcouplings.
2.4.1.SpikeletechoorQCPMGdetection
Thebasicmethodistoacquiretheinducedsignalsthatresultfromanechotrain thatwasgeneratedasaCarr–PurcellMeiboom–Gillsequence(CPMG).57,58 The transversemagnetizationintheechotrainwas,asmentionedabove,createdbya CPsequence.SinceweareexaminingtheNMRspectroscopyofaquadrupolar
nuclide,theexperimenthasbeentermedaCP/QCPMGexperimentorsimplythe spikeletexperiment.Thepulsesequenceissummarizedin Fig.3
Thereasonforthecollectionoftheentireechotrainisoutlinedin Fig.4.Thelefthandsideof Fig.4 depictsanexpansionofthefirstfewechoesinasimulated inducedsignal.Theechospacing, te (fromtoptobottom)increasessuchthatinthe lowerleft,thespacinghasbecomeinfinite,analogouswithchangingthespinning speedinanMASexperiment.Fouriertransformationofthetime-domainsignals resultsinapowderlineshapewherethespikeseparationisequalto(te) 1 Witha simplelineshape,suchasthatdepicteditiseasytofollowthetops(connectthedots) ofthespikesandrecoverthelineshape.However,inthepresenceofnoiseandmore thanonelineshapetheproblembecomesmoredifficult.Ascanbeenseenfrom Fig.4,thedecreasedspikeseparationmakesthelineshapemoreapparent,butata costofS/Nperunittime.Thatistosaythelineshapeisdividedintomoreandmore spikesdecreasingtheS/Ninagivenspikeforagiventimeperiod.
Thereaderwillnotethatthespinechoonlyrefocusesinhomogeneousinteractions(chemicalshieldingandquadrupoleeffects).Itdoesnotrefocusinteractions thatarehomogeneous,i.e.dynamicsandhomonuclearcouplings.At10Kthe dynamiceffects(withsomecaution)canbeignoredwhichleaveshomonuclear couplings.Inprinciple,thecouplingsmanifestedinthisexperimentaredipolar innature.Thesedipolarcouplingsareproportionaltotheinversecubeofthe internucleardistance.Typicalcouplingsaresmall(afewHz)duetothemetal–metal distancesinproteins.However,thepresenceofsuchcouplingscanbeascertained,
Fig.3. SchematicdiagramoftheCP/QCPMGsequence.
Fig.4. Influenceof te inthetimedomainonthefrequencydomain.
inprinciple,byfollowingthewidthofagivenspikeletdependingonthetypeof experimentbeingperformed.
2.4.2.Datacollection
WehavealreadydiscussedtheadvantagestoaQCPMGdetectionschemeinthe previoussection.Nowwemustturnourattentiontothepracticalaspectsofthis experiment,namelywhatconsiderationsaretheretorunningsuchanexperiment? Whatfollowshereisadiscussionthatwehopewillproveindependentofspectrometervendorandsoftware.
Tobeginonemusthavethetimingofthesequenceunderstood,includingallthe deadtimesandfilterdelays.WesuggeststartingwithasampleofhighS/Nthatcan bereadilyobservedinashortamountoftime(saylessthanafewminutessothat parameteroptimizationcanbeperformed),withthespectrometerset-uptocollecta singleechowiththeADCsrunningatorneartheirmaximumrateandtheaudio filterssetwhereyouexpecttheactualanalytestobe(thismaybewithinthelineshape whichwillbeexplainedinamoment).Nowyouwillneedtoruntheexperimentand adjust t2 (see Fig.3)sothatthefirstpointacquiredisthetopoftheechoformed. YoudoNOTwanttouseleftshiftingtogettothetopoftheecho,thiserrorwould bepropagatedbytheechotrainandintroducetimingerrors.Itisnormalif t2 exceeds t1,andwilldependonwhattheaudiofiltersaresetto.Forexample,ifthefiltersare setto200kHz(or 7100kHz)onecanexpectanadditionalfilterdelayontheorder oftheinverseof200kHzor5 ms.ThiscanbeverifiedbyacquiringanFIDwitha filtersettingandthenagainwithavaluehalfaswide.Theechomaximumshould movecorrespondingtothechangeyoumade.Knowingthisdelay(callitdt orthe time t2 exceeds t1)onewillhavetoaccountforitincodingthepulsesequence.The reasonforthisisthattherearerequireddelayssurroundingthe p pulsestoprevent digitizingRFbreakthrough(orproberinging).Thesedelaysmustbesymmetricto keepthetimingonthesignalconsistentandshouldbekeptclosetotheoriginal t’s, whichwerepresumablychosentominimizeartifacts.Thedifferenceisthatinsteadof t1 onewillneedtocompensateforthedelaydt.Doingthiscompensationkeepsthe pulsetrainsynchronizedwiththeechoformationintheprobe,notwhenitisactually detectedwiththeADC’s.Thisisshownschematicallyin Fig.5
Fig.5. TimingdiagramoftheQCPMGsequence.
Thenextthingistodecidethespikeletspacingrequired.Thepracticalaspects ofthisaretwofold:firsthowbroaddoyouexpectyourlineshapetobeandsecond howmuchsensitivitygainisdesired?Aswehaveseenintheprevioussection themorespikesgeneratedinthetransformeddatathemoreaccuratelythelineshape isdescribed,butatatrade-offofS/Nperunittime.Forexample,youwouldnot wantyourlineshapedescribedbyonlyfourspikes,asitwillbealmostimpossible toextractanyNMRparameters.Theparameterbeingadjustedhereis te whose inverseistheseparationinfrequency.Therearetwowaystomakethischange, byalteringeitherthenumberofpointsintheechoorbythedwelltime.Remember thatwewanttoaccuratelyrepresentthelineshapeandthatthehalf-echocontainsthisinformation.Sochooseabalancethatwillnotoversampletoomuch, thetransformedspikescanbequitenarrowandyouwillneedaverylarge Fouriernumberinthetransformtokeepthedigitalresolutionadequatetodescribe thepeaks.Forexample,donotchoosea5MHzspectralwidthifthelineshapeis 50kHzwideandthespikesareeachonly10Hzwide.Asagoodstartingpointwe suggesta1MHzsamplingratewithaudiofiltersat100kHz(youdonotwantthe filtersmuchlargerthantheexcitationbandwidth)and te of500 ms(a2kHzspike separation).
Nextdecidehowmanyechoestoacquire.Thereareafewconsiderationshere, especiallyifyourequireprotondecoupling.Themajorconcernhereissample heating.Withalong T2 onemightbetemptedtoruntheechoesoutuntilthereisno moresignaltobehad.However,thiscaneasilyexceed100msmakingthedecouplingportionoftheexperimentalmostCWinnature.Besuretohavesomemethod ofheatdissipationnearthesamplearea,suchasbodyairorinthecaseofacryostat alargeflowofthecoolinggas.Withoutproperairflowthisexperimenthasgeneratedenoughheattovaporizesamples,liquefyplastic,orevenmeltsolderand detachtheRFcoil.Theotherlimitationhereisthespectrometer,astheremaybea limittothenumberofpointstheinstrumentcanacquire.Onceyoudecideonthe numberofechoesyouarenowreadytoacquireadataset.
ThefinaldetailthereaderwillneedtoputthisintopracticeisthechoiceofRF fieldstrength.Assumingoneisutilizingcrosspolarizationtogeneratemagnetizationtheexcitationbandwidthisalreadylimitedtothematchingfieldrequired. However,itisnotnecessarythatthetrainof p pulsesbesettothesameRFfield strength.Withamodesttosmallvalueof Cq,toostronga p pulsewillseverely distort59 theresultingdatasetsuchthatitdoesnotresembleapurequadrupole lineshape(andmaypreventasimulationoptimizationfromconverging).Theregimesto avoid arewheretheRFfieldstrength(oRF)forthe p pulsesiscomparable tothequadrupolarsplitting,i.e.
andwherethe oRF islessthanthesecond-orderquadrupolarlineshape,i.e.
oQ isdefinedas
or Cq/40for I ¼ 5 2.Thisisexemplifiedinthe 25Mgspectraof Fig.6.Thetoptwo spectraaremagnesiumacetateacquiredwithCPanda p pulseof4 msandanoptimized simulationwithquadrupoleparametersof Cq ¼ 3.02and Zq ¼ 0.72.Thebottom spectraarethesamesampleacquiredutilizinga15 ms p pulsewidthanditsrespective simulationcalculatedwith Cq ¼ 2.81MHzwith Zq ¼ 0.68.Theseparameterswere independentlyoptimizedshowingthatbyusinganexactdensitymatrixcalculationone canapproximatethelineshapetoextractvaluesof Cq and Z towithin10%error. However,thesenumberswouldbelessreliableforthosenuclidesthathavesignificant shiftanisotropycontributionstothelineshape,suchas 63/65Cu60–62 or 87/89Rb,63–65 aswellasdistortionsduetopulsewidth.Itis alsoworthnotingthattherearevaluesof Cq whereonecannotfulfilltheinequalitiesmentionedabove.Allofthesimulations employedwithinthemanuscriptwerecarriedusingtheprogramSIMPSON.115
When Cq islargeenoughthatthewidthofthelineshapeexceedstheexcitation bandwidth,thenoneisforcedtoperformmultipleexperimentssothatthecomplete lineshapecanbereconstructed.Thewholelineshapeisdividedintobins,eachbin correspondingtoanexcitationbandwidth.Thereadershouldnotethatsomeoverlapisdesiredsuchthattherearenobreaksduetonon-uniformexcitation.The transmitteristhenarrayedtothesefrequenciesandthesubspectracollected. Typically,theprobeneedsretuningevery 50kHztomaintainthe‘‘nominal’’ Hartmann–Hahn37 matchconditions.Theresultingphase-correctedsubspectraare re-referenced(byeitherleftorrightshiftingthe spectrum thenumberofpoints correspondingtotheoffsetorequivalentlyperformingafrequencyshiftinthe time
Fig.6. Finitepulsewidtheffectsinthe 25MgNMRofMg(OAc)2 4H2Oat50K/9.4Twith (a)42kHzRFand(b)11kHzRFfieldswiththeirrespectivesimulationsabove.
Fig.7. Frequencyshifted 67ZnNMRexperimentson[HB(3-tBu-5-Me-pz)3]ZnIdopedwith 2wt.%ofitsCoanalogat10K/9.4Twiththeresultingskyprojection.Transmitteroffsets wereasindicatedoneachsubspectrum.
domain66).Thedataarethencombinedtoformaskyprojection.67 Fig.7 depictsone suchprojectionandthesubspectrathatwereusedinitsconstruction.Itisimportant tonotethatprojectionsareutilizedtocombinethedatasets,NOTasummation.
2.4.3.Postprocessinganddatamanipulation
AtthispointthereadershouldbeabletoacquireaQCPMG-detected‘‘FID’’with ‘‘N’’echoesofspacing te.AtypicalmethodforfurtherincreasingS/Nistoapply
someformofapodization,suchasexponentiallinebroadening.Forasingledecay thisisadequate,however,atrainofechoeshastwotimeconstants.Asidefromthe T2 decayofthetrainthereisalsothedecayofeachhalf-echoandthentheriseofthe nextechoformation.Ifonlythefirsthalf-echowereacquiredthenthelinebroadeningappliedwouldbeamatchtothisdecay.Fortheperiodicnatureofthisdata setafunctioncanbedefinedtomatchthisrapiddecay,thenthefunctioninvertedto riseagain,andfinallythisnewfunctioncanbereplicated‘‘N’’timestomatchthe completetrain.Followingthisfunctionasecondapodizationforthesecondtime constantcanbeappliedtothewhole‘‘FID’’.Examplesofthesefunctionsandtheir effectonthedataaredepictedin Fig.8.
Whatfurthermanipulationsmightbedesiredotherthanmatchedapodization functions?Thereisalsothepossibilityofchangingtheechospacingafterthedata hasbeencollectedorcollapsingalltheechoesintoasinglehalf-echotogeneratea highS/Npowderpattern.Atthispointthereaderisreferredbackto Fig.4 in Section2.4.1toseetherelationshipbetweenechospacinginthetimevs.frequency domains.Nowsupposethedatasetcollectedwastoocoarseonthechoiceofspike spacing,ratherthancollectthedataagainwithmoretransients(finerfrequency spacingwillcostinS/N),onecouldinsteadzerofillbetweentheechoesinthetime domaintoadjustthewidthof te.Ofcourse,theinversealsoappliesinthatiftoo fineaspacingwascollectedthenpointscouldberemovedfrombetweentheechoes foragaininS/Ninthetransformedspectrum.Further,onecouldcollapsetheecho trainitselfbycombiningalltheindividualechoeswhereeachfullechoissummed andthensplit,inverted(soeachhalfisadecay),andfinallysummedagaintoforma singlehalf-echo.Inprinciple,assuminglittleorno T2 decay,thismethodaffordsa
Fig.8. Simulated‘‘FID’’andapodizationswhere(a)isthe‘‘raw’’data,(b)thematched apodizationfunctionwitha2kHztimeconstant,(c)thematchedfunctioncombinedwitha 25Hzexponentialdecay,and(d)theresulting‘‘FID’’withtheapodizationapplied.
S/Ngainoverasingleechoproportionalto ð1 þ 2N Þ p ,where N isthenumberof echoesinthetrain.68
Tosummarizethesectionthusfar:wehavewalkedthereaderthroughour methodofsettinguptheQCPMGdetection(thisisindependentofhowtheinitial magnetizationwasgenerated),practicalconsiderationsforexcitationbandwidthfor bothlargeandsmallvaluesof Cq,aswellassomedifferentwaystheacquireddata canbetreated.Thefollowingsectionwilldealwithinterpretingtheresultingdata. Thereareafewpointsthatareuniquetothespectroscopyofmetalsinproteins.
2.4.4.Datainterpretation
Toreview,wheninvestigatinghalf-integerquadrupolarnuclidesbysolid-state NMRmethodstheprincipalobservableisthecentralor 71 2 transitionforthatspin. TheexperimentweareutilizingisCP28 followedbyaCPMGtrainof p pulses.57,58 Consideraspin 5 2 nucleus,suchas 67Znor 25Mgwithanunknownvalueof Cq;there aretwopossibleextremesthatonecanfindwiththeseexperiments:first,forasmall valueof Cq wherethecentraltransitionlineshapeisnarrowandtotallycontained withintheexcitationregion,andsecondthat Cq islargeandtheexpectedlineshape isquitebroad(requiringseveralsubspectraatdifferentoffsetstoreconstructthe completespectrum30).Afurtherquestionistheselectivityoftheseexperimentsfor the 71 2 transition.Thesetransitions( 3 2 2 1 2 ; 5 2 2 3 2 )alloverlapasindicatedin thesimulateddatain Fig.9,wherethetopspectrumisaspin 5 2 lineshapewithan Z of1andthelowerspectrumisthesameexceptwithan Z of0.Onecanseethatfor Z ¼ 1thereissignificantoverlapofintensitycenteredonthe 71 2 transition.This becomesimportantfortheinvestigationofquadrupolarmetalsinproteins,aseach proteininvestigatedthusfarhasexhibitedavalueof Zq of1.Inonesensethisis helpfulinthatthereisnowonelessparametertooptimizeinsimulatingthese lineshapes.However,inthecasewherethereislowS/Norsignificantstatic
Fig.9. Simulatedspectraofaspin 5 2 witha6MHz Cq with Z of(a)1.0and(b)0.0ata 31.3MHzresonancefrequency(67Znat11.7T).
disorder,theedgesofthecentraltransitioncanbedifficulttoestimateinducing uncertaintyintheextractedvalueof Cq.Thequestionofselectivityfurthercomplicatesthesedeterminationsastheoutertransitionsarealsoexcited(evenwith selectivepulses).The 3 2 2 1 2 transitionhasaHartmann–Hahnmatchcondition veryclosetothe 71 2 transition.69–72 RecallfromtheHartmann–Hahncondition (Eqs.(5)and(6))thatthefactor a fora 5 2 spin(like 67Znor 25Mg)is3forthe 71 2 transition,howeverforthe 3 2 2 1 2 transitionthisfactoris 8p .Toanalyzethese data,anexactcalculationwasperformedutilizingfinitepulsewidthsandacompletedensitymatrix.TheresultsofthatcalculationdemonstratedthattheQCPMG trainalsopopulatestheoutertransitionsevenwithselective p pulses.Tosimulate morecloselyhowtheexperimentisactuallyperformedthetransmitterfrequencyin thesimulationwasmovedevery20kHz(from 200to+200kHz,andincoarser stepsoutsidethatrange),adataset‘‘acquired’’usingaQCPMGsequence(noCP), followedbyaskyprojectionofthedatatoreconstructit.Theresultingsimulation ofa10MHz Cq iscomparedwithasimulatedlineshapeofonlythecentraltransitionin Fig.10a
Armedwiththeknowledgethattheoutertransitionsofthe 67Zn(orother quadrupolarnuclides)canalsobeobservedratherthansimplythe 71 2 transition, onecandeviseastrategyfordistinguishingthedesired 71 2 transitionfromany extraneousresonance(s)/featuresarisingfromtheoutertransitions(specificallythe 3 2 2 1 2 ).Thesimplestmethodistosimulatethelineshapeusingonlythecentral transitionasin Fig.10aandb andcomparethewidthofthecentralportionofthe lineshapestoseeifthecalculatedspectrumadequatelydescribesthebreadthofthis feature.Ifnot(asin Fig.10b)thelikelihoodisthattheoutertransitionsarealso beingobserved.Thespectrumcanalsobeacquiredathigherfield(i.e.from9.4to
Fig.10. SimulatedsteppedfrequencyQCPMGdatawithsuperimposedsimulationsof(a) 71 2 transitionwith Cq of10MHz,(b) 71 2 transitionwith Cq of28MHz,and(c)allthe transitionsofa Cq of10MHzat11.7T.
18.8T),whichallowstheseparationofthesecond-orderquadrupolarlineshape fromthefirst-orderlineshapeoftheoutertransitions.Bydoublingthefieldthe centraltransitionlineshapehashalfofthewidthofthelowerfield,whilethe 3 2 2 1 2 contributionremainsthesame(thusdroppinginintensityrelativetothe centraltransition).Ifthecomparisonoftherelativeintensities(centralpeakvs. plateau)isinvariant,thentheoutertransitionsarenotcontributing.
Thepreviousdiscussionforthemostpartonlyappliestometalsinaprotein; however,crystalline,smallmoleculesarenotconstrainedtoanyasymmetryparameter.Likewise,thusfartherehasbeennomentionofcontributionsfromthe shieldingtensor.Asasuggestedstrategyoneshouldattempttosimulatethelineshapeusingonlythequadrupoleinteraction,howeverifthisisnotsatisfactorythen twopossibilitiespresentthemselves:namelychemicalshieldinganisotropy(CSA)or samplepurity.Todistinguishbetweenthesetwooptionsonehastomakeuseofat leastonemoremagneticfield(aslargeadifferencefromthefirstaspossible).Owing tothelinearnatureofthefielddependenceoftheCSAandthecorresponding inversedependenceofthequadrupolarcontributionstothelineshape,theutilizationofmultiplefieldsbecomesnecessaryfordisentanglingeachoftheinteractions andtheirrelativeorientations.Ifthelineshapedoesnotfollowthepredictedfield dependencethenmostlikelyisthepresenceofanotherspecies.Thisassumesone hasperformedthesimulationsaccountingforfinitepulsewidtheffectsandallowed forthepresenceofstaticdisorder(especiallyinproteinsamples).Asforsample puritythereareagainafewpossibilities,suchasimpurities,phasetransitions, reactionproducts,equilibriumstates(suchasapHdependence),ornon-specific binding.Weleaveittothereadertodeterminethequalityoftheirsample,however, thedatacanstillbeinterpretedinthesamemannerifeachspeciesisdistinct.The caseofnon-specificbindingpresentsafurtherchallengeasthesespeciesarenot distinctandwilloftenmanifestasanensembleofoverlappinglineshapesthatcannotbesimulated.
2.5.Sampleconsiderations
2.5.1.Staticdisorder
Settingasidethenativedisorderthatexistswithinproteins,73 low-temperatureexperimentsarenotoriousforinducingproblemsassociatedwithstaticdisorder.74 Foragivenvalueof I,thewidthofthequadrupolelineshapeinourexperimentsis proportionalto C 2 q .o0 ,wheretypicalvaluesof Cq canbetensofMHz.Hence,the disorderisbeingaveragedinsomefashionoveraninteractionthatspansseveral MHz.ThisproblemislessseverewhencomparedtothoseobservedinEPRspectroscopy.Inthiscasethequantitybeingaveragedistheelectronspinspectrum, whichcancovermanyGHz.Theproblemof reducing theconsequencesofstatic disorderinEPRspectroscopyhasbeensolved.Thiswasaccomplishedbyutilizinga cryosolventcomposedof30%glycerol/water.Therearestilloutstandingissues associatedwiththedetailsofsystemswhichbenefitfromannealingthefrozen
solutionornot,buttheutilizationofthissolventsystemhasgivenusthebest lineshapeswehaveobservedforourproteinsystems.Thiscryosolventhasenabled ustobeabletofinallyaddressissuesassociatedwiththeseparationandrelative quantitationofmultiplespecieswithinagivenlineshape.This,inturn,hasledusto beabletomakesensiblecommentsrelativetostoichiometry,pKa,andspeciation.
2.5.2.Non-specificbinding:consequencesandpotentialsolutions
AsmentionedinSection1,thereisakeydifferencebetweenMg2+ andZn2+: namelythenatureofthebindingtheyhavetotheirrespectiveproteins.Thebinding constantsforZn2+ areusuallyreflectiveoftightbinding,whereasforMg2+ the bindingistypicallyweaktomodest.Suchadifferencehasnoconsequencesinan X-rayscatteringexperiment,becausetheexperimentissensitivetolong-rangeorder andasaresultdoesnot‘‘see’’thenon-specificallyboundMg2+.Thisisnotthecase intheNMRexperiment,theexperimentobserves all oftheMg2+.Hence,astrategy hastobedevelopedtodistinguishbetweenspecificallyandnon-specificallybound Mg2+.
Non-specificbindingcanbethoughtofsimplyasanundesiredbackgroundsignal thatmustberemoved.Thetypicalmethodforremovingabackgroundsignalisto haveablanksamplethathasthesamemeasurementsperformedonitandtheresult issubtractedfromtheanalyte.Thechallengeistocreateaproperblankforthis typeofsystem.ForMg2+-dependentproteins,theapproachwehavetakenisto utilizesite-specificmutationstoremovealloftheMg2+-bindingsitesofinterest. Thecaveatisthatthemutantproteinshouldfoldintoasimilarstructureasthe nativeproteinsuchthatnoalternativemetal-bindingsitesarecreated.Inthecase whereasubstrateispresentintheanalyte,theblankshouldalsocontainthe substrate.Forexample,aDNA-bindingproteinshouldcontainDNAintheblank aswell(preferablyboundinthesamemannertothenativeprotein).Thisensures thattheblankcontainsasmanyofthesamenon-specificbindingopportunitiesas possibletomimictheanalyte.
Oncethisproperblankhasbeenidentifiedthenthespectroscopyproceedsasone mightexpect.Thefirststageistoobtain 25MgNMRspectraoneachsampleatthe desiredMg2+ stoichiometry,pH,andifapplicablesubstrateconcentration.The differencespectrumshouldyieldaspectrumconsistentwithMg2+ boundtothe site(s)ofinterestunclutteredbynon-specificbindingeffects.Thisstatementistrue eveninthepresenceofDNAaslongastheblankcontainsthesameDNA.Note thatifthesubstrateisDNAthensaltingtheDNAwithhighamountsofK+ before addingtheMg2+ insamplepreparationwouldbeprudent.Recallthatwithinthe celltherelativeamountsofK+ toMg2+ are 4–5and 400forfreeandbound, respectively.75
Weillustratethisprocedureusingtheproteinalkalinephosphatase(AP).AP typicallybindsthreemetals(twoZn2+ andaMg2+),whichareconsideredtightly boundandstabletodialysis.However,inthe 25MgNMRspectrumthereisalso evidencefornon-specificallyboundMg2+ thatisdistortingthecenterofthelineshape,shownin Fig.11.TheblankchoseninthisexamplewastheD153Hmutant,
Fig.11. 25MgNMRspectrumof(a)nativeAPatpH7inthepresenceofexcessMg2+,(b) D153HmutantofAP,and(c)thedifferencespectrum.Superimposedonthedifference spectrumisthefit(usingidealpulses)witha Cq of3.5970.08MHz.
whichremovesthecriticalresidueforMg2+ binding.Oneobviousdistinctionbetweentheblankandthenativeprotein’sNMRspectrumisthattheblankhasa narrowlineshapecomparedwiththeanalyte.Thiscanbeseenin Fig.11 alongwith thedifferencespectrum.
TomakethisstrategyworkrequireshighS/Ninbothexperiments.Furtherthe differenceentailsanarbitraryamountoftheblanktobesubtractedfromtheanalyte.Thiscanonlybedeterminedempirically.Thereareobviouslimitssuchasif negativeresonancesaregeneratedinthedifferencespectrum.Thereaderwillhave tousejudgmentbasedonwhatisconsistentwithatheoreticallineshape.Ina determinationofanunknownstoichiometryatleastanadditionaltwoexperiments willneedtobeperformedeachatdifferentloadings.
3.COUPLINGSPECTROSCOPYWITHSTRUCTURAL INFORMATION
Wehaveseenintheprevioussectionsamethodforacquiringhigh-sensitivitydata forhalf-integerquadrupolarnuclidesaswellasstrategiesforinterpretingtheresults.Theseexperimentsallowadirectmeasurementofthequadrupolecoupling constant,orthezz-elementofthefield-gradienttensor,howeveritisoftendifficult tointerprettheseresults.Whatisneededistobridgethegapbetweenanystructural
dataandtheNMRresults.Thiscanmeanrefiningthestructurewithdistance measurementsorrestraintsgeneratedfromtheintroductionofdipolarcouplings intotheexperiment.Analysisofdipolar-coupledspectracanleadtodistancedeterminationandorientationswithinthemolecularframe.Further,aswehavepreviouslystated,thevalueof Cq issensitivetotheelectrostaticsaroundthenucleusin question.Utilizingmoleculartheorytocontrastpredicted Cq’sofmodelsofthe systemofinterest,onecangenerateacomprehensivedescriptionofthecenterof interest.Thisincludesdeterminingthepresenceorabsenceofachargeinthecoordinationsphereorlocatinghydrogen-bondingnetworks.Thefollowingsections detailthesemethodsforextractingorinferringstructuralinformationfromthe experiment.
3.1.Homonucleardipolarcouplings
Typicaldistancemeasurementsbysolid-stateNMRmethodsareaccomplishedby meansofarotationaldoubleresonanceexperiment(REDOR).76,77 Thisinvolves rotor-synchronized p pulsesonthe I-spinsforvaryingcyclesfollowedbythesame experimentswithsynchronized p pulsesonthe S-spins.Thetwosetsofexperiments aresubtractedtocreateasetofdifferencespectra,whichdecaybasedonthestrength ofthedipolarinteraction.Similarlythesametypeofdatasetscanbecreatedfora staticcasewithaspinechodoubleresonance78 (SEDOR)experiment.Thesetwo methodsareeffectiveforthecaseofaheteronuclearspinpair,butdonotworkfor homonuclearcoupling.EngelsbergandYannoni79 usedaCPMGtraintoremove theinhomogeneousbroadeningwhilepreservingthedipolarinteraction.Thetopsof theechoesfromtheCPMGtrainareFourier-transformedtogiveaPake80 doublet fromwhichtheinternucleardistancecanbeinferred.Thisisanalogoustohomonuclear-coupled 1H’sdisplaying J-modulationofthetime-domainresponsetoa trainof p pulses,81 wheretheechotopscanbeFourier-transformedtorecoverthe J-couplingbetweenthespins.EngelsbergandYannoni79 alsonotedthepresenceofa spinlockcomponentintheirspectra.Ifthecouplingsaresmallthiscomponentcan dominatethespectrumleadingtoaninabilitytomeasurethecouplings.
Considernowthisexperimentappliedtoapairofquadrupoles,fortwolikespins thetruncateddipole–dipoleHamiltonianisgivenby
Here D isgivenby
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marito, giurando a tutti che in quel giorno egli trovavasi presso di lei. I fratelli le tennero il broncio e non le parlarono più; ma la povera donna sfidò l’odio ingiusto del Vasa, e protestò sempre energicamente contro l’arresto del suo innocente marito. VIII.
La posta al cinghiale
Dal giorno dell’assassinio della madre di Pietro Vasa, non vi fu più tregua. Era un continuo succedersi di combattimenti sanguinosi e di uccisioni: una caccia di fiere che si davano uomini contro uomini.
Era un lutto generale; il terrore regnava sovrano in quelle contrade. Sul far del giorno, prima di recarsi in campagna, i figli abbracciavano i padri — le sorelle abbracciavano i fratelli, come se mai più si dovessero rivedere. Non erano sicuri di ritornare la sera in seno alla famiglia. E lungo la giornata erano ansie, spasimi, trepidazioni; preghiere a Dio ed ai santi. Un ritardo li spaventava; una fucilata li faceva trasalire.
Nè avevano torto di temere a tal segno. Si correva rischio di esser uccisi in campagna, in paese, e persino sulla soglia della propria casa. Zii, nipoti, cugini, congiunti di terzo e quarto grado, tutti cadevano da una parte e dall’altra, senza tregua.
Potrei ma non voglio più oltre far nomi; la penna si rifiuta ad enunciare il numero delle vittime cadute in quell’eccidio. Perchè il lettore possa farsi un’idea delle stragi che funestarono la campagna d’Aggius dal 1850 al 1856, mi basterà accennare, che il numero dei morti fra le due fazioni superò la cifra di settanta, e che nella statistica dei cinque anni furono registrate oltre quaranta vedove.[19]
I due capi fazione, senza mai stancarsi, continuarono ad eccitare i congiunti e gli amici alla vendetta e alla strage. Ed erano ben singolari quei capi! L’uno vecchio, freddo stratega, che dirigeva
l’esercito dalla sua tenda; — l’altro giovane ardente, che era generale e soldato ad un tempo.
Pietro Vasa, fin dal primo attacco, aveva preso la campagna per sfuggire alle insidie dei nemici e dei carabinieri. Egli contava, sopra un braccio forte — sul braccio di suo cugino Bastiano il muto.
Costui, non solo aspettava che Pietro gli designasse la vittima da colpire ma non risparmiava il nemico se gli capitava fra i piedi. Il suo occhio come il suo fucile non fallivano mai! Quando stabiliva di disfarsi di qualcuno, i suoi occhi mandavano lampi, i suoi muscoli si contraevano e persino la sua lingua paralizzata sapeva trovare una parola; lu tumbu! — parola che nel suo linguaggio di fiera significava: lo uccido!
Il muto era strumento del Vasa — e questi sapeva valersene perchè possedeva il segreto d’insinuarsi nell’animo di quel disgraziato che somigliava più ad una belva che ad un uomo.
Eppure — strano invero! mentre tutta la Gallura designava il muto come il più inesorabile dei sicari, nessuno avrebbe saputo nominare le vittime da lui immolate. Vi ha chi afferma, che Bastiano non odiasse e non perseguitasse che i soli uccisori del fratello. Quanti omicidi imputati ai Vasa, ai Pileri e ai Mamia furono invece commessi dal muto! E quanti delitti, al muto imputati, furono forse consumati da assassini che seppero nascondersi nell’ombra e nel silenzio!
Il vecchio Mamia era rimasto fin’allora incolume. Esperto generale, aveva saputo deludere gli agguati del nemico, e si guardava bene dall’esporre la sua vita. Dalla sua casetta d’Aggius, o dai suoi stazzi, sapeva dirigere i feroci scontri; che a lui dava il nome di giusta vendetta. Nessuno sapeva come e quando il Mamia uscisse di casa per visitare le sue campagne e i suoi stazzi; nè quando e come rientrasse nel suo covo.
Nel giorno di S. Giovanni il vecchio voleva recarsi alla campagna di Pietro Carlotto, situata a poca distanza da Tempio. Diversi amici lo avevano più volte avvertito di non fidarsi, perchè gli avversari potevano preparargli un brutto tiro. Il Mamia disprezzò i saggi consigli; continuò a fidare nella sua sagacia, e rispose agli amici ch’era troppo sicuro di sè.
La mattina del 24 giugno 1855 — giorno di San Giovanni — Antonio Mamia non mancò di recarsi alla solita campagna. Invano i suoi amici tentarono di dissuaderlo; egli fu irremovibile, e vi andò. Pareva che il destino lo trascinasse per i capelli sul luogo del supplizio.
Mentre in compagnia di un amico guardava il rio Veldidonna, si udì una scarica di fucili, e Antonio Mamia cadde colpito a morte da una palla. Venti e più uomini fin dal mattino si erano appiattati dietro ai graniti ed ai lentischi, aspettando al varco il formidabile nemico come si aspetta un cinghiale. — La sua morte era inevitabile; perocchè tutti in quel giorno, erano decisi di fargli fuoco addosso, fino a freddarlo. Il compagno del Mamia prese la fuga; e gli fu sparato contro, più per fargli paura che per intenzione di ferirlo.
Il vecchio capo della fazione Mamia era caduto, nè è a dirsi quanto ne gioissero in quel giorno Pietro Vasa ed i suoi. La morte del vecchio non salvava Pietro dall’ira degli avversari; ma che perciò? Antonio Mamia era stato ucciso per ilprimo — e ciò costituiva una soddisfazione ed una vittoria per il partito avverso. IX.
Le paci d’Aggius
Nei tre o quattro mesi che precedettero l’agguato da noi descritto, si era verificata una certa tregua nelle uccisioni; appena però fu ucciso il vecchio Mamia, i suoi parenti si destarono più inferociti che mai, e ricominciarono gli assalti ed i delitti.
La popolazione della Gallura era ormai stanca di cinque anni di lotte, di ansie e di paure; si aveva bisogno di un pò di quiete, e tutti la desideravano ardentemente.
Il Governo vedendo infruttuosi i tentativi fatti per mezzo della forza, aveva pensato di tentare le paci fra i due partiti; così almeno, se non era riuscito ad impadronirsi dei colpevoli, avrebbe impedito nuove uccisioni e nuove stragi in Gallura.
L’intendente di Tempio — allora Angelo Conte — cominciò ad accordare salvacondotti ai fuorusciti; e primo fra tutti chiamò presso di sè Pietro Vasa per persuaderlo alla conciliazione coi suoi nemici.
Il Vasa aveva ascoltato le parole dell’Intendente colle braccia sul petto e col capo chino, in atteggiamento d’uomo che rifletta alla risoluzione che deve prendere.
Appena ebbe udito la proposta, levò con alterigia la fronte corrugata, e rispose risoluto:
— Sta bene: vi darò la risposta. — E fece per andarsene.
— Hai forse bisogno di consultare qualcuno?
— Sì.... consulterò mia madre. Se essa mi dirà di sì, acconsentirò volentieri a far pace coi Mamia.
— Che vuoi tu dire?
— Voglio dire, che io perdonerò ai miei nemici, sol quando mia madre, ch’essi hanno ucciso, tornerà dall’altro mondo per darmene il permesso.
— Pietro! — gli disse l’Intendente col piglio severo — anche al vecchio Manna hanno ucciso un figlio — e se non erro, fu ucciso prima di tua madre!
Pietro non rispose.
— Sei molto più superbo di loro o Pietro! Parmi che i Mamia, nell’accettare la conciliazione, siano più generosi di voi. Ad essi fu ucciso il capo; tu invece sei vivo!
Pietro continuò a tacere; l’ostinato silenzio in cui egli si chiuse, ben fece capire all’Intendente che ogni ulteriore esortazione sarebbe riuscita vana.
Il Vasa tornò alla campagna, e per altri otto mesi non se ne fece niente. Gli odi e le uccisioni ripresero il loro corso.
Ma ciò che non potè il governo, lo potè infine la religione. Il Rettore d’Aggius, Leonardo Sechi — oggi vicario di Tempio — si prese l’incarico di ridurre alla ragione quelle belve. Egli era molto amato in paese, e godeva a buon diritto la fiducia generale; era stato lui che aveva favorito la cerimonia dell’abbraccio: lui ch’era stato fra gli arbitri nelle diverse questioni sorte fra i Vasa e i Mamia; lui infine, a cui i due partiti avevano fatto le più segrete confidenze. Di comune accordo colle persone più saggie ed influenti del paese, e col concorso di Raimondo Orrù (Intendente di Tempio, succeduto al Conte) il Rettore riuscì a persuadere le due fazioni dei Vasa e dei Mamia a riconciliarsi. I principali capi delle due famiglie nemiche si recarono a Tempio muniti di salvacondotto, e furono presi i necessari accordi per la cerimonia delle paci. E ciò avvalora le parole rivolte dal Re Carlo Alberto al Padre Bresciani: valere, cioè in Sardegna, più una dozzina di buoni missionari, che dieci reggimenti di soldati.
Eppure, poco mancò che le paci non andassero a monte per la seconda volta. Altre contestazioni, all’ultimora, sorsero fra le due famiglie avversarie. Michele Pileri (che capitanava la fazione Mamia dopo la morte del capo) non voleva che sulla spianata di S. Sebastiano, insieme agli altri, si schierassero due parenti di Pietro Vasa, non compromessi con la giustizia a causa della fazione, bensì come sicari, avendo essi assassinato un uomo mediante compenso. Il Vasa, dal suo canto, rifiutava recisamente di accettare le paci, se non intervenivano alla cerimonia i due coniugi che si volevano scartare. Così almeno, fu trattato e questo prova l’onestà e la fierezza di quei galluresi: i quali, pur acciecati da un odio
implacabile, sdegnavano di aver a fianco chi si era macchiato di sangue umano per ingordigia di denaro, non per scopo di vendetta.
Il momento era decisivo: trattavasi di oltre cinquecento persone compromesse, già radunate in un luogo stabilito per intendersi sulle paci; trattavasi, che ciascuna delle due fazioni teneva pronti, in piede di battaglia, quattordici uomini scelti che all’occasione potevano fare una strage; trattavasi, infine, del pericolo di rendere inutili le pratiche fatte per indurre gli avversari ad un accordo che doveva apportare la pace e la tranquillità nella Gallura.
E la buona riuscita di questa conciliazione si deve in gran parte al giudice d’Aggius Celestino Concas, che incaricato dall’intendente Orrù, e venuto a colloquio co’ nemici, fece sì che Pietro Vasa rinunziasse alla presenza dei suoi due parenti sul campo di S. Sebastiano — col patto però, che le paci con essi si sarebbero stabilite più tardi, nella chiesa di S. Francesco.
Il 26 maggio 1856 fu un giorno memorabile per la Gallura.
Nel famoso campo di S. Sebastiano — quasi alle porte della città di Tempio — fin dall’alba accorrevano a frotte uomini e donne dai vicini villaggi e dalla campagna. Erano famiglie intiere dell’una e dell’altra fazione, che convenivano là per la sospirata pace. Gli avversari volevano darsi il bacio del perdono, alla presenza di un ministro che avrebbe loro parlato la parola di Cristo.
Era il mese di maggio. Sette anni precisi dal giorno dell’abbraccio, che aveva avuto luogo nello stazzo Giunchicchia nel 1849.
Oltre seimila persone erano in quel campo, fra attori e spettatori, offesi e difensori, testimoni e curiosi. Non mancava alcuno, neppure un fanciullo; perocchè la mancanza di esso sarebbe bastata per far rompere le paci. Si sarebbe potuto dire, che il fanciullo assente, non legato a giuramento, pensasse a far le vendette diventando adulto. Vi assistevano anche molte signore; tant’è vero che il Vasa ebbe a
dire ad un suo vicino: essere venute a curiosare e a far sfoggio di ricche vesti.
Sopra un palco costrutto per la circostanza, sormontato da un gran crocifisso, era il ministro della chiesa. — Il P. Carboni frate scolopino, venuto appositamente da Sassari. Da una parte e dall’altra, divise in due schiere, a dieci passi di distanza, erano due lunghe file di avversari; a destra del frate i coniugi del Vasa, con a capo Pietro — a sinistra quelli del Mamia, guidati da Michele Pileri.
Il frate cominciò a voce alta la sua predica, esortando quei feroci alla pace ed al perdono, in nome di Cristo.
Terminato il sermone, le due schiere si slanciarono l’una verso l’altra, ed offesi ed offensori si baciarono sulla guancia.
Narra la cronaca, che fra le schiere ci fosse un fanciullo ostinato, che non voleva baciare sul viso alcuno degli avversari: e non fu che dopo mille preghiere ed esortazioni che si decise ad accostare la bocca alle guancie del nemico di suo padre. Quest’incidente turbò alquanto la cerimonia, ma fu cosa di un momento.
Era uno spettacolo commovente. Quasi tutta la Gallura assisteva a quel solenne perdono; e molte donne, e vecchi e fanciulli scoppiarono in pianto, forse ripensando ai tanti morti che giacevano sotto terra, colpiti dall’odio e dalla ferocia. Oltre la metà dei componenti le due fazioni vestivano ancora il lutto!
E doveva essere uno spettacolo imponente, vedere quella moltitudine composta d’uomini e donne, di vecchi e di giovani, di fanciulli e di bambine — tutti là, intorno a quella chiesa in rovina e col tetto a metà smantellato, posta nel centro di un campo estesissimo, dal quale si domina uno stupendo orizzonte! — A tramontana la punta della Balestra, le montagne di Padule, e più in là il monte Crosta della Corsica: a mezzogiorno la città di Tempio, da cui spunta il campanile della cattedrale col suo gallo irrequieto; a levante la catena dei monti di Limbara; a ponente infine le frastagliate punte dei monti d’Aggius col sottostante paese, centro delle tremende inimicizie che lo avevano decimato. I tre villaggi di
Nuchis, Luras e Calangianus erano là sotto, quasi a testimoni di quel solenne giuramento.
Verso sera, il campo era sgombro, i curiosi spettatori erano rientrati nelle loro case, e le turbe venute per le paci avevan fatto ritorno ai propri paesi od alla campagna. Per la prima volta, sui loro volti si leggeva la serenità e la fiducia poichè finalmente potevano camminar sicuri, senza tema d’esser colti all’impensata dai nemici.
E ho detto senza tema, perchè la parola del gallurese è sacra; e dopo aver concesso il bacio del perdono, è ben difficile trovar chi manchi alla promessa ed al giuramento. In mezzo agli odi di parte che li rendono quasi crudeli, torna ad onore dei figli della Gallura questo sentimento di dignità, di cui si mostrano tanto gelosi.
Fra i mille individui che formavano le schiere degli avversari convocati per le paci, due sopra tutti avevano attirato la curiosità degli astanti. Pietro Vasa, l’antico fidanzato di Mariangiola, e causa prima delle inimicizie; e Bastiano il muto, in fama del più sanguinario dei fuorusciti, e l’unico che avesse opposto resistenza, quando fu pregato d’intervenire alle paci.[20]
Ad ogni modo, il 26 maggio 1856 fu per Aggius una giornata memoranda. Nel paese si fecero feste; e gli abitanti, tutti commossi, si abbracciarono l’un l’altro, come se si fossero riveduti, dopo sette anni di separazione.
PARTE TERZA
GLI AMORI DEL BANDITO
Un raggio nelle tenebre
Fatte le paci, il muto riprese il fucile, che durante la cerimonia aveva deposto nella casa di un suo amico di Tempio, lasciò il campo di S. Sebastiano, e si diresse ad Aggius per la viottola tortuosa che allora vi conduceva.
Che importava a lui delle paci concluse fra le due fazioni? Egli continuava ad essere il perseguitato dall’umana giustizia, e la sua condizione non era mutata. Tutti i suoi conterranei erano ritornati alle proprie case per godere in seno alla famiglia un po’ di quiete e di pace egli però non poteva ciò fare, poichè non aveva casa nè famiglia. Il suo covo erano i crepacci di granito e le spelonche dei monti d’Aggius e di Bortigiadas. Quale il suo vantaggio? — Invece di due, doveva guardarsi da un sol nemico, dal carabiniere!
Negli stazzi era una festa continua; i giovani e i vecchi, donne e fanciulli si erano riuniti insieme, tranquilli finalmente. Erano cessate le loro ambasce, i loro timori, le loro trepidazioni. Per il muto niente di nuovo; per lui le paci erano state una pantomima ridicola; aveva veduto un mondo di gente sul campo di S. Sebastiano; aveva veduto i due avversari schierati l’uno in faccia all’altro, facendo gesti strani; aveva veduto un sacerdote colle braccia levate al cielo e con le labbra contratte — ma non aveva udito nè le preghiere del ministro
di Dio, nè la parola de’ suoi nemici. Per lui quella cerimonia era stata una formalità a cui si era piegato senza coscienza. Che sapeva egli di accordi? Sapeva solo che i parenti lo avevano circondato, trascinato a Tempio con un salvacondotto, e costretto a prestare un giuramento.
Il muto si era accompagnato col Vasa, suo cugino, ancor esso bandito, e venuto alle paci con un salvacondotto; ma era ben diversa la loro condizione! Il Vasa da qualche anno aveva tolto moglie, era padre e ben sovente penetrava inosservato nello stazzo della Trinità, per rivedere i suoi cari e per sedersi al desco, in mezzo alla famiglia.
Bastiano era solo; compagno e confidente del cugino, egli non aveva servito che come cieco strumento di vendetta. In fondo al cuore non nutriva odio di parte — odiava solo chi gli aveva ucciso il fratello; gli altri delitti li commetteva per cieca ferocia, per brutale istinto in lui nato per la fatalità degli eventi. Egli si batteva con coraggio; nè vi era alcuno che lo vincesse in temerità. Disprezzava la vita perchè abituato al silenzio, e perchè muta com’esso.
Errava dall’una all’altra cussorgia, stanco, annoiato della vita; girava intorno i suoi grandi occhi neri, quasi volesse avvertire con essi le pedate dei carabinieri; la sua sordità doveva renderlo più circospetto. Aveva visitato tutte le montagne — dal monte Pulchiana a monte Spina, dal monte Ruiu al monte Cucurenza; aveva guadato tutti i fiumi — dal rio Sirena a Conca di Chiara, da Turrali a Fiuminaltu; qualche volta si spingeva fino al litorale — tal’altra faceva notte sul monte Cùcaro, antico protettore dei banditi d’ogni specie.
Il monte Cùcaro ha una storia; esso è sinistramente celebre, essendo stato nel secolo scorso il quartiere generale dei fuorusciti perseguitati dalle armi regie. Vi si raccolsero persino trecento banditi, sotto diversi capi squadriglia, fra i quali, Don Gavino Delitala, i fratelli Pintus di Nulvi, i Cubeddu di Pozzomaggiore e i Fois di Chiaramonti. Su questo monte i banditi ebbero molti scontri coi soldati, riuscendo or vincitori, or vinti. Vincitori — come nel 1745, in cui misero in fuga le compagnie svizzere capitanate dal colonnello Sumaker, dopo aver ucciso 75 soldati; e nel 1746, in cui, dopo aver
