Taller de Humedales urbanos

A partir de una gran convocatoria y una muy interesante participación, el 31 de Marzo se llevó a cabo el taller, con el fin de dar un cierre al proyecto de investigación enmarcado en la secretaria de Investigaciones de la Facultad De Arquitectura, Diseño y Urbanismo de la Universidad de Buenos Aires. En tal sentido y como parte de los objetivos propuestos, la difusión y concientización de dicha problemática era una cuestión a atender, por lo que se dio lugar a este evento.

Con más de 120 inscriptos, y una participación de más de 30 asistentes, de los cuales muchos de ellos son representantes de organizaciones de la sociedad civil, como así también de diversas universidades y ámbitos de investigación, arrancamos el Taller por la mañana con la presentación personal de todos los asistentes, con su perfil y sus inquietudes en la temática.

Se fueron tratando todos los temas propuestas y a partir de una consigna determinada, se fue trabajando en conjunto. A partir de ello se fueron registrando diversos sitios y se definió el armado de un feedback para considerar que lo propuesto haya sido útil para los asistentes, con el fin también de poder avanzar en conjunto en nuevas propuestas.

En la misma línea, se considera una segunda etapa del taller de humedales, pero con un enfoque más técnico, denominado Humedales construidos para el tratamiento de efluentes, el que organizara la división Técnica Aidis Joven, desde ya que esperamos contar con la presencia y la participación de todos!

En este último párrafo no quiero dejar de agradecer la colaboración de Aidis Argentina que fue una parte fundamental para la organización del evento, como así también al Dr. Gabriel Burgueño por el compromiso y la entrega de siempre.

De claritromicina como fuente De carbono y energía.

Autores:

Adrian Acuña1 y Graciela Pucci2

1 Departamento de Química UTN Unidad Regional Santa Cruz. Rio Gallegos. adrianjacuna@yahoo.com.ar

2 Centro de Estudios e Investigación en Microbiología Aplicada. Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. Ciudad Universitaria Km 4, 9000. Comodoro Rivadavia, Chubut, Argentina. ceima@unpata.edu.ar

Resumen

Una muestra de suelo proveniente de una biopila contaminada con hidrocarburo se incubaron en el laboratorio con el antibiótico claritromicina y se realizaron la cinética de la utilización de la claritromicina mediante métodos consumo de oxígeno, medición en UV a 415nm y 600nm durante 14 días. Se aislaron cepas que se realizaron la misma cinética y se identificaron por ácidos grasos. Los resultado relevaron que la claritromicina fue utilizada por la comunidad bacterias y dos cepas 56,34-57,75% ambas cepas identificadas como Pseudomonas aeruginosa y dos cepas con más baja utilización Stenotrophomonas maltophilia y otra Pseudomona aeruginosa con un 14,12 y 28,17% respectivamente.

Palabras claves: claritromicina, degradación, bacterias.

Introducción

La demanda mundial de antibióticos se incrementó de forma indefinida en los últimos años, relacionado directamente con el aumento de la población y la expansión del sector ganadero. El metabolismo parcial (17–90 %) de los antibióticos en humanos y animales da como resultado su excreción a través de la orina y las heces (Albero et al., 2018, van Epps & Blaney, 2016), los que finalmente contaminan diferentes tipos de ambientes acuáticos y terrestres. En las grandes ciudades, los líquidos cloacales domiciliarios son tratados en plantas depuradoras de este tipo de efluentes, siendo estos efluentes municipales otra vía importante para la aparición de microcontaminantes en el medio acuático (Tijani et al., 2013). Las aguas residuales tratadas en estas plantas provienen principalmente de actividades domésticas y/o industriales, así como de hospitales.

El contacto del suelo con contaminantes como los antibióticos, va generando una adaptación de su comunidad microbiana, que mejora su utilización como fuente de carbono y energía. En este sentido, Topp et al., (2016)) determinaron que los antibióticos sulfametazina (sulfonamida) y la tilosina (macrólido) fueron degradados con mayor eficiencia en los suelos con un historial de exposición anual a este tipo de antibióticos, en comparación con un suelo control sin exposición previa a este tipo de compuestos. Por otro lado, Tappe et al., (2013) pudieron demostrar que la mineralización de los antibióticos contaminantes de un suelo era posible. Esto lo demostraron trabajando con un suelo de Alemania contaminado con sulfadiazina marcada con 14C, observando en sus experiencias que estos residuos de medicamentos radiomarcados se mineralizaron a 14CO2 con una gran eficacia (Tappe et al., 2013). Hay que considerar que muchos autores han sugerido que la transformación o degradación ambiental de los antibióticos depende de su estructura molecular y de sus propiedades fisicoquímicas, siendo éstos parámetros los más importantes y responsables que rigen el destino de los diferentes antibióticos en los suelos (Pan & Chu, 2017, Zhang & Dick, 2014). Dado que muchos factores abióticos y bióticos afectan la degradación de los antibióticos en el ambiente, los diferentes grupos de estos productos farmacéuticos difieren en sus tasas de degradación en el suelo, como lo demuestra la amplia gama de vidas medias que los antibióticos poseen en este tipo de matriz ambiental. Por el contrario, debido a sus propiedades, las tetraciclinas, fluoroquinolonas, macrólidos y sulfonamidas se unen fuertemente a los componentes del suelo y forman residuos estables (Albero et al., 2018).

La claritromicina es un antibiótico de tipo macrólido de amplio espectro, que posee función lactona, pue- de penetrar la pared celular de los microorganismos y unirse a las subunidades ribosómicas, lo que podría ejercer un efecto inhibitorio sobre el crecimiento y el metabolismo de los microorganismos, o incluso de organismos no objetivo al impedir la síntesis de proteínas microbianas (Isidori et al., 2005). Además de los microorganismos, se considera que la claritromicina tiene una fuerte toxicidad para los organismos fotoautótrofos acuáticos y que también podría causar pérdida auditiva reversible en organismos superiores (Whittemore et al., 2011). Su introducción en matrices ambientales sólidas o líquidas, genera modificaciones de la población bacteria sensible a este compuesto pero, por otro lado, se ha demostrado que algunos microorganismos en estos sistemas ambientales podrían biodegradar la claritromicina, generando así su depuración en el ambiente que contaminan (Topp et al., 2016)..

La eliminación de claritromicina de sistemas de efluentes líquidos se ha asociado con su sorción a las partículas de los lodos sólidos que se forman en las plantas depuradoras, con porcentajes de remoción de este tipo de antibióticos alrededor del 20% (Jelic et al., 2011). Por otro lado, se ha demostrado que una mayor presencia de microorganismos en la matriz de este tipo de efluentes mejora su biodegradabilidad, ya que la producción de enzimas por parte de los microorganismos puede mejorar la eliminación de antibióticos durante el tratamiento de los efluentes domiciliarios (Karaolia et al., 2014). Un aspecto a destacar, es que la estabilidad del antibiótico y la producción de metabolitos y otros derivados durante su degradación biológica son importantes, ya que pueden ser tan activos como el compuesto original o incluso tóxicos para los organismos, algo que es válido para todos los compuestos farmacéuticos. Muy pocos estudios han examinado el impacto de la claritromicina en los efluentes de aguas residuales con respecto a su capacidad de ser tóxico para los organismos y de producir resistencia a los antibióticos en los microorganismos una vez que se libera al medio ambiente ( Kim et al., 2009). El presente estudio evaluó la capacidad de la comunidad bacteriana expuesta a hidrocarburos de utilizar claritromicina como fuente de carbono y energía. Utilizando una medición colorimétrica a 415 nm para medir la concentración de la claritromicina y realizar el seguimiento por el consumo de oxígeno.

Materiales Y M Todos

Toma de muestras

Se tomó una muestra de suelo de aproximadamente 8 kg en un sistema de bioremedición de hidrocarburos a una profundidad comprendida entre los 10 y 30 cm. La misma se tamizó con una malla de 2 mm de poro y se almacenó hasta su posterior caracterización física, quí- mica y microbiológica Contenía un 8,21% de hidrocarburos totales de petróleo, cloruros 934,7ppm, bicarbonatos 32ppm, carbonatos <1ppm nitratos 0,8ppm sulfatos 900ppm calcio 801ppm, magnesio 291ppm hierro 0,2 ppm sodio 596ppm.

Ensayo de biodegradación de claritromicina

El suelo se lo incubo con medio base mineral (10g:90 ml) con 50 ppm de claritromicina, con agitación a 120 rpm y a 28C durante 20 días, luego se tomaron 10 ml y se volvieron a cultivar con 90 ml de medio Bushnell Haas modificado (CaCl2 0,01; MgSO2 0,2; FeCl3 0,005; NH4NO3 1; KH2PO3 0,5; Extracto de levadura 0,025 ; KH2PO4 0,5; pluripeptona 0,025) y 50ppm de claritromicina, esto se realizo cinco veces seguida para obtener la comunidad que solo crezca a expensas de la claritromicina. Y se realizaron asilamiento a los cuales se les realizo tes de esculina, lisina descarboxilada y presencia de beta lactamasas.

Cada comunidad, cepas aisladas y sus respectivos controles se trabajarán por triplicado, a 28°C en estufa de cultivo, en oscuridad y agitación constante (120 rpm) midiendo la presión de oxígeno por el sistema Oxitop. Como control negativo se utilizarán soluciones de los antibióticos a probar, en el mismo medio de cultivo. Los ensayos se controlarán periódicamente por lecturas en espectrofotómetro a 600 nm y seguimiento a 415 nm para determinar la concentración de la claritromicina.

Determinación de claritromicina por UV

Se transfirieron alícuotas 3 ml de la muestra a un embudo de decantación. Se añade 2 ml de HCl 0,1 N, 1 ml de 0,1% de Bromothymol blue (BTB) y 4 ml de agua destila se mezcló bien luego se añadió 10 ml y se agito vigorosamente por 2 minutos. A continuación, se dejó que las dos fases se separaran claramente y se midió la absorbancia de la fase orgánica de color amarillo a 415 nm (Rao et al 2003 , Shah et al 2008)

Caracterización e identificación de las cepas

Caracterización de las cepas aisladas

Las cepas asiladas se las realizó un tinción de Gram, pruebas en discos de Diatelab de detección de b- lactamassa, hidrolisis de esculina, lisina descarboxilasa, desaminasa de triptófano.

Actividad hemolítica

Cada cepa se inoculó en una placa de agar sangre y se incubó a 37 oC durante 48 h. Las placas fueron revisadas visualmente para la detección de halos de hemólisis alrededor de las colonias. Los biosurfactantes pueden causar la lisis de los eritrocitos de la sangre. La presencia de un halo de hemólisis alrededor de la cepa indica la lisis de los eritrocitos y por lo tanto, la presencia del biosurfactante (Walter et al. 2010)..

Estabilidad de la emulsión (E.E.) (12)Este parámetro se determinó́ a partir del volumen de emulsión (VE) relativa medido en el intervalo de 0 a 48 h, cada 24 h con las siguientes ecuaciones: altura de la emulsión (mm) x área volumen total de líquido

VE=altura de la emulsión (mm) x área de la sección transversal (mm q2) (volumen total del líquido(mm q3)

EE= VE al tiempo (h) x 100 VE al tiempo 0 (h)

Un criterio citado para definir la estabilidad de la emulsión es que el parámetro E.E. sea mayor a 50 % después de 48 h. Las estabilidades de las emulsiones formadas fueron comparadas con una solución 1 % de dodecil sulfato de sodio en agua desionizada.

Identificación de bacterias por FAMEs

La extracción de ácidos grasos se realizará por tratamiento de 40 mg (peso húmedo) de células crecidas en la tercera estría a las 24 horas en medio digerido de Tripteina y Soya en Agar (T.S.B.A), efectuando una saponificación con alcohol metílico-hidróxido de sodioagua (150 mL: 45 g: 150 mL), seguida de una metilación con ácido clorhídrico 6 N y alcohol metílico (325 mL: 275 mL) y a continuación una extracción con n-hexanometil terbutil eter (1:1) y lavado con hidróxido de sodio-agua (10.8 g-900 mL).

Los ácidos grasos se determinarán como metil ésteres por cromatografía gaseosa, usando una columna capilar Ultra 2 de 25 cm de longitud, 0,2 mm de diámetro, con un cromatógrafo HP 6890 series II GC con inyección splitless; presión inicial 10 psi; programa de temperatura: 170-288°C a 28°C/min, 288-310°C 60°C/ min, 1,5 min de permanencia a 310 °C y detector por ionización de llama. La integración de los picos se efectuará mediante HP 10.01 Chem Station, siendo los ácidos grasos identificados mediante el sistema Sherlock (versión 6.0) con el estándar Agilent Calibration standards kit for the microbial identification system. La composición en ácidos grasos será calculada como porcentaje del área de pico en relación con la sumatoria de áreas de todos los ácidos grasos de C9 a C20.

Resultados Y Discusi N

A partir de la muestra de suelo proveniente de una biopila, sistema típico de remediación de suelos, contaminado con hidrocarburos propios de la Cuenca del Golfo San Jorge, se enriqueció la comunidad bacteriana capaz de desarrollar en presencia de claritromicina. Esto se logró luego de 5 enriquecimientos sucesivos, para finalmente con este extracto bacteriano realizar los estudios de actividad microbiana presentados en las Figuras 1 y 2. A partir de este extracto microbiano obtenido, también se aislaron cuatro cepas bacterianas que se presentan en el Cuadro 1, resultando ser todas Gram negativas. Esto último pudo deberse a que los enriquecimientos bacterianos se realizaron en un medio de cultivo líquido, en donde las bacterias Gram negativas tienen una ventaja evolutiva respecto a las bacterias Gram positivas que son en general de desarrollo más lento.

Todas las cepas bacterianas aisladas en el presente estudio tuvieron la capacidad de desarrollar en presencia de claritromicina como fuente de carbono y energía, mostrando diferentes porcentajes de biodegradación de este compuesto. El desarrollo en presencia de claritromicina de la comunidad bacteriana enriquecida del suelo, como el de las cepas aisladas fue similar, con excepción de la cepa 4 que mostró una cinética de consumo de oxígeno inferior. Sin embargo, el porcentaje de eliminación de claritromicina de esta cepa 4 fue similar que al observado para la cepa 1 y para la comunidad bacteriana estudiada, con valores cercanos al 60%. Por otro lado, las cepas 6 y 8 presentaron una capacidad de metabolizar la claritromicina inferior, con porcentajes cercanos al 14 y 30%, respectivamente. Tres de las cuatro cepas aisladas fueron identificadas como Pseudomonas aeruginosa (cepas 3, 4 y 8), encontrándose que la cuarta cepa fue identificada como Stenotrophomonas maltophilia (cepa 6). Estudios previos presentan una gran variedad de géneros bacterianos que evidencian resistencia natural a la claritromicina, que incluyen a Enterobacterias, Pseudomonas, Nocardia, Micoplasma, Chlamydia y Mycobacterium (Prescott 2002).

Las cepas 3, 4 y 8 mostraron la capacidad para producir biosurfactantes con propiedades emulsificantes y porcentajes de estabilidad de la emulsión determinada a las 48 h entre 75 y 85 % aproximadamente. Esto indica que la emulsión formada por estos microorganismos es estable, al menos por 48 h, según el criterio propuesto por Das et al. (1998). Si bien la actividad hemolítica se presentó solo en dos cepas bacterianas identificadas como Pseudomonas aeruginosa (cepas 1 y 4), cabe mencionar que no todos los biosurfactantes poseen actividad hemolítica (12). La falta de esta actividad hemolítica en las cepas 6 y 8 en el presente trabajo pudo deberse a dos variantes: o no hay actividad biosurfactante en estos microorganismos, o hay actividad biosurfactante sin actividad hemolítica, situación que fue observada por (Lara-Severino et al 2017) en cepas de Pseudomanas aeruginosa descriptas como productoras de biosurfactantes.

El rápido consumo de oxígeno observado en la Figura 1A marcó una cinética de crecimiento con una llegada a fase estacionaria en el segundo día de la experiencia, observándose que luego de este periodo la curva obtenida mantiene una pendiente poco pronunciada. Respecto de la cinética de crecimiento obtenida a par- tir del monitoreo de la densidad óptica de los cultivos a 600 nm, se observó un desarrollo máximo a los siete días, momento en que todos los cultivos ingresaron en fase estacionaria (Fig. 1B). Autores como Zeng et al., (2021)) comunicaron la degradación parcial de la claritromicina durante una digestión anaerobia de matrices ambientales, generando metabolitos con menor o sin actividad antimicrobiana. La nueva información proporcionada en este estudio demostró que la claritromicina podría degradarse en oleandomicina, un antibiótico macrólido con menor actividad antimicrobiana, y otros metabolitos sin actividad antimicrobiana durante la digestión anaeróbica, lo que indica que el riesgo ambiental potencial inducido por la claritromicina podría reducirse gracias a los microorganismos ambientales con capacidad de metabolizar este tipo de antibióticos.

La degradación microbiana puede contribuir a la desaparición de antibióticos en el suelo. Algunas bacterias que degradan los antibióticos se han aislado de suelos contaminados con este tipo de compuestos. Por ejemplo, cepas pertenecientes a los géneros Microbacterium (Topp et al., 2016), Burkholderia (Zhang & Dick, 2014), Stenotrophomonas (Leng et al., 2016), Labrys (Mulla et al., 2018), Ochrobactrum (Zhang et al., 2017b; Mulla et al., 2018) y Escherichia (Mulla et al., 2018; Wen et al., 2018) fueron capaces de degradar sulfametazina, penicilina G, tetraciclina, eritromicina y doxiciclina en cultivos líquidos, respectivamente. Otros microorganismos pertenecientes a los géneros

Identificación (FAMEs)

ID

Actividad hemolítica

Hidrólisis de esculina

Lisina descarboxilasa

Test β-lactamasa

Estabilidad de emulsión

Klebsiella (Xin et al., 2012), Acinetobacter, Escherichia (Zhang et al., 2012), Microbacterium (Kim et al., 2011) y Bacillus (Rafii et al., 2009; Erickson et al., 2014) que eran capaces de degradar cloranfenicol, sulfapiridina, sulfametazina, ciprofloxacina, norfloxacina y ceftiofur fueron aislados de pacientes cursando infección de alguno de ellos, sedimentos, lodos, heces de animales y agua de mar.

La hidrólisis del anillo de lactona presente en la clarotromicina puede realizarse por enzimas de tipo β-lactamasas. En el presente estudio, estas enzimas solo fueron detectadas en la cepa 6 identificada como Stenotrophomonas maltophilia, este microorganismo se caracteriza por presentar una importante actividad de este tipo de enzimas según lo reportado por Tamma et al. (2021) en cultivos obtenidos a partir de estudios clínicos. El anillo lactona se encuentra unido por enlaces glucosídicos a desoxiazúcares aminados. Su hidrólisis generalmente se considera una de las vías más importantes para la degradación abiótica de estos antibióticos. Los betalactámicos son especialmente susceptibles a la degradación hidrolítica, mientras que los macrólidos y las sulfonamidas son menos susceptibles a la hidrólisis (Braschi et al., 2013, Mitchell et al., 2015).

La utilización de claritromicina y otros macrólidos por microalgas fue reportada por Zeng al 2019, donde comunica que los antibióticos macrólidos claritromicina, roxitromicina y azitromicina sufrieron una eliminación del 76 63 y 78%, respectivamente, luego de 40 días de incubación. Se informaron eficiencias de eliminación similares para claritromicina y roximitromicina en aguas residuales afluentes de cuatro microalgas, donde se destacó C. vulgaris (Zhou et al., 2014).

Los valores de eliminación de claritromicina observados para la comunidad bacteriana enriquecida desde el suelo, como los de la cepas aisladas, se correspondieron con lo comunicado por Feng et al 2017, quienes determinaron que la eliminación de los macrólidos como la claritromicina y la eritromicina fue del 36 y del 99%, respectivamente, no pudiendo ellos identificar en sus experimentos cinéticos productos de transformación de la claritromicina. Observaron que la claritromicina fue degradada lentamente desde valores de concentración inicial de 557 μg/L hasta valores de 356 μg/L. Abegglen et al., (2009) informaron que la claritromicina se adsorbe significativamente a los sólidos que constituyen los lodos presentes en las platas depuradoras de efluentes domiciliarios, observando que esta alta adsorción a estos sólidos disminuye su biodegradabilidad en estos sistemas. Estrada-Arriaga et al., (2016) también encontraron que la claritromicina era uno de los compuestos más persistentes en los efluentes de diferentes, con tasas de degradación entre 0 y 50%. Observaron que se podría esperar una mayor tasa de degradación aumentando el tiempo de retención de sólidos en el reactor de lodos activados de la planta de tratamiento de aguas residuales. Los resultados informados en la literatura muestran que la degradación de la claritromicina aumenta a valores entre 87 y 90% con un tiempo de retención sólidos de 60-80 días, en comparación con tiempos de retención sólidos más bajos (27).

Conclusi N

La comunidad bacteriana presente en un suelo contaminado con hidrocarburos de larga data, también pudo utilizar claritromicina como fuente de carbono y energía.

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