Revista de Técnicas Inmunológicas

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NO. 26

INTEGRANTES DEL EQUIPO: 1. GARCÍA HERNÁNDEZ MILDRED YERADI. 2. GUTIÉRREZ VÁSQUEZ ALEJANDRA. 3. IGNACIO VARELA ESTEFANÍA. 4. RUÍZ PÉREZ URIEL ALEJANDRO. 4to Semestre.

Grupo: Q.

Fecha de entrega: 28/04/22

Índice NOMBRE:

No. DE PÁGINA:

Introducción --------------------------------------------------- 3 Fundamento de la Reacción de Aglutinación --------------------------------------------------- 4 Grupos Sanguíneos --------------------------------------------- 5 Factor Rh ------------------------------------------------------ 6 Factor Reumatoide ----------------------------------------------7 Proteína C. Reactiva ------------------------------------------- 8 Reacciones Febriles -------------------------------------------- 9 VDRL --------------------------------------------------------- 10 Fundamento de las Reacciones de Precipitación------------------- 11 Antiestreptolisinas --------------------------------------------- 12 Detección de Inmunoglobulinas por Inmunodifusión -------------- 13 Fundamento de las Pruebas Enzimáticas --------------------------14 Técnicas de ELISA ---------------------------------------------- 15 Determinación de Hormona Gonadotropina Coriónica Humana ---- 16 Técnicas Especiales --------------------------------------------- 17 Fundamento de la Inmunofluorescencia.

Fundamento de las Pruebas con PCR ----------------------------- 18 Bibliografía ------------------------------------------------------ 19

INTRODUCCIÓN La elaboración de esta revista de técnicas inmunológicas tiene como principal objetivo que a los lectores les sea de gran ayuda para la comprensión de todas y cada unas de las técnicas presentadas, teniendo en cuenta que los elaboradores somos estudiantes, por lo cual, lo descrito en dicha revista es lo más claro y detallado posible.

Es de gran importancia tener en cuenta que algunas de las técnicas van a ser realizadas en el laboratorio escolar, por ello, se encuentran muy detalladas con su objetivo, fundamento científico, material, procedimiento e interpretación de los resultados con el fin de obtener éxito al finalizar cada una de las prácticas. De igual manera, en dicha revista se presentan técnicas o métodos que requieren de aparatos especializados que solo son encontrados en laboratorios profesionales, por ello, de estás técnicas solo se describe lo esencial, es decir, su fundamento teórico.

Estas técnicas son realizado en con base a la Inmunología que es la ciencia encargada del estudio de los procesos y/o fenómenos biológicos de la Inmunidad y la Respuesta Inmunitaria. Como bien se sabe, gracias a todos los estudios que se han realizado por científicos, se ha logrado que cada día se vayan innovando aparatos especializados que han descubierto nuevas enfermedades y tratamientos de prevención y/o para contrarrestar a cada uno de los patógenos que aquejan a la salud de los seres humanos.

Por lo tanto, podemos darnos cuenta de la importancia de estas técnicas inmunológicas en la determinación del diagnóstico de una enfermedad. Esperemos sea de su agrado, tanto como lo es para nosotros.

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FUNDAMENTOS DE LA REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN Las reacciones de aglutinación y de precipitación son la base de la mayor parte de las técnicas inmunológicas. Su principio se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Para comprender lo anterior es necesario definir qué es un antígeno y un anticuerpo: Antígeno: es una mólecula propia o extraña, soluble o partículada, capaz de desencadenar una respuesta inmune.

Anticuerpo: es una molécula proteica, producida por linfocitos B activados, como respuesta a la presencia de un antígeno en el organismo.

Dichos anticuerpos llamados también inmunoglobulinas, se presentan en cinco clases principales, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, que se diferencian entre sí por sus características físicas, químicas y biológicas.

Los principios fisicoquímicos que gobiernan la formación de estos aglutinados son los mismos que gobiernan la formación de un precipitado. En otras palabras, los principios de la zona de exceso de antígeno, la zona de equivalencia y la zona de exceso de anticuerpo, son válidas y aplicables a las reacciones de aglutinación.

Involucran una interacción secundaria entre Ag-Ac que llevará a la aparición de un aglutinado que se visualiza como grumos. s reacciones de aglutinación presentan una menor sensibilidad que las reacciones de interacción primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia indirecta.

Las ventajas enumeradas hacen de las reacciones de aglutinación una valiosa herramienta para diversos estudios serológicos (búsqueda de Acs específicos contra agentes patógenos) y para la detección de antígenos en fluidos biológicos.

TIPOS DE REACCIONES DE AGLUTINACIÓN SEGÚN LAS CARACTERÍSTICAS DE LAS PARTÍCULAS AGLUTINANTES: De acuerdo a las características de las partículas aglutinantes, las reacciones de aglutinación pueden clasificarse en: Reacciones de aglutinación activa o directa Reacciones de aglutinación pasiva o indirecta.

Las reacciones de aglutinación activa o directa se basan en el empleo de la partícula aglutinante como antígeno. Como ejemplos podemos mencionar: Glóbulos rojos (Coombs indirecta): Determinación de sensibilización por incompatibilidad Rh. Las reacciones de aglutinación pasiva o indirecta se basan en el empleo de una partícula aglutinante inerte a la cual se la ha unido un antígeno.

Como ejemplos podemos mencionar: Glóbulos rojos + lisado de T. gondii (HAI-Toxo) Búsqueda de Ac anti-T. Gondii en sueros humanos.

Las reacciones de aglutinación pasiva o indirecta más ampliamente empleadas se basan en la sensibilización de la partícula inerte con el Ag, por lo que resultan útiles para la detección y titulación de Ac en distintos fluidos biológicos.

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Grupos sanguíneos Objetivo De La Práctica: Entender el término de grupos de sanguíneos y conocer los tipos sanguíneos más relevantes.

Conocer la importancia de determinar el grupo sanguíneo en la terapia transfusional y el sistema de compatibilidades e incompatibilidades transfusionales.

Fundamento teórico: La determinación de grupos sanguíneos del sistema AB0 se efectúa enfrentando los hematíes problema con reactivos de especifica conocida anti-A, anti-B y anti-D. La aglutinación o no de los hematíes ensayados frente a cada uno de los reactivos, es indicativa de la presencia o ausencia de los correspondientes antígenos.

GRUPO A: Aglutinación con reactivo anti-A GRUPO B: Aglutinación con reactivo anti-B GRUPO AB: Aglutinación con los reactivos anti-A y anti-B GRUPO 0: No se produce aglutinación ni con el reactivo anti-A ni anti-B

Material:

3 tubos de ensayo 12x75 mm 1 tubo de ensayo 13x100mm 1 pipeta Pasteur Marcador de vidrio Pipeta serológica 5ml. 1ml. 10 ml.

Vaso de precipitado de 5 ml. 10 ml Microcentrífuga Muestra de sangre con EDTA Sueros Anti A Anti B Anti AB Solucion salina

Procedimiento: 1. Marcar 3 tubos 1(A) 2(B) 3 (AB) 2. Hacer una dilución al 5% con la sangre en estudio, con solución salina fisiológica, y colocar una gota de esta dilución a cada tubo.

3. Agregar al primer tubo una gota de anti A, al segundo una gota de anti B y al tercero una gota de anti AB. 4. Mezclar y centrifugar a 2500 r.p.m. durante 30 seg 5. Leer cuidadosamente sacudiendo el tubo suavemente, buscando un botón de aglutinación, e interpretar.

6. Reportar los resultados.

Interpretación de los resultados: La sangre es del grupo A si aglutina a los 3 minutos con el suero anti-A y no aglutina con el suero anti-B. La sangre es del grupo B si aglutina a los 3 minutos con el suero anti-B y no aglutina con el suero anti-A. La sangre es del grupo AB si aglutina con el suero anti-A y con el suero anti-B. La sangre es del grupo 0 si no aglutina ni con el suero anti-A ni con el suero anti-B

POR EJEMPLO: una persona con grupo sanguíneo AB tiene un gen A y otro B, mientras que una persona con grupo sanguíneo A puede tener dos genes AA o un gen A y otro 0, pero prevalece el A, puesto que es dominante.

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Factor Rh Objetivo de la practica: Se realiza para que usted pueda donar sangre o recibir una transfusión de sangre de manera segura.

También se realiza para ver si usted posee una sustancia llamada factor Rh en la superficie de sus glóbulos rojos. El factor Rhesus (Rh) es una proteína heredada que se encuentra en la superficie de los glóbulos rojos. Si tu sangre contiene esta proteína, eres Rh positivo. Si tu sangre carece de esta proteína, eres Rh negativo. Rh positivo es el grupo sanguíneo más frecuente.

Fundamento teórico: El sistema Rh es un sistema muy complejo donde pueden aparecer diferentes Ag: D, C, E, c, e. Una sangre se considera Rh+ si presenta el Ag D, y se considera Rh- si no presenta el Ag D. Además, en algunos de estos Ag se han encontrado variedades antigénicas, siendo el de mayor interés el Du, también llamado Rh positivo débil. Es importante tipificar este Ag y no confundir la sangre con un Rh - (Prueba de Coombs). De todos estos antígenos, el que presenta mayor capacidad antigénica es el D, por lo que en la determinación rutinaria del Rh sólo se investiga el Ag D.

Material: Muestra de sangre venosa con EDTA Suero anti-D. Portaobjetos

Procedimiento: Obtener una muestra de sangre venosa con EDTA, etiquetarla.

Colocamos dos portas y los marcamos con las letras A y B para diferenciar el suero anti-A y el o suero anti-B. Colocaremos una gota de reactivo con suero anti-A y otra con suero anti-B en cada porta.

Colocar una gota de sangre en cada porta y mezclara con el suero durante unos dos o tres minutos, y los mezclaremos con la punta de la micro pipeta.

Interpretación de los resultados: La sangre es del grupo A si aglutina a los 3 minutos con el suero anti-A y no aglutina con el suero anti-B. La sangre es del grupo B si aglutina a los 3 minutos con el suero anti-B y no aglutina con el suero anti-A. La sangre es del grupo AB si aglutina con el suero anti-A y con el suero anti-B. La sangre es del grupo 0 si no aglutina ni con el suero anti-A ni con el suero anti-B.

POR EJEMPLO: Si una persona tiene el tipo de sangre B negativo (B–), esa persona es Rh negativo. Una persona con un tipo de sangre B positivo (B+) es Rh positivo.

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Factor Rematoie Objetivo de la práctica:

La prueba de FR se usa a menudo para el diagnóstico de la artritis reumatoide. La artritis reumatoide es un tipo de trastorno autoinmune que causa dolor, hinchazón y rigidez en las articulaciones. Los factores reumatoideos presentes en la muestra son capaces de aglutinar las partículas de látex recubiertas con γ-globulina humana. La turbidez causada por la aglutinación de las partículas de látex es proporcional a la concentración de FR en la muestra y puede ser medida espectrofotométricamente.

Fundamento teórico:

Los factores reumatoideos (FR) son un grupo heterogéneo de autoanticuerpos dirigidos contra el fragmento Fc de la IgG. Generalmente pertenecen al tipo IgM aunque también se han hallado FR de todos los tipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgD e IgE). Los FR se encuentran en un 70-80% de los pacientes adultos con artritis reumatoidea, en un 10% de jóvenes con artritis reumatoidea juvenil y en una variedad de otras enfermedades del tejido conectivo tales como: LES, síndrome de Sjögren, esclerosis sistémica, polimiositis, etc. Los FR son los autoanticuerpos más comúnmente encontrados en pacientes con artritis reumatoidea y por ello representan la determinación serológica más requerida para el diagnóstico de dicha enfermedad Su hallazgo aislado no determina la presencia de la enfermedad y es sólo uno de los tantos criterios necesarios (clínicos, radiológicos y de laboratorio) para el diagnóstico de artritis reumatoidea.

Material: Centrífuga clínica.

Frasco con torundas alcoholadas.

100 ml de solución salina isotónica.

Equipo para determinación de Factor Reumatoide preferentemente marca SPINREACT. Jeringa desechable de 5 ml.

Ligadura.

5 tubos de 13x100 mm.

1 gradilla metálica. 2 pipetas Pasteur con bulbo.

1 pipeta graduada terminal de 1 ml.

1 pipeta graduada terminal de 0.1 ml.

Placa de reacción.

Aplicadores de madera.

Procedimiento: 1. Extraer 3.0 ml de sangre venosa del paciente, retirar aguja y colocarla en un tubo sin anticongelante.

2. Dejar coagular a temperatura ambiente (aprox. 10 min.) y centrifugar a 2000 r.p.m. / 5 minutos.

3. Separar el suero con ayuda de la pipeta Pasteur en otro tubo (suero no hemolizado ni lipémico).

4. Nota: dependiendo de la marca del equipo utilizado se podrá realizar de la siguiente manera.

5. Atemperar el reactivo y los controles a temperatura ambiente.

6. Homogeneizar el reactivo FR-látex con agitación suave.

7. Comprobar la funcionalidad del reactivo mediante los controles positivo y negativo.

8. Dosificar 50 µl (1 gota) de suero problema a analizar en un círculo de la placa de reacción SIN DILUIR. 9. En otro círculo de la placa depositar una gota de suero control positivo.

10. En el tercer círculo depositar una gota de suero control negativo.

11. Añadir a cada círculo una gota del reactivo FR-látex, previamente Re suspendido.

12. Mezclar con ayuda del aplicador de madera y extender la muestra en todo el círculo 13. Mover la placa en forma rotatoria durante 2 min 14. Al cabo de este tiempo observar la aparición o ausencia de aglutinación.

Interpretación de los resultados: Resultado positivo: Presencia de aglutinación indica un nivel de FR igual o superior a 8 Ul/ml en la muestra (aglutinación comparable al control positivo) Resultado negativo: Ausencia de aglutinación indica un nivel de FR inferior a 8 Ul/ml en la muestra (sin aglutinación comparable al control negativo).

Por ejemplo: Si una persona tiene el tipo de sangre B negativo (B–), esa persona es Rh negativo.

Una persona con un tipo de sangre B positivo (B+) es Rh positivo.

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Proteína C. Reactiva FUNDAMENTO TEÓRICO:

OBJETIVO:

La CRP fue descrita originalmente por Tillet y Francis en 1930, quienes hallaron que los sueros de pacientes que sufrían infecciones agudas por estreptococos, precipitaban el polisacárido C de Streptococcus pneumoniae, en presencia de calcio. Por esto, a la proteína causante de dicha reacción se le llamó "proteína C-reactiva". Estas proteínas son sintetizadas en su mayoría por el hígado y normalmente se pueden encontrar circulando en bajas concentraciones. La proteína C-reactiva (usualmente abreviada como PCR o CRP, por sus siglas de C reactive protein) pertenece a un grupo de glicoproteínas séricas denominadas proteínas de fase aguda y se incrementa en suero, en una gran variedad de enfermedades inflamatorias o como respuesta a necrosis tisular.

Se realizará la determinación de los niveles séricos de CRP que es de utilidad para el seguimiento y control de procesos infecciosos, inflamatorios o de daño tisular.

La PCR se detecta en suero por reacción con un anticuerpo específico adsorbido sobre un soporte inerte de látex. La PCR se une a los anticuerpos adsorbidos produciendo la aglutinación de las partículas de látex.

MATERIAL: Muestra Suero a) Recolección: obtener suero de la manera usual sin aditivos.

REACTIVOS A. Reactivo A: suspensión de partículas de látex-poliestireno sensibilizadas con anticuerpos anti-PCR. Control Negativo: dilución de suero negativo.

Control Positivo: dilución de suero positivo.

Solución fisiológica.

Placas de plástico o vidrio fondo negro Material volumétrico adecuado para efectuar mediciones y diluciones de las muestras Palillos mezcladores descartables Cronómetro

PROCEDIMIENTO: Obtener previamente una muestra sin aditivos.

TÉCNICA CUALITATIVA Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.

Agitar el Reactivo A antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero.

Mezclar con un palillo descartable hasta obtener una suspensión uniforme en toda la superficie del círculo. Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y observar macroscópicamente el resultado bajo un haz luminoso dentro de los 2 minutos.

Inclinar la lamina hacia adelante y hacia tras haciendo movimientos oscilatorios en varios planos durante dos minutos e inmediatamente bajo una buena fuente de luz, verificar la presencia o no de aglutinacion macroscopica.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: Negativo: suspensión homogénea. Indica niveles de proteína C reactiva menores a 6 mg/L Positivo: aglutinación visible macroscópicamente. que aparece dentro de los 2 minutos, con formación de grupos finos hasta gruesos indicando una concentración mayor a 6 mg/L. La concentración aproximada de PCR en la muestra puede ser calculada por la fórmula siguiente: PCR (mg/l) = Título x Sensibilidad de la reacción (6 mg/l) Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:2.

Su concentración de PCR es de 2 x 6 = 12 mg/l.

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VALORES DE REFERENCIA: Hasta 6 mg/l. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

Positivo (1) y muestra problema (2) se ha formado aglutinación, indicando la presencia de proteína C-reactiva.

Determinación semicuantitativame de la concentración de proteína CReactiva,

Reacciones febriles Objetivo de la práctica: El alumno interpretará correctamente el diagnóstico de enfermedades febriles como la fiebre tifoidea, paratifoidea, tifo epidémico y brucelosis, mediante reacciones de aglutinación.

Fundamento teórico: Estas reacciones se basan en el hecho de que cuando el organismo humano es invadido por agentes infecciosos, responde produciendo anticuerpos aglutinantes contra ellos los cuales se ponen de manifiesto al entrar en contacto el anticuerpo con el anticuerpo específico. El título del anticuerpo depende del tipo y curso de la enfermedad. Para que los resultados tengan un valor diagnóstico el título de ellos debe aumentar.

Material: Centrifuga clinica Frasco con torundas alcoholadas Equipo completo para determinar Reacciones Febriles (Febriclin) 1 jeringa desechable de 5 ml.

1 ligadura.

2 tubos de 13x100 mm.

1 gradilla metálica.

1 pipeta Pasteur con bulbo.

1 pipeta graduada terminal de 0.1 ml.

1 placa excavada para aglutinación.

Aplicadores de madera.

Procedimiento: PRUEBA DE ANTÍGENOS FEBRILES * Puede ser de dos maneras: 1. Método de aglutinación rápida en placa: a) Anotar el antígeno correspondiente en la placa de vidrio. b) Depositar en cada cuadro 0.04ml de suero del paciente para cada uno de los antígenos que se vayan a utiliza. c) A cada gota de suero añadir una gota de cada antígeno. d) Mezclar con un aplicador limpio ( utilizar un aplicador para cada antígeno. e) Agitar suavemente la placa por rotación (120 r.p.m) durante 2-3 minutos. f) Observar la aglutinación con ayuda de una lámpara. Cuando hay reacción positiva se repite la t�cnica con diluciones las cuales se obtienen con el uso de las siguientes cantidades del suero en la siguiente forma. Mililitros de Dilución suero 0.08 1:20 0.04 1:40 0.02 1:80 0.01 1:160 0.005 1:329 interpretación: El informe del resultado de la prueba se hace tomando en consideración la dilución más alta que se observe en la reacción positiva. En tifoideas los anticuerpos llegan a tener títulos diagnósticos hasta los 8 días después de la fiebre.

2. Método de aglutinación en tubo.: a) Numerar siete tubos ( 13x75mm) del uno al seis y un testigo (T) para cada antígeno. b) Adicionar 0.9 ml de solución salina al primero y 0.5 ml a los restantes c) Agregar 0.1ml del suero problema al tubo uno. Mezclar y pasar 0.5ml al tubo dos y así sucesivamente hasta el seis eliminando 0.5ml de esta última dilución. Obteniendose diluciones 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320. d) Adicionar 0.3ml de antígeno diluido previamente 1:20 con solución salina en cada uno de los tubos. e) Agitar enérgicamente e incubar en baño maría. f) Tomar dos o tres tubos a la vez, agitarlos ligeramente frente una fuente de luz que ilumine las partículas claramente

Interpretación de los resultados: Reportar el resultado, empleando la recíproca de la dilución más alta que presenta aglutinación. • Grado de aglutinación.

100% ++++ Sedimentación de los grumos y el sobrenadante claro.

75% +++ grumos sedimentados casi totalmente y sobrenadante claro.

50% ++ sedimentación marcada y sobrenadante ligeramente claro.

Negativo. Ninguna evidencia de aglutinación, sobrenadante idéntico al control.

Con esta prueba se pueden encontrar diferentes tipos de fiebre por ejemplo: fiebre tifoidea, brucelosis, rickettsiosis

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V.D.R.L FUNDAMENTO TEÓRICO: La prueba denominada VDRL recibe su nombre de las siglas del Venereal Diseases Research Laboratory, institución que la desarrolló alrededor de 1946. Es una de las pruebas serológicas que ayudan al diagnóstico de sífilis o enfermedad de Lúes, causada por la espiroqueta Treponema pallidum.

La prueba de VDRL detecta anticuerpos contra la cardiolipina (por tanto, anticuerpos no-treponémicos) en el suero o en el líquido cefalorraquídeo del paciente en estudio, mediante una aglutinación pasiva de microcristales (también llamada microfloculación).

El antígeno empleado en la técnica de VDRL es la cardiolipina y el método cumple la B. definición de una micro aglutinación pasiva, aunque también se ha clasificado como una microfloculación, por el pequeño tamaño y aspecto de los grumos.

PROCEDIMIENTO Método cualitativo Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.

La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.

Depositar 50 µL de la muestra a ensayar y una gota de cada uno de los controles Positivo y Negativo, sobre círculos distintos de un porta de vidrio.

Homogeneizar suavemente la suspensión de antígeno VDRL antes de usar y dispensar una gota (20 µL) sobre cada una de las gotas anteriores.

Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 160-180 r.p.m. durante 4 minutos. El exceso de tiempo de agitación puede originar la aparición de falsos positivos.

OBJETIVO: Aprender a realizar la prueba de VDRL. La técnica VDRL permite el análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras de suero y LCR. Es de elección para seguimiento del tratamiento, por ser el primer examen serológico que disminuye sus títulos de reactividad después de un tratamiento adecuado.

REACTIVOS Y MATERIAL A. Reactivo A: suspensión acuosa de antígeno de cardiolipina y lecitina purificados, en buffer fosfatos con cloruro de colina y EDTA de acuerdo a las indicaciones de la O.M.S. Control Positivo: dilución de suero inactivado, reactivo.

Control Negativo: dilución de suero inactivado, no reactivo.

Solución fisiológica (para la prueba semicuantitativa).

Agitador mecánico rotatorio de velocidad regulable a 180 r.p.m.

Portas de vidrio.

Microscopio óptico (objetivo 10x).

Pipetas de 50 µL. 1 gotero Muestra: suero fresco o plasma.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Inmediatamente después de la agitación leer las reacciones al microscopio con aumento de 100x (10x ocular y 10x objetivo).

Leer los controles No Reactivo (NR), Reactivo débil (Rd) y Reactivo (R).

Interpretación de lecturas de floculación macroscópica.

El resultado Reactivo se caracteriza habitualmente por grumos grandes o pequeños, pero el tamaño es uniforme.

Todo resultado Reactivo, Reactivo débil y No Reactivo rugoso debe ser analizado cuantitativamente.

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Fundamento de las ReaccIones de PrecIpItacIón La reacción de precipitación depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da idea del número de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente posee dos sitios capaces de reconocer al Ag. Del mismo modo, la valencia de un Ag nos habla del máximo número de epítopes que posee. Para que se pueda producir la interacción secundaria Ag-Ag con la consecuente formación del precipitado, tanto el Ag como el Ac deben ser, al menos, bivalentes.

Los anticuerpos que aglomeran antígenos solubles se denominan precipitinas. Aunque la formación del complejo soluble Ag-Ab ocurre en el transcurso de minutos, la del precipitado visible se lleva a cabo con mayor lentitud y a menudo requiere uno o dos días para completarse.

Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs específicos, la interacción Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interacción Ag-Ac. Cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero conteniendo Acs específicos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, luego del cual declina. En un extremo de la curva de precipitación, cuando se agregan pequeñas cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ag siendo pequeños y probablemente constituidos por una molécula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relación Ag-Ac permite la formación de grandes redes de CI que precipitan.

TécnIcas InmunológIcas basadas en reaccIones de precIpItacIón

Inmuno Difusión Radial (IDR): esta técnica permite cuantificar de manera sencilla y económica inmunoglobulinas de isotipo G, M y A o antígenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biológicas.

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ANTIESTREPTOLISINAS Objetivo de la práctica: La prueba para detectar antiestreptolisinas 0 (ASLO) se solicita para determinar si una infección reciente por estreptococo del grupo A puede ser la causa de: Endocarditis bacteriana, una infección del revestimiento interno del corazón Escarlatina Faringitis estreptocócica Una forma de enfermedad renal conocida como glomerulonefritis Una fiebre reumática en una persona con signos y síntomas sugestivos

Fundamento teórico: Las antiestreptolisinas son anticuerpos producidos en los organismos que padecen de infecciones repetidas por estreptococos de los grupos A, C y G (de Lancefield). Un título alto de antiestreptolisinas es un dato menor en el diagnóstico de la fiebre reumática, es decir por si solo no permite hacer el diagnóstico confirmativo, pero sí es útil en el control de la enfermedad. Una sola determinación no tiene valor significativo, la prueba debe repetirse en lapsos de dos semanas El incremento de los títulos de una determinación a otra, indica presencia de hipersensibilidad producida por infecciones estreptocócicas de repetición.

Material: Centrífuga clínica.

Baño maría a 37°C Equipo para la determinación de antiestreptolisina "O".

250 ml solución salina amortiguadora para la determinación de antiestreptolisina “O".

Frasco con torundas alcoholadas.

100 ml de una suspensión de glóbulos rojos lavados al 5% (usar sangre humana tipo O Rh+ fresca y desfibrilada).

1 jeringa desechable 5 ml.

1 ligadura.

16 tubos de ensaye 13 x 100 mm. 3 tubos de ensaye 16 x 150 mm.

1 gradilla.

5 pipetas serológicas de 1 ml. 1 pipeta serológica de 5 ml. Y 10 ml 1 pipeta Pasteur con bulbo.

2 vasos de precipitados de 50 ml.

Aplicadores de madera

Procedimiento:

1. Reconstituir con 10 ml de agua destilada el frasco de reactivo de estreptomicina "O". Adicionar el contenido de 2 capilares de hidro sulfito de sodio para activar la estreptomicina. Agite por inversión hasta que se disuelva.

Nota: una vez añadido el hidro sulfito, la estreptomicina debe ser empleada de inmediato, ya que al reoxidarse ésta se inactiva.

2. Extraer 5 ml de sangre del paciente, retirar la aguja y vaciar en el tubo de ensaye de 13x100.

3. Dejar coagular a temperatura ambiente (aprox. 10 min.) y centrifugar a 2000 rpm/ 5 min, separar el suero con ayuda de la pipeta Pasteur en otro tubo (no deben usarse sueros lipémicos ni hemolizados).

4. Hacer diluciones del suero problema en los tubos 16 x150 mm: 5. 1:10 = 0.5 ml del suero problema + 4.5ml de sol. amortiguadora.

6. 1:100 = 1 ml de la dilución 1:10 + 9 ml de solución amortiguadora.

7. 1:500 = 2 ml de la dilución 1:100 + 8 ml del sol. amortiguadora.

Interpretación de los resultados: El título de antiestreptolisina "O", se expresa en unidades Todd. Estas unidades son la recíproca de la dilución más alta del suero que neutraliza completamente a la estreptomicina "O".

Valores para esta técnica: Normales < 125 Unidades Todo.

EJEMPLO: Este examen se usa con Dudoso de 166 a 333 Unidades Todo. mayor frecuencia para el Significativo > 500 Unidades Todo. diagnóstico de la artritis reumatoidea o el síndrome de Sjögren.

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DETECCIÓN DE INMUNOGLOBULINAS POR INMUNODIFUSIÓN INMUNODIFUSIÓN Es una técnica utilizada para la detección y cuantificación de cualquiera de las inmunoglobulinas. Se basa en la presencia de un precipitado visible resultado de la combinación antígeno-anticuerpo.

FUNDAMENTO TEÓRICO La inmunodifusión radial es una técnica de análisis inmunológico de tipo cuantitativo. Se utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos que hay en el suero de un individuo.

Esta técnica permite cuantificar de manera sencilla y económica inmunoglobulinas de isotipo G, M y A o antígenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biológicas.

La técnica se basa en la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas o antígenos solubles) en una matriz semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac específico.

PRINCIPIO DEL MÉTODO El procedimiento consiste en una inmunoprecipitación en agarosa entre un antígeno a cuantificar y su anticuerpo homólogo. Se realiza incorporando uno de los dos reactivos inmunes (generalmente el anticuerpo) uniformemente en una capa de agarosa y luego introduciendo el otro reactivo en pocillos cavados en el gel. El antígeno difunde radialmente en la mezcla gel-anticuerpo y se forma un disco o anillo visible en un punto que depende de la relación estequiometria antígeno-anticuerpo. A medida que más antígeno difunde, el anillo se re disuelve y reaparece a una distancia mayor del pocillo. Este aumento en el diámetro de precipitación continúa hasta que antígeno y anticuerpo reaccionan completamente.

Mientras que el precipitado se está expandiendo (16 a 20 horas) la relación entre el diámetro del anillo y el logaritmo de la concentración de antígeno es aproximadamente lineal. Al completarse la reacción, la relación entre el diámetro al cuadrado y la concentración es lineal.

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FUNDAMENTO DE PRUEBAS ENZIMÁTICAS Para evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo se han usado diferentes métodos; de los basados en la inmunoprecipitación y la aglutinación, que adolecen de insuficiente sensibilidad y detectabilidad, se pasó a los que emplean marcadores para detectar dicha reacción. Se han usado isótopos radioactivos, compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes, marcadores electroactivos, lantánidos, radicales libres estables, partículas de látex, liposomas, colorantes, coloides, bacteriófagos y enzimas, entre otros.

Las técnicas inmunoenzimáticas constituyen el desarrollo ulterior del radioinmunoanálisis; en lugar de los peligrosos radioisótopos de corta vida media, se emplean enzimas como sustancias marcadoras. Surgieron a mediados de la década de los 60 para la identificación y localización intracelular de antígenos y han tenido un auge vertiginoso, su uso se ha ampliado para la detección de un diverso número de antígenos y anticuerpos.

Estos ensayos se apoyan en tres características biológicas fundamentales: la extraordinaria especificidad de los anticuerpos, el elevado poder catalítico y la alta especificidad de las enzimas. Mediante la combinación de la reacción inmunológica con un indicador altamente sensible, el débil efecto inmunológico se ve reforzado por la amplificación enzimática, de forma que se consigue una elevada sensibilidad y detectabilidad; si a esto le añadimos la especificidad de la reacción inmunológica, se podrá comprender su aplicabilidad en el diagnóstico clínico.

La técnica ELISA se fundamenta en la premisa de que luego de acoplar antígenos solubles o anticuerpos a una matriz sólida insoluble, éstos retienen la actividad inmunológica y en que estas biomoléculas también pueden unirse a una enzima, reteniendo el conjugado resultante, tanto la actividad enzimática como inmunológica.

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TÉCNICAS DE ELISA Esta técnica suele ser conocida como ELISA, aunque también como “Ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas” o bien, “inmunoensayo enzimático heterogéneo” debido a que dicha técnica utiliza Anticuerpos marcados con una enzima (por lo general la peroxidasa) con la cual pueden visualizar la reacción Ag-Ac. Un ejemplo sería: el cambio de color, que haría posible la medición del antígeno en la muestra utilizando la espectrofotometría. Es por ello que la técnica es de gran ayuda para la determinación de Antígenos y de Anticuerpos, así mismo, está siempre dependerá de una enzima. Para la técnica siempre se realiza una separación entre el inmunocomplejo formado sobre la fase sólida y las biomoléculas no fijadas.

La técnica ELISA se fundamenta en la premisa de que después de acoplar antígenos solubles o anticuerpos a una matriz sólida insoluble, éstos retienen la actividad inmunológica y las biomoléculas pueden unirse a una enzima, reteniendo el conjugado resultante de la actividad enzimática o inmunológica. En la técnica es posible determinar la presencia de Haptenos al igual de moléculas de alto peso molecular.

Algo muy importante de resaltar como ventaja de dicha técnica, es que presenta un alto grado de sensibilidad, detectabilidad, precisión y exactitud, lo que hace que los inmunoensayos enzimáticos según el principio ELISA, puedan equipararse a los radioinmunoensayos (RIA, basado en la formación específica de los complejos antígeno-anticuerpo).

CLASIFICACIÓN:

Se clasifica en competitivos debido a que en estos ensayos los anticuerpos o los antígenos son inmovilizados sobre la fase sólida y su unión con el conjugado antígeno-enzima o anticuerpoenzima, es inhibida por la presencia de analito no marcado en la muestra y también son clasificados en no competitivos, ya que en estos ensayos pueden subdividirse de acuerdo al inmuno reactante inmovilizado, siendo así, ensayos de captura de anticuerpos o de antígenos.

Un ejemplo: serían los ensayos de ELISA indirecto.

DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS Para la determinación de Antígenos se utiliza el modelo ELISA "Sandwich" directo. En el cual, el Anticuerpo específico para el Antígeno de interés, se encuentra adsorbido en un soporte sólido (por ejemplo: una placa de petri), sobre el que se añadirá la muestra biológica que contiene al antígeno, dejándolo reaccionar con el anticuerpo inmovilizado.

Luego de lavar la placa de Petri y en dado caso de que en dicha muestra se encuentre el Ag, quedará capturado en la placa y será puesto en evidencia tras la adición de otro Ac específico conjugado con la enzima. Ya que, posteriormente del lavado se agrega un segundo anticuerpo ligado al enzima específico para un epítopo distinto del antígeno y se permite que reaccione con el antígeno unido después de eliminar el segundo anticuerpo mediante el lavado. Por último, se añade el sustrato incoloro que, por acción de la enzima, dará un producto coloreado que producirá un color observable a simple vista y cuantificable mediante un espectrofotómetro.

DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS Para la determinación de Acs específicos para un determinado Ag se utiliza la modalidad de ELISA indirecto, sobre alguna muestra que contenga el anticuerpo primario (Ab1), como por ejemplo: el suero, se le añade a una placa de Petri recubierta con un antígeno y se permite que reaccione con el antígeno unido a dicha placa. Después de eliminar por lavado cualquier Ab1 libre, la presencia de anticuerpo unido a antígeno se detecta mediante la adición de un anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con la enzima, que se une al anticuerpo primario. Posteriormente se elimina por lavado cualquier Ab2 libre y se añade un sustrato para la enzima. Con ello, la cantidad de producto de la reacción de color que se forma se mide con lectores espectrofotométricos de placa especializados, que pueden medir la absorbancia de la totalidad de los fosos de una placa de 96 fosos en segundos.

Este modelo se pueden utilizar para antígenos, proteínas virales o bacterianas e incluso virus completos, pero cada día es más frecuente adsorber exclusivamente las proteínas de interés inmunológico. Esta es una de las técnicas de elección para buscar Acs contra proteínas del virus HIV en sueros de pacientes.

ELISA COMPETITIVO El método de ELISA competitivo es otra variante para medir cantidades de antígenos. En esta técnica primero se incuba el anticuerpo en solución con una muestra que contiene antígeno.

Después la mezcla de antígeno y anticuerpo se añade a un foso de macrotítulo recubierto con antígeno.

Es importante recordar: que cuanto más antígeno se encuentra en la muestra, menos anticuerpo libre está disponible para unirse al foso recubierto con antígeno. La adición de un anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con la enzima específica para el isotipo (inmunoglobulina) de un anticuerpo primario puede utilizarse para determinar la cantidad de anticuerpo primario unido al foso como en un ELISA indirecto. Sin embargo, en la prueba competitiva cuanto más alta es la concentración de antígeno en la muestra original, más baja será la absorción.

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Determinación de hormona gonadotropina coriónica humana La prueba de la gonadotropina coriónica humana (hCG, por sus siglas en inglés) se realiza para detectar la hormona hCG en la sangre o la orina. Algunas pruebas de hCG miden la cantidad exacta. Otras solo verifican la presencia de la hormona.

FUNDAMENTO: Desde la etapa más temprana del desarrollo (9 días de edad), la placenta produce hormonas, ya sea por sí sola o en conjunto con el feto. Los trofoblastos placentarios muy jóvenes producen cantidades apreciables de hormona gonadotropina coriónica humana (hCG) Todas las pruebas de embarazo están encaminadas para descubrir hCG; ésta se encuentra en sangre y en orina siempre que hay un tejido canónico.

OBJETIVO: Que el alumno al finalizar esta práctica pueda interpretar correctamente la prueba de embarazo, mediante la detección de Gonadotropina coriónica humana (hCG).

MATERIAL: Un equipo para diagnóstico de embarazo Muestra de orina problema (de preferencia la primera de la mañana) por contener la mayor concentración de hCG. PROCEDIMIENTO: 1. Colocar la placa sobre una superficie horizontal.

2. Agitar suavemente el reactivo de látex durante 15 segundos para obtener una suspensión homogénea (no es necesario temperar).

3. Aspirar con la pipeta la cantidad suficiente de reactivo y transferir 25 µl (una gota) cayendo libremente sobre el círculo de la placa.

4. Devolver el reactivo restante de la pipeta al frasco original.

5. Utilizando la misma pipeta aspirar la muestra de orina y transferir 50 µl (2 gotas) cayendo libremente sobre la misma área de prueba.

6. Mezclar con la espátula el reactivo y la orina esparciendo la mezcla sobre toda el área de prueba.

7. Balancear suavemente la placa dejando que el líquido fluya lentamente durante 2 min.

8. Colocar la placa sobre una superficie horizontal bien iluminada para hacer la lectura.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Reacción positiva: viene indicada por la producción de una aglutinación de látex granulosa y roja, en el plazo de 2 min.

Reacción negativa: corresponde a que la suspensión de látex se mantiene uniforme al final del período de 2 min.

Nota: en el caso de muestras de orina conteniendo bajas concentraciones de hCG, o muestras negativas, el balanceo debe continuarse por 2 minutos más.

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TÉCNICAS ESPECIALES:

FUNDAMENTO DE LA INMUNOFLUORESCENCIA La inmunofluorescencia es un conjunto de técnicas en las que se emplean anticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y/o tejidos. Al igual de que se ha aplicado para identificar varias subpoblaciones de linfocitos, en especial las de células T CD4 y CD8. También es adecuada para identificar especies bacterianas, detectar complejos Ag-Ab en enfermedad autoinmunitaria, descubrir componentes del complemento en tejidos y localizar hormonas y otros productos celulares teñidos in situ.

Desde un punto de vista biológico, la posibilidad de estudiar la presencia de un anticuerpo y de un antígeno en cualquier preparación biológica es siempre importante y muy útil en la inmunología, es por ello que en 1944 Albert Coons mostró que con facilidad se puede marcar los anticuerpos con moléculas que tienen la propiedad de la fluorescencia. Debido a que las moléculas fluorescentes absorben luz de una longitud de onda, siendo denominadas como “excitación” y emiten luz de otra longitud de onda denominada “emisión”. De esta forma la luz emitida puede verse con un microscopio de fluorescencia, que está equipado con una fuente de luz UV. Esta técnica se conoce como inmunofluorescencia, en la cual suelen emplearse compuestos fluorescentes, como fluoresceína y rodamina, pero también otras sustancias muy fluorescentes, por ejemplo: ficoeritrina que es un pigmento de color muy intenso y muy fluorescente color rojo obtenido de algas,el cual absorbe luz de manera eficiente (~30 veces más que la fluoresceína) y por su tono es un buen marcador de inmunofluorescencia.

El hecho de que existan distintos fluorocromos capaces de emitir a diferentes longitudes de onda, permite que puedan detectarse Ag diferentes en un mismo corte de tejido o célula.

Ejemplos: 1. Fluoresceína: es un colorante orgánico, el cual es el marcador más utilizado para procedimientos de inmunofluorescencia, debido a que absorbe luz azul de 490 nm y emite una fluorescencia verde-amarillo intensa de 517 nm.

2. Rodamina: es un colorante orgánico, que absorbe en el intervalo del verde y el amarillo de 515 nm y emite una fluorescencia roja intensa de 546 nm. Ya que emite fluorescencia en una longitud de onda más larga que la fluoresceína, puede usarse en pruebas de inmunofluorescencia de dos colores.

Es así como la visualización de la fluorescencia puede realizarse utilizando un microscopio de fluorescencia (para cortes de tejido o células en portaobjetos) o por Citometría de flujo (para células en suspensión).

La tinción con anticuerpo fluorescente de moléculas de la membrana celular o de cortes de tejido puede ser directa o indirecta: En la tinción directa el anticuerpo específico (el anticuerpo primario) se conjuga directamente con fluoresceína, esta tinción se utiliza para diagnosticar enfermedades de tipo autoinmunitario, es decir, aquéllas en las cuales las defensas pierden el control y atacan algún órgano de nuestro propio organismo.

En la tinción indirecta el anticuerpo primario no se marca y se detecta con un reactivo adicional marcado con fluorocromo. En la actualidad se han desarrollado varios reactivos para dicha tinción: el más usual es un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo formado en una especie contra anticuerpos de otra especie, un ejemplo es la inmunoglobulina antirratón de cabra marcada con fluoresceína. Una de las ventajas de esta técnica es que no es necesario conjugar el anticuerpo primario con un fluorocromo, ya que los métodos indirectos evitan la pérdida de anticuerpo que suele ocurrir durante la reacción de conjugación. Además de que aumentan la sensibilidad de tinción porque múltiples moléculas del reactivo fluorocromo se unen a cada molécula de anticuerpo primario, lo que incrementa la cantidad de luz que se emite en la localización de cada molécula de anticuerpo primario.

PASOS CLAVES DE UNA INMUNOFLUORESCENCIA: 1. Fijación: se preserva la localización, composición y estructura del material biológico a analizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que existe in vivo. Lo cual dependerá del tipo de microscopia a utilizar, la estructura subcelular que se quiera detectar, entre otras.

2. Permeabilización: se producen poros en las membranas celulares, que permiten el ingreso de los anticuerpos a la célula si queremos detectar estructuras internas de la célula. Estos serán más “suaves” o más “fuertes” según de la naturaleza del compuesto permeabilizante a utilizar (por ejemplo: Tritón X‐ 100, NP40).

3. Bloqueo: su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con el material biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica, es así como el anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirse a su epitope y así detectar la estructura de interés. Generalmente se utilizan soluciones proteicas concentradas (por ejemplo: la Albúmina bovina sérica o gelatina de pescado).

4. Inmunodetección: en este último paso se diferencian dos tipos de inmunofluorescencia; directa o indirecta, debido a que la molécula que es reconocida por los anticuerpos se denomina antígeno. Cada antígeno tiene al menos un epítopo o región reconocida por un anticuerpo.

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FUNDAMENTO DE LAS PRUEBAS CON PCR Esta prueba, cuyo nombre proviene de las siglas en inglés “Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de ADN, en dicha técnica se utilizan secuencias cortas de ADN denominados “cebadores”, para seleccionar la parte del genoma a amplificar. En dicha técnica la temperatura de la muestra se sube y se baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicación del ADN a duplicar la secuencia del ADN que está siendo copiada, proceso denominado como “amplificación” y gracias a ello, se pueden producir un billón de copias de la secuencia en estudio en unas pocas horas, lo cual es de gran ayuda para estudiar la molécula del ADN a detalle en el laboratorio.

Por ser una prueba rápida y muy precisa, permite diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas, cambios genéticos y detectar la presencia de pequeñas cantidades de células cancerosas, aunque sólo se presente una cantidad muy pequeña de patógenos en el cuerpo analizado, debido a que se detecta el ADN o el ARN del patógeno (organismo que causa una enfermedad) o células anormales en la muestra de dicho cuerpo.

El ADN o DNA (por sus siglas en inglés): es el material genético que contiene las instrucciones y la información de todos los seres vivos.

El ARN: es otro tipo de material genético, el cual contiene información copiada del ADN e interviene en la producción de proteínas.

Los métodos más comunes para obtener una muestra para una prueba de PCR, son el análisis de sangre y el hisopado nasal:

1. Análisis de sangre: se realiza una extracción de sangre por venopunción.

2. Hisopado nasal: se realiza la toma de la muestra en la parte delantera de las fosas nasales (narinas anteriores), o bien, de la parte trasera de las fosas nasales en un procedimiento conocido como hisopado de cornete medio (NMT, por sus siglas en inglés). La muestra también puede ser tomada de la nasofaringe que es la parte superior de la garganta, detrás de la nariz. Ø Ejemplo: una prueba en la que se emplea este método es en el caso de la prueba de SARS-CoV-2 mediante el frotis nasofaríngeo y/o orofaríngeo.

¿Qué ocurre en la reacción? Se desnaturaliza el DNA en bandas sencillas mediante un tratamiento breve con calor, el cual se enfría en presencia de exceso de oligonucleótidos cebadores complementarios de las secuencias de DNA que flanquean el segmento de DNA deseado. Posteriormente se emplea una polimerasa de DNA termorresistente para copiar el DNA a partir de los extremos 3’ de los cebadores.

Debido a que todos los componentes de la reacción son termoestables, se puede repetir el ciclo de calentamiento y enfriamiento muchas veces, lo que tiene como resultado fusión y síntesis de DNA alterno, y la amplificación rápida de una secuencia determinada.

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“Nunca consideres el estudio como una obligación, sino como una oportunidad para penetrar en el bello y maravilloso mundo del saber”.

Albert Einstein.