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Programma Operativo Regionale 2007IT051PO007 FSE Puglia

Percorso di batteriologia


IPPOCRATE 2012

Dirigente Scolastico: Prof.ssa Giovanna Caretto D.S.G.A.: Dott. Valterluigi Carluccio Coordinatore log.co e org.vo e Responsabile piattaforma Ansas Resp. PubblicitĂ : Prof. Rollo Antonio Facilitatore: Prof. Enrico Peccarisi


Tutor scolastiche: Prof.ssa Maria Rosaria Arlotta Prof.ssa Alessandra Galizia Prof.ssa Luciana Tesorone Prof.ssa Patrizia Tommasi

Gruppo di lavoro: Valentina Pesce Barbara Irno Consalvo Roberta Iovino Francesca Erroi Katia Monteduro


Percorso di Batteriologia

Tutor d’azienda: Dott.ssa Carla Colaci


MICROBIOLOGIA  


Il batterio è un microrganismo unicellulare procariota. La cellula procariotica si distingue da quella eucariotica per: •  Assenza di una membrana nucleare •  Struttura priva di compartimenti •  Presenza di un unico filamento di DNA circolare


I batteri in base alla particolare struttura della loro parete batterica si suddividono in due gruppi: •  Gram + •  Gram -


LA COLORAZIONE DI GRAM La  colorazione  di  Gram  è  un  esame  di  laboratorio  che  perme6e  la  classificazione  dei   ba6eri  in  gram-­‐posi:vi  e  gram-­‐nega:vi  (gram+  e  gram-­‐).   Fu  messo  a  punto  dal  medico  danese  Hans  Joachim  Chris:an  Gram  (1884)  e  me6e   in  evidenza  alcune  proprietà  fondamentali  della  parete  cellulare  dei  ba6eri.   Le  fasi  della  colorazione  sono  le  seguen::   1.  Preparare  un  soKle  striscio  di  materiale   2.      Fissare  il  materiale  sul  vetrino  passando  3-­‐4  volte  il  vetrino  sulla  fiamma  di  un             becco  Bunsen   3.      Ricoprire  la  superficie  con  il  colorante  cristalviole0o  (  o  viole6o  di  genziana)  e           lasciarlo  agire  per  1  minuto   4.        Coprire  il  preparato  con  il  Lugol  (iodio  in  ioduro  di  potassio)  e  lasciare  agire  per  1   minuto.  Successivamente  risciacquare  con  acqua                                                                       5.        Lavare  la  superficie  con  il  decolorante  a  base  alcolica   6.        Lavare  con  acqua  e  ricoprire  il  vetrino  con  il  colorante  di  contrasto  fucsina  (  o   safranina)  per  1  minuto,  quindi  risciacquare   7.        Esaminare  il  preparato  al  microscopio  con  obieKvo  100x  ad  immersione  


I GRAM + al microscopio appaiono colorati in BLU SCURO perché la parete essendo più spessa ha trattenuto il primo colorante I GRAM – risultano invece colorati in ROSSO/ROSA in quanto la parete è più sottile


Un’indagine è clinicamente efficace se contribuisce a:   •  Individuare o escludere una malattia •  Aiutare il processo decisionale: valutazione sulla possibilità di iniziare la terapia o sulla necessità di eseguire ulteriori indagini •  Determinare la sensibilità del microrganismo agli antibiotici •  Valutare la prognosi •  Monitorare il decorso clinico


LE FASI DELL’ ITER DIAGNOSTICO FASE PRE-ANALITICA • Richiesta • Accettazione del campione che consiste in tamponi del distretto interessato (faringeo, vaginale, uretrale, congiuntivale...) o feci, urine, cute, liquido seminale e sangue (nel caso di sospetta batteriemia) • Associazione univoca tra il campione e il codice

assegnatogli.    


FASE ANALITICA Consiste nell’approccio diretto con il materiale. Il campione prelevato viene analizzato dapprima con un esame microscopico e poi attraverso una coltura.

L’esame microscopico può essere di due diversi tipi: •  Esame microscopico a fresco che rivela la mobilità e la morfologia del batterio. •  Esame microscopico dopo colorazione


FASE ANALITICA      I microrganismi isolati in coltura, se ritenuti patogeni, devono essere identificati e sottoposti a saggio di sensibilità agli antibiotici.

L’identificazione biochimica è basata sullo studio delle attività metaboliche del microrganismo. L’antibiogramma è un esame che permette di valutare se un batterio è sensibile o resistente ad un determinato antibiotico. Seguendo questo procedimento si può stabilire la terapia più adatta.


IDENTIFICAZIONE  Il sistema di identificazione API è stato il sistema manuale utilizzato per lungo tempo per la identificazione di batteri gram positivi, gram negativi fermentanti e non, lieviti.

Attualmente l’introduzione di terreni cromogeni, come il CPS, sono di grande aiuto per una identificazione presuntiva di molti microrganismi, per cui l’esecuzione sulla colonia batterica di pochi test biochimici è sufficiente per definire la specie batterica.


SISTEMA AUTOMATICO Il VITEK 2 è uno strumento di microbiologia che garantisce sicurezza e rapidità dei risultati dei test di identificazione dei microrganismi e dei saggi di sensibilità agli antibiotici ; è in grado di saggiare 32 antibiotici per i cocchi Gram + e 46 antibiotici per i bacilli Gram-.

Le card VITEK per l’identificazione e l’antibiogramma presentano 64 pozzetti contenenti reagenti biochimici o antibiotici. Nella card è preinserito il tubicino di trasferimento della sospensione del microrganismo e un’etichetta con codice a barre che permette il collegamento tra card e numero di riferimento del paziente.


FASE POST-ANALITICA Produzione di un referto


I terreni di coltura •  Il terreno di coltura è il mezzo NEL quale o SUL quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo. Le sue caratteristiche principali sono : -  Concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica. -  Adeguato grado di umidità. -  Reazione (pH) adatta. -  Sterilità e protezione da qualsiasi inquinamento.


In base allo STATO FISICO si distinguono: - Terreni LIQUIDI in cui i componenti sono sciolti in acqua e sterilizzati.

- Terreni SOLIDI i quali possono essere naturalmente tali o vengono solidificanti per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina..)


In base alla FUNZIONE si distinguono: -  Terreni di ARRICHIMENTO (o elettivi) : la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche. Possibili arricchimenti sono sangue lisato, emoglobina ecc necessari per la crescita di batteri “esigenti” dal punto di vista nutrizionale. -  Terreni SELETTIVI: A concentrazione nota che inibiscono o ralletano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Sono utilizzati in casi di campioni particolarmente contaminati. -  Terreni DIFFERENZIALI: Contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso.

Hektoen Enteric Agar: a destra nel terreno selettivo si ha la crescita della Klebsiella (lac più), a sinistra Salmonella (lac meno).


Fattori influenzanti la crescita: Con il termine crescita si indica generalmente l’acquisizione di biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione). A seconda dei fattori della crescita dei batteri essi si definiscono OBBLIGATI se una condizione è necessaria per la crescita batterica e FACOLTATIVI se il microrganismo può crescere in quella condizione sebbene non necessaria (ad esempio un termofilo facoltativo può crescere ad alte temperature ma anche a temperature più basse). Fattori influenzanti sono la TEMPERATURA, pH e OSSIGENO. Nel primo caso la maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20°C, poi si suddividono in:   Psicrofili 0-20 °C   Mesofili 10-50°C   Termofili 40-75°C   Ipertermofili 70-110 °C


In base al pH:   Acidofili : crescono al di sotto di pH 6 come funghi e lieviti   Neutrofili crescono in un intervallo di pH tra 6-8 come nel caso della maggior parte dei batteri   Alcalofili crescono a pH >8


In base all’ossigeno : Batteri AEROBI OBBLIGATI Vivono solo in presenza di O2 Batteri AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI Vivono in presenza/assenza di O2 Batteri ANAEROBI OBBLIGATI Vivono in assenza di O2 Batteri MICROAEROFILI Vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%) 1: I batteri aerobi obbligati si sviluppano in suferficie, in modo da assorbire la maggior quantità possibile di ossigeno. 2: I batteri anaerobi obbligati si raccolgono sul fondo, per evitare l'ossigeno. 3: I batteri aerobi-anaerobi facoltativi possono crescere sia in presenza che in assenza di ossigeno,per cui si distribuiscono nel terreno di coltura,concentrandosi in maggiore quantità in prossimità della superficie (aerobi facolt.) o sul fondo (anerobi facolt.) . 4: I microaerofili si raccolgono nella parte superiore della provetta, ma non in testa; essi richiedono infatti ossigeno a bassa concentrazione. 5: Il metabolismo dei batteri aerotolleranti non è influenzato dalla presenza di ossigeno


Terreni di coltura e tecniche di semina.. L’allestimento delle colture microbiche comporta il trasferimento dei microorganismi in esame negli opportuni mezzi di crescita. La scelta della tecnica di semina è determinata dalle condizioni in cui si presenta il campione e dallo scopo per cui vengono predisposte. Le più comuni tecniche di semina sono:

-  Semina per striscio. -  Tecnica per infissione. -  Tecnica becco di clarino.


SEMINA PER STRISCIO

SEMINA  PER  STRISCIO  

Si utilizzano piastre contenenti terreno già solidificato. Il prelievo dell’inoculo viene effettuato con un’ansa. Prima di effettuare il prelievo l’ansa va sterilizzata alla fiamma di un bunsen e fatta raffreddare per non rischiare di uccidere i microrganismi dell’inoculo. La semina viene eseguita strisciando delicatamente con movimenti a zig-zag l’ansa sul terreno della piastra.


TECNICA PER INFISSIONE  

Avviene mediante un ago ed è utilizzata per inoculare nei terreni già solidificati in provetta. L’ago consente di inserire le cellule batteriche lungo una linea verticale, in profondità e quindi permette lo sviluppo dei batteri anaerobi e favorisce l’osservazione delle forme mobili che manifestano una crescita diffusa a partire dalla linea dell’inoculo.

TECNICA A BECCO DI CLARINO  

Si lascia la provetta contenente il terreno in posizione orizzontale e si fa raffreddare. Si semina il campione per striscio con un' ansa sulla superficie del terreno nella provetta.


COPROLOGIA            La  coprologia  è  un  se6ore  della  microbiologia  che  si   occupa  dell’esame  delle  feci.  Una  delle  metodologie   più  comunemente  u:lizzate  è  l’esame  chimico-­‐fisico   che  in  una  prima  fase  consiste  nello  studio  di:      Consistenza  (poltacea,  formata  e  liquida)    Colore  (nocciola,  marrone,  verdastro  ed  ocraceo)    Odore  (fermentazione,  putrefazione)    Presenza  di  muco    Analisi  del  pH              In  una  seconda  fase  si  procede  alla  ricerca  del  sangue   occulto  e  all’esame  parassitologico.  


Consiste  nella  ricerca  di  tracce  di   sangue  umano  nelle  feci:   rappresenta  uno  dei  marker  più   significa:vi  per  le  patologie   infiammatorie  e  neoplas:che   dell’intes:no.  L’esame  è  effe6uato   tramite  un  test  rapido   immunocromatografico  che  si  basa   sull’interazione  tra  an:corpi   monoclonali  ed  emoglobina   umana  (per  escludere  la  presenza   di  sangue  proveniente  da  carne   animale  ingerita).    


È  finalizzato  alla  ricerca  di  parassi:   a6raverso  l’osservazione  microscopica  “a   fresco”  di  un  campione  di  feci  che   inizialmente  viene  filtrato  e  mescolato   con  della  fisiologica  e  successivamente   viene  centrifugato.  Al  microscopio  è   possibile  osservare  diversi  parassi:  come   la  giardia,  le  amebe,  la  tenia,  le  uova  di   ossiuri.    


Malaria  

       Un  caso  di  malaria  è:     Importato  se  l’infezione  è  stata  contra6a  al  di  fuori  della  zona   in  cui  viene  diagnos:cato;     Autoctono  se  l’infezione  è  stata  contra6a  localmente                                                                                                                            

       Gli  agen:  eziologici  della  malaria  sono  protozoi  appartenen:   al  genere  Plasmodium.  Se  ne  conoscono  più  di  cento  specie   di  cui  qua6ro  interessano  l’uomo:   •  Plasmodium  falciparum                                                               •  Plasmodium  vivax                                                                                                           •  Plasmodium  ovale   •  Plasmodium  malariae  


I  plasmodi  si  mol8plicano  per  schizogonia  nelle  cellule  del  parenchima   epa8co  (ciclo  pre–eritrocitario)  e  poi  nei  globuli  rossi  (ciclo  eritrocitario);   qui  si  formano  anche  i  gametoci8  che  vengono  ingeri8  dall’inseJo   veJore.  Nello  stomaco  della  zanzara  i  gametoci8  maturano  a  game8  e  si   accoppiano  a  dare  uno  zigote  mobile  (oocinete).  Segue  la  formazione  di   una  oocis8  con  numerosi  sporozoi8  (ciclo  sporogonico)  che  raggiungono   le  ghiandole  salivari  e  da  qui  vengono  inieJa8  all’uomo.      


Plasmodium  falciparum           È   la   specie   più   comune   nelle   zone   tropicali   e   subtropicali,   occasionalmente   zone   temperate.   Questo  :po  di  plasmodium  è  l’agente  eziologico  della   terzana  maligna,  cosidde6a  perché  può  essere  letale.   Il  ciclo  schizogonico  ema:co  si  completa  in  48  ore  e  gli   accessi  febbrili  si  ripetono  ogni  terzo  giorno.    


Ha  la  stessa   distribuzione  di  P.   falciparum  ma  è  molto   meno  frequente;  è   responsabile,  infaO,  di   circa  il  5%  dei  casi  di   malaria  nel  mondo.   Esso  è  l’agente   eziologico  della   malaria  cosiddeJa   “quartana”,  perché   durante  gli  aJacchi   l’accesso  febbrile  si   verifica  ogni  72  ore.    


È  la  specie  più  diffusa  nelle  zone  temperate   ed  è  l’agente  eziologico    della  “terzana   benigna”,  responsabile  di  circa  il  40%  dei   casi  di  malaria  nel  mondo.  È  praticamente   assente  in  Africa  occidentale,  le  sue  infezioni   sono  caratterizzate  da  frequenti  ricadute;  la   malattia  è  raramente  letale.  

È  presente  in  Africa  tropicale  e   occasionalmente  nell’Oceano  Indiano  e  nel   Pacifico  occidentale  (Papua  e  Nuova   Guinea).  La  malattia  che  provoca  è  simile  a   quella  da  P.  vivax  ,  ma  più  benigna.  È   responsabile  di  una  bassa  percentuale  di   casi  di  malaria  nel  mondo  


La  diagnosi  clinica  della  malaria  deve  essere  seguita  dalla   conferma      diagnos:ca  con  test  di  laboratorio.  Le  tecniche   diagnos:che  per  la  malaria  possono  essere  riunite  in:              metodi  dire8    diagnosi  microscopica  di  prepara:  ema:ci  colora:  con   Giemsa  o  con  fluorocromi    test  immunocromatografici    test  molecolari              metodi  indire8    test  immunologici                            Il  prelievo  deve  essere  fa6o  prima  che  il  paziente  inizi  la   terapia  e  tenendo  presente  che  i  parassi:  sono  più  numerosi   nel  sangue  qualche  ora  dopo  l’inizio  dell’accesso  febbrile.  Per   ogni  individuo  si  deve  alles:re  almeno  una  goccia  spessa  per   la  ricerca  del  parassita  e  uno  striscio  soKle  per   l’iden:ficazione  della  specie.        


L’inizio dell’era degli antibiotici

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La storia degli antibiotici comincia nel 1929 quando Fleming, studiando varianti dello stafilococco, osservò che una muffa che contaminava una delle sue colture aveva inibito intorno a sé la crescita del batterio. Inoltre, Fleming poté osservare che il brodo di coltura in cui erano cresciuti i funghi possedeva un potente effetto inibitorio nei confronti di molti altri microrganismi. Poiché la muffa apparteneva al genere Penicillum, Fleming chiamò questa sostanza antibatterica penicillina. Iniziava così l’era degli antibiotici il cui significato è letteralmente «contro la vita». Il termine nell'uso comune attuale indica un farmaco, di origine naturale (antibiotico in senso stretto) o di sintesi (chemioterapico),in grado di rallentare o fermare la proliferazione dei batteri. La loro caratteristica principale è la tossicità selettiva che gli permette di non agire sulle cellule eucariotiche (a differenza dei disinfettanti.) L'antibiogramma (spesso indicato come ABG) è un esame in vitro che permette di valutare se un batterio è sensibile ad un determinato antibiotico.


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inibizione della sintesi della parete cellulare (penicilline e cefalosporine) alterazione delle membrane cellulari (polimixine) inibizione della sintesi proteica (cloramfenicolo, eritromicina e tetracicline) inibizione della sintesi degli acidi nucleici (actinomicina, mitomicine e acido nalidixico) attività anti-metabolica o antagonismo competitivo (sulfamidici)


Resistenza antibiotica Naturale: si tratta di una resistenza naturale all’azione antibiotica, immutabile nel tempo, geneticamente determinata: es. resistenza di Klebsiella sp. ad ampicillina

Acquisita: Si tratta di una

variazione informazionale e può essere cromosomica o endogena (quando il DNA batterico va incontro a mutazione) o extracromosomica (quando c’è trasferimento di materiale genetico da un microrganismo all’altro).


Saggio di sensibilità agli antibiotici. Si possono utilizzare diverse tecniche di saggio di sensibilità agli antibiotici: - Antibiogramma secondo Kirby-Bauer -  Antibiogramma con il metodo delle diluizioni per la valutazione delle MIC (sistema automatico, E test)


MIC e MBC Il metodo più corretto per determinare l’efficacia di un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico, la concentrazione minima inibente (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC). -  MIC (Minimal Inhibitory Concentration ): la concentrazione minima di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica. -  MBC (Minimal Bactericidal Concentration): la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere i batteri.  


Subito dopo l’inoculo si depongono sulla superficie della piastra una serie di dischetti di carta assorbente sterili imbevuti di adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare.  • Si pongono le piastre in incubatore a 37°C per 18-24 ore. • Si misura il diametro degli aloni di inibizione per ogni antibiotico.


Interpretazione dei risultati. L’interpretazione del saggio di sensibilità agli antibiotici permette di classificare il microrganismo come: - "sensibile" (l'antibiotico risulta efficace ai dosaggi comunemente raccomandati). - "intermedio“ (la crescita batterica è inibita solo al dosaggio massimo raccomandato). - "resistente" (l'antibiotico non ha effetto nei confronti del microrganismo).



Percorso di battereologia