Revista Biotecnología Nº1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

CENTRO DE BIOTECNOLOGIA Volumen: 1, Nro. 1: 2012

Loja - Ecuador 2012

CENTRO DE BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

Volumen: 1, Nro. 1 Año: 2012

COMITE EDITORIAL: Dr. Rómulo Chávez Valdivieso, Ph. D.

DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN - UNL Ing. Iván Granda Mora, Mg. Sc.,

DOCENTE INVESTIGADOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

COMITÉ DE REVISION: Aminael Sánchez Rodríguez, Ph.D., Roldán Torres Gutiérrez, Ph.D. Klever Iván Granda Mora, Mg. Sc.

EDITOR: Rómulo Chávez Valdivieso, Ph.D. DIRECCION: Ciudad Universitaria “Guillermo Falconí Espinosa”, Sector “La Argelia” EMAIL: centrobiotecnologia@unl.edu.ec Cesar Sandoya V.

RESPONSABLE DE COMUNICACIÓN INSTITUCIONAL Byron Gutierrez Q.

DISEÑO Y DIAGRAMACIÓN - UNL

Loja – Ecuador

EDITORIAL El Centro de Biotecnología (CB) de la Universidad Nacional de Loja, se creó como una entidad res-ponsable de la investigación científica aplicada, innovación biotecnológica y docencia, con el obje-tivo de impulsar la Biotecnología en beneficio de la colectividad, con especial énfasis en lo productivo y social, por lo tanto el CB considera las necesida-des de los sectores agrícola, ambiental, pecuario, de salud pública, y apoyo a la investigación para la vida, el desarrollo y la legislación, siendo esta unidad académica un referente para la región sur y el Ecuador, que ofertará alternativas tecnológicas, y se proyecta a desarrollar estudios de Posgrado y de Maestría en Ciencias Biotecnológicas en coordinación con las Áreas Académicas de la Universidad Nacional de Loja y otras entidades públicas y privadas nacionales y externas.

El Centro de Biotecnología cuenta con instalacio-nes y equipamiento para realizar estudios, explo-ración y manipulación de genes de animales, plan-tas, y microorganismos de interés económico y ecológico, así como para desarrollar biotecnolo-gías competitivas, con enfoque multi e interdisci-plinario La presente publicación abarca artículos de revi-sión sobre las temáticas biotecnológicas referentes a los proyectos de investigación propuestos a desarrollar en el Centro de Biotecnología, en los que se proporciona en forma resumida y analítica el Estado del Arte con la información actualizada generada por centros e investigadores del mundo científico. En la segunda sección se proporciona un resumen de los proyectos de generación bio-tecnológica que han sido formulados y elaborados por el personal de investigadores del Centro de Biotecnología y se han sometido al análisis de pares externos y a captación de financiamiento para su ejecución. Finalmente se describe las actividades vinculadas con la gestión del centro y cumplidas durante el año 2011

AUTORIDADES UNIVERSITARIAS: Dr. Gustavo Villacís Rivas, Mg.Sc., RECTOR Dr. Ernesto González Pesantes, Mg.Sc., VICERRECTOR Dr. Rómulo Chàvez Valdivieso, Ph.D. DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN - UNL

COMITÉ DIRECTIVO DEL CENTRO DE BIO-TECNOLOGIA: Dra. Graciela Yépez de Ruíz, DIRECTORA DEL ÁREA JURÍDICA, SOCIAL Y ADMINISTRATIVA (E) Dr. Edgar Benítez González, Mg.Sc., DIRECTOR DEL ÁREA AGROPECUARIA Y DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES Dr. César León Aguirre, DIRECTOR DEL ÁREA DE LA EDUCACIÓN, EL ARTE Y LA COMUNICACIÓN (E) Dr. Jorge Reyes Jaramillo, DIRECTOR DEL ÁREA DE LA SALUD HUMANA (E) Ing. José Ochoa Alfaro, DIRECTOR DEL ÁREA DE LA ENERGÍA, LAS INDUSTRIAS Y LOS RECURSOS NATURALES RENOVABLES

Dr. Tito Muñoz Guarnizo, Mg. Sc., DIRECTOR DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA

CONTENIDOS I.

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

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RECURSOS GENÉTICOS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACIÓN Autor: Ing. Aníbal Homero Ruiz Sánchez.

BIOLOGÍA DE SISTEMAS Y BIOINFORMÁTICA: ESTUDIO DE INTERACCIONES FITOPATOLÓGICAS Autores: Ing. Marlon Pineda Escobar, Dr. Ph.D. Aminael Sánchez Rodríguez MICROORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS Y SU CONTRIBUCIÓN A LA FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL NITRÓGENO Autores: Ing. Klever Iván Granda Mora, M.Sc., Biólogo. Santiago Erazo Sotomayor.

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USO DE MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS Y SUSTANCIAS NATURALES COMO UNA ALTERNATIVA ECOLÓ-GICA EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN CULTIVOS Autor: Ing. Ángel Rolando Robles Carrión, M.Sc.

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MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIÓN LYCOPERSICON Autora: Ing. María Natalia Morales Palacio Mg.Sc.

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NANOESTRUCTURAS POLIMÉRICAS PARA LA DETECCIÓN DE ADN Autor: Ing. Ivan Burneo Saavedra Mg. Sc.

II.

RESUMEN DE PROYECTOS:

“ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PATÓGENO-PATÓGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO (VASCONCELLEA HELBORNII VAR. PEN-TAGONA)” Autor: Ing. Marlon Pineda Escobar

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I. Artículos de revisión

“PRODUCCIÓN DE UN BIOINOCULANTE EFICIENTE PARA EL CULTIVO DE LEGUMINOSAS: MEDIANTE LA UTILI-ZACIÓN DE CEPAS NATIVAS DE MICROORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS” Autor: Ing. Klever Iván Granda Mora, M.Sc “MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIÓN LYCOPERSICON” Autor: Ing. María Natalia Morales Palacio, Mg.Sc “AMPLIACIÓN Y ESPECIALIZACIÓN DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA, PRIORIZANDO LEGUMINOSAS DE LA ZONA 7 DEL ECUADOR” Autor: Ing. Aníbal Homero Ruiz Sánchez.

“DESARROLLO DE BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS “LABEL-FREE” MEDIANTE EL USO DE MATERIALES NANOESTRUCTURADOS PARA LA DETECCIÓN TEMPRANA Y RÁPIDA DE CÁNCER”.

Autor: Ing. Ivan Burneo Saavedra Mg. Sc. PRODUCCIÓN DE BACTERINAS INACTIVADAS PARA PREVENIR LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS DE ORIGEN BACTERIANO EN COBAYOS (Cavia porcellus) DE LA PROVINCIA DE LOJA. Autora: Med. Vet. Vanessa Herrera Yunga

III. INFORMATIVO

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INFORMATIVO DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA - 2011

Centro de biotecnología: E-mail: centrobiotecnologia@unl.edu.ec

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RECURSOS GENÉTICOS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACIÓN Aníbal Homero Ruiz Sánchez1.

1. Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S” E-mail: anibalruiz1@hotmail.es _____________________________________________________________________________

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ABSTRACT The diversity among species and within species, biodiversity, is a feature easily observable. Part of this diversity is what we recognize as the definition of genetic resources, FAO (1989), is “the heredi-tary material of economic value, scientific or social.” With the disappearance of species and wild forms of cultivated plants, due processes such as massive deforestation, de-gradation and pollution of natural habitats, in short, are but results of the abuse of the planet’s resources, is what is now known as genetic erosion. genetic resources have now been introduced as a new branch of biotech-nology that is independent of Genetics and Molecular Biology, its main objectives are to ensure the conservation and sustainable use of genetic resources for food and agriculture, and the fair and equi-table the benefits.

Key words: Genetic Resources, Genetic Erosion, Conservation In situ - Ex situ _____________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

RESUMEN La diversidad entre especies y dentro de cada especie, biodiversidad, es una característica fácilmen-te observable. Una parte de esta biodiversidad es lo que reconocemos como recursos genéticos cuya definición, según la FAO (1989), es “el material hereditario con valor económico, científico o social”. Con la desaparición de especies y formas silvestres de las plantas cultivadas; debida a pro-cesos como la deforestación masiva, degradación y contaminación de los hábitats naturales que, en definitiva, no son sino resultados de la explotación abusiva de los recursos del planeta, es lo que hoy conocemos como erosión genética. Los Recursos Genéticos en la actualidad se han instaurado co-mo una nueva rama de la Biotecnología que se independiza de la Genética y la Biología Molecular, sus principales objetivos son velar por la conservación y la utilización sostenible de los recursos ge-néticos para la alimentación y la agricultura, y por la distribución justa y equitativa de los beneficios derivados.

Palabras clave: Recurso genético; Erosión Genética; Conservación In situ – Ex situ _____________________________________________________________________________ 6

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de germoplasma son un recurso vital e irreemplazable, una herencia que se debe conservar para proveer opciones a la agricultura en el futuro, en un mundo que afronta el cambio climático y otros desafíos. La conservación sostenible de los recursos genéticos depende del trabajo eficaz del personal de los bancos de germoplasma, cuyo papel es crítico para garantizar que el germoplasma se conserve de manera efectiva y eficiente. (3).

El Ecuador se localiza en el extremo occidental de América del Sur, entre 1° 30’ N y 5° S de latitud y 75° W y 81° W de longitud, siendo un país pequeño en superficie (275 830 km2), pero poseedor de una configuración climatológica, fisiográfica y orográfica destacable, lo cual le permite disponer de una gama de recursos con singular potencial productivo. (1). La biodiversidad que podríamos llamar domesticada, báGeneralidades de los Recursos Genéticos. sicamente la agrícola, y más específicamente el pool de recursos genéticos de uso en la aliDesde la aparición de la vida en la Tierra hace mentación y la agricultura, es la gran despenunos 3.000 millones de años, el proceso evosa que garantiza a la humanidad los alimenlutivo ha originado una enorme diversidad de tos, los vestidos y, en una parte importante, las especies e individuos que mediante los procemedicinas. La preservación de esta riqueza es sos de selección permanente esencial en el desarrollo de la se han adaptado a las difeagricultura sostenible y la seLa diversidad genética es muy rentes condiciones del globo. guridad alimentaria. (2) importante para la alimenta- Esta variabilidad genética ción humana. Los recursos fito- acumulada resulta esencial La diversidad genética es genéticos cumplen una función para el equilibrio del sistema muy importante para la alivital en el desarrollo sostenible y constituye lo que se denomentación humana. (2). Los de la agricultura en tanto ayu- mina germoplasma del plabancos de germoplasma dan a aumentar la producción neta. como mecanismos de conde alimentos y a combatir el Dentro de este conjunto, los servación, son depósitos de “recursos filogenéticos” comhambre y la pobreza. recursos fitogenéticos que prenden la diversidad genéproporcionan la materia pritica correspondiente al mundo vegetal que se ma para el mejoramiento de los cultivos. Esconsidera poseedora de un valor para el pretos recursos cumplen una función vital en el sente o el futuro. Bajo esta definición se includesarrollo sostenible de la agricultura en tanto yen normalmente las categorías siguientes: ayudan a aumentar la producción de alimenvariedades de especies cultivadas, tanto traditos y a combatir el hambre y la pobreza. (3) cionales como comerciales; especies silvestres Las semillas que se almacenan en los bancos o asilvestradas afines a las cultivadas o con un Centro de biotecnología: E-mail: centrobiotecnologia@unl.edu.ec

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valor actual o potencial, y materiales obtenidos en trabajos de mejora genética (Esquinas- Alcázar 1993). (6) Los recursos fitogenéticos son el conjunto de combinaciones de genes resultante de la evolución de las especies, constituyen la base de la seguridad alimentaria mundial tienen potencial de uso agrícola actual o futuro (4). El estudio y conservación de los recursos fitogenéticos es una disciplina emergente en la que obviamente la Genética es la clave en la que se apoyan otros componentes del arco de las ciencias puras y aplicadas que estudian a los seres vivos y su utilización por el hombre. (5) La diversidad entre especies y dentro de cada especie, biodiversidad, es una característica fácilmente observable. Una parte de esta biodiversidad es lo que reconocemos como recursos genéticos cuya definición, según la FAO (1989), es “el material hereditario con valor económico, científico o social contenido en las especies”; definición que incluye una enorme cantidad de especies si se acepta que su valor sea al menos potencial. Sin embargo, frecuentemente el término de recursos fitogenéticos se entiende por los mejoradores de forma más limitada, incluyendo los pocos cientos de especies cultivadas, pratenses y forestales con utilidad directa y/o cuya diversidad genética puede usarse en mejora y domesticación. Otro de los hechos fácilmente observables en la naturaleza es la adaptación de los seres vivos a su medio natural, lo que implica adaptación a condiciones del medio físico (climático y edáfico) y del medio biológico: mecanismos de defensa contra predadores y patógenos. (5).

Erosión Genética La pérdida de diversidad se acentuó entre los años 1940-50 cuando el desarrollo de la mejora genética dio lugar a la introducción de variedades comerciales, uniformes y mucho más adaptadas a las técnicas modernas de cultivo y a los nuevos sistemas de comercialización, siendo incuestionable el beneficio obtenido de ello por una población mundial creciente y subalimentada. Sin embargo, como 8

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contrapartida, las variedades modernas, con una base genética muy reducida, han ido desplazando a innumerables variedades tradicionales, heterogéneas y menos productivas, pero altamente adaptadas a su ambiente local y poseedoras de una gran diversidad genética. La consecuencia paradójica es que la aplicación masiva de los logros de la mejora vegetal ha puesto en marcha un proceso que destruye los materiales esenciales de abastecimiento de los propios fitomejoradores. (6) El problema de la erosión genética de las variedades locales se ve agravado, además, por la desaparición de especies y formas silvestres de las plantas cultivadas debida a procesos como la deforestación masiva o la degradación y contaminación de los habitats naturales que, en definitiva, no son sino resultados de la explotación abusiva de los recursos del planeta. La pérdida de variabilidad genética supone una limitación de la capacidad de responder a nuevas necesidades y un incremento de la vulnerabilidad de nuestros cultivos frente a cambios ambientales o aparición de nuevas plagas o enfermedades. (6).

El reconocimiento de la erosión genética como un problema grave tiene lugar en los años 50, cuando el desarrollo agrícola empieza a alcanzar a las regiones del planeta con mayor diversidad genética, siendo en este momento cuando se empiezan a poner en marcha medidas globales para preservar los recursos fitogenéticos.

En el ámbito internacional, la reunión Técnica organizada por FAO en 1961 “Plant Exploration and Introduction” puede considerarse el punto de partida en el desarrollo del proceso coordinado de conservación de recursos filogenéticos. Sucesivas actividades y reuniones promovidas por este organismo establecieron las directrices para solucionar los problemas técnicos relacionados con la recolección, conservación, evaluación, etc. del germoplasma y sus resultados se han plasmado en dos libros de obligada referencia: “Genetic Resources in Plant: Their Exploration and Conservation” (Frankel y Bennett, 1970) y “Crop Genetic Resources for Today and Tomorrow” (Frankel y Hawkes, 1975). En 1983, se estableció el “Sistema Mundial de la FAO para la Conservación y Uso Sostenible de los Re-

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cursos Fitogenéticos para la Alimentación y la Agricultura” cuyos objetivos son asegurar la conservación y promover la disponibilidad y utilización sostenible de los recursos genéticos, para las generaciones presentes y futuras (FAO, 1996).(6) Razones para colectar germoplasma • Rescatar una especie en peligro de extinción o de erosión genética.

• Usar el germoplasma inmediatamente.

• Completar colecciones ex situ.

• Profundizar en los conocimientos sobre la especie.

• Aprovechar una oportunidad para colectar.

• La colecta forma parte de una estrategia de conservación. (11) Evaluación y Caracterización Son actividades complementarias que consisten en describir los atributos cualitativos y cuantitativos de las accesiones de una misma especie para diferenciarlas, determinar su utilidad, estructura, variabilidad genética y relaciones entre ellas, y localizar genes que estimulen su uso en la producción o en el mejoramiento de cultivos. Ambas requieren exactitud, cuidado y constancia, e incluyen un componente importante de registro de datos.

Estas dos actividades son muy parecidas y su principal diferencia radica en que: 1. En la caracterización se persiguen propósitos múltiples, describiendo los fitorecursos en la forma más amplia posible, para los más diversos caracteres de dichos materiales.

2. En la evaluación tiene propósitos definidos, o sea, evalúa caracteres o cualidades con determinados objetivos. Es importante para identificar rasgos potencialmente valiosos de las muestras, así como las variedades locales que podrían utilizar directamente los agricultores. (7).

Conservación El aspecto de cómo conservar es uno de los más desarrollados. Este aspecto implica los

métodos de conservación en sí y los previos de recolección. Los estudios realizados sobre las técnicas de muestreo, recolección y conservación son numerosísimos. En el aspecto concreto de la conservación, esta puede realizarse in situ o ex situ. El primer tipo es usado fundamentalmente con especies silvestres, forestales o no, y en muy baja proporción con especies cultivadas. (5) Las plantas se conservan dependiendo de su necesidad y/o utilidad actuales y futuras. Los recursos fitogenéticos se pueden conservar en su hábitat natural (in situ), en condiciones diferentes a las de su hábitat natural (ex situ), o combinando los métodos in situ y ex situ, es decir, de manera complementaria. La selección de uno o varios métodos depende de las necesidades, las posibilidades y la especie objetivo. (4) La conservación de los recursos filogenéticos es una labor continua, de largo plazo, que implica inversiones importantes en tiempo, personal, instalaciones y operación, justificables en función de las necesidades no del deseo o conveniencia de conservar un material. Las razones para conservar y las especies objetivo se deben definir con base en criterios lógicos, científicos y económicos como la necesidad, el factibilidad de conservarlas (Maxted et al. 1997). (4).

Requerimientos de la conservación Como cualquier proceso estratégico, la conservación de los recursos fitogenéticos implica planificar y tomar decisiones con base en información previa. La conservación requiere establecer prioridades en cuanto a: a) el tipo de material que se va a conservar (especies en peligro o de interés para la alimentación y la agricultura), b) las actividades que se van a realizar con él posteriormente, y c) los recursos disponibles para realizar esas actividades. Las prioridades pueden variar pero hay que tener presente que la conservación y el uso del germoplasma son los objetivos más importantes. La conservación debe disminuir al máximo posible los efectos del nuevo ambiente en las especies objetivo. Quienes conservan germoplasma deben conocer la taxonomía de las especies y las técnicas para representar su variabilidad genética y

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conservar estable el genotipo original. También se debe obtener información como datos de pasaporte, caracterización y evaluación (Cuevas 1988). (4).

Las instalaciones en donde se va a conservar el material deben garantizar el aislamiento tanto de factores ambientales como contra plagas y enfermedades. Las instalaciones pueden variar en diseño y dimensiones dependiendo del número y el tamaño de las muestras que van a conservar pero deben contar con un suministro constante de energía eléctrica y equipos que permitan acondicionar, conservar y regenerar los materiales. Deben ser seguras para que protejan el material de incendios, inundaciones, robo, saqueo y disturbios de orden público. El manejo de las colecciones de recursos fitogenéticos debe estar a cargo de personal calificado, en lo posible de diversas disciplinas (fisiólogos, botánicos, mejoradores y agrónomos), que conozca los aspectos técnicos y los procedimientos de seguridad inherentes a sus labores. Conviene que la colección dependa de un grupo de personas laboralmente estables —no exclusivamente del curador— que puedan darle continuidad al trabajo de conservación, sin presiones políticas o de orden público. La sola creación de un banco de germoplasma no garantiza la conservación de los recursos genéticos de interés para un país.

La conservación requiere apoyo institucional, es decir, proveer de manera sostenida los recursos económicos, humanos y técnicos necesarios para mantener las colecciones y realizar las actividades de conservación. (4) Conservación ex situ de los recursos fitogenéticos Es la conservación de genes o genotipos de plantas fuera de su ambiente de ocurrencia natural, para uso actual o futuro (Hoyt 1988 citado por Engle 1992). La conservación ex situ pertenece al importante conjunto de actividades que componen el manejo de los recursos fitogenéticos. Se considera complementaria de la in situ por cuanto no es posible conservar ex situ todas las especies. La conservación ex situ abarca un amplio espectro taxonómico. Sirve para proteger desde especies silvestres y formas regresivas hasta especies cultivadas. Aplicada a 10

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especies domesticadas, la conservación ex situ busca conservar fuera de su centro de origen o diversidad tanto las especies como la variabilidad producida durante el proceso evolutivo de domesticación. Este tipo de conservación se ha utilizado ampliamente durante las últimas décadas (Hidalgo 1991). (4) Conservación in situ de los recursos filogenéticos La conservación in situ, también llamada conservación dinámica, se realiza en las áreas en las que ocurre naturalmente la diversidad biológica. Para los recursos Fitogenéticos silvestres, esta conservación se realiza en los sitios en que las poblaciones de las especies de interés evolucionaron y se diversificaron. En el caso de los recursos fitogenéticos cultivados, la conservación in situ se realiza en los predios o fincas de los agricultores que poseen variedades locales o criollas y en los huertos familiares. Esta estrategia de conservación adquiere una importancia creciente ante escenarios globales que afectan a nuestro planeta, tales como la pérdida de biodiversidad, el cambio climático y los procesos de desertificación. En las próximas décadas, una población mundial creciente requerirá cada vez más de la diversidad genética para lograr nuevas adaptaciones a estreses ambientales, resistencia a nuevas plagas y/o enfermedades, productos nutraceúticos y otra gran diversidad de productos, farmaceúticos y cosméticos, entre otros.

La principal diferencia entre ambos tipos de conservación, es que en la conservación in situ no se aísla a los recursos fitogenéticos de su entorno biofísico, socio-económico y cultural.

Continúan ocurriendo los procesos evolutivos y co-evolutivos, así como los procesos de selección y diversificación en los agrosistemas.

La generación de variantes genéticas adaptadas de forma continuada es sustancial para el mantenimiento de la vida y las especies en el planeta, especialmente importante ante las perspectivas de cambio climático. La seguridad alimentaria de los pueblos, el mantenimiento de los servicios ecosistémicos, la recreación, el turismo y el futuro del mejoramiento genético dependen directamente de la conservación dinámica de la biodiversidad. (8)

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Documentación e información de recursos genéticos Se denomina documentación a la organización de la información, siendo un componente básico y fundamental para tomar decisiones respecto al manejo y uso de los recursos genéticos. El término documentación incluye todos los procesos necesarios para recopilar, organizar, analizar y distribuir la información sobre los recursos fitogenéticos. Contiene para una especie o grupo de especies datos sobre estatus taxonómico, estado de conservación y datos de caracterización, entre otros.

La actividad de documentación de recursos genéticos debe prever incluir todas las formas en que las especies se encuentren y no quedar restringida al manejo de una estructura tradicional de banco de germoplasma, asociado generalmente a semillas. Incluyen las colecciones ‘a campo’, colecciones in situ, cultivos de tejidos, colecciones de ADN, y de herbarios asociados a materiales conservados. La documentación incluye también la información sobre variedades criollas de especies introducidas, muchas de ellas conservadas en fincas de agricultores; la de parientes silvestres afines a las cultivadas y la de especies silvestres reconocidas como potenciales recursos genéticos. A este cúmulo de información también deben integrarse los datos de evaluación agronómica realizada por mejoradores, fitopatólogos, la información generada por químicos, citogenetistas, etc., así como la contenida en las publicaciones existentes.

La documentación comprende la obtención, almacenamiento, procesamiento, análisis y difusión de los datos e informaciones, tanto por métodos manuales como computarizados relacionados con las actividades de: 1) ampliación de la variabilidad genética disponible (por medio de colectas, mejoramiento genético, métodos biotecnológicos); 2) conservación in situ (en áreas protegidas y en predios rurales o fincas); 3) conocimiento asociado al uso de esos recursos genéticos; 4) conservación ex situ (banco de mediano y largo plazo,

in vitro, colecciones de campo, colecciones de ADN, etc.); 5) estado de las colecciones (inventario, viabilidad, % de germinación, poder germinativo, número de semillas, peso de muestra, etc.), así como actividades de regeneración y/o multiplicación llevadas a cabo; 6) caracterización (morfológica, química, molecular, otras.); 7) evaluación agronómica (caracteres cuantitativos).

Un sistema de documentación correctamente diseñado debe permitir el acceso de links internos y externos, y facilitar el almacenamiento y recuperación de objetos digitales, tales como imágenes, hojas de cálculo, pdf, etc.).

Una característica valiosa de un sistema de documentación es la capacidad de importar y exportar datos mediante planillas electrónicas para actualización y consulta. Esto agiliza enormemente la carga de las bases de datos e incentiva el uso del sistema. Un sistema de documentación no es un sistema para el análisis de materiales de ensayos en la etapa de mejoramiento, sino que es para el registro de datos que aporten al conocimiento del germoplasma y promover su uso.

La rápida evolución y diseminación de las Tecnologías de la Información y Comunicaciones (TIC) proveen en la actualidad excelentes mecanismos confiables y probados que son usados para los sistemas de información. Las aplicaciones web son herramientas de software que facilitan el acceso a la información para fines de mantenimiento y consultas de las bases de datos independientemente de la ubicación geográfica del usuario. Más recientemente, la difusión del uso de dispositivos móviles agrega más oportunidades al acceso remoto de la información. (8) Bancos internacionales y nacionales de genes Once centros GCIAI administran colecciones de germoplasma en nombre de la comunidad mundial. Bioversity International, CIAT , CIMMYT, CIP, ICA RDA, Centro Mundial de Agrosilvicultura (anteriormente ICRAF), ICRISAT , Instituto Internacional de Agricultura Tropical, Instituto Internacional de Investigaciones Agropecuarias, INIBAP , IRRI y el

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Centro Africano del Arroz (antes WARDA). nos, universidades, jardines botánicos, ONG, El total de las colecciones de CIMMYT, ICA compañías, agricultores y demás interesados RDA, ICRISAT e IRRI comprenden más de de los sectores público y privado conservan 100 000 muestras cada una. En conjunto, recursos en bancos de genes a nivel local y los centros mantienen un total aproximado nacional. Albergan una amplia gama de disde 741 319 muestras de 3 446 variedades tintos tipos de colecciones: colecciones nade 612 géneros distintos. Además, muchas cionales conservadas a largo plazo, colecciootras instituciones internacionales y regionanes de trabajo mantenidas a mediano o corto les conservan colecciones plazo, colecciones de maimportantes, por ejemplo.

Los centros de genes mantienen terial genético y otras. Los un total aproximado de 741.319 cuatro bancos nacionales • El AVRDC conserva de genes más importantes muestras de 3.446 variedades de alrededor de 56 500 son los que se encuentran 612 géneros distintos. muestras de germoplasen el Institute of Crop Germma de hortalizas. plasm Resources, la Aca• El Centro Nórdico de Recursos Genétidemia China de Agronomía (ICGR-CAA S) cos (NordGen) conserva cerca de 28 000 de China, el National Center for Genetic Reejemplares de 129 géneros de especies sources Preservation de Estados Unidos de cultivadas.

America, el National Bureau of Plant Genetic • El Centro Agronómico Tropical de InvesResources (NBPGR) de India y el N. I. Vavitigación y Enseñanza (CATIE) tiene un lov All-Russian Scientific Research Institute of total de más de 11 000 muestras de horPlant Industry (VIR). También, existen bancos talizas, frutas, café y cacao. nacionales de genes que hospedan más de • El Centro de Recursos Fitogenéticos 100 000 muestras en Alemania, Brasil, Cana(SPGRC) de la Comunidad para el Desadá, Japón y la República de Corea. rrollo del África Austral (SADC) conserva más de 10 500 ejemplares de varios El NPGS del Departamento de Agricultura de cultivos importantes para la agricultura los Estados Unidos trabaja con un sistema de africana. conservación de germoplasma que establece • La West Indies Central Sugarcane Breeuna red entre 31 bancos de genes dentro del ding Station (WICSBS) de Barbados conpaís y conserva más del siete por ciento de las serva alrededor de 3 500 muestras. tenencias de germoplasma, lo que representa • El banco de genes International Cocoa más del 50 por ciento de los géneros conservaGenebank de Trinidad y Tobago (ICGT), dos en los bancos de genes a nivel mundial. El en la Universidad de las Indias Occidenbanco de genes de semillas Millennium Seed tales, conserva aproximadamente 2 300 Bank es el más grande del mundo dedicado ejemplares. a la conservación de especies silvestres. Está • El Centro para los Cultivos y los Árboles dirigido por el Jardín Botánico Real de Kew, del Pacífico (CePaCT) de la Secretaría que también cuenta con colecciones vivas de de la Comunidad del Pacífico mantiene envergadura, así como también un herbario y colecciones de aproximadamente 1 500 colecciones carpológicas.(10) muestras de distintos cultivos, incluyendo colocasias, ñames y boniatos.

La comisión de recursos genéticos para la Un acontecimiento muy significativo desde alimentación y la agricultura la publicación del Primer Informe ha sido la creación del SGSV. Si bien no se trata de un Consciente de la importancia de la biodiverbanco de genes en sentido estricto, el SGSV sidad en la alimentación y la agricultura para ofrece instalaciones seguras para el almacela seguridad alimentaria mundial, la Organinamiento de muestras de seguridad de los zación de las Naciones Unidas para la Agriejemplares que hay en bancos de genes de cultura y la Alimentación (FAO) creó en 1983 todo el mundo. En todo el planeta, gobierla Comisión de Recursos Genéticos para la 12

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Alimentación y la Agricultura, de carácter intergubernamental. El mandato original de la Comisión – trata la cuestión de los recursos Fitogenéticos en la Alimentación y la Agricultura – se amplió en 1995, para incluir todos los componentes de la biodiversidad relativa a la alimentación y la agricultura.

Con más de 170 miembros, la Comisión constituye un foro intergubernamental para alcanzar un consenso mundial sobre políticas pertinentes para la biodiversidad en la alimentación y la agricultura. Sus objetivos principales son velar por la conservación y la utilización sostenible de los recursos genéticos para la alimentación y la agricultura, y por la distribución justa y equitativa de los beneficios derivados de su uso, para las generaciones presentes y futuras.

La tarea de la comisión se centra en el desarrollo y la supervisión de la aplicación de políticas y nuevas iniciativas complementarias que no estén destinadas únicamente a fomentar la sensibilización acerca de estas cuestiones, sino que miren hacia el futuro para saber cómo solucionar los problemas. Además, se encarga de orientar la preparación periódica de evaluaciones mundiales acerca del estado y las tendencias de la diversidad genética, las amenazas para la diversidad genética y las medidas que están siendo tomadas para la conservación y utilización sostenible. La comisión también negocia planes de acción, códigos de conducta y otros instrumentos de interés para la conservación y utilización sostenible de recursos genéticos relativos a la alimentación y la agricultura.

CONCLUSIONES Los recursos genéticos en la actualidad son prioridad de todos los países y en especial de América Latina y el Caribe, donde se localiza la mayor biodiversidad de especies vegetales en el mundo. Es tal la importancia de los recursos genéticos; que hoy en día vemos como se ha instaurado como una nueva rama de la Biotecnología que se independiza de la Genética y la Biología Molecular.

Somos conscientes que los recursos genéticos son la base de la subsistencia del ser humano.

Ya sea directamente, por su consumo como vegetales para la alimentación del hombre, como por ser la base de la alimentación animal, que suministra las proteínas tan necesarias para la vida, los recursos genéticos están en el centro de la seguridad alimentaria mundial.

REFERENCIAS 1. Leipzig, 1996. Biodiversidad en Ecuador. Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias. QuitoEcuador. 137p.

2. Tapia, C; Zambrano, E; Monteros, A. 2008. Estado de los recursos Fitogenéticos para la Agricultura y la Alimentación en Ecuador. INIAP. Quito – Ecuador. 101p.

3. Kameswara, N; Hanson, J; et.al. 2007.

Manual para el Manejo de Semillas en Bancos de Germoplasma. Bioversity International. Roma - Italia. 167p.

4. Jaramillo, S; Baena, M. 2000. Conservación ex situ de Recursos Fitogenéticos. IPGRI – España. 105p.

5. Pérez, M. Recursos Fitogenéticos. Área de Genética, fac. de biología y E.S. y T. de Ing. Agraria, Universidad de León.

6. Martin, I. Conservación de Recursos Fitogenéticos. Centro de Recursos Fitogenéticos (CRF) – Instituto Nacional de Investigaciones y Tecnología Agraria y Alimenticia (INIA).

7. Rodríguez, C. 2009. Conservación y Producción de Recursos Fitogenéticos – Maestría en Agricultura sostenible.

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8. PROCISUR. 2010. Estrategia en los Recursos Fitogenéticos para los países del Cono Sur. 162p.

9. FAO. 2007. La comisión de recursos genéticos para la alimentación y la agricultura. FAO. 2010. Segundo Informe sobre el estado de los Recursos Fitogenéticos para la alimentación y la agricultura en el mundo. 402p.

10. INIA. 2001. Introducción a la colecta de germoplasma.25p.

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BIOLOGÍA DE SISTEMAS Y BIOINFORMÁTICA: ESTUDIO DE INTERACCIONES FITOPATOLÓGICAS Marlon Pineda Escobar1, Aminael Sánchez Rodríguez2 1. Centro. Biotecnología, Universidad Nacional de Loja (UNL), La Argelia, Loja, Ecuador. E-mail: mao_os11@yahoo.es, 2. Department of Microbial and Molecular Systems, K.U. Leuven, Kasteelpark Arenberg 20, B-3001 Leuven, Belgium. E-mail: aminael.sanchezrodriguez@biw.kuleuven.be ____________________________________________________________________________

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ABSTRACT With the completion of the human genome and the growth in number of sequenced genomes, a new age of evolutionary research is taking shape. Many technological advances in biology are leading to the unification of diverse scientific fields such as molecular biology, biochemistry, physics, mathematics and computer science, now known as systems biology. In this paper we focus on bioinformatics workflows that allow to go beyond the study of model organisms in isolation to shape a new dimension of study: the biological system.

Key words: Systems biology; Bioinformatics; Molecular interactions ____________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

RESUMEN Con la finalización del genoma humano y el crecimiento en número de diversos genomas secuenciados, una nueva era de la investigación sobre evolución molecular está tomando forma.

La gran cantidad de avances tecnológicos en el área biológica, están llevando a la unificación de campos científicos como la biología molecular, bioquímica, física, matemáticas y ciencias de la computación, lo que ahora se conoce como biología de sistemas. En este artículo hacemos un énfasis en los flujos de trabajo en bioinformática que permiten la adopción de enfoques comparativos que van más allá del estudio de organismos modelos de forma aislada para dar forma a una nueva dimensión de estudios: los sistemas biológicos.

Palabras clave: Biología de Sistemas; Bioinformática, Interacciones moleculares ____________________________________________________________________________

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La maduración de la Biología Molecular, de nuestros tiempos ha cambiado de forma significativa, la forma en que miramos a la célula: ello permite un acercamiento holístico y no determinístico. Las nuevas tecnologías que han dado lugar al acceso a grandes volúmenes de datos, el mayor poder computacional y el diseño de nuevos algoritmos, han cambiado la actitud de muchos científicos sobre cómo solucionar algunos de sus problemas (1). Sólo en la última década hemos tenido acceso a la casi completa diversidad de genomas, que permiten a gran escala, el análisis comparativo de organismos (ej. comparaciones de familias de genes) (1), y ha propiciado el nacimiento de una nueva disciplina denominada Biología de Sistemas (2). El acceso a esta inmensa cantidad de datos significa proporcionar una visión profunda en el árbol de la vida a casi todos los niveles de divergencia entre especies. Por ello no es sorprendente que la comprensión de relaciones filogenéticas sea un objetivo de investigación común entre los biólogos evolucionistas, y en los científicos interesados en la organización y función del genoma (1). A partir de esta concepción se han realizado muchos estudios referentes a las interacciones biológicas, tratando de explicar el surgimiento de caracteres fenotípicos complejos de manera integrada (2).

Una de las dificultades más importantes que afrontamos proviene, de la enorme cantidad de datos que disponemos: la secuencia de más de un millón y medio de proteínas, la de más de mil genomas, la estructura tridimensional de más de 20 mil proteínas; también

disponemos de muchos datos que indican qué proteínas interaccionan entre sí; y todo el conocimiento científico acumulado a lo largo de las últimas décadas se encuentra disperso en más de 12 millones de artículos. El reto es ser capaces de relacionar todos estos datos, extraer conocimiento de ellos, comprender la biología de los organismos (3) y empezar a tener un impacto importante en nuestra comprensión de la evolución molecular (1).

Los animales, hongos y plantas son los más representados en términos de iniciativa genómica, porque han iniciado el interés de las diversas comunidades científicas, incluyendo los parasitólogos, fitopatólogos, los oceanógrafos, y biólogos en general. A medida que se realizan más estudios genómicos, se va proporcionando información sobre la función de los sistemas biológicos, a través del bioanálisis mediante el empleo de nuevos métodos de alto rendimiento como la bioinformática que permite analizar información biológica a través de modelos computacionales. (1).

Cuando se secuencia un genoma vemos poco más que una larga serie de caracteres en un alfabeto de cuatro letras (los nucleótidos: A, C, T y G). Para lograr extraer patrones significativos de dicha información, la bioinformática tiene un papel protagonista por dos razones principales: por una parte, la enorme cantidad de datos disponibles sólo puede ser analizada utilizando ordenadores; por otra, los datos son complejos, entre la maraña que entretejen hay información que sólo puede salir a la luz utilizando sofisticados algoritmos computacionales, que permiten comprender la información que encierran estos libros de

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instrucciones encontrando los genes y su función.

Esta herramienta de bioanálisis ha aportado algunas soluciones que son alternativas de gran valor al lento y costoso trabajo experimental (3). Desde los primeros estudios en esta temática y hasta el presente, la secuenciación del genoma humano ha dado un empujón importante a esta disciplina (3).

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y temporales entre moléculas, células, tejidos, órganos y organismos que dan lugar a causa y efecto en sistemas vivos.

Frente a la aproximación tradicional de la biología al estudio de genes, proteínas y células como entidades individuales, la Biología de Sistemas busca la comprensión global de las interacciones que se proLos animales, hongos y plantas ducen a todos los niveles en los seres vivos. Permitienson los más representados en do mirar a la célula con un términos de iniciativa genómi- acercamiento holístico y no ca, porque han iniciado el inte- determinístico.

La importancia del análisis comparativo es evidente en la proporción cada vez mayor rés de las diversas comunidades de nuevos proyectos en gecientíficas, incluyendo los para- La Biología de Sistemas es nomas procarióticos que se sitólogos, fitopatólogos, los ocea- un campo emergente de las han elegido por su relación filogenética con organismos ciencias de la vida con un nógrafos y biólogos en general. modelo como Escherichia carácter multidisciplinario. coli y Bacillus subtilis y sus correspondientes En esta nueva disciplina convergen expertos taxones relacionados. Esta misma tendencia procedentes de áreas como la genómica, proestá ocurriendo en los eucariotas. Algunos teómica, metabolómica, bioquímica y biología ejemplos destacados son los múltiples promolecular, bioinformática, biofísica, fisiología yectos de genómica en Saccharomyces, en y modelación computacional. Fruto de esta Ascomycetes, en Plasmodium y otras iniciaticolaboración entre grupos podrán establecervas de genoma en nematodos y Drosophila, y se estándares en bases de datos, software y el gran número de los proyectos de genómica algoritmos. La Biología de Sistemas revolude primates y mamíferos. (1). cionará la medicina del futuro. Actualmente, la medicina está enfocada al tratamiento de El objetivo de esta reseña es realizar una resíntomas mientras que en un futuro será más copilación y análisis de la información relaciopredictiva, previsiva y personalizada. Esto nada con la Biología de Sistemas, que a traocurrirá gracias al apoyo que tendrá de discivés de la Bioinformática permita en conjunto, plinas como la Biología de Sistemas que peranalizar y entender dos de las preguntas funmitirá la caracterización y el establecimiento damentales: la función de los sistemas biolóde diferencias entre estados patológicos y gicos en las interacciones y el conocimiento normales mediante el diseño de modelos prede la evolución de la diversidad de la vida. dictivos de estados patológicos. A partir de esta concepción se han realizados muchos Parte Especial: estudios referentes a las interacciones biológicas, tratando de explicar el surgimiento de En los últimos años, se han producido grancaracteres fenotípicos complejos de manera des avances en diferentes técnicas de biolointegrada. gía molecular, que han generado un aumento exponencial en la cantidad de información Para llegar a materializar estos objetivos, es proveniente de genes, proteínas, dinámica crítico desarrollar herramientas de software celular y respuestas de los organismos frenmás potentes y modelos matemáticos más te a mutaciones y el medio que los rodea. El robustos que permitan realizar modelos cuanprincipal objetivo de las ciencias biológicas es titativos y cualitativos capaces de reproducir comprender la organización y dinámica de los detalladamente los fenómenos biológicos. componentes que forman los sistemas vivos, Paralelamente también es necesario desaes decir, investigar las relaciones espaciales 16

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rrollar nuevas tecnologías y metodologías (y abaratar las ya existentes) para miniaturizar, estandarizar y automatizar la obtención de datos experimentales. (2).

ASPECTOS GENERALES DE LA BIOLOGÍA DE SISTEMAS: La Bioinformática tradicionalmente se ha centrado en el estudio de las proteínas y los genes de forma aislada. Por ejemplo, para predecir la función o la estructura tridimensional de una proteína nueva, se buscan proteínas parecidas cuya función o estructura ya se conozcan. Existen multitud de métodos computacionales en torno a esta perspectiva, y han sido, y sigue siendo, de gran ayuda. Desde hace algunos años, sin embargo, el panorama se ha ampliado: nuevas técnicas experimentales nos permiten conocer las redes de interacción entre proteínas de una célula, o cómo se expresan en determinada situación miles de genes. Este emergente punto de vista, más amplio, necesita de nuevos métodos para que seamos capaces de comprender los datos.

Una de las dificultades más importantes que afrontamos en Biología proviene, paradójicamente, de la enorme cantidad de datos que disponemos. El reto es ser capaces de relacionar todos estos datos, extraer conocimiento de ellos, y comprender la biología de los organismos. (3). La gran mayoría de los fenotipos cuantificables en las especies presentan un gran nivel de variabilidad a nivel poblacional (variación genética natural). Mientras que la presencia de esta diversidad es ampliamente reconocida, mucho menos se sabe acerca de las consecuencias de la variación genética natural o las fuerzas detrás de su mantenimiento o generación, que son fundamentales para la evolución y la ecología. La utilidad de la biología de sistemas ha ido más allá de la capacidad para describir fenotipos individuales sino para empezar describiendo la forma de las interacciones (4). La biología de sistemas también ha comenzado a tener un gran avance para ayudar a entender mejor y así describir la biología de las plantas (5).

Este incluye el desarrollo de enfoques clave para combinar datos de metabolómica y transcripción en la identificación de nuevos genes de regulación enzimática (6;7). Numerosos métodos de biología de sistemas ahora se aplican al estudio de la variación genética natural, incluyendo la transcriptómica (8;9), metabolómica (10;11), la proteómica (12), compilación de grandes conjuntos de datos fisiológicos (8), la red de herramientas de análisis (13;14), y toda la secuenciación del genoma (15;16).

Cada uno de estos enfoques tiene una mirada fuerte y ayuda en la identificación rápida de genes subyacentes, fenotipos que van desde la floración a los mecanismos de resistencia biótica. Sin embargo, su uso potencial es la comprensión de las bases genéticas de determinados fenotipos biológicos que han sido revisados ampliamente en los últimos años. (17).

Sólo en la última década hemos tenido acceso a la casi completa diversidad de genomas, que permiten a gran escala el análisis comparativo de organismos. Nuevos genomas, secuencias y métodos de análisis están ayudando a mejorar nuestra comprensión de la filogenia, y al mismo tiempo mejorarlas.

Actualmente, sin embargo, el nivel de la secuenciación del genoma de las diferentes ramas del árbol de la vida está lejos de ser equivalentes. Proyectos de genoma procariótico son abundantes, principalmente debido al pequeño tamaño del genoma, con 200 genomas ya publicados y 500 por lo menos actualmente en curso (www.genomesonline.org).

En contraste, 300 genomas de eucariotas están terminados o en curso (www.genomesonline.org). Sin embargo, estos datos están empezando a tener un impacto importante en nuestra comprensión de la evolución eucariótica. Los animales, hongos y plantas son los más representados en términos de iniciativa genómica. A medida que se realizan más proyectos genómicos, postgenómicos, la biología también va proporcionando información sobre la función de los sistemas biológicos (1).

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La inmensa cantidad de datos obtenidos a través de los proyectos de secuenciación del genoma no proporcionan suficiente información acerca de funcionamiento de un organismo a nivel molecular. Por esta razón, en los últimos años se ha producido un incremento en los esfuerzos por entender la función y objetivos de las diversas moléculas existentes en la célula (ADN, ARN, proteínas, y metabolitos).

Para lograrlo es preciso definir la estructura tridimensional de estas macromoléculas, su localización subcelular, interacciones macromoleculares, y niveles de expresión.

Un nuevo tipo de terminología que emplea el sufijo “oma” se ha extendido en la comunidad científica en los últimos años, en referencia a los distintos tipos de subpoblaciones de macromoléculas en la célula. Por extensión, a la disciplina o área de investigación que se encarga del estudio de cada una de estas subpoblaciones, se le añade el sufijo “ómica”.

El número de publicaciones es un buen indicador de la situación de la investigación en Biología de Sistemas. Al realizar una búsqueda utilizando como palabra clave “Biología de Sistemas” (Systems Biology) en la base de datos de publicaciones científicas Pubmed, se observan un total de 46448 artículos científicos publicados entre enero del año 1999 y octubre del 2011. Si se compara este número de artículos con los 71.707 artículos que emplean los términos Genómica o Genómica Funcional (Genomics) que se han publicado en el mismo período de tiempo, podemos hacernos una idea del estado inicial en que se encuentra la investigación en Biología de Sistemas (2).

BIOINFORMÁTICA ANÁLISIS DE DATOS GENÓMICOS Con múltiples secuencias del genoma a disposición del público, ahora estamos en la era de la post-genómica. La llamada siguiente generación (NextGen) de técnicas rápidas y baratas de secuenciación es lo que permite abordar una amplia gama de aplicaciones de análisis genético que incluye: la genómica 18

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comparativa, de alto rendimiento de detección de polimorfismo, el análisis de la regulación transcripcional, desentrañar los genes mutantes en las enfermedades, y muchos otros estudios, sólo limitada por la imaginación de los investigadores. La genómica comparativa es un paso fundamental en muchos estudios de análisis de secuencias y la anotación de genomas completos a través de la identificación de regiones codificantes y regulación.

Es además uno de los principales retos en la investigación actual en biología molecular (18) presentando una evaluación estadística de las características discriminatorias de proteínas codificantes y no codificantes entre especies.

Distintos grupos de investigación han desarrollado un procedimiento automatizado que permite de forma masiva realizar búsquedas similares de agrupación de genes, cálculo de varias alineaciones, y la reconstrucción de árboles filogenéticos dando lugar a la producción de tres bases de datos: HOVERGEN, HOGENOM y HOMOLENS. (19; 20).

ANÁLISIS DE DATOS DE TRANSCRIPTÓMICA: La evaluación de los datos de transcriptómica requiere el uso de enfoques que aprovechen la dinámica de activación de funciones de los genes. Un nuevo enfoque complejo en la evaluación de los datos de expresión es presentado por (21). En este trabajo los autores presentan tres nuevos métodos capaces de capturar los diferentes aspectos de la relación entre los genes, las funciones y co-expresión que son biológicamente significativos. Otro aspecto interesante del análisis a gran escala de datos de transcriptoma es tratado por (22) con EasyCluster, una herramienta de agrupación capaz de generar nuevos genes.

ANÁLISIS DE DATOS DE PROTEÓMICA Son dos elementos clave de ómicas, el análisis automático de datos y la visualización de datos (23) la una presenta una herramienta nueva llamada agrupación GIBA y demuestra

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cómo la combinación de los métodos existentes, en este caso las herramientas de clustering para analizar las interacciones entre proteínas, puede aumentar la calidad de los resultados. (24) describe una herramienta de visualización para comparar dos proteínas LC-MS conjuntos de datos a un nivel muy detallado, mientras que (25) presentan un nuevo enfoque computacional para visualizar y comparar quimiogenómica proteínas.

INTEGRACIÓN DE DATOS BIOLÓGICOS

INTERACCIONES FITOPATOLÓGICAS En la tríada clásica de la epidemiología, la expresión clínica de la enfermedad infecciosa se entiende como un producto de una relación compleja de un agente infeccioso, la respuesta inmune del huésped y factores ambientales. (28). En síntesis moderna, los genes eran las características de adaptación de las especies, no un nivel de evolución, con una historia profunda o con procesos de ramificación potencialmente diferentes de las especies. Esta visión estaba relacionada con el supuesto de que la historia de las especies estaba dominada por el ajuste fino de la evolución de los sub-orgaanálisis genético nismos rasgos específicos a fines funcionales. (29).

La integración de los resultados de la predicción automática y visualización para el análisis genómico de datos del genoma es un gran problema de la era postgenómica. (26) describen El poder del su trabajo en la anotación consiste en que, mediante el esy visualización de secuentudio de relaciones genotipofe- Los estudios genéticos no cias retrovirales endógenotipo, podemos acercarnos a sólo nos ayudan a entennas usando el Sistema de los detalles de los sistemas bio- der mecanismos básicos en Anotación distribuido (DAS) lógicos. biología, sino también nos y eBioX. (27) aplicar la exbrindan información sobre periencia en la interacción la relación entre el genotipo – contenido gepersona-ordenador para crear componentes nético de un individuo en forma de ADN – y de software reutilizables que analicen a gran el fenotipo – la expresión del genotipo en un escala un conjunto de bases de datos (20). determinado contexto ambiental. Entender dichas relaciones entre el genotipo y el fenotiLa Bioinformática es el área de la Biología po nos brinda el potencial de mejorar nuestra donde intentamos aplicar los métodos comhabilidad para prevenir, diagnosticar y tratar putacionales para analizar esta información. enfermedades.

Desde los primeros estudios en esta temática y hasta el presente, la secuenciación del geEn tiempos recientes, la biología molecular noma humano ha dado un empujón importancelular ha transitado del estudio de compote a esta disciplina, debido a que se han desnentes moleculares individuales al estudio del crito millones de diferencias en la secuencia conjunto de dichos componentes y sus inteentre distintas personas. racciones (30). Esta aproximación de biología de sistemas busca, en la medida de lo posiLa Bioinformática tradicionalmente se ha cenble, una descripción integral y cuantitativa de trado en el estudio de las proteínas y los gelas células y de los organismos, para lo cual nes de forma aislada. Desde hace algunos ha sido necesario el desarrollo de nuevos méaños, el panorama se ha ampliado: nuevas todos tanto teóricos como experimentales. técnicas experimentales nos permiten conoLas interacciones genéticas son particularcer las redes de interacción entre proteínas mente atractivas para el análisis de los sistede una célula, o cómo se expresan en determas biológicos, por su naturaleza trascienden minada situación miles de genes. Este incien la interacción física y reflejan relaciones piente punto de vista, más amplio, necesita funcionales entre diferentes componentes de nuevos métodos para que seamos capagenéticos. Gracias a las interacciones genéces de comprender los datos. (3) ticas conocemos en la actualidad un número Centro de biotecnología: E-mail: centrobiotecnologia@unl.edu.ec

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importante de vías metabólicas, de transducción de señales y de procesos de desarrollo.

El poder del análisis genético consiste en que, mediante el estudio de relaciones genotipofenotipo, podemos acercarnos a los detalles de los sistemas biológicos. De hecho, mucho de nuestro conocimiento sobre procesos biológicos clásicos se recopiló incluso antes de que se describiera el dogma central de la biología molecular. Las últimas décadas han visto un progreso sin precedente en el desarrollo de la biología molecular. Los avances tecnológicos y de diseño de protocolos han permitido a los científicos automatizar muchos de los experimentos que tradicionalmente se hacían a mano y a pequeña escala. La combinación de dichas tecnologías con los catálogos genéticos completos que representan las secuencias genómicas han resultado en experimentos de alto rendimiento que examinan las propiedades bioquímicas y genéticas de un gran número de genes en paralelo. De esta forma, podemos interrogar a los sistemas biológicos de manera sistemática.

Dado el atractivo particular del estudio de las interacciones genéticas de los genes entre sí y de éstos con las condiciones externas, no es de extrañar que éstas también hayan sido sujeto de análisis funcional sistemático.

Dichos estudios se enfocaron originalmente en organismos modelo como la levadura Saccharomyces cerevisiae (31; 32; 33; 34; 35; 36) y el nemátodo de vida libre Caenorhabditi selegans (37; 38), dada la facilidad con que estos organismos pueden ser manipulados genéticamente. Entre tanto, podemos aprender principios básicos sobre un número importante de procesos biológicos mediante el estudio de interacciones genéticas en organismos más simples, donde muchas de las herramientas pertinentes ya están a la mano.

Con esta idea en mente, muchos grupos de investigación han desarrollado protocolos para crear combinaciones genéticas de diferente naturaleza (inactivación completa, inactivación parcial, sobreexpresión, etc.) en parejas de genes.

Esto nos permite construir el mapa de inte20

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racciones para 2n pares de genes para un número n razonable de genes. Es importante destacar que el muestreo en estos casos aumenta de manera exponencial: un estudio de todas las interacciones de cien parejas de genes implica el análisis de 10.000 muestras experimentales, mientras que para el estudio de mil parejas de genes requeriría 1’000.000 de muestras. Los primeros estudios sistemáticos se concentraron en la identificación de parejas de mutaciones co-letales (39; 33; 35; 36). La tecnología más reciente ha permitido hasta cierto punto el análisis cuantitativo de interacciones genéticas mediante el estudio de fenotipos tales como la velocidad de crecimiento (32; 34). Algunas variantes de estos ensayos han examinado las interacciones de las perturbaciones genéticas con las condiciones externas tales como respuesta a estrés o a la presencia de drogas (31; 40). (41).

CONCLUSIONES De este estudio se resalta la importancia que tiene el conocimiento profundo de la Biología de Sistemas. Este conocimiento es vital desde el punto de vista biológico, debido a que permite una adecuada y mejor comprensión de la organización y dinámica de los componentes que forman los sistemas vivos, es decir, investigar las relaciones espaciales y temporales entre moléculas, células, tejidos, órganos. Y la integración de los resultados de la predicción automática y visualización para el análisis genómico de datos del genoma en estudio.

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MICROORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS Y SU CONTRIBUCIÓN A LA FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL NITRÓGENO Klever Iván Granda Mora1, Santiago Erazo Sotomayor1 1. Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S” E-mail: ivang100@gmail.com ____________________________________________________________________________

RESUMEN El énfasis de la comunidad internacional en el desarrollo ambiental sostenible, parece centrar su atención en el papel potencial de la fijación biológica del nitrógeno (FBN), al suministrar nitrógeno para la agricultura con el fin de contrarrestar el indiscriminado empleo de fertilizantes nitrogenados. En la presente revisión exploramos los microorganismos beneficiosos fijadores de nitrógeno (N) asociados a las plantas, que pueden tener una gran influencia en el crecimiento y desarrollo de las mismas, al contribuir al balance del ciclo del nitrógeno (N), aumentando la absorción de los nutrientes y promoviendo su crecimiento, en esta revisión hacemos énfasis en la interacción Rhizobium-leguminosa su asociación y simbiosis con leguminosas de importancia agronómica y su aporte en el incremento de la sostenibilidad de los agro-ecosistemas y los rendimientos agrícolas.

Palabras Claves: Fijación biológica del N, microorganismos, asociación, nutrientes, Rhizobium ____________________________________________________________________________

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ABSTRACT The emphasis of the international community on sustainable environmental development seems to focus on the potential role of biological nitrogen fixation (BNF), to provide nitrogen for agriculture in order to counteract the indiscriminate use of nitrogenous fertilizers. In this review we explore the beneficial nitrogen-fixing microorganisms (N) associated ciated with plants, which can have a major influence on the growth and development of my-more, by contributing to the balance of the nitrogen cycle (N), increasing the absorption of nutrients and growth promoting, in this review we emphasize the Rhizobium-legume interaction and partnership symbiosis with legumes of agronomic importance and its contribution in increasing the sustainability of agro-ecosystems and agricultural yields.

Keywords: biological N fixation, microorganisms, association, nutrients, Rhizobium ___________________________________________________________________________

INTRODUCCION El suministro de nitrógeno (N) al suelo no es suficiente para compensar su creciente demanda por las plantas y organismos vivos que habitan en este planeta, haciéndose necesaria la aplicación de algún fertilizante nitrogenado (Beever et al., 2007). Sin embargo, esta estrategia puede producir una creciente contaminación ambiental donde se ven afectados todos los factores actuantes, ya sean bióticos como abióticos (Urzua et al., 2001).

El N es el principal factor nutricional que limita el crecimiento de plantas en los agroecosistemas mundiales (Graham, 1988). Este elemento es un componente esencial en sustancias básicas para la vida, tales como ácidos nucleicos y la conformación de proteínas (Harrison, 2003), por lo que el cultivo de plantas con capacidad para incorporar este elemento tanto a su metabolismo como para el adecuado comportamiento del ciclo del N en la biosfera es de vital importancia. Las plantas pertenecientes a la familia leguminosa (Fabaceae) son unas de las máximas responsables del equilibrio del N en los ecosistemas (Broughton et al., 2003). Estas son capaces de realizar el proceso de fijación biológica del N (FBN) mediante la estrecha relación con bacterias del suelo comúnmente conocidas como rizobios (Weir, 2006).

En la presente revisión se abordan los principales problemas causados por la aplicación indiscriminada de N sintético a los suelos, así como el aporte de los microorganismos dia24

zotróficos al ciclo de este vital elemento para el desarrollo y crecimiento de las plantas y a la FBN. Impacto del nitrógeno (N) en los ecosistemas.

A partir de la década del 40, millones de toneladas de N sintético eran suministradas a las producciones agrícolas anualmente con el fin de aumentar sus rendimientos potenciales.

La alta demanda de alimentos fue un factor determinante de tal incremento en la producción y aplicación de fertilizantes nitrogenados.

La “revolución verde” se convirtió en el punto sublime de la difusión de los mencionados fertilizantes, trayendo consigo el gasto incalculable de fuentes de energía natural para su producción y los nefastos problemas que han ocasionado en la ecología y el equilibrio biológico (Biological Nitrogen Fixation, 2001). Desde 1972, con la fundación de la IFOAM (Internacional Federation of Organic Agriculture Movements), se estableció que la agricultura orgánica debía aumentar la fertilidad de los suelos, su actividad microbiana e incrementar el reciclaje de los nutrientes. En la década de los 90, los biofertilizantes se convirtieron en un punto común de investigación teniendo en cuenta los serios problemas ambientales causados con la aplicación irracional de los fertilizantes químicos (IFOAM, 2001), lo cual se ha mantenido hasta la actual década.

La aplicación de fertilizantes que contienen

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N para las cosechas es esencial para equiproteínico en las cosechas, reducción de la librar las entradas y salidas de nutrientes y materia orgánica de los suelos, erosión y en por tanto para mantener o mejorar la fertilidad casos extremos, la desertificación (Barbier y del suelo, para incrementar la productividad Bergeron, 2001). No obstante, existen nefasagrícola y a su vez, para evitar que los ecotos problemas que pueden originarse con el sistemas naturales y los hábitats vírgenes se exceso o la aplicación irracional de productos conviertan en tierras de cultivo (Beever et al., químicos nitrogenados. El exceso de NO3- en 2007). Sin embargo, esto ha los suelos comúnmente suetraído como consecuencia el La aplicación de fertilizantes le lixiviarse a los suministros gran uso de fertilizantes nide agua subterránea y agua que contienen N (un elementrogenados para reponer el potable, contaminando las to necesario en la composición N del suelo y para obtener fuentes fluviales. Aunque el de proteínas, ácidos, nucleicos llamado síndrome de niños los rendimientos deseados, y otros componentes celulares) cianóticos (enfermedad couna práctica que conlleva para las cosechas es esencial múnmente conocida como a altos costos y que produpara equilibrar las entradas y “niños azules”, causante de ce efectos severos al medio ambiente (Gustafson y salidas de nutrientes y por tanto la metahemoglobinaemia), Kreys, 2006). Los grandes para mantener o mejorar la fer- la misma que ha sido atriincrementos de las productilidad del suelo, para aumentar buido recientemente a la ciones de cereales en los la productividad agrícola y a su contaminación bacteriana países desarrollados entre vez, para evitar que los ecosiste- y no al exceso de NO3- en 1959 y 1990 están directamas naturales y los hábitats vír- las aguas como originalmenmente relacionados con el te se suponía (L’hirondel y genes se conviertan en tierras de aumento de la aplicación de L’hirondel, 2002). cultivo. fertilizantes nitrogenados.

Unido a los altos niveles de Es ampliamente conocido aplicación de estos fertilizantes se encuentra que el exceso de NO3- en vegetales y alila emisión de óxido nitroso (N2O) a la atmósmentos causado por la irrigación con aguas fera, el deterioro de recursos no renovables, contaminadas con NO3- está estrechamente un desequilibrio en el ciclo global del N y la relacionado con la aparición de cánceres inlixiviación del nitrato a las aguas subterráneas testinales y gástricos (Leifert y Dorado, 2000).

(Torres-Gutiérrez, 2008). El uso de N sintético (Beever et al., 2007) han reportado que los en los últimos 40 años ha aumentado de 3.5 nitratos en aguas superficiales aumentan la a 80 millones de toneladas, tanto en países carga de N lo cual puede jugar un rol fundesarrollados como en vías de desarrollo, indamental en la eutrofización. Este proceso crementándose sus costos de producción a contribuye a la degradación de los recursos más de 20 billones de USD anualmente (Bioecológicos creando grandes concentraciones logical Nitrogen Fixation, 2001). En este pede algas y organismos en las aguas superfiriodo, el ciclo global del N se ha visto afectado ciales y su contaminación. En la atmósfera el por el incremento irracional de la fijación de N oxido de N (NO2) de manera particular puede mediante procesos industriales, es decir, meexacerbar varias enfermedades en los seres diante la aplicación de fertilizantes nitrogenahumanos, tales como asma y enfermedades dos; pero su impacto ambiental aún está por cardiovasculares. En este medio, el increcalcularse (Montañés et al., 2004). mento de las concentraciones de (N2O) contribuye sustancialmente al calentamiento gloImplicaciones de la liberación de N reactibal y consecuentemente a la salud humana vo en los ecosistemas (Graham y Vance, 2003).

La falta de N reactivo en los agro-ecosistemas lleva al descenso de la fertilidad de los suelos, bajos rendimientos y escaso contenido

Todos los ecosistemas emiten N2O y más de 50% de las emisiones globales son considerados como “naturales” (tierras bajo vegetación

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natural, océanos, etc.). La agricultura justifica el 86% de las emisiones globales antropogénicas de N2O (USEPA, 2006). De las emisiones N2O agrícolas, 44% está relacionado a la administración y la aplicación de abono animal; y 14% es asociado directamente con el uso de fertilizantes minerales (Mosier et al., 2004). Sin embargo, está claro que aumentando la aplicación de fertilizantes nitrogenados aumentará las emisiones de este potente gas invernadero por los procesos naturales de desnitrificación (Merino et al., 2001).

Las proyecciones recientes indican que la demanda global de fertilizantes nitrogenados en el 2050 podrían estar entre 107 y 171 t de N (Beever et al., 2007). De acuerdo con los cuatro escenarios reportados por la Evaluación del Ecosistema del Milenio (2005) así como otros investigadores, corroboran que el consumo global del fertilizante nitrogenado en el 2050 se prevé que esté entre 110 y 140 t de N (Heffer y Prud’homme, 2006). Estos incrementos sin precedentes en la producción agrícola para satisfacer los niveles de insumos calóricos y proteicos para el abastecimiento a la gran población mundial, propicia la búsqueda de nuevos métodos de producción agronómicamente y ecológicamente sustentables. (Biological Nitrogen Fixation, 2001).

La fijación biológica del nitrógeno (FBN) El N es un elemento necesario en la composición de proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares, siendo así una molécula esencial para el crecimiento de todos los organismos. En la atmósfera el N ocupa aproximadamente el 80%, existiendo en la forma N≡N; sin embargo, el N2, debido al triple enlace entre los dos átomos de nitrógeno, que hace a la molécula casi inerte, no puede ser aprovechado por la mayoría de las formas vivientes, sino sólo por un pequeño grupo de microorganismos altamente especializados, que incluyen algas, bacterias y actinomicetos.

Para ser utilizado en el crecimiento, este elemento debe ser primero reducido y luego “fijado” (combinado) en la forma de iones amonio (NH4+) o nitrato (NO3-). El proceso a través del cual los microorganismos reducen el nitrógeno hasta una forma utilizable es conocido 26

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como Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN), este proceso puede ser llevado a cabo por los microorganismos de vida libre o en simbiosis con plantas. La FBN es una fuente eficiente de N, las entradas anuales de N en la tierra a partir de la FBN como se plantea por (Weir, 2006) oscilan entre 139 y 175 millones de toneladas de N, de este total cerca del 30 % (45 millones de toneladas de N) se lleva a cabo mediante interacciones asociativas planta-bacteria y con el pasto permanente, mientras mediante asociaciones simbióticas (Rhizobium-leguminosas), en terrenos arables representa entre un 25 y un 30 % (entre 35 y 45 millones de toneladas de N). Aunque la exactitud de estas cifras puede ser cuestionada (Beever et al., 2007).

Los organismos que pueden fijar N, es decir, convertir el gas N2 estable en la atmosfera en una forma útil biológicamente, pertenecen todos ellos a un grupo biológico conocido como procariotas. Todos los organismos que reducen el N2 a NH4+ lo hacen con la ayuda de una enzima compleja, la nitrogenasa (Zahran, 1999). Un amplio espectro de microorganismos podría tener la capacidad de fijar N, sin embargo; solamente una proporción pequeña de las especies conocidas pueden hacerlo.

Cerca de 87 especies en 2 géneros de archaea, 38 géneros de bacterias y 20 géneros de cianobacterias han sido identificados como diazótrofos u organismos que pueden fijar el N2 atmosférico (Zahran y Afkar, 1995).

La FBN resulta ser, entonces, una tecnología limpia de producción y una forma concreta de proteger el medio ambiente.

Interacciones asociativas diazotróficas.

Contribución de las plantas no leguminosas a la FBN. El primer diazótrofo de vida libre fue reportado por Beijerinck en 1925 con el nombre de Spirillum lipoferum. Sin embargo, fue solamente cerca de medio siglo más tarde, después del descubrimiento de la asociación Azotobacter paspali-Paspalum notatum altamente específica y del descubrimiento de Spirillum lipoferum (ahora denominada Azospirillum) (Döbereiner et al., 1972), que los científicos

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aumentaron su interés por las bacterias diazotróficas asociadas con plantas gramináceas.

Debido al avance de los métodos de identificación de microorganismos y a la biología molecular se ha reportado que varios géneros de bacterias son capaces de incluirse dentro de la denominacion de diazótrofos asociados íntimamente (endófitos) con las plantas, incluyendo entre otros generos; Acetobacter, Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter (Gluconacetobacter), Beijerinckia, Burkholderia, Enterobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Paenibacillus y Pseudomonas (Dobbelaere, 2002).

Los esfuerzos para determinar las proporciones de fijación del N en asociaciones naturales con las plantas han producido una amplia gama de resultados. En los últimos 30 años muchos estudios de inoculaciones, unido a las mediciones de reducción de acetileno (ARA), el equilibrio del N y los experimentos de dilución del isótopo 15N, han sido realizados con bacterias asociadas a las raíces para determinar si las bacterias proporcionan cantidades significativas de N a las plantas cultivadas (James, 2000). La contribución de las interacciones asociativas para la FBN global es una evidencia de la importancia económica del cultivo de las plantas no leguminosas a nivel mundial; sin embargo, las respuestas de las cosechas variadas debido a limitaciones bióticas y abióticas (Roesch et al., 2006).

El arroz (Oryza sativa), el trigo (Triticum aestivum) y el maíz (Zea mays) son las tres fuentes principales de alimentación de la población mundial. En una cosecha el arroz consume alrededor de 16 o 17 kg de N para producir 1 t (Sahrawat, 2000). Una cosecha de trigo necesita entre 26 y 28 kg de N para producir 1 t de grano (Angus, 2001). El maíz requiere de 9 a 11 kg de N para producir 1 t de biomasa (Anuar et al., 1995). La mayoría de los suelos carecen de suficiente N y las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados son esenciales para la obtención de buenos rendimientos de tales cereales. Generalmente la urea es la fuente más conveniente de N pero menos del 50% del producto aplicado es usada por las plantas (Halvorson et al., 2002). Esta baja eficiencia tiene su causa fundamentalmente en la

volatilización del NH4+, la desnitrificación y las perdidas por escapes hacia la atmósfera (Bijay-Singh et al., 1995).

Un determinado número de estudios realizados en el cultivo del arroz sugieren que del 20 al 25 % de las necesidades totales de N pueden derivarse de la fijación asociativa.

(James, 2000). Sherestha et al. (1996) realizaron dos experimentos comparando hasta setenta variedades de arroz en cada uno. En un experimento se estimó que la cantidad de N derivado de la atmósfera oscilaba entre un 0 y un 20.2 %. En un segundo experimento se encontró que se fijo un equivalente de 16 a 70 % de N por hectárea. Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii comúnmente observado en la simbiosis con la planta leguminosa puede colonizar raíces del arroz de manera endofítica, reemplazando entre un 25 y un 33 % de la cantidad de fertilizante nitrogenado recomendado para el arroz en condiciones de campo (Yanni et al., 1997). Los experimentos de campo demostraron que la inoculación de esta bacteria aumentó el rendimiento medio del arroz en 3.8 t.ha-1 (Yanni et al., 2001).

La inoculación con Azospirillum brasilense puede incrementar el rendimiento del grano de trigo hasta un 30 % en condiciones de campo (Okon y Labandera-Gonzalez, 1994), pero solamente con proporciones de aplicación más bajas de fertilizante nitrogenado (50–60 kg N ha-1). Con aplicaciones más elevadas (110–170 kg N ha-1), los efectos de la inoculación de Azospirillum no fueron estadísticamente significativos (Dobbelaere et al., 2001).

En el maíz García de Salamone et al. (1996) sugirieron que algunos cultivares fijan hasta un 60 % de N después de la inoculación con cepas apropiadas de Azospirillum. Recientemente (Roesch et al., 2006) estudiaron la dinámica de las bacterias asociativas en dos genotipos de maíz y la influencia del suministro de N los cuales reportaron que la dinámica y la distribución de las bacterias asociativas de los géneros Azospirillum, Burkholderia y Acetobacter fueron afectados por el estado ontogénico de la planta de maíz y la pobla-

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ción bacteria fue afectada por la fertilización con N durante las primeras etapas del crecimiento de la planta.

En la Universidad de Wisconsin: Estados Unidos Riggs et al., (2001) mostraron mediante pruebas de invernadero; usando suelos no esterilizados que los rendimientos del grano de maíz aumentaron entre 36 y 48 % al inocular las semillas con B. cepacia AMMDR1. En las pruebas de campo esta bacteria fue capaz de incrementar el rendimiento del maíz entre 5.9 y 6.3 %.

De igual forma Rhizobium etli bv. phaseoli y Ensifer sp. (anteriormente Sinorhizobium sp., puede colonizar las raíces del maíz e incrementar el peso seco de la planta (GutiérrezZamora y Martínez-Romero, 2001), y a la vez incrementar los rendimientos del maíz en 34 y 11 % en condiciones de invernadero y de campo, respectivamente. Estos resultados enfatizan la importancia de evaluar combinaciones de diferentes cepas de Rhizobium con genotipos de maíz.

Simbiosis de las bacterias que fijan N con las plantas.

Las interacciones simbióticas de las bacterias con varios grupos de plantas son las mejores estudiadas para el suministro biológico de N. En estas interacciones se encuentra una multiplicidad de bacterias con diferentes antecedentes fisiológicos, incluyendo las proteobacterias Gram negativas como Rhizobium sp. y Burkholderia sp., Gram-positivas Frankia sp. (Benson y Silvester, 1993) y las cianobacterias filamentosas o unicelulares (Rai et al., 2000). Las características fisiológicas y morfológicas de estas simbiosis van desde comunidades extracelulares hasta interfaces altamente adaptadas dentro de órganos o compartimentos especiales. La simbiosis mutualista entre varias proteobacterias no fotosintéticas del orden Rhizobiales con plantas de las ordenes Fabales, Curcurbitales y Rosales son las interacciones entre bacterias y plantas más ampliamente estudiadas (Kneip et al., 2007). En esta revisión nos centramos en la interrelación entre Rhizobium y plantas 28

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leguminosas por su contribución sustancial al ciclo del N y a la FBN. La simbiosis Rhizobium-Leguminosa Un análisis de la historia de la FBN muestra que el interés generalmente se ha enfocado en el sistema simbiótico de las plantas leguminosas con las bacterias conocidas genéricamente como especie rizobia, debido a que estas asociaciones han tenido el mayor impacto cuantitativo en el ciclo del N. Entre las leguminosas existe un gran potencial para la contribución del N fijado a los ecosistemas (Tate, 1995). Hay aproximadamente 650 géneros y alrededor de 20 000 especies de leguminosas (Sprent, 1985), y solamente cerca del 20% (Sprent y Sprent, 1990) han sido estudiadas para la nodulación y han mostrado tener la capacidad de fijar N2 atmosférico.

La FBN, en particular mediante la simbiosis Rhizobium-Leguminosa tiene un papel crucial en el aumento de la sostenibilidad de los rendimientos con mínimas entradas externas no renovables (Vance, 2001). La simbiosis entre las plantas de la familia Leguminosae y los procarióticas se caracteriza típicamente por la formación de nódulos en la raíz y parte del tallo que son inducidos y posteriormente invadidos por micro simbiontes específicos (Weidner et al., 2003). Weir (2006) reporta que entre ellas se encuentran el muy conocido grupo alfa-proteo bacterial de Rhizobiaceae que contiene los géneros Azorhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer, Mesorhizobium y Rhizobium; junto con otros grupos tales como Methylobacterium (Sy et al., 2001), Ochrobactrum, Phyllobacterium (Valverde et al., 2005) y Shinela (Lin et al., 2008) y miembros de las Beta proteo bacterias Burkholderia (Moulin et al., 2001) y Cupriavidus (Chen et al., 2001).

El apoyo de la microscopia para examinar la simbiosis nodular ha ganado nueva importancia a la luz de estos descubrimientos y varios estudios han unido el enfoque visual con la caracterización molecular de los simbiontes (Elliott et al., 2007). La taxonomía rizobial actual tiene 5 géneros y 79 especies, la mayoría de los cuales fueron descritos en la última dé-

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cada usando técnicas de biología molecular (Weir et al., 2006).

la capacidad de nodular el frejol común en diferentes ambientes en Túnez, reportando que las cepas varían entre las regiones y los cultiAplicación y contribución practica de Intevares, con R. leguminosarum. Recientemenracción Rhizobium-Leguminosa. te (Tajini et al., 2008) demostraron la efectiva combinación Rhizobium etli y (R. tropici Los efectos cuantitativos de las interaccioCIAT899) en los genotipos del frejol común. nes Rhizobium-leguminosa pueden medirse Fue evidente que las cepas nativas de rizoen términos de cómo las bacterias responbia eran más eficientes que la cepa CIAT899. den al genotipo del hospedero. Varios invesTodos estos resultados indican una estrecha tigadores han estudiado cómo la capacidad interacción entre el genotipo del hospedero y de las cepas para competir por la ocupación rizobia. Se supone que esta interacción es el del nódulo es afectada por resultado de la coevolución el genotipo del hospedero.

Las interacciones simbióticas de entre las cepas de RhizoLa incapacidad de las celas bacterias con varios grupos bium y los genotipos del hospas introducidas que fijan de plantas son las mejores estu- pedero (Aguilar et al., 2004). el N para competir con las diadas por el suministro biológi- En estudios en condiciones cepas propias del suelo por co de N. (un elemento necesario controladas, Granda Mora et la ocupación del nódulo es en la composición de proteínas, al. (2010) reportan la variabiuna limitante importante en ácidos, nucleicos y otros compo- lidad genotípica de diferenel desarrollo de los inoculannentes celulares). tes de Rhizobium (Snoeck tes aislados de Rhizobium et al., 2003). Cregan et al., provenientes de nódulos de (1989) encontraron efectos significativos en frejol común en la zona central de Cuba. Los los genotipos de soya (Glycine max) sobre la resultados demostraron que todas las cepas competitividad de cepas de Bradyrhizobium fueron capaces de establecer adecuadas rejaponicum estrechamente relacionadas. Un laciones simbióticas con el macro simbionte, ejemplo de ello lo constituye la limitación de observándose que muchas de estas cepas la nodulación del genotipo de soya PI417566 superaron los parámetros de nodulación (nucepa USDA 129 resultando en una baja ocumero de nódulos totales y peso fresco y seco pación nodular mientras que al inocular este de los nódulos) en comparación con la cepa mismo genotipo con las cepas USDA 123 o tipo de R. etli CNPAF512. con USDA 127 se obtuvieron buenos resultados en la nodulación total. Sin embargo en La aplicación de combinaciones de diazótrootro cultivar de soya, la cepa USDA 129 ocufos ha sido uno de los apartados de interés po más del 87 % de los nódulos (Josephon para científicos en todo el mundo, lo cual poet al., 1991) coinocularon dos cepas, KIM5 y tencia el efecto de los diazótrofos simbióticos.

Viking-1, en 12 cultivares de frejol común, miLas asociaciones bacteriales diazotróficas dieron la ocupación porcentual del nódulo de contribuyen de manera sustancial a la FBN cada cepa para cada cultivar y encontraron en cosechas de no leguminosas importantes. una significativa interacción cultivar por cepa.

En las leguminosas la combinación de PGPR De acuerdo con los primeros estudios reporcon diazótrofos simbióticos ejerce un martados por Amarger (1986), la fijación del N decado efecto en los parámetros fisiológicos y pende de la interacción rizobia con el cultivar. fenotípicos. (Rodelas et al., 1999) reportaron Esto enfatiza la importancia de examinar la para el frejol blanco que las respuestas a la interacción entre la diversidad de cepas natiinoculación de Azotobacter y Azospirillum en vas de rizobia con un cultivar nuevo, además combinación con Rhizobium conducía a camde la influencia del genotipo de la planta en bios en el contenido total y/o la distribución la nodulación y la efectividad en una especie de macro y micro nutrientes (K, P, Ca, Mg, determinada. (Mhamdi et al., 2002) describieFe, B, Mn, Zn y Cu) cuando se comparaba ron la variabilidad de las cepas de rizobia con con plantas inoculadas solamente con RhiCentro de biotecnología: E-mail: centrobiotecnologia@unl.edu.ec

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zobium. Torres-Gutiérrez (2004, 2008) reporta el beneficio de la co-inoculacion de cepas de Azotobacter y Azospirillum conjuntamente con cepas tipo de Rhizobium etli y R. tropici.

La combinación de los diazótrofos logró estimular la nodulación, componentes del rendimiento y el rendimiento agrícola de genotipos de frejol común en comparación con la inoculación en solitario de Rhizobium y con la fertilización mineral, reduciendo las tasas de aplicación de fertilizante e incrementando las producciones.

Existen evidencias de algunos modos de acción para la estimulación de PGPR en la simbiosis Rhizobium-leguminosa, pero el modo más comúnmente implicado es la estimulación de crecimiento mediante la liberación de la fitohormona inducida (ácido indol-3-acetico) (Vessey y Buss, 2002). De esta forma la estimulación de nodulación es más comúnmente un efecto indirecto; las PGPR estimulan el crecimiento de la raíz lo cual proporciona más sitios para la infección y la nodulación. Burdman et al. (2000) relacionaron la estimulación mediada de Azospirillum brasilense en la nodulación del frejol común con una producción incrementada de flavonoides por el hospedero de la leguminosa. Estos flavonoides son las señales químicas iniciales segregadas por el hospedero de la legumbre para inducir genes Nod en rizobia y por tanto iniciar la simbiosis Rhizobium-leguminosa (Schultze y Kondorosi, 1998). Se reportan otras evidencias por Thilak et al. (2006) mostrando que PGPR unido al eficiente Rhizobium puede también afectar positivamente en el crecimiento y la fijación del N en arveja. Recientemente Figueredo et al., (2007) reportaron la nodulación mejorada y la fijación del N en el frejol común con la co-inoculación de Rhizobium y varias cepas de Paenibacilus. En este estudio la coinoculación con Rhizobium tropici (CIAT899) y Paenibacillus polymyxa (DSM 36) tuvieron concentraciones más altas de legemoglobina, actividad de nitrogenasa y eficiencia de la fijación de N2 y por tanto se formaron asociaciones de mayor eficiencia simbiótica.

CONCLUSIONES 30

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Los procesos naturales de FBN juegan un importante rol en la activación de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental. El incremento de su aplicación puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguiente efecto benéfico al ciclo del N, el calentamiento global y el saneamiento de las aguas subterráneas y superficiales. Estimular la aplicación de microorganismos diazotróficos, ya sean de vida libre como simbióticos, traerá consigo el incremento de las producciones agrícolas sin la utilización de elementos no renovables, disminución de los costos de producción y la reducción de las emisiones de gases con efecto invernadero.

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USO DE MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS Y SUSTANCIAS NATURALES COMO UNA ALTERNATIVA ECOLÓGICA EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN CULTIVOS Ángel Rolando Robles Carrión1 1. Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S” E-mail: aroblescarrion@gmail.com ____________________________________________________________________________

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ABSTRACT This paper presents a literature review on the main applications of antagonistic microorganisms and natural substances to control crop diseases, with the goal of giving a technical and scientific overview of the current state of the use of these bio-fungicides in the field. First we review the concepts of biological control and of the various mechanisms of action (antagonism, antibiosis, competition, fungistasis, systemic acquired resistance and mycoparasitism) against the various diseases in plants. Secondly, we introduce antagonistic microorganisms and natural substances that are important in the control of plant diseases, some of which have been successfully tested as biofungicides. This review offers a glimpse of the great potential of these bioproducts in agriculture.

Key words: antagonistic microorganisms, natural substances, mechanisms of action, plant diseases. ____________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN En los últimos años el control biológico de plagas y enfermedades en la agricultura ha adquirido gran importancia frente a los problemas fitosanitarios ocurridos por el uso indiscriminado de plaguicidas químicos en la agricultura, lo cual ha traído como consecuencia severos problemas de contaminación al medio ambiente y ha generado la resistencia de plagas y enfermedades, así como la presencia de nuevas especies de microorganismos fitopatógenos con un grado de afectación más virulento (Bravo et al. , 2006).

RESUMEN En este trabajo se presenta una revisión bibliográfica sobre las principales aplicaciones de microorganismos antagonistas y sustancias naturales en el control de enfermedades en los cultivos, con el objetivo de tener una visión más técnica y científica del estado actual de uso de estos biofungicidas en este campo. En primer lugar se revisa el concepto de control biológico y los diversos mecanismos de acción (Antagonismo, Antibiosis, Competencia, Fungistasis, Resistencia sistémica adquirida, y Micoparasitismo) con que actúan frente a las diversas enfermedades en plantas. En segundo término se presentan los microorganismos antagonistas y sustancias naturales más importantes en el control de enfermedades en plantas, algunos de los cuales han sido probados como biofungicidas satisfactoriamente. La revisión realizada permite vislumbrar un gran potencial de aplicación de estos bioproductos en el área agrícola.

Palabras claves: microorganismos antagonistas, sustancias naturales, mecanismos de acción, enfermedades de plantas. ____________________________________________________________________________ 34

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La mayoría de los microorganismos fitopatógenos tienen antagonistas biológicos que se pueden emplear como estrategia de lucha en un programa de control biológico. En los últimos años el empleo de bacterias y hongos antagonistas de enfermedades agrícolas ha cobrado una singular importancia, debido a que no solo actúan contra un grupo determinado de microorganismos fitopatógenos (como lo hacen los plaguicidas químicos), sino que se están utilizando para un grupo muy amplio de microorganismos fitopatógenos (Pérez, 2004; Mondino y Vero, 2006).

Aunque el control biológico no pretende reemplazar completamente los sistemas de control químico, puede ser utilizado junto con otras técnicas como parte de un sistema integrado de control y ha de ser puesto en práctica integrándolo con los métodos y con las estra-

tegias de producción existentes actualmente.

El control biológico depende de un funcionamiento efectivo del microorganismo antagonista apropiado para cada ecosistema particular planta-patógeno (Pérez, 2004).

Concepto de Control Biológico Pérez (2004), define el control biológico como la utilización de microorganismos naturales o modificados, para reducir los efectos de organismos indeseables, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de los microorganismos beneficiosos para las plantas.

Microorganismos antagonistas como agentes de biocontrol en enfermedades de las plantas.

Varios tipos de microorganismos (hongos, bacterias y virus) se han descrito como agentes de control biológico de enfermedades en cultivos. Prácticamente todas las plagas y enfermedades son afectadas en alguna medida por organismos antagonistas. En muchos casos estos entes biológicos representan el factor más importante en la regulación de las poblaciones de microorganismos fitopatógenos en la naturaleza (Pérez, 2004; Ezziyyani et al., 2006; Mondino y Vero, 2006).

Mecanismos de acción En la naturaleza existe una continua interacción entre los microorganismos fitopató-

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genos y sus antagonistas, de forma tal que ellos ayudan a la regulación natural de las enfermedades. En condiciones naturales los microorganismos están en una proporción dinámica en la superficie de las plantas. No es fácil establecer con precisión los mecanismos que actúan en las interacciones entre los microorganismos antagonistas y los microorganismos fitopatógenos sobre la planta.

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cimiento de las células de los microorganismos fitopatógenos.

rrespondientes genes de avirulencia (Avr) de los patógenos.

Competencia

Algunos de los procesos bioquímicos y fisiológicos asociados con la resistencia gen por gen son la generación de especies reactivas de oxígeno, la producción de oxido nítrico, la producción de compuestos antimicrobianos, la peroxidación de lípidos, el flujo de iones, y la inducción de genes de defensa, entre otros. (Pérez, 2004; Mondino y Vero, 2006).

La competencia surge cuando al menos dos organismos requieren para su funcionamiento del mismo alimento. El consumo de uno reduce la cantidad disponible del otro; al final se impone uno de ellos. La competencia por En general los antagonistas tienen varios monutrientes y espacio dentro de su nicho ecodos de acción y la combinación de estos es lógico se realiza en la superficie de la hoja, importante para poder elegir un antagonista es el principal mecanismo involucrado en el ideal. Si estos poseen divercontrol de bacterias fitopatósos modos de acción, se reVarios tipos de microorganis- genas; en el caso de hongos ducen los riesgos de que los mos (hongos, bacterias y virus) es variable. La competencia microorganismos fitopatógees un modo de acción indise han descrito como agentes de nos adquieran resistencia, recto (Michel-Aceves, 2001; control biológico de enfermedalo cual se logra mediante el Pérez, 2004; Mondino y des en cultivos. uso de combinaciones de Vero, 2006). antagonistas con diferente modo de acción. Así, se han descrito varios Fungistasis mecanismos mediante los cuales los antagonistas ejercen su acción para controlar el Es la imposición por parte del controlador desarrollo de microorganismos fitopatógenos biológico de dormancia especialmente de es(Michel-Aceves, 2001; Pérez, 2004; Mondino poras fungales por medio de la limitación de y Vero, 2006; Ezziyyani et al., 2006). nutrientes. La más común de esta, es la relacionada con la disponibilidad de elementos Antagonismo nutritivos, el más estudiado hasta el momento el carbono (Pérez, 2004).

Es una interacción entre microorganismos Resistencia sistémica adquirida donde uno interfiere con el otro, es decir causa la pérdida o la actividad de uno de ellos.

Consiste en una o varias moléculas excretaEsta es la base sobre la que se sustenta el das por los microorganismos controladores verdadero control biológico de microorgabiologicos con la capacidad de inducir aunismos fitopatógenos en las plantas (Pérez, todefensas en las plantas frente a la acción 2004). del cualquier microorganismo fitopatógeno.

Antibiosis Existen dos tipos de resistencia: la constitutiva, propia de la planta y que se expresa en Michel-Aceves (2001) y Pérez (2004) definen cualquier momento, y la inducida, expresada a la antibiosis como un proceso de interacción solo ante determinados estímulos. Las inteentre organismos en el cual uno o más metaracciones planta-patógeno son de dos tipos: bolitos son excretados (enzimas hidrolíticas, compatible, cuando ocurre la enfermedad, e metabolitos secundarios volátiles y pequeñas incompatible, cuando la planta resiste. moléculas tóxicas) por un organismo y tienen efecto dañino sobre uno o más organismos, De ahí se sustenta la teoría del gen para el normalmente actúan en bajas concentraciogen, la cual dice que la resistencia de las nes. Además, los antibióticos y otros producplantas a las enfermedades frecuentemente tos tóxicos que son volátiles (como el cianuro resulta de la interacción específica de genes de hidrógeno), son capaces de afectar el crede resistencia (R) de las plantas con los co36

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Micoparasitismo Es la acción antagónica entre dos hongos, el uno (hiperparásito) parasita al otro (micoparásito) a través de una síntesis de exoenzimas hidrolíticas para facilitar la degradación de la pared celular del hospedante. Un antagonista puede utilizar a un hongo como fuente de alimento. Basado en el micoparasitismo se dividen en dos grupos: biotrópicos, tienen un rango restringido de hospedantes, y necrotrópicos, matan a la célula antes o después de la invasión, excretan sustancias tóxicas y utilizan sus nutrientes (Michel-Aceves, 2001; Pérez, 2004).

(Cueva, 2007). Actualmente se conoce las siguientes especies del género Trichoderma: T. aggressivum, T. álbum, T. arundinaceum, T. asperellum, T. atroviride, T. aureoviride, T. brevicompactum, T. citrinoviride, T. citrinoviridex, T. crassum, T. erinaceum, T. fasciculatum, T. fertile, T. gamsii, T. ghanense, T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. koningiopsis, T. longibrachiatum, T. lignorum, T. minutisporum, T. oblongisporum, T. ovalisporum, T. pleuroticola, T. polysporum, T. pseudokoningii, T. pubescens, T. reesei, T. saturnisporum, T. spirale, T. strictipile, T. strigosum, T. stromaticum, T. tomentosum, T. virens, T. viride, T. viridescens. (Michel-Aceves, 2001; Cruz, 2007; Cobos, 2010; Samuels et al., 2010).

Trichoderma sp.

El género Trichoderma es un grupo de hongos aislados del suelo que se reproducen asexualmente. Además, es un hongo filamentoso anamórfico, heterótrofo, aerobio facultativo, con una pared celular compuesta de quitina, de rápido crecimiento. De conidióforo hialino muy ramificado no verticilado, fiálides individuales o en grupos, conidios hialinos de una célula, ovoides, nacidos en pequeños racimos terminales. Muchas cepas crecen eficientemente en medios sólidos o líquidos y en un amplio rango de temperaturas, además son relativamente tolerantes a humedades bajas y tienden a crecer en suelos ácidos (Michel-Aceves, 2001; Cruz, 2007).

Varias investigaciones han demostrado que el control biológico a través del uso de hongos benéficos como Trichoderma es una alternativa potencial respecto al uso de fungicidas o fumigantes en la agricultura (Paredes-Escalante et al., 2009).

Los mecanismos de acción antagonista con que actúa frente a los hongos fitopatógenos son: competencia por espacio y nutrientes, micoparasitismo, antibiosis, la secreción de enzimas y la producción de compuestos inhibidores (Infante et al., 2009).

Agrios (2005), afirma que el género Trichoderma comprende un conjunto de especies sin fase sexual evidente (anamorfo). Pertenece a la Subdivisión Deuteromycotina; Clase Hyphomycetes; Orden Hyphales (Moniliales) y Familia Moniliaceae. Hasta el momento no se conoce que dicho hongo sea patógeno de ninguna planta, exceptuando a T. viride. Sin embargo es capaz de controlar e hiperparasitar muchos hongos, nematodos y otros fitopatógenos, que atacan y destruyen los cultivos

Ezziyyani et al. (2004) manifiestan que T. harzianum controla a Phytophthora capsici, agente causal de la podredumbre de pimiento, aumentando los niveles de enzimas hidrolíticas β-1,3-glucanasa (lisis enzimática), ejerciendo una mayor competencia por espacio y nutrientes e interacciona directamente con el microorganismo fitopatógeno (micoparasitismo), todo lo cual juega un rol importante en la reducción y destrucción del microorganismo fitopatógeno. Además, los géneros de T.

Microorganismos antagonistas como controladores biológicos de enfermedades

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harzianum y longibrachiatum han demostrado efectividad al reducir in vitro hasta un 65 % las enfermedades causadas por Alternaria solani Sorauer y Phytophthora infestans Mont de Bary en tomate. También se ha demostrado que las especies del género Trichoderma controlan una amplia gama de hongos patogenos y dentro de ellos se encuentran los hongos fitopatógenos, tales como: Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Paracercospora fijiensis, Rhyzopus stolonifer, Mucor spp., Penicillium digitatum, Aspergillus niger y Pythium sp., Alternaria sp., entre otros (Michel-Aceves et al., 2008; Cholango, 2009; Guédez et al., 2009; Guilcapi, 2009; Infante et al., 2009).

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de diversas enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular de los microorganismo fitopatógenos, producción de sideróforos (los producidos por estas bacterias tienen mayor afinidad por compuestos de hierro) y el incremento de la capacidad de respuesta sistémica de la planta frente a los microorganismo fitopatógenos. Dentro de este grupo se puede mencionar a las Pseudomonas (aeruginosa, fluorescens, putida), Bacillus y Burkholderia, que son las más usadas en el control de enfermedades en plantas (Mondino y Vero, 2006; Gato, 2006; Rodríguez et al., 2009).

Bacterias del género Pseudomonas

Las rizobacterias del género Pseudomonas Bacterias como controladores biológicos han sido estudiadas como importantes agende enfermedades tes de biocontrol por su capacidad de inhibir el crecimiento de ciertos microorganismos Las bacterias forman parte de la gran cantidad fitopatógenos, como bacterias, hongos, nede microorganismos biológicos que existen matodos y virus, los cuales pueden llegar a como agentes de control de enfermedades reducir considerablemente la producción de fúngicas y bacterianas, tanto en la parte aécultivos. Estos organismos ejercen ciertos rea como en la raíz de las plantas hospedemecanismos de acción antagonista que invoras, y están presentes en la lucran la producción de comrizosfera, además favorecen Las bacterias forman parte de la puestos bacterianos como: el crecimiento y desarrollo gran cantidad de microorganis- sideróforos, ácido cianhídride las plantas (Mondino y mos biológicos que existen como co y antibiótico. Además, se Vero, 2006). A este grupo de agentes de control de enferme- ha comprobado que indubacterias antagonistas de cen un sistema de resistendades fúngicas y bacterianas, enfermedades se les denocia en las plantas que hace tanto en la parte aérea como en que puedan tolerar el ataque mina PGPB (Plant Growth la raíz de las plantas hospederas, de diversos microorganisPromoting Bacteria), es dey están presentes en la rizosfera, mo fitopatógenos del suelo cir aquellas asociadas a las además favorecen el crecimiento (Chaves, 2007). P. fluoresplantas que promueven el crecimiento de ellas. Dentro y desarrollo de las plantas. cens es un cocobacilo Gram de los mecanismos para la negativo que se encuentra promoción del crecimiento vegetal podemos como saprófito en el suelo y es ampliamenencontrar: mecanismos directos, son aquellos te conocido por ser una PGPR. Abunda en la en donde los microorganismos actúan sobre superficie de las raíces, y es versátil en su la planta, dentro de ellos podemos encontrar a metabolismo, además puede utilizar varios los promotores del crecimiento vegetal (auxisustratos producidos por ellas mismas, y no nas, giberelinas y citoquininas), y mecanismos establecen una relación simbiótica con la indirectos, aquellos en donde el microorganisplanta. Entre sus mecanismos de acción se mo es capaz de inhibir diferentes microorgaencuentran el aumento de la toma de agua nismo fitopatógenos (hongos y bacterias) que y nutrientes por la planta, la solubilización de interfieren con el desarrollo de la planta y son fosfatos, la producción de reguladores del neutralizados por diversos mecanismos como: crecimiento vegetal y el control biológico de competencia por espacio o nutrientes, producmicroorganismo fitopatógenos, la producción ción de metabolitos y antibióticos, secreción 38

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de sideróforos, la antibiosis y la inducción de resistencia a la planta, mediante la producción de ácido salicílico, el cual actúa como una molécula de señalización que activa la “resistencia sistémica inducida” (RSI) (Gato, 2006; Rodríguez et al., 2009).

terianas son: competencia por espacio y nutrientes, antibiosis, inducción de resistencia, y promotores del crecimiento de las plantas (Chaves, 2007; Rodríguez y Martín, 2009).

La especie P. aeruginosa fue aislada por primera vez de muestras ambientales. Debido a que las colonias son pigmentadas, tiene el color característico de azul-verdoso hidrosoluble debido a la producción de pigmentos.

Además, es un bacilo Gram negativo aerobio, muy versátil metabólicamente, pudiendo utilizar más de 80 compuestos orgánicos como fuentes de carbono y energía. Es oxidasa positiva y puede crecer a temperaturas superiores a 42 °C. Dicha bacteria produce toxinas como la piocianina, puede colonizar una amplia variedad de cultivos y ser antagonista de diversas enfermedades fúngicas (Gato, 2006; Ruiz, 2007).

El género Burkholderia está compuesto por: bacilos rectos; Gram negativos; oxidasa y catalasa positivos; con una proporción de G+C que oscila entre el 59 y el 69,5 %. Son bacterias móviles con un flagelo polar único o bien con un penacho de flagelos polares según las especies. También son mesófilos y no esporulados. Su metabolismo es aerobio y muy versátil. Como sustancia de reserva utilizan el polihidroxibutirato (Stoyanova et al., 2007; Parra, 2009).

Bacterias del género Bacillus El género Bacillus se caracteriza por ser bacterias Gram positivas, no patogénicas, con propiedades antagonistas, son de forma bacilar, aerobias estrictas o anaerobias facultativas, en condiciones estresantes forman una endospora que es termorresistente a los factores físicos (desecación, radiación, ácidos y desinfectantes químicos), es decir tiene la capacidad de formar esporas que sobreviven y permanecen metabólicamente activas bajo condiciones adversas. (Lisboa, 2003; Chaves, 2007; Rodríguez y Martín, 2009).

Muchas especies producen enzimas hidrofílicas extracelulares que descomponen los polisacáridos, ácidos nucleicos y lípidos, permitiendo que el organismo emplee estos productos como fuentes de carbono y donadores de electrones. También producen antibióticos (bacitracina, polimixina, tirocidina, gramicidina y circulina), lipopéptidos que actúan como biosurfactantes y solubilizadores de fosfatos, son buenas secretoras de proteínas y metabolitos, fáciles de cultivar y altamente eficientes para el control de plagas y enfermedades.

Los mecanismos de acción de Bacillus como antagonista de enfermedades fúngicas y bac-

Bacterias del género Burkholderia

Burkholderia cepacia fue descubierta por Walter Burkholder en 1949 en las catáfilas de cebolla y en su epidermis radicular. La identificación y clasificación de la B. cepacia es extremadamente complicada; se conoce ahora como un “complejo Burkholderia cepacia” y está compuesto por al menos 9 especies distintas que constituyen los denominados “genomovars” o genotipos: B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. vietnamienses, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina y B. pyrrocinia; con la excepción de B. mallei y B. pseudomallei, las que son patógenas de animales y humanos. El género Burkholderia ecológicamente es saprófito, es decir que interviene en el reciclaje de materia orgánica, además es uno de los géneros bacterianos utilizados para biorremediación de herbicidas y plaguicidas recalcitrantes, como agentes de control biológico de hongos fitopatógenos y para promover el crecimiento de las plantas (Stoyanova et al., 2007; Parra, 2009).

Parra et al., (2009) y Trujillo et al., (2007) quienes exponen la actividad antifúngica de B. cepacia aislada del maíz amarillo, lograron inhibir la esporulación de los hongos como F. solani, F. moniliforme, F. oxysporum, Aspergillus niger, Penicillium expansum, A. alternata y Curvularia sp., además indican que esta bacteria produce sustancias químicas quinolisidínicas de naturaleza antibiótica, y antibióticos

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como: A. cepacidina, B. xilocandina y pirrolnitrina, capaces de inhibir el desarrollo de diversos hongos fitopatógenos. En Venezuela se ha utilizado la bacteria B. cepacia en control de enfermedades en especies forestales como la mancha azul en Pinus caribae causada por Lasiodiplodia theobromae; también muchas especies del complejo B. cepacia se han utilizado en biorremediación ambiental por su capacidad de degradar plaguicidas recalcitrantes. (Alemán et al., 2003, Benítez y McSpadden, 2008). Un aspecto importante a señalar sobre esta bacteria es: la capacidad de inhibir a hongos entomopatógenos y a antagonistas como Beauveria bassiana y Trichoderma harzianum, por lo que se debe tener cuidado si se usa en combinación para un programa de Manejo Integrado de Plagas.

(Santos et al., 2004; Parra, 2009).

Sustancias naturales: Quitosana La Quitosana es un producto obtenido de la desacetilación alcalina de la quitina, que es el principal componente del exoesqueleto de crustáceos como el camarón y el cangrejo.

Las propiedades antimicrobianas de la Quitosana eran conocidas por el hombre desde la antigüedad, por lo cual la usaban como cicatrizante de heridas. El uso en la agricultura comenzó su auge en la década de los setenta, aunque actualmente se siguen descubriendo otros usos de este compuesto (Lárez, 2008; Porras et al., 2009).

Son muchos los resultados exitosos de la utilización de Quitosana, así podemos mencionar los experimentos de Sánchez-Domínguez et al., (2007) quienes estudiaron el efecto in vitro de Quitosana en el desarrollo y morfología de Alternaria alternata en tomate, y obtuvieron reducción del grado de inhibición y crecimiento de este hongo en un 50,6 %. La Quitosana en los últimos años se ha demostrado tener un efecto negativo contra diversos hongos fitopatógenos. Esto dependerá del grado de polimerización, de acetilación, naturaleza del hospedante, composición de los nutrientes, condiciones del medio ambiente y período de incubación; además, mientras menor sea el grado de polimerización de la Quitosana menor será el número de especies 40

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de hongos que controle (Porras et al., 2009).

Lárez (2008) y Fernández (2010) reportan que la Quitosana tiene diversas propiedades como: actividad antibacteriana (controla un gran número de bacterias Gram negativas mediante la interacción electrostática con diferente grado de acetilación), actividad antifúngica (controla las enfermedades como: Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Phytophthora capsici, Pythium debaryanum y Sclerotium rolfsii) y actividad antiviral (una solución acuosa 0,1 % de Quitosana controla completamente la infección en hojas de frijoles producida por el virus del mosaico de la alfalfa (AMV), el virus de la necrosis del tabaco (TMV), virus del no crecimiento del maní, virus del mosaico del pepino y el virus X de la papa.

Asimismo se ha demostrado la inhibición del viroide que afecta a las solanáceas, denominado potato spindle tuber viroid. Además de ser antagonista de diversos microorganismo fitopatógenos en plantas, se ha señalado que Quitosana estimula el crecimiento de la planta e induce a la resistencia frente al ataque de microorganismo fitopatógenos (Lárez, 2008; Rodríguez-Pedroso et al., 2006).

CONCLUSIONES La presencia de residuos tóxicos en los alimentos debido a la utilización de productos químicos en la agricultura, hace que los microorganismos antagonistas como: Trichoderma sp., Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, Bacillus y Burkholderia. A pesar que el uso de los biocontroladores es promisorio, es necesario estudiar en detalle los patosistemas desde el punto de vista molecular para hacer una mejor proyección del controlador que seria efectivo en cada caso.

Por ello el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja, está desarrollando el proyecto titulado “ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PATÓGENO-PATÓGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO

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(Vasconcellea helbornii var. pentagona)”, con el objetivo de estudiar este patosistema entre microorganismos desde el punto de vista molecular, para ello se utilizará técnicas de Secuencia Genómica de Nueva Generación, para mayor información referirse a la sección de resumen proyectos de investigación en la pagina 76.

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MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIÓN LYCOPERSICON María Natalia Morales Palacio1 1. Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S” E-mail: nataliamorales88@yahoo.es ____________________________________________________________________________

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Palabras clave: Tomate, Solanum, Lycopersicon, Filogenie, Genética, Marcador, Especie, Silvestre ____________________________________________________________________________

ABSTRACT Tomato (Solanum lycopersicum) is the most important vegetable around the world and it has a very high economic value. This situation has caused too much interest for investigation in scientist around the entire. Molecular genetics has had a significant impact for the estimation of genetic diversity, in the phylogeny studies from wild species of Lycopersicon section, and from generation of molecular markers which have been used by geneticist in order to be attended from the genetic improvement of the tomatoes cultivars. Has been generated for tomato studies, a long information for many of the mapped cDNA markers, which have been joined into the General Index in Tomato Institute for Genomic Research, has made the mapping of cDNA markers, multilocus tests in order to determine the effects of the subdivision of closely related species, has been designed specific primers based on published data about cDNA or genomic DNA sequences, the amplified products were sequenced and generated new sequences, and joined in the Gene Bank Database. In this moment, the entire scientific community has enough information about the genome, as well as the level of relationships between genetically related wild species belonging to the section Lycopersicon.

Key words: Tomato, Solanum, Lycopersicon, Phylogeny, Genetics, Marker, Wild ____________________________________________________________________________ PROBLEMÁTICA

RESUMEN La hortaliza más difundida en todo el mundo y la de mayor valor económico es el tomate riñón (Solanum lycopersicum). Esta situación ha despertado desde hace mas de una década, enorme interés en científicos de todo el planeta. La genética molecular ha tenido un impacto significativo en la estimación de su diversidad genética, en la determinación de la filogenie existente entre las diferentes especies silvestres de la sección Lycopersicon, así como en la generación de marcadores moleculares que han asistido a los genetistas, en la mejora genética de los cultivos comerciales. Ha sido generada para su estudio, abundante información para muchos de los marcadores de ADNc mapeados, los cuales han sido integrados dentro de un extenso consensus en el Tomatoe Gene Index en el Insitute for Genomic Research, se ha realizado el mapeo de marcadores de ADNc, pruebas multilocus para determinar los efectos de la subdivisión de especies estrechamente emparentadas, se han diseñado primers específicos basados en datos publicados sobre ADNc o secuencias de ADN genómico, los productos amplificados han sido secuenciados y las nuevas secuencias generadas depositadas en la base de datos del Gene Bank, de manera que al momento la comunidad científica cuenta con basta información sobre el genoma, así como con el grado de filiación de las diferentes especies silvestres relacionadas genéticamente pertenecientes a la sección Lycopersicon.

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El tomate riñón (Solanum lycopersicum), es la hortaliza más difundida en todo el mundo y la de mayor valor económico, por lo que su cultivo, producción y comercio, se han incrementado en los últimos años; por ello, el principal objetivo de los mejoradores ha sido el de obtener variedades híbridas mejoradas que presenten resistencia a factores bióticos y abióticos, mayor productividad y mejor calidad del fruto.

En el Ecuador, el tomate se cultiva en dos regiones. En el litoral se cultiva principalmente el tomate industrial, registrándose en el 2008 un total de 1023 ha cultivadas y una producción de 15323 Tm; mientras que en los valles cálidos de la región interandina se cultiva mayoritariamente tomate de mesa, con 1586 ha cultivadas y una producción de 35151 Tm en ese mismo año. El total de tomate producido a nivel nacional en el 2008 fue 2610 Ha cultivadas, con una producción de 50551 Tm [1].

En el extremo Sur oriental de la región Inte-

randina (provincia de Loja), su cultivo constituye una importante forma de ingresos para pequeños y medianos productores, sin embargo a nivel regional su producción es muy deficiente y se ha ido decrementando paulatinamente, de manera que en el año 2004 aquí se producía el 34,8% de tomate de la región y en el año 2008 solamente el 4,7%. [1] La baja productividad de éste agroecosistema, se debe principalmente a que con el inicio de la explotación petrolera en el Amazonas, el Ecuador experimentó un auge económico que aceleró la modernización de su agricultura en la zona costera del Pacífico, basada en el alto uso de insumos. [2] La agricultura tradicional de la serranía, también fue influenciada por esta tendencia de modernización, donde los pequeños agricultores de la Sierra producen productos para el autoconsumo y el mercado local, con el empleo exagerado de agroquímicos, particularmente, con hortalizas económicamente rentables como el tomate; por lo que , el fácil acceso a los plaguicidas, la poca capacitación sobre su uso seguro y el uso de variedades mejoradas para las condiciones de los países donde se producen,

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ha provocado la difusión del uso incorrecto de estos productos en Ecuador, además del efecto negativo en la calidad de los frutos, la salud de los consumidores y productores el medio ambiente y los sistemas agrícolas.

INTRODUCCIÓN

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una hortaliza de consumo masivo, posible de cultivar prácticamente en todos los países del mundo y casi en todas las latitudes, justifica el hecho de que haya despertado profundo interés en científicos de todo el mundo, quienes han generado información en el campo molecular sobre las especies silvestres, las cuales constituyen el pool de genes para el mejoramiento de los cultivares comerciales.

El Ecuador es mundialmente conocido por su flora y fauna únicas y posee una enorme variabilidad genética en varias especies de Así por ejemplo, un estudio publicado en interés económico y social para el país. Nu1996, mediante el empleo de cerca de 2000 merosas especies silvestres de la sección secuencias de especies de solanáceas reLycopersicon en las cuales reside toda la gistradas en el EMBL y la base de datos del variabilidad genética disponible y que están Banco de Genes, se encontraron 220 regioemparentadas a las variedanes microsatélite “STRs” des cultivadas de tomate, se Un estudio publicado en 1996, (Short Tándem Repeats) en encuentran abundantemenmediante el empleo de cerca la familia Solanaceae y 80 te distribuidas en las estride 2000 secuencias de especies regiones microsatélite en el baciones de los Andes del de solanáceas registradas en el género Lycopersicon. Las Ecuador: (Solanum pimpiEMBL, y la base de datos del repeticiones dinucleotídicas nellifolium, S. habrochaites, fueron encontradas en reBanco de Genes, se encontraron S. lycopersicum var. ceragiones no codificantes del 220 regiones microsatélite en la siforme, S. cheesmanii, S. ADN, mientras que las repefamilia Solanaceae y 80 regio- ticiones trinucleotídicas fuechmielewskii, S. chilense, S. nes microsatélite en el género ron predominantemente enneorickii, S. peruvianum, S. [3] Lycopersicon. pennellii). contradas en los exones del ADN. De las 80 regiones miEl enorme interés económico mundial sobre crosatélite del género Lycopersicon, escogieestas especies ha ocasionado que se hayan ron 44 loci, identificando 36 pares de primers potencialmente utilizado para el mejoramienque mostraron fragmentos legibles o grupos to genético de las variedades cultivadas, por de fragmentos en cultivares de L. esculentum poseer características interesantes para el y otras especies de Lycopersicon. Encontramejoramiento tales como tolerancia a la huron 29 bandas polimórficas para 4 especies medad, resistencia a hongos e insectos, pode Lycopersicon y 10 pares de primer resuldredumbre de las raíces, mejora del color de taron polimórficos en 7 cultivares de tomate. los frutos, tolerancia a la sal, alto contenido de azúcar, tolerancia al frío y heladas, resisEl porcentaje de loci polimórficos entre cultitencia a la sequía; alto contenido de licopeno, vares varió desde el 6% en los loci más peetc. [3] queños, hasta 60% en los grupos con número Sin lugar a dudas, en las últimas décadas la de repeticiones mayores, sin embargo entre genética molecular ha tenido un impacto sigespecies, encontraron hasta un 83% de ponificativo en la estimación de la diversidad gelimorfismo. En el trabajo se reportan entre nética de las especies, en la determinación de 2 y 4 formas alélicas diferentes, aunque en la filiación genética, en la búsqueda de genes unos pocos casos encontraron más de 8 forresponsables de caracteres agronómicos de mas alélicas distintas; por lo que, mediante el interés; así como, en la generación de marcaestudio se presentan loci microsatélites útiles dores moleculares que han permitido asistir para distinguir entre cultivares de tomate que a los genetistas, en la mejora genética de los se encuentren genéticamente estrechamente cultivos comerciales. El tomate riñón, siendo relacionados unos con otros. [4] 46

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En un estudio posterior, publicado en el 2005, otros autores publican los resultados de un estudio multilocus con el cual evalúan los patrones de polimorfismo de nucleótidos dentro y entre tres especies autoincompatibles de tomates silvestres (Clado Lycopersicon) estrechamente relacionadas. Basados en los datos de secuencias de ADN para 13 loci nucleares, encontraron que la especiación ocurrió bajo un flujo de genes residuales, lo que implica a la selección natural, como una de las fuerzas de la evolución de conducir a la diversificación de los linajes de tomate. [5] Las relaciones genéticas existentes entre las diferentes especies silvestres relacionadas con el tomate cultivado habían sido hasta el momento estudiadas por diversas técnicas como los RFLPs (restriction fragment length polymorphisms), ADN mitocondrial, ADN nuclear y cloroplástico; regiones microsatélites, isoenzimas, ITS (secuencias de genes de transcritos espaciadores internos) o de ADN ribosómico nuclear, SNPs (single copy nuclear polymorphism), GBSSI (granule-bound Starch Synthase gene), datos morfológicos, etc. En el 2005, se publican los resultados de un estudio en el que se emplean marcadores de tipo AFLPs, pero que además compara los resultados obtenidos, con aquellos generados previamente por diferentes técnicas. El estudio considera 10 especies de tomate silvestre, incluyendo el recientemente descrito en ese entonces S. galapagense, con una concentración en la mayoría de especies variables y distribuidas de S. peruvianum. Los datos generados mediante AFLPs, resultan largamente concordantes con aquellos generados con el GBSSI y los datos morfológicos; y, en general apoyan los resultados publicados por C.M. Rick; sin embargo, demuestran la distinta naturaleza de las poblaciones del norte y el sur del Perú (S. peruvianum) o sugieren que la taxonomía necesita una revisión. Solanum ochranthum es mantenido como hermano de las especies silvestres de tomate y S. habrochaites y S. pennellii se ubican en el clado del tomate. [6]

Posterior al trabajo antes descrito y durante el mismo año, se reportan dos nuevas especies de tomate silvestre (Solanum arcanum y S. huaylasense) segregadas de Solanum peruvianum. Estas dos especies se ubican en el clado con otros dos segregantes de S. peruvianum (S. peruvianum sensu stricto y S. corneliomulleri) y junto a la morfológicamente similar (S. chilense). En la publicación además presentan una lista de todas las 13 especies de tomate silvestre reconocidas y sus equivalentes nombres en la sección Lycopersicon. [7] En el 2007 se publican los resultados de la secuenciación de ocho loci nucleares no ligados en 4 poblaciones de dos especies relacionadas (Solanum peruvianum y S. Chilense), con un total evaluado de 40 a 46 alelos por locus y por especie. Tanto el polimorfismo como la diversidad nucleotídica para cada locus y cada población fueron cuantificadas, reportándose que la mayoría de los loci y de las poblaciones muestran polimorfismo. El mayor nivel de polimorfismo lo encontraron en las poblaciones de S peruvianum del norte peruano, respecto de las poblaciones del sur. En cuanto a Solanum chilense, tres poblaciones muestran comparables niveles de diversidad, mientras que otras 2 muestran una diversidad tan alta como las que encontraron en S. peruvianum.

En el trabajo reportan que ambas especies mostraron gran variación de nucleótidos y proponen que la estructura de la población es una de las más importantes fuerzas de la evolución dentro y entre poblaciones en estos tomates silvestres. [8] En el 2008, se publica un estudio sobre genética de poblaciones en dos especies de tomate silvestre estrechamente relacionadas (S. peruvianum y S. chilense) pertenecientes a la sección Lycopersicon, colectadas en el centro y el sur del Perú; para ello realizan una secuenciación multilocus que les permite generar patrones de polimorfismo y divergencia en estas especies de tomate silvestres muy relacionadas. En el estudio focalizan múltiples poblaciones de las dos especies, escogiendo un subset de loci previamente analizados en trabajos iniciales (Roselius et al 2005; Stadler

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et al 2005; Tanksley et al 1992). Los resultados que obtienen sugieren que la especiación ocurrió bajo flujo genético residual, lo cual implica que la selección natural es una de las fuerzas evolutivas que maneja la divergencia de estas dos especies de tomate (tiempo de divergencia igual o menor a 0,55 millones de años). [9] Tal inferencia es fuertemente consistente con lo reportado por investigadores en trabajos previos, como los anteriormente citados.

Durante el siguiente año, se publica un estudio el cual señala que en general, tanto la clasificación como la filogenia de las especies que pertenecen a la sección Lycopersicon es compleja debido a la ausencia de un consensus que sea ampliamente aceptado; además, señala que estas especies divergieron recientemente y que aún están estrechamente relacionadas al punto en que en algunos casos son incluso capaces de hibridarse interespecíficamente, lo cual disminuye aun más el poder diferenciar la variación intra e inteLa población ecuatoriana de especies silvesrespecífica. El estudio permitió dar solución a tres del grupo Lycopersicon había estado eslos problemas antes mencionados, mediante casamente representada en estudios previos, hasta que un grupo de investigadores publiel empleo de muchas accesiones que cubrieron el rango natural de cada can en el 2008 los resultados de un estudio de estructura Las poblaciones ecuatorianas especie que emplearon. En poblacional en una especie del sur peruano presentan baja el estudio utilizan para la silvestre propia de las áreas diversidad genética y alta hete- clasificación y relación filocosteras del Perú y Ecuador; rocigosidad, posiblemente debi- genética la técnica de los y, que ha sido fuente para la do a la alta autogamia, pequeño AFLPs en dos secuencias de genes nucleares; en adigeneración de muchas vatamaño de las poblaciones y forción para evitar los sesgos riedades comerciales (Somación de cuellos de botella. debido al método molecular lanum pimpinellifolium). empleado (AFLP), caracteriSu variación fue detectada zan el material con dos secuencias de genes en 10 regiones microsatélites y analizaron nucleares. Los datos obtenidos sugieren una 248 plantas representativas del área entera clasificación similar a aquellos previamente de distribución, con énfasis en la población propuestos por otros autores, así como alecuatoriana. En el estudio se reportan grandes diferencias genéticas en las dos poblagunos cambios significativos. En el estudio ciones; así, las poblaciones peruanas no prese reconocen y distinguen doce especies; sentan estructura genética, mientras que las además, proponen que la especie S. corneecuatorianas se encuentran geográficamente liomulleri es distinguible de S. peruvianum. parchadas. Los autores señalan que una poEn adición, los arboles obtenidos con ambas sible causa de esta diferencia podría ser la técnicas (secuencias y AFLPs) sugieren que naturaleza no uniforme del clima ecuatoriano, S. arcanum podría representar un complejo ya que encontraron una importante correlade poblaciones compuesta de dos especies ción entre la estructura genética y el clima. crípticas. Con la búsqueda de las relaciones Por otro lado, las poblaciones ecuatorianas filogenéticas entre especies, encuentran aly del sur peruano presentan baja diversidad gunos grupos claros: Grupo Lycopersicon (S. genética y alta heterocigosidad, posiblemente pimpinellifolium; S. Lycopersicum; S. cheesdebido a la alta autogamia, pequeño tamaño maniae; S. galapagense) Grupo Arcanum: de las poblaciones y formación de cuellos de (S. chmielewskii; S. neorickii; S. Arcanum; S. botella. El extremo de casi ninguna diversidad huaylasense) Grupo Eriopersicon: (S. perugenética lo presentan las poblaciones de las vianum; S. chilense; S. penellii; S. habrochaiIslas Galápagos, a causa posiblemente de tes); y, no incluido en ningún grupo, pero esuna reciente colonización desde regiones del trechamente relacionado S. lycopersicoides.

[11] Guayas y Los Ríos continental, donde encontraron plantas genéticamente idénticas. [10] 48

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CONCLUSIONES El tomate riñón es la principal hortaliza que se cultiva y se consume alrededor del planeta entero y su cultivo y producción denota gran importancia económica para sus productores.

Las especies silvestres emparentadas al tomate cultivado, son portadoras de un sinnúmero de genes de interés agronómico, por lo que estas han constituido por décadas, la fuente de genes para el mejoramiento genético de las variedades comerciales que han sido lanzadas al mercado, de manera que al momento existe una enorme cantidad de fenotipos que se comercializan (frutos rojos, amarillos, grandes, pequeños, acorazonados, ovalados, alargados, etc.), así como frutos con gran cantidad de sólidos solubles, mejorados para la industria (salsas, jugos, etc.), plantas con ciclos de cultivo más cortos, con tipo de crecimiento determinado, resistentes a factores bióticos (hongos, insectos, bacterias) como a factores abióticos (sequías, heladas, salinidad del suelo, etc.). Tal situación ha sido posible por supuesto al enorme interés que ha despertado su investigación en científicos de todo el mundo, quienes han generado numerosos estudios sobre las especies de la sección Lycopersicon, de manera que al momento se cuenta con enorme cantidad de información, ya sea publicada en artículos científicos, así como información ingresada en las bases de datos del Banco de genes y que están disponibles para la comunidad en general; así mismo su estudio ha permitido establecer en forma clara la relación filogenética que existe entre estas especies estrechamente emparentadas..

REFERENCIAS 1. INEC (www.inec.gob.ec).

2. Nuez F, Prohens J, Blanca JM (2004) Relationships, origin, and diversity of Galápagos tomatoes: implications for the conservation of natural polulations. Am J Bot 91:86-99.Fernandez de Cordova P, Soler S, Valdivieso E, Solórzano V (1999) Germoplasm of Solanaceae horticultural crops in the south of Ecuador. Plant Gene-

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10. Zuriaga E, Blanca JM, Cordero L, Sifres A, Blas-Cerdán WG, Morales R, Nuez F (2008) Genetic and bioclimatic variation in Solanum pimpinellifolium. Genet Resours Crop Evol. Doi: 10.1007/s10722-0089340-z.

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Genet Resours Crop Evol 56:663-678

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NANOESTRUCTURAS POLIMÉRICAS PARA LA DETECCIÓN DE ADN Iván Burneo Saavedra1, Programa de Máster en Nanociencia y Nanotecnología Centro de Biotecnología Universidad Nacional de Loja Supervisores: Olivier Henry1*, Ciara K. O’Sullivan1*, ‡ 1Nanobiotechnology and Bioanalysis Group, Department of Chemical Engineering, Universitat Rovira I Virgili, Avinguda Paısos Catalans, 26, 43007, Tarragona, Spain, ‡ Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats, Passeig Lluıs Companys 23, 08010 Barcelona, Spain e-mail: olivier.henry@urv.cat, ciara.osullivan@urv.cat ____________________________________________________________________________

revestimiento por centrifugado, mediante eliminación de la fase de poli(metil-metacrilato) (PMMA) de la capa de poli(estireno-b-metilmetacrilato) (PS-b-PMMA), usando el método de degradación UV y grabado químico con ácido acético. Las condiciones de la operación de revestimiento por centrifugación fueron optimizadas para preparar filmes de 10-20 nm de espesor, medido por reflectometría de Rayos X. La morfología de las películas fue caracterizada mediante microscopia de fuerza atómica (AFM) y las técnicas electroquímicas tales como voltametría cíclica y espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) se usaron para evaluar el comportamiento electroquímico de los electrodos nanoestructurados resultantes para la fabricación de sensores electroquímicos de ADN. Palabras clave: Diblock copolímeros, nanoporos, bisoensores electroquímicos de ADN. ____________________________________________________________________________

ABSTRACT The development of new detection methods remains a very active research topic in the field of optical and electrochemical biosensors. The prospect of a rapid analysis requires processing and handling of samples in a few steps, and this coupled with rapid screening diagnoses would enable a more economic and obtain results faster. The use of nanostructured films in biosensing is a versatile tool to develop and meet the re-quirements size of many lab-on-a-chips. To achieve this goal, we prepared films of block-copolymers containing cylindrical spaces gold substrates produced by spin coating, by eliminating the phase of poly (methyl methacrylate) (PMMA) layer of poly (styreneb-methyl methacrylate) (PS-b-PMMA), using the method of UV degradation and etching with acetic acid. The conditions of the coating operation by centrifugation were optimized to prepare films of 1020 nm thickness, measured by X-ray reflectometry The morphology of the films was characterized by atomic force microscopy (AFM) and electrochemical techniques such as cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were used to evaluate the electrochemical behavior of nanostructured electrodes resulting in the manufacture of electrochemical sensors DNA. Key words: Diblock copolymers, nanopores, DNA electrochemical bisoensozres. ____________________________________________________________________________

1.

RESUMEN El desarrollo de nuevos métodos de detección sigue siendo un tema de investigación muy activo en el campo de los biosensores ópticos o electroquímicos. La perspectiva de un análisis rápido requiere el procesamiento y manejo de las muestras en pocos pasos; esto unido a una detección rápida permitiría diagnósticos más económicos y la obtención de resultados más rápidamente. El uso de filmes nanoestructurados en biodetección es una herramienta versátil para desarrollar y satisfacer los requerimientos de tamaño de muchas tecnologías lab-on-a-chip. Para lograr este objetivo, se preparó films de block-copolímeros que contienen espacios cilíndricos sobre sustratos de oro, producidos por 50

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INTRODUCCIÓN

La consecución de patrones nanoscópicos funcionales regulares y el control de estructuras superficiales a la escala nanométrica son esenciales para el desarrollo de superficies con propiedades nuevas y útiles[1, 2].

Los filmes porosos han sido usados para la fabricación de materiales nanoestructurados que tienen aplicaciones potenciales en catálisis y nanolitografía, en electrónica, óptica y magnetismo, así como en biosensores [1, 3-5]. Los materiales nanoestructurados constituyen nuevas plataformas para la detección biomolecular que pueden proporcionar una mayor sensibilidad y susceptibilidad a la miniaturización [4, 5]. Los nuevos métodos de modelado basados en “top-down”, incluyen varios enfoques litográficos que emplean UV, rayos X, interferencia, zone plane array, scan-

ning óptico de campo cercano, haz de iones focalizados, haz de electrones, dip-pen y nano-impresión [6] para obtener nanoestructuras altamente ordenadas. Sin embargo, estas tecnologías siguen siendo caras y con limitaciones intrínsecas.

Como alternativa, la auto-organización de macromoléculas es una técnica emergente, promisoria y flexible [2], que se caracteriza por la formación espontánea de dominios de escala nanométrica que exhiben un alto grado de ordenamiento [7]. En este sentido, los block copolímeros (BCPs) son materiales ideales debido a la conectividad de las dos cadenas químicamente distintas en morfologías ordenadas con una escala de tamaño limitado por la dimensiones moleculares de las cadenas del polímero.

Además, el tamaño y forma de los nanodominios pueden ser convenientemente controlados simplemente cambiando sus pesos molecula-

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res y su composición [6, 8]. Los filmes delgados nanoporosos de BCPs son el centro de una intense investigación debido a su alto impacto para fabricar matrices de alta densidad para el almacenamiento de datos, la electrónica, la separación molecular, la química combinatoria, o la detección de ADN [5, 9-11].

Los blocopolímeros pueden ser considerados como dos o más fragmentos químicamente homogéneos de polímeros, es decir, cadenas de homopolímeros, unidas por enlaces covalentes para formar macromoléculas más complejas tales como los copolímeros lineales, di-, tri, o multibloque, y arquitecturas no lineales como multibrazo, starblock o graft copolímeros [12].

Esquema 1. Representación de varias clases de BCPs y los nanodominios formados. Adaptado de Lazarri et al. [12].

Los enfoques para controlar la orientación de los microdominios de blocopolímeros incluyen el uso de vapores de solventes, campos eléctricos, sustratos químicamente modelados, grafo epitaxia, cristalización epitaxial, control de interacciones interfacial, gradientes térmicos y zone casting [13]. Una vez fundida, se producirá la separación de fases entre los distintos bloques lo que se traduce en la formación de dominios laminares o cilíndricos como se representa en el Esquema 1. El espesor del film, el tiempo y la temperatura de annealing pueden ayudar a controla la uniformidad y la orientación del las películas auto-organizadas, mientras que el peso molecular del polímero y la variación de la longitud del bloque controlan el tamaño y la separación de los diferentes dominios. [7,14].

Para la fabricación de nanoestructuras, se remueve, posteriormente, uno de los bloques usando plasma o grabado químico [15]. Los fil52

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mes ultra delgados (<100 nm de espesor) de nanoelectrodos se prepararon por spin-coating de una capa de poliestireno-b-polimetil metacrilato (PS-b-PMMA) sobre sustratos de oro. Bajo condiciones óptimas, los bloques se auto-organizan para formar dominios cilíndricos perpendiculares a la superficie. Los bloques de PMMA pueden ser grabados por simple exposición a luz ultravioleta y ácido acético para exponer la superficie de oro.

La razón principal para el uso de nanoelectrodos es el beneficio obtenido por la transferencia de masa mejorada debido al dominio de la difusión radial, disminución de las corrientes de carga y reducción de los efectos deletéreos debidos a la resistencia de la solución [16]. Como el electrodo disminuye en tamaño, la difusión radial se vuelve predominante y dando como resultado un transporte de masa más rápido y mejor sensibilidad, tiempos de respuesta más rápidos, y respuestas independientes de convección en comparación con los electrodos de tamaño macro. [14, 16,17].

El uso de filmes porosos nanoestrucurados en biodetección aparece como una herramienta versátil para desarrollar y satisfacer los requerimientos de tamaño de muchas tecnologías lab-on-a-chip [6]. Los sensores de ADN basados en nanomateriales pueden detector la presencia de genes o la mutación de genes asociados a enfermedades humanas hereditarias y pueden usarse directamente para el monitoreo directo de los eventos de hibridación [18].

Muchas técnicas que incluyen la fluorescencia, espectrometría de masa, electroquímica, espectroscopia de resonancia de plasmones de superficie y microbalanza de cristal de cuarzo, se han desarrollado para la detección de ADN [19]. Sin embargo, las técnicas electroquímicas ofrecen grandes ventajas debido a su simplicidad, rapidez, bajo costo y alta sensibilidad.

Muchas metodología se han propuesto para el monitoreo electroquímico de la hibridización del ADN [19, 20] de acuerdo a como se haga la medición eléctrica, por ejemplo, voltametría, amperometría/culombimetría, o espectroscopia de impedancia [21, 22].

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La espectroscopia de impedancia (EIS) se usa ampliamente en el campo de la investigación biomédica [23]. El potencial de la EIS se basa en que la impedancia del sistema puede ser escaneado en un amplio rango de frecuencias para determinar las propiedades electrónicas de las varias interfaces que lo componen, por lo general se describe como un circuito equivalente de las resistencias, los condensadores e inductores en paralelo o en serie. Los modelos de los circuitos equivalentes son útiles para la interpretación del espectro de impedancia, y como tal la EIS es una técnica valiosa para la investigación de la cinética y la morfología de los electrodos, de polímeros, de semiconductores, de sensores bioquímicos, de tejidos animales y vegetales [24]. El principal motivo para el estudio de sensores de impedancia es su capacidad para realizar detecciones label-free [21, 23, 25].

Esta técnica junto con indicadores electroactivos como el ferrocianuro de potasio, ha sido usada frecuentemente para caracterizar cadenas simples o dobles de ADN [24], para el seguimiento de la hibridización del ADN [26, 27] y para la detección de polimorfirmos de un solo nucleótido [28] usando electrodos modificados.

En este trabajo, presentamos los resultados tras el estudio de superficies de electrodos de oro modificados con nanoestructuras que de superficies de nanogaps poliméricos ultradelgados preparados mediante auto-organización de blocopolímeros de PS-b-PMMA de longitud de bloque variable para la fabricación de matrices de nanoelectrodos.

to hybridisation and blocking of the pore structure.

Estos electrodos se usaron posteriormente para preparar sensores electroquímicos de ADN, inmovilizando cortas secuencias de ADN tiolado dentro de los poros poliméricos y monitoreando el evento de hibridización con una cadena de ADN complementario utilizando espectroscopia de impedancia electroquímica. La combinación de EIS y las matrices de nanoelectrodos podría ofrecer un método electrónico de detección simple basado en el aumento de la resistencia interfacial de la transferencia de electrones, asociada con el bloqueo de los poros seguido por la formación de un aducto de ADN, como se muestra en el Esquema 2.

La voltametría cíclica junto con la EIS se usó para monitorear la calidad del graba químico de los dominios de PMMA tanto como la detección de los eventos de hibridización después de la funcionalización de los electrodos con cadenas cortas de ADN, de 20 bases de longitud. La secuencia Exon 16, presente en el gen BRCA1 del cáncer de mama se usó como sistema modelo de ADN. Para caracterizar la morfología y el espesor de los films nanoporosos se usó Microscopia de Fuerza Atómica (AFM) and y reflectometría de rayosX. El presente trabajo demuestra que las estructuras de nanoporos permiten al sustrato de oro subyacente mantener la actividad electroquímica y ser usadas en la detección de ADN. 2. PARTE EXPERIMENTAL 2.1 Materiales.

Esquema 2. Schematic of (a) surface nanostructure (top view), (b) effect of hybridisation and de-hybridisation event on the blocking of the pore structure and (c) read out of resulting surface impedance variation due

Ferrocianuro de potasio (III), tetrahidrofurano, tolueno y tampón fosfato salino pH 7.4 con Tween 20 (PBS-T) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (España), Sodio hexacianoferrato (II) decahidratado, cloruro de potasio, ácido sulfúrico, cloroformo y acetona fueron adquiridos de Scharlau Chemie (Barcelona, España), ácido acético glacial fue adquirido de Panreac (Barcelona, España). Se usó agua ultrapura (18 MΩ cm) obtenida con un

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sistema Milli-Q RG (Barcelona, España). Los oligonucleótidos fueron comprados a Eurogentec (Eurogentec, España) y a Biomers.net GmbH (Ulm, Alemania). Las secuencias de oligonucleótidos empleadas en este trabajo se enumeran a continuación: DNA-SH target (Exon 16): 5’-SH-AG-GGTCAT-CAG-AGA-AGA-GG-3’ Sonda complementaria (Exon 16 A): 5’-CCTCTT-CTC-TGA-TGA-CCC-T-3’

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PMMA se degradaron usando una lámpara UV (350 W) durante 10 min, que consiste en el entrecruzamiento de la matriz de PS y la degradación de los dominios cilíndricos de PMMA. Posteriormente, la degradación dominios de PMMA se elimina por lavado con ácido acético glacial durante 5 min.

2.2.2. Caracterización

Medición del espesor de los films. El espesor de las películas de PS-b-PMMA se depoli(estirenoterminó utilizando reflectometría de rayos-X (XRR) antes de la radiación Muchas técnicas que incluyen UV, las mediciones se realila fluorescencia, espectrome- zaron con un difractómetro tría de masa, electroquímica, de rayos-x D-500 (Siemens, Alemania)

Los blocopolímeros (BCP) block-metil metacrilato) (PSb-PMMA) fueron comprados a Polymers Source Inc. (Montreal,Canada) y usados como fueron recibidos. Los espectroscopia de resonancia d sistema de blocopolímeplasmones de superficie y micro- Morfología de las pelícuros usados en este trabajos balanza de cristal de cuarzo, se las poliméricas. Se usó fueron PS(24 KDa)-b-PMhan desarrollado para la detec- Microscopía de Fuerza AtóMA(11.5 KDa) with Mw/Mn= ción de ADN. 1.06, PS(39.8 KDa)-b-PMmica (AFM) para caracteriMA(17 KDa) with Mw/Mn= zar la morfología de los films 1.06, PS(68 KDa)-b-PMMA(33.5 KDa) with preparados. Se usó un 5400 Scanning Probe Mw/Mn= 1.08, y PS(140 KDa)-b-PMMA(60 Microscope (SPM)/Atomic Force MicroscoKDa) with Mw/Mn= 1.08. pe para obtener imagines de microscopía de La obleas de silicio de 4” de diámetro y 525 μm fuerza atómica en modo tapping (Agilent Tede espesor, recubiertas con 10 nm de titanio chnologies, USA). Cantiléveres de silicio con y 100 nm de oro fueron adquiridos a Platypus constantes elásticas de resorte entre 5 y 40 Technologies (Madison, USA), fueron usados N.m-1 y frecuencias de resonancia de 150 y como sustrato a menos que se indique lo con300 Hz se usaron para obtener las imágenes. trario. Se obtuvo chips de 2 x 2 cm2 usando un El radio típico de los tips fue inferior de 10 lápiz de diamante a partir de las obleas de silicio nm. El análisis de las imágenes de AFM fue (RS electronics, Michigan,USA), luego lavadas realizado usando el software WSxM (Nanotec en agua milipore, acetona y secadas bajo fluElectrónica, España). jo de nitrógeno, y finalmente limpiadas usando ozono con el sistema PSD-UVT ozone (NovasVoltametría cíclica y Espectroscopía de Imcan Technologies, USA) durante 10 minutos. pedancia. Los ensayos de voltametría cíclica (CV) y Espectroscopía de Impedancia (EIS) se 2.2. Métodos realizaron usando un potenciostato/galvanostato Autolab PGSTAT controlado con los soft2.2.1. Fabricación de filmes poliméricos wares General Purpose Electrochemical Sysdelgados. Los blocopolímeros PS-b-PMMA tem (GPES) y Frequency Response Analyser fueron disueltos en THF o tolueno para for(FRA) (Eco Chemie B.V., Holanda). Las memar soluciones stock de 1 % w/v. Los films diciones se llevaron a cabo en una sola celda delgados fueron preparados por revestimienelectroquímica en un arreglo de tres electroto por centrifugación en chips de silicio-oro 2 dos que consiste en filmes copoliméricas/DNA x 2 cm2 centrifugados a velocidades de 4000 como electrodos de trabajo, un alambre de Ag/ rpm y cocidos a 170ºC por 72 horas para obAgCl como electrodo de referencia y un alamtener dominios cilíndricos. Los dominios de bre de Pt como electrodo de conteo. Los elec54

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trodos de trabajo fueron chips cuadrados (2 cm × 2 cm) de silicio-oro. El diámetro de los electrodos de trabajo se definió por un agujero circular perforado en una máscara de plástico adhesivo de 6 mm de diámetroo. El electrolito usado fue 10 mM Fe (CN)63-/10mM Fe(CN)64- en solución acuosa 0,1 M de KCl. Todos los potenciales se registraron con respecto al electrodo de referencia.

2.2.3. Ensayos analíticos Inmovilización del AND. La inmovilización de las cadenas sencillas de ADN tiolado (HSssDNA) en la matriz de nanoelectrodos se logró mediante absorción química [29]. En resumen, 50 µL de una solución 1μM de la sonda tiolada, recién preparada en 1 µM KH2PO4 se depositó sobre la superficie del electrodo y se inmovilizó durante toda la noche en una cámara húmeda para evitar la evaporación.

Luego los electrodos fueron lavados en una solución de PBS-Tween durante 5 min para eliminar las sondas no adsorbidas.

Hibridización. La hibridación se llevó a cabo a través de la adición de 50 µL (100 nM) de la sonda complementaria. El la secuencia de ADN blanco, Exon 16, se añadió a la superficie del electrodo de trabajo, seguido por un periodo de incubación de al menos una hora en una cámara húmeda, el electrodo fue lavado con PBS Tween por 5 minutos para remover cualquier secuencia no hibridada. La regeneración de los electrodos se logró por lavados con una solución acuosa de 20 mM Nao durante 5 min, seguido por enjuague con PBS 600 por 10 min, y finalmente con agua Milli-Q. Los procesos de hibridización fueron realizados dos veces. Los niveles de inmovilización, hibridización, y deshibridización fueron medidos usando voltametría cíclica y EIS. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Morfología de los films delgados di-blockcopoliméricos por Microscopía de Fuerza Atómica.

Se realizaron una serie de experimentos en los cuales se varió sistemáticamente los pa-

rámetros de procesamiento (temperatura de annealing y tiempo de grabado) con el fin de optimizar el proceso de auto-organización.

Para caracterizar la morfología de los films resultantes, se analizó la distribución de perímetros de poros observados por de AFM, como una medida indirecta de la distribución del tamaño del poro.

Efecto del espesor del film Todas las películas de block-copolímero en los sustratos de oro se prepararon por recubrimiento por rotación a diferentes velocidades de giro. Utilizando Reflectometría de Rayos-X (XRR), se estimó el espesor de las películas fabricadas a velocidades de 2000, 3000 y 4000 rpm se estimó su espesor en 49, 36 y 16 nm, respectivamente.

Figura 1. Espectros de reflectometría de rayos X (XRR) utilizados en la determinación del espesor de películas delgadas de blocopolímeros recubiertos por centrifugación a 4000 rpm.

En la determinación del espesor (Figura 1), el ángulo de incidencia del haz de rayos X utilizado es mayor que el ángulo crítico θC. La medida resultante consiste en un patrón de interferencia entre el haz incidente y el haz reflejado, que consta de un patrón periódico de fase lo que puede estar relacionado con el espesor total de la capa de en cuestión. El espesor se determinó usando la ecuación 1.

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donde d es el espesor de la película delgada, λ es la longitud de onda del rayo-x, y θm+1 - θm es la diferencia entre el ángulo de incidencia de dos máximos y mínimos cercanos [30].

El auto-ensamblaje de las plantillas ordenadas depende en gran medida del espesor películas de polímeros, como se muestra en la Figura 2. Está bien establecido que la morfología de las películas de blocopolímeros depende en gran medida el grosor de la superficie debido a las interacciones tienen lugar dentro de las películas [15].

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muestran la distribución del perímetro de los poros. Se puede observar que el valor medio de los poros fue de aproximadamente 20 nm, suponiendo poros circulares, y la distancia entre poros más cercanos fue de 34 nm. Sin embargo, frente a la fabricación de películas delgadas como plataformas para el desarrollo de sensores de ADN, se prefirió las superficies ordenadas entre 10 y 20 nm de espesor a fin de evitar la limitación de la difusión del ADN presente en la muestra a través de los huecos en el ADN inmovilizado. Por tanto, se seleccionó una velocidad de revestimiento por centrifugado de 4000 rpm para el trabajo futuro.

Efecto de la naturaleza del sustrato Las interacciones interfaciales entre los bloques de polímero determinan tanto el sustrato y las interfaces de superficie y, en consecuencia, la orientación de los microdominios dentro de la película [31].

de silicio con recubrimiento de de oro y obleas de silicio nativo, sobre la morfología y orientación de las estructuras porosas.

Las imágenes AFM de la figura 3 presentan la morfología de las películas sobre los dos sustratos. Las películas de las soluciones de PS (39.8kDa)-b-PMMA (17) fueron revestidas por centrifugado a 2.000 rpm, y cocidas a 165 º C durante 48 h. Se puede observar que, esencialmente, la morfología en ambos sustratos es la misma, debido a las similares interacciones polímero-sustrato.

Sin embargo, se puede observar patrones ligeramente más ordenados en las películas centrifugadas sobre sustratos de Si nativo. La relación del área- perímetro y la distancia de primer vecino, que representan el diámetro de poro y el espaciamiento de los poros [7], fueron de 34,5 nm y 3,6 nm para películas sobre sustratos de silicio y 38 nm y 5,4 nm para las películas en Au. Estos resultados sugieren una mejor distribución de los poros, una mejora en el espaciamiento y poros más grandes.

Efecto de las condiciones de post procesamiento

Figura 2. Análisis del efecto del espesor de PS-b-PMMA en el procesamiento de películas delgadas. Imágenes de altura y fase, y distribución del perímetro de los poros de la PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kDa) 1% (w / v) en THF, a-c) girar a 2000 rpm,. d-f) 3000 rpm, y g i) 4.000 rpm.

La película más gruesa, de 49 nm centrifugada a 2000 rpm demostró una distribución ordenada y homogénea del tamaño de poro (Fig. 2a-c). Las películas más delgadas de 36 nm y 16 mostraron grandes distribuciones de tamaño de los poros con muy poco orden (Fig. 2d-i). Todas las películas se prepararon a una temperatura fija (165 º C) durante 48 horas, que fue suficiente para asegurar la formación de una estructura equilibrada y mostraron una morfología que consta de poros redondeados y una orientación perpendicular. Las figuras 2c, 2f y 2i, 56

PS-b-PMMA. Las imágenes de altura y fase, y distribución del perímetro de los poros de PS (39.8kDa)-bPMMA (17kDa) 1% en THF centrifugado a 4000 rpm. a-b) 3 minutos de tiempo de grabado, c-d) 5 minutos, y e-f) distribución de perímetros de poros de 3 min y 5 min, respectivamente.

Se investigó también la evolución de la morfología de los poros como una función del tiempo de grabado. La figura 4 muestra las imágenes de AFM de las películas después de 3 y 5 minutos de grabado usando ácido acético glacial seguido por cocido térmico a 165 º C durante 48 horas.

Para todos los tiempos de grabado utilizados, las superficies observadas fueron consistentes con una orientación perpendicular cilíndrica. La morfología resultante no mostró diferencias entre 3 y 5 minutos, y, en general la distribución de los poros son iguales con un valor medio del perímetro de los poros de 50 nm, aproximadamente 16 nm de tamaño de poro. Además, se observó que los tiempos de grabado más cortos de 2 minutos no son suficientes para completar la eliminación de los microdominios de PMMA. El efecto del campo externo también fue utilizado en un intento de alinear microdominios de los blocopolímeros siguiendo varios informes de Thurn-Albrecht et al. [8, 32], que afirman que un campo eléctrico podría orientar películas de hasta 1μm de espesor.

El cocido del diblock-copolímero se llevó a cabo durante 14 horas a 165 º C, por encima de la temperatura de transición vítrea de los dos componentes (105 º C para el PS y 115 º C durante PMMA) bajo la aplicación de un campo eléctrico [32].

Figura 3. Análisis del efecto de la interacción de la superficie de silicio nativo y obleas de silicio con recubrimiento de oro, en películas delgadas de PS-bPMMA. Imágenes de altura y fase, y de distribución del perímetro de los poros de PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kDa) 1% en THF centrifugado a 2000 rpm, 10 min exposición UV y 2 min ataque químico con ácido acético glacial. a-b) imágenes de topografía y fase en la obleas recubiertas de oro, d-e) imágenes de topografía y fase en obleas de Si nativo, y c-f) distribución de perímetros de poro sobre el oro y Si, respectivamente.

Como tal, ya que la mayoría de los informes de películas delgadas de copolímeros en bloque patrón se han desarrollan en sustratos de silicio, se investigó también la influencia de los sustratos, es decir, en obleas

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Figura 4. Análisis del efecto del tiempo de grabado usando ácido acético glacial, en películas delgadas de

El tiempo de recocido se extendió a 48 horas sin detectar cambios en la morfología y la orientación como se puede observar en la Figura 5, que presenta las imágenes topográficas y de fase posteriores a la exposición ultravioleta y la eliminación de los dominios de PMMA degradado por lavado con ácido acético.

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crementan, los voltamogramas se vuelven más sinusoidales, característica de la difusión esencialmente no lineal. Estas observaciones indican que la nanoelectrodos se comportan casi de forma independiente el uno del otro, aunque a velocidades de barrido mayor sus perfiles de difusión se superponen [14].

Figura 5. Imágenes de AFM de la orientación de películas delgadas aplicando un campo eléctrico. PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) 1% en tolueno, centrifugadas a 2000 rpm. a) Topografía y b) imágenes de fase.

Efecto del Tiempo de annealing en atmósfera de solvente.

En el proceso de solvent-annealing, la movilidad de las cadenas de copolímeros se ve reforzada por la presencia del disolvente y la reorganización del copolímero, conduciendo a la recuperación de estructuras ordenadas cilíndricas [33].

Tras la exposición a vapor saturado de cloroformo en una cámara sellada a temperatura ambiente durante diferentes períodos de tiempo, las muestras de películas delgadas de recubiertos con PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) fueron llevadas a atmósfera ambiente y secadas rápidamente.

El efecto del tiempo de recocido disolvente se presenta en la Figura 6. Después de 24 h (Figura 6), la película muestra una estructura muy desordenada con señales de separación de las microfase.

La exposición prolongada al vapor saturado de cloroformo (48 h, en la figura 6b) conduce a una estructura ordenada porosa con una relación área-perímetro de aproximadamente 6 nm y la distancia de primer vecino de 35 nm.

La ampliación de la duración del disolvente tratamiento de vapor (> 72 horas, la figura 6c, d), dio lugar a franjas y morfología laminar, de acuerdo con Xuan et al, 2004 [10].

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Figura 6. Análisis del efecto del tiempo de solvent annealing utilizando cloroformo. Altura y distribución del perímetro de los poros de PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) 1% en THF centrifugadas a 2000 rpm. a) 24 h, b) 48, c) 72, d) 92 h y e) distribución del perímetro sobre sustratos de oro.

Caracterización electroquímica de los filmes delgados de matrices de nanoelectrodos por Voltametría Cíclica En la caracterización de la profundidad de los poros por AFM, las incertidumbres en las mediciones son demasiado grandes para la conclusión definitiva de que los poros de penetrar la película por completo. Los métodos electroquímicos constituyen una forma sencilla para la caracterización de electrodos nanoporosos.

Los informes anteriores han demostrado que los nanoelectrodos presentan una dependencia scan-rate [14], como se ve en la Figura 7., los voltamogramas cíclicos fueron tomados a velocidades de barrido diferentes (Figura 7), y las intensidades de los picos se representa en función de la raíz cuadrada de la velocidad de barrido (Figura 7b). Una relación lineal entre la corriente y la raíz cuadrada de las tasas de exploración muestran que el proceso electroquímico está limitado sólo por la difusión habitual de las especies electroactivas en la proximidad del electrodo [1]. Sin embargo, a velocidades de barrido bajas, los voltamogramas de la sonda de ferricianuro de potasio redox presenta un pico de forma sigmoidea, característica de un perfil de difusión radial de la sonda redox para los dominios nano-poros, mientras que las tasas de exploración se in-

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Figura 7. Voltamogramas cíclicos a velocidades de barrido (10, 50, 100, 150, 200, 300, 400 y 500 mV / s) de Fe (CN) 63 - / Fe (CN) 64 - en sustratos de oro después de cubrir con película delgada de PS (39.8kDa)b-PMMA(17kDa). Recuadro: Relación lineal entre la intensidad de pico y la raíz cuadrada de la velocidad de exploración.

Un análisis cuantitativo de los datos de la cinética facilitó la estimación de la superficie real del oro subyacente utilizando la ecuación de Randles-Sevcik [34]:

donde: ip es la corriente máxima (A), A es el área de los electrodos (cm2), D es el coeficiente de difusión (cm2 s-1), C es la concentración (mol cm-3) y v es la velocidad de barrido (V s-1). El coeficiente de difusión del ferricianuro potásico se determinó primero utilizando un electrodo de área conocida, A. Los voltamogramas fueron adquiridos a velocidades de barrido diferentes (10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400 y 500 mV/s), y la ip resultante se graficó contra v1/2. El coeficiente de difusión se calculó a partir de la pendiente de la recta resultante como

Los datos de la figura 7 se extrajeron para estimar la superficie real en un 2.16 x 10-7 cm2, es decir, aproximadamente tres órdenes de magnitud menor que la geometría real del electrodo.

Prueba de concepto del sensor electroquímico de ADN por voltametría cíclica y espectroscopía de impedancia electroquímica.

Las películas nanoporosas de blocopolímeros sobre sustratos de oro, y la electroactividad de las sales de ferri/ferrocianuro de potasio (Fe(CN)63-/Fe(CN)64-) se probaron utilizando voltametría cíclica después de la inmovilización de las sondas de ADN tiolado, la hibridación con la secuencia complementaria y la regeneración de los electrodos, es decir, dehibridación (Esquema 2). Un ejemplo típico se presenta en la Figura 8. La intensidad de la señal es proporcional a la concentración de las moléculas que sufren oxidación/reducción, y la diferencia entre el potencial máximo está relacionado con la cinética del proceso electroquímico [1].

Figura 8. Voltamogramas cíclicos a una velocidad de barrido de 100 mV/s de la Fe (CN)63 - / Fe (CN)64 en sustratos de oro después del recubrimiento con PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kD). a) Película delgada, b) después de la inmovilización, c) después de la hibridación, d) regeneración (dehibridización) y e) segunda hibridación.

Tras la inmovilización, la corriente máxima medida aumentó considerablemente de 1,15 nA para la matriz de electrodos desnudos hasta 4,22 nA. Tras la hibridación, la corriente aumentó, además, a 5,38 nA y disminuyó a 5,26 nA después de la hibridación. Este comportamiento es muy diferente de los senso-

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res de ADN electroquímico preparados sobre electrodos de oro puro, donde por lo general, el ADN monocapa forma corrientes de pico que disminuyen debido a la obstrucción parcial de los sitios de los electrodos activos. Sin embargo, en la hibridación, la corriente puede aumentar [36] o disminuir [37] dependiendo de la configuración de los electrodos y monocapas inmovilizadas. En todos los casos, tras la re-generación, la señal del sensor se volvió a la registrada antes de la hibridación. A raíz de los resultados reportados por los grupos de investigación de Gooding et al. y Barton et al., se puede sugerir que a la inmovilización y la hibridación o la transducción de carga a través del ADN ocurrido o que de iones de puertas abiertas [37, 38]. Las gráficas de EIS después de cada derivatización etapas brindan una visión más clara de los resultados obtenidos [21]. Como se indica en los diagramas de Nyquist en la Figura 9, la impedancia total del sistema en gran medida el aumento de 3.200Ω a más de 12.000Ω en la inmovilización siguiente.

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zado podría haber removido de la superficie.

Sin embargo, después de una segunda hibridación, la impedancia aumentó hasta un valor similar a la medida después de la primera hibridación, es decir, un aumento de la impedancia de aproximadamente 6 veces, lo que confirma la presencia de sondas de ADN inmovilizado y la funcionalidad del sensor.

La inmovilización del ADN y los eventos hibridación aumentan la carga global negativa de la superficie del electrodo debido a las cargas negativas presentes en el esqueleto de fosfato del ADN, y limitan aún más la difusión del ferricianuro con carga negativa a la superficie del electrodo, lo que resulta en un aumento de la impedancia. La impedancia inicialmente alta después de la inmovilización por tanto, podría atribuirse a la interacción no específica del ADN tiolada con los patrones de poliestireno, la mayoría de los cuales se lavó después de la hibridación y la regeneración con hidróxido de sodio [21].

La inmovilización de la sonda de ADN tiolada en la superficie de oro con una densidad óptima, el radio y el espaciamiento óptimo para la hibridación eventual son técnicas claves para mejorar la eficiencia de detección de ADN. Todos estos parámetros se puede mejorar mediante el desarrollo de una plataforma porosos bien ordenada que permita una inmovilización tiolada ADN fácil y bien orientada.

5. CONCLUSIONES

Figura 9. a) Resultados de impedancia electroquímica sobre sustratos de oro después del recubrimiento con película delgada PS(39.8kDa)-b-PMMA(17kDa). b) Después de la inmovilización, c) después de la hibridación, d) regeneración (dehibridización) y e) segunda hibridación.

Sin embargo, en la hibridación la resistencia a la transferencia de carga disminuye a aproximadamente 20.000Ω. Después de la hibridación, la resistencia a la transferencia de carga casi volvió a su valor inicial, aunque se observa la contribución de un componente capacitivo. A partir de estos resultados existe cierta preocupación de que el ADN inmovili60

En conclusión, hemos analizado la calidad de auto-ensamblado de las películas delgadas de blocopolímero, se caracterizó la uniformidad y el grado de orden mediante microscopía de fuerza atómica, y se extrajo información sobre la distribución de los poros y el parámetro de distancia poro a poro (distancia al primer vecino) . Hemos demostrado maneras convenientes de ordenar películas de blocopolímeros, cambiando las condiciones de elaboración y el uso de diferentes enfoques, tales como thermal annealing, campos eléctricos y solvent annealing. Otros enfoques de proceso también fueron considerados, tales

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como recubrimiento por inmersión, pero el mejor resultado se logra mediante spin-coating.

Los experimentos se realizaron usando dos solventes diferentes, tolueno y tetrahidrofurano, y se encontró un incremento ligero en el ordenamiento usando el primer solvente, debido a una mayor reactividad del solvente en la formación de los puentes de hidrógeno.

Las mejores ordenadas basadas en películas delgadas de blocopolímeros se lograron usando solvent y thermal annealing, mientras que el espesor de las películas pudo ser controlado variando la velocidad de centrifugación. Mostramos que usando solvent annealing se puede conseguir microdominios cilíndricos porosos, ordenados y orientados en las películas, y que su morfología se mantiene estable después del annealing.

Además, la caracterización de las superficies por espectroscopía de impedancia y voltametría cíclica mostraron que, el ADN tiolado puede ser inmovilizado en oro desnudo dentro de los poros y el sensor de ADN resultante puede usarse para detectar la unión del ADN complementario mediante la medición de los cambios en la impedancia. Estos resultados prometedores de la funcionalización inicial, indican el potencial de las matrices de nanoelectrodos porosos para la detección de ADN. Sin embargo, se requieren trabajos adicionales para controlar el tamaño de los poros y su distribución como requisitos cruciales para estudiar de forma fiable y mejorar el rendimiento del sensor, en parámetros como selectividad, sensibilidad, límite de detección y la reproducibilidad.

AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue llevado a cabo con la ayuda financiera del Séptimo Programa Marco de la Comisión Europea (FP7/2007-2013) bajo el acuerdo FP7-IEF-221198.

Por otra parte, agradezco a la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia Tecnología e Innovación (SENESCYT), por la beca otorgada para realizar los estudios de Máster en Nanociencia y Nanotecnología en la Universidad Rovira y Virgili, Tarragona, España.

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II. Resumen de proyectos

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“ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PATÓGENO-PATÓGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO (VASCONCELLEA HELBORNII VAR. PENTAGONA)” Resumen La investigación propone estudiar las bases genéticas de la interacción patógeno – patógeno entre Fusarium oxysporum spp. y Phytophthora sp., en la enfermedad del marchitamiento vascular en el Babaco, estas interacciones será el objetivo general de este proyecto. Para caracterizar la interac-ción patógeno - patógeno durante la infección del material vegetal, haremos uso de técnicas de se-cuenciación de nueva generación; ambas cepas colonizadoras del Babaco serán secuenciadas. Subsecuentemente se llevará a cabo un análisis comparativo de las secuencias obtenidas respecto a genomas de especies relacionadas con Phytophthora sp y Fusarium oxysporum spp., lo que reve-lará determinantes genéticos únicos de las cepas secuenciadas. Estos factores genéticos distintivos son candidatos a participar en interacciones específicas del tipo patógeno - patógeno. Adicional-mente se estudiará el transcriptoma de ambas especies de forma aislada o en comunidad. Tal estu-dio de expresión génica mostrará genes que son activados o reprimidos durante la interacción pató-geno - patógeno. Toda esta información en su conjunto facilitará determinar cuáles son las caracte-rísticas genéticas que un agente usado en el biocontrol de la enfermedad de la marchitez radicular en Babaco debe tener para que sea efectivo y por tanto propiciará su identificación de forma racio-nal. ____________________________________________________________________________

“PRODUCCIÓN DE UN BIOINOCULANTE EFICIENTE PARA EL CULTIVO DE LEGUMI-NOSAS: MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE CEPAS NATIVAS DE MICROORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS” Resumen El presente trabajo se llevara a cabo con el objetivo de caracterizar e identificar genéticamente bac-terias diazotróficas las mismas que serán aisladas de 8 zonas de muestreos en la provincia de Loja, así como determinar el efecto de estos aislados sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de nitrógeno en leguminosas de importancia agronómica, El análisis morfológico se basara en determinar las diferencias de las colonias obtenidas del aislamiento, donde se evaluara la tinción al Gram, tipo de crecimiento, color, producción de mucus, bordes y elevación. La identificación gené-tica de los aislados resultantes de la caracterización morfológica se realizara mediante la secuencia-ción total de los genes de la región 16S ARNr en estrecha colaboración con las Universidades de Gent y Lovaina de Bélgica. El análisis fenotípico de los aislados se llevará a cabo en condiciones controladas y de campo, evaluándose los parámetros de nodulación, morfológicos, fisiológicos y la fijación de nitrógeno en leguminosas como frejol, soya, maní, arveja y haba. Los resultados obteni-dos de estas evaluaciones y determinados los mejores aislados cepas-genotipos, de estos se obten-drán bioinoculantes comerciales eficientes para el cultivo de leguminosas, para el efecto se seguirán protocolos establecidos según estándares internacionales de fabricación.

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MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIÓN LYCOPERSICON Resumen La hortaliza más difundida en todo el mundo y la de mayor valor económico es el tomate riñón (So-lanum lycopersicum). Esta situación ha despertado desde hace mas de una década, enorme interés en científicos de todo el planeta. La genética molecular ha tenido un impacto significativo en la esti-mación de su diversidad genética, en la determinación de la filogenie existente entre las diferentes especies silvestres de la sección Lycopersicon, así como en la generación de marcadores molecula-res que han asistido a los genetistas, en la mejora genética de los cultivos comerciales. Ha sido ge-nerada para su estudio, abundante información para muchos de los marcadores de ADNc mapea-dos, los cuales han sido integrados dentro de un extenso consensus en el Tomatoe Gene Index en el Insitute for Genomic Research, se ha realizado el mapeo de marcadores de ADNc, pruebas multi-locus para determinar los efectos de la subdivisión de especies estrechamente emparentadas, se han diseñado primers específicos basados en datos publicados sobre ADNc o secuencias de ADN genómico, los productos amplificados han sido secuenciados y las nuevas secuencias generadas depositadas en la base de datos del Gene Bank, de manera que al momento la comunidad científica cuenta con basta información sobre el genoma, así como con el grado de filiación de las diferentes especies silvestres relacionadas genéticamente pertenecientes a la sección Lycopersicon. ____________________________________________________________________________

“AMPLIACIÓN Y ESPECIALIZACIÓN DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA, PRIORIZANDO LE-GUMINOSAS DE LA ZONA 7 DEL ECUADOR”.

Resumen El presente proyecto está relacionado a la ampliación del banco de germoplasma actual del Centro de Biotecnología, priorizando leguminosas de la zona 7 del ecuador. El proyecto básicamente con-siste en el rescate de accesiones de leguminosas del banco actual, con el fin de conformar un banco especializado de leguminosas que almacene colecciones de semillas, como; las que se puedan res-catar y otras que se colectaran. Para el cumplimiento de lo expuesto nos hemos planteados los si-guientes objetivos. Garantizar la sobrevivencia del Recurso Genético de Leguminosas de la Zona 7 del Ecuador, con miras a desarrollar investigación en la Universidad Nacional de Loja; Establecer un Banco de Germoplasma de Leguminosas para la Universidad Nacional de Loja; Conservar el Recur-so Fitogenético de la Zona 7 del Ecuador; Evaluar el germoplasma e instaurar una base de datos digital. Las actividades a desarrollarse en el trascurso del proyecto están relacionadas con; pruebas de viabilidad del material germoplasmico actual, implementación de protocolos para el tratamiento adecuado de las semillas, adquisición de equipos, instrumental y recipientes para una adecuada conservación, evaluación agro morfológica del material obtenido a través de la siembra e instaura-ción de una base de datos digital – software que almacene toda información obtenida. El proyecto como tal tiene una duración de 36 meses y el monto requerido es de 126672.10 Dólares America-nos.

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“DESARROLLO DE BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS “LABEL-FREE” MEDIANTE EL USO DE MATERIALES NANOESTRUCTURADOS PARA LA DETECCIÓN TEMPRANA Y RÁPIDA DE CÁNCER” Resumen El proyecto de investigación propuesto tiene como objetivo el estudio y desarrollo de nuevas superficies nanoestructuradas para la fabricación de biosensores electroquímicos de ADN. Biosensores de ADN utilizan ampliamente las herramientas de diagnóstico en el campo de la genómica y perfiles de expresión, a menudo organizados en el formato de microarrays para permitir el análisis en paralelo. La capacidad para detectar una sola muestra de una multitud de parámetros genéticos al mismo tiempo ha permitido a los investigadores lograr avances considerables en la comprensión de enfermedades como las enferme-dades mentales, enfermedades del corazón, enfermedades infecciosas y el cáncer con el objetivo de adaptar el tratamiento necesario de forma adecuada. Para la consecución de este objetivo es clave el estudio de la química de la superficie nanoestructurada necesaria para la realización exitosa de este dispositivo, con el fin de lograr el aumento de la sensibilidad y límites de detección más bajos de los bio-sensores. Este proyecto contribuirá al desarrollo de microarrays electroquímicos de ADN. El proyecto es multidisciplinario y aborda los campos del auto-ensamblaje molecular y el reconocimiento molecular en superficies, la biología molecular, el diseño de instrumentos y técnicas de microfabricación. La metodolo-gía de la investigación se centrará en la preparación de las superficies de los electrodos nanoestructura-dos. Se investigarán metodologías para la fabricación de monocapas de superficies nanoporosas, bus-cando optimizar el tamaño y el grosor de los poros de las superficies poliméricas. Las superficies prepa-radas serán funcionalizada con sondas de ADN cancerígeno y se monitoreará los eventos de inmoviliza-ción e hibridación con el ADN complementario. Por último, a fin de evaluar los dispositivos preparados se usarán técnicas como la microscopía de fuerza atómica, la voltametría y espectroscopia de impedancia electroquímica rutinariamente para confirmar la funcionalización eficiente y el funcionamiento del disposi-tivo. ____________________________________________________________________________

PRODUCCIÓN DE BACTERINAS INACTIVADAS PARA PREVENIR LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS DE ORIGEN BACTERIANO EN COBAYOS (Cavia porcellus) DE LA PROVINCIA DE LOJA. RESUMEN Actualmente uno de los mecanismos de prevención que se está empleando es el uso de bacterinas (pro-ducto biológico que se obtiene a partir de exudados o productos del animal enfermo, el cual es procesa-do, para posteriormente inocularlo y estimular al sistema inmunológico, provocando una respuesta espe-cífica), con la finalidad de generar inmunología (anticuerpos) frente a los agentes patógenos, y con ello evitar el uso de productos antimicrobianos, que se expresaría en el abaratamiento de los costos de pro-ducción y por último y no por ello menos importante, como una medida de prevención del posible impacto que dichos medicamentos pueden producir en el medio ambiente. Cabe destacar que en el mercado nacional no se encuentran bacterinas para esta especie, ni para prevenir, en particular, los problemas respiratorios, principal causa de la alta morbi-mortalidad de los cobayos, razones por las cuales el Cen-tro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja, se ve en la necesidad de implementar un labora-torio para producir bacterinas y ofertar a los productores para la prevención de problemas de salud de sus animales, que les causa serios daños económicos.

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III. Informativo

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ACTIVIDADES Y EVENTOS REALIZADOS EN EL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA

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nebuliza-ción para el invernadero del Centro de Biotecnología y la compra de 2 bombas de mochila para fumigación.

• Seminario interno de análisis de los proyectos en formulación, con miras a recoger los criterios del grupo de investigadores del centro de biotecnología.

• Presentación de los proyectos para análisis, ante los profesores y estudiantes del Área Agrope-cuaria y de Recursos Naturales Renovables, 18 de mayo de 2011 en el Aula Magna de la Ca-rrera de Medio Ambiente.

• Socialización de los proyectos con investigadores del Centro Biotecnología en el aula de proyecciones, 05 de octubre de 2011.

• Gestión ante la Cooperación Belga en el marco del programa VLIR- UOS para aprobación del proyecto “Estudio de las interacciones patógeno-patógeno, que se establecen durante el desarrollo de la enfermedad de la marchitez vascular en el babaco (vasconcellea helbor-nii var. pentagona)”, con asistencia directa del Dr. Aminael Sánchez Rodríguez, Ph. D. a eje-cutarse en coordinación con el Centro de Genética de Plantas y Microorganismos de la Univer-sidad Católica de Lovaina y el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja. El proyecto se encuentra aprobado.

• Reparación e instalación de dos cámaras frigoríficas para conservación de material fitogenético.

• Creación de una base de datos del banco de germoplasma, que recopila información de las ac-cesiones; año de ingreso, código de banco, número de estante, número de frasco, nombre co-mún, nombre científico, país, provincia, cantón y localidad.

•

• Desarrollo de la tesis titulada “Repotenciación de cámaras frigoríficas para el centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja”.

• Readecuación de los espacios logísticos del Banco de Germoplasma como: cambio de cubierta, puntos de luz, toma de agua, reservorios, implementación de un sistema de riego por 68

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• Creación del laboratorio de Microbiología y Bioinoculantes, adquisición de equipos, materiales y reactivos.

Tutotia de Dr. Rómulo Chávez Valdivieso Ph. D. a: - “Identificación de las patologías de los órganos genitales de las vacas faenadas en el camal fri-gorífico de Loja, CAFRILOSA” - “Estudio de la eficacia de protocolos en la sincronización del celo de cabras del bosque seco tropical de la provincia de Loja, a base de la combinación de progestágenos con estradiol y en asociación con gonadotropina corionica” Tutoria de Ing. Iván Granda Mg. Sc., a: - Identificación y caracterización de cepas nativas de Rhizobium: sobre genotipos de frejol común (Phaseolus vulgaris), en diferentes condiciones agroecológicas de la provincia de Loja.

• Realización del curso: “Biología Molecular para la Identificación de Microorganismos y Análisis Computacional de Información Genética” los días 20-29 de julio de 2011, dictado por los profesores: Dr. Aminael Sánchez, Ph.D., y, Dr. Roldan Torres, Ph.D., de Bélgica y Cuba respectivamente.

• Formulación de la propuesta y preparación de la documentación soporte para el desarrollo de la “Maestría en Ciencias en Biotecnología Genómica”, que se pretende ejecutar con el apoyo del Instituto Nacional Politécnico de México, - IPN, Centro de Biotecnología Genómica de Rey-nosa, México.

• Elaboración de la Programación Institucional, a nivel de proyecto: POA 2012; PAC 2012.

• Defensa y sustentación de los proyectos ante la Comisión de Investigación de la Universidad Nacional de Loja, lográndose su aprobación e inclusión en el Presupuesto General de Investigación de la Universidad Nacional de Loja.. ____________________________________________________________________________

CURSOS Y EVENTOS EN LOS QUE HA PARTICIPADO EL PERSONAL DEL CENTRO • Apoyo en la formulación de tesis de pregrado y dirección de proyectos de investigación de tesis, por el personal del centro de biotecnología: Tutoria de Ing. Natalia Morales Mg. Sc. a: - “Caracterización morfológica y molecular de 100 accesiones de ají (Capsicum baccatum) del banco de germoplasma del Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja”.

- “Caracterización molecular de la resistencia del tomate a Fusarium oxysporum”

• Curso Teórico-Práctico “Fundamentos de la PCR en Tiempo Real y Aplicaciones en Biología Molecular”. 06-07 de abril del 2011. Pontificia Universidad Católica del Ecuador. Quito.

• Seminario – Taller “Lectura, Escritura y Comunicación de la Ciencia”. 30 de mayo al 03 de junio de 2011. UNL. Loja.

• Taller “Diseño y Elaboración de Proyectos de Investigación Científica”. 11-15 de julio del 2011.

UNL. Loja.

• Curso Teórico-Práctico “Uso y Aplicaciones de Marcadores Moleculares en Biotecnología

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Agrí-cola”, 14 al 18 de noviembre de 2011. INIAP. Estación Experimental Pichilingue, Quevedo.

• “VIII Simposio Internacional de Recursos Genéticos de América Latina y el Caribe”. 21 al 23 de noviembre de 2011. Quito.

• Taller “Bioseguridad y Desechos Infecciosos”. 25-26 de noviembre del 2011. MSP. Loja. ____________________________________________________________________________

APOYO A LA FORMACION EN CALIDAD DE DOCENTES: • Ing. María Natalia Morales Palacio, Mg.Sc., en las Carreras de: Ingeniera Agronómica; y, Manejo y Conservación del Medio Ambiente • Dr. Rómulo Chávez Valdivieso, Ph.D., en la Carrera de Medicina Veteriana y Zootecnia.

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GRUPO DE INVESTIGADORES DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA 2011 - 2012 Dr. Rómulo Chávez Valdivieso, Ph.D. E-mail: rchaval.24@gmail.com Ing. María Natalia Morales Palacio Mg.Sc. E-Mail: nataliamorales88@yahoo.es Ing. Iván Patricio Burneo Saavedra Mg.Sc. E-mail: ivanburneo@gmail.com Ing. Klever Iván Granda Mora Mg. Sc. E-mail: ivang100@gmail.com Ing. Angel Rolando Robles Carriòn Mg. Sc E-mail: aroblescarriòn@gmail.com Ing. Aníbal Homero Ruiz Sánchez E-mail: anibalruiz1@hotmail.es Ing. Marlon Oswaldo Pineda Escobar E-mail: mao_os11@yahoo.es Blgo. Omar Santiago Erazo Sotomayor E-mail: santiagoe07@hotmail.com Med. Vet. Vanessa Herrera Yunga E-mail: vanpa_06@hotmail.com

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