dallo specchio cambiano angolo ed arrivano al fotodiodo che produce il segnale corrispondente al picco cromatografico.
E' un rivelatore molto versatile con una buona sensibilità ma non è adatto lavorando in gradiente di eluizione; è inoltre sensibile a variazioni di temperatura e di pressione. 4.
Rivelatore conduttimetrico: la misura della conducibilità del liquido uscente dalla colonna permette di rivelare l'eluizione di sostanze ioniche o di specie con polarità nettamente diversa da quella del solvente (per es. gli amminoacidi). E' un rivelatore sensibile alla temperatura che non consente di lavorare in gradiente di eluizione; ha una buona sensibilità, fino a 10-8 g/ml
5.6.7 - La fase fissa Il riempimento di una colonna per HPLC può essere di due tipi: a) pellicolare: si tratta di granuli di circa 50m con porosità limitata alla zona superficiale, in modo da rendere più rapidi gli scambi di materia tra le due fasi; si realizzano in tal modo delle superfici specifiche di circa 50 m2/g di solido b) poroso: si tratta di granuli di 5-10 m con porosità estesa a tutto il granulo; in tal caso la superficie specifica arriva a circa 500 m2/g di solido e quindi migliora nettamente l'efficienza della colonna; è oggi il riempimento più usato. I solidi impiegati in HPLC hanno diversa natura chimica in relazione al tipo di cromatografia da realizzare: 1. Adsorbimento: si usa gel di silice o allumina che, essendo polari, trattengono per tempi maggiori gli analiti maggiormente polari 2. Ripartizione: si utilizzano liquidi ad alto peso molecolare immobilizzati su un solido inerte, generalmente silice; per evitare il trasporto del liquido di ripartizione spesso si lega chimicamente lo stesso al solido: in questo caso si parla di fasi legate
5.6.8 - La fase mobile L'eluente (o solvente) deve trascinare i diversi componenti lungo la colonna, dove si separano per effetto della competizione tra le due fasi, mobile e stazionaria. L'eluente deve possedere particolari caratteristiche: - deve avere un adeguato potere solvente nei confronti degli analiti - deve avere un'elevata purezza poiché spesso si analizzano sostanze in tracce - deve essere compatibile col rivelatore (per es. non deve dare massimi di assorbimento in UV utilizzando un rivelatore spettrofotometrico). Di solito viene utilizzata una miscela binaria di eluenti, uno ad alta polarità, l'altro a bassa polarità: in tal modo, la % dei due eluenti determina la polarità complessiva del solvente; per esempio una miscela molto usata è quella acqua-metanolo. Normalmente l'HPLC utilizza una fase stazionaria polare ed una fase mobile tendenzialmente apolare (cromatografia normale o NPC): gli analiti maggiormente polari vengono trattenuti maggiormente e quindi presentano maggiori tempi di eluizione. Si può anche realizzare una situazione opposta, con una fase stazionaria apolare ed una fase mobile polare, con polarità variabile a seconda della sua composizione (cromatografia in fase inversa o RPC): in questo caso l'ordine di eluizione è opposto. L'eluizione in HPLC può essere realizzata in due modi diversi: 1. Separazione isocratica: la composizione dell'eluente rimane costante per tutto lo sviluppo del cromatogramma
ITIS “G.C.FACCIO” - Dipartimento di Chimica - 2010
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