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Hansen Wilber Murcia Gutierrez
DISCUSIÓN La cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) es una técnica que permite la separación a escala pequeña de analitos presentes en una mezcla. Al momento de iniciar la estandarización de un método cromatográfico para la separación de analitos de interés bajo unas condiciones que no son idénticas a las que se encuentran en la literatura, es necesario partir de condiciones diferentes que permitan dar un primer paso en encontrar las condiciones que se ajustan al cromatógrafo y los reactivos con los que se dispone. No siempre se tienen las condiciones cromatográficas precisas para la separación de sustancias de interés e inclusive, si un método es encontrado este puede llegar a ser no reproducible. Por esto se busca en la literatura técnicas similares que den una primera luz en la estandarización de las condiciones óptimas de separación. De los 6 métodos estandarizados se encontró que muchos métodos reportados en la literatura no son fácilmente reproducibles y que solo aportan algunas de las condiciones necesarias para la separación, lo que hace que se tenga que experimentar variando gradualmente cada parámetro hasta encontrar las condiciones óptimas de separación de analitos en una mezcla compleja como lo son las incubaciones in vitro. Hay que tener en cuenta que en la técnica de HPLC diferentes factores afectan la separación, como el tipo de columna utilizada (fase reversa o fase normal), la fase móvil, el uso de gradientes y aditivos (como ácidos orgánicos o inorgánicos), la temperatura, la velocidad del flujo y el tipo de detección (fluorescencia o ultravioleta). De muchos de ellos reportados en la literatura se pueden tomar Analitos
T ( C)
Flujo (mL/min)
Resorufina
Amb
Metoxiresorufina
Resorufina
Cumarina
solo ciertas condiciones que con la experimentación abren camino a condiciones que permitan una buena resolución de los compuestos a separar. En el caso de estos sustratos prototipo se tuvo la ventaja de ser separados por parejas. En otros casos se enfrentan condiciones donde el número de analitos es mayos dificultando enormemente la estandarización del método. Con la estandarización de las condiciones por parejas sustrato-producto se espera poder desarrollar un método que permita la separación de mezclas mas complejas que permitan la detección de las de una forma de CYP cuando se realizan este tipo de ensayos in vitro. CONCLUSIONES La búsqueda en la literatura de condiciones de separación por cromatografía liquida de alta eficiencia de un compuesto especifico o de formas similares es base fundamental para agilizar la estandarización de las condiciones de separación de compuestos por la técnica de HPLC. Es claro que a medida que la mezcla de compuestos es más compleja, es más difícil encontrar condiciones en la literatura que guíen a la estandarización de las condiciones cromatográficas, por ende, los tiempos de estandarización y el esfuerzo se hacen más grandes. No siempre se encuentran condiciones que den una luz como trabajar un compuesto por HPLC e inclusive, el uso de una técnica ya estandarizada no es reproducible en equipos que difieran del usado en el reporte. Por esto la información que se puede adquirir en la literatura en la gran mayoría de casos es una base para ajustar a las condiciones que se tienen en el laboratorio.
580
1:10
5
7.3
3.7
530
580
1:10
2
5.9
3.7
N.A.
325
542
1:100
5
N.A.
4.1
Isocrática 30% de metanol, 70% agua y 0.1% de acido fórmico
N.A.
210
290
Sin diluir
5
5.9
4.0
0.50
Isocrática 32% acetonitrilo y 68% agua
270
N.A.
N.A.
Sin diluir
5
16.7
14.2
0.35
gradiente lineal con A: agua y B: metanol acidificados con acido fórmico al 0.1%, de la siguiente manera: 0 minutos: 30% B; 7 minutos: 55% B; 7.01 minutos: 30% B; 14 minutos: 30% B
N.A.
365
425
1:100
2
12.4
7.8
0.30
Isocrática 30% buffer fosfato (20 mM pH 7.4) y 70% metanol
Amb
0.30
7-hidroxicumarina
Amb
Debrisoquinona
4-hidroxidebrisoquinona
Nifedipina AFB1
Etoxiresorufina
Tiempo de retención (min.) Sustrato Producto
Loop (L)
UV ( abs)
Producto
Fluorescencia
Dilución
Fase móvil
Sustrato
ext
em
N.A.
530
Isocrática 30% buffer fosfato (20 mM pH 7.4) y 70% metanol
N.A.
0.40
Isocrática 30% acetonitrilo y 70% agua
Amb
0.30
Nifedipina Oxidada
Amb
Dhd-AFB1
40
Tabla 1. Condiciones cromatográficas para la separación de parejas sustrato-producto. Se incluye también la separación de la AFB1 y su producto de biotransformcion dhd-AFB1. C: grados celcius. mL: mililitros. Amb: temperatura ambiente. λ: longitud de onda (en nm - nanómetros). Abs: absorbancia. N.A.: no aplica. Min.: minutos.
Revista TEORÍA Y PRAXIS INVESTIGATIVA, Volumen 7 - No. 1, Enero - Junio 2012 Centro de Investigación y Desarrollo • CID / Fundación Universitaria de Área Andina