BiOMédicas
nanovacunas) decidimos inyectar 10,000 partículas de poliedra conteniendo a la proteína verde fluorescente (GFP) como reportero. Gracias a que la proteína verde fluorescente genera luz color verde (alrededor de los 500 nm) al ser excitada con luz ultravioleta (alrededor de los 400 nm), esto nos permite visualizar las partículas de poliedra dentro de animales vivos, por esto definimos a la GFP como un gen reportero. La figura 4 muestra ejemplos de la fluorescencia obtenida en animales vivos, posterior a la inyección en el musculo extensor de la pata trasera de ratas con 10,000 poliedras conteniendo a la GFP. La duración de la fluorescencia se siguió in vivo mediante un equipo de fluorescencia de Kodak. Dicho equipo permite seguir la fluorescencia de GFP en un animal anestesiado sin necesidad de sacrificarlo o alguna otra manipulación. Con este sistema pudimos seguir la fluorescencia de las poliedras con GFP por varias semanas en el mismo animal y medir, de esta forma, los tiempos de absorción
(eliminación de fluorescencia) de las poliedras recombinantes (recombinantes por llevar en su interior a la GFP). Sorprendentemente encontramos que la duración de la fluorescencia de GFP (lo cual indica el tiempo de vida media de la GFP dentro de la poliedra) dependía de dos parámetros: del fragmento utilizado como señal de incorporación dentro del cristal y de la forma de la poliedra (poliédrica versus cúbica). Como se ejemplifica en la figura 4A, sin nanovacuna no se observó fluorescencia (control de autofluorescencia). Interesantemente, utilizando la secuencia de importación 1-110 a la poliedra produjo cristales de mayor duración in vivo que la secuencia de importación 1-58. Lo anterior refleja la estabilidad y orden del cristal, siendo el más ordenado mucho más difícil de disolver en el tiempo. Controlar los tiempos de absorción in vivo resulta una herramienta muy poderosa, al permitirnos diseñar vacunas de liberación rápida o de liberación prolongada
(dependiendo de la forma del cristal de poliedra utilizado). Controlar con precisión los tiempos de liberación de vacunas in vivo nos permitiría producir una nueva generación de vacunas de liberación modulable. De esta manera concluimos que los cristales inyectados en animales vivos generan una respuesta inmune vigorosa y otras proteínas y enzimas incorporadas dentro de los cristales mantienen su actividad enzimática por meses a temperatura ambiente. Lo anterior nos ha permitido definir a los cristales de poliedra como estructuras que mantienen las propiedades de proteínas incorporadas en su interior por meses, sin necesidad de refrigeración o manejos especiales. La morfología de los cristales de poliedra puede ser manipulada, y con ellos se controlan los tiempos de liberación de proteínas de interés en animales vivos. Lo anterior permitirá la producción de una nueva generación de vacunas de liberación controlada, que además no requieren refrigeración y con fecha de caducidad de varios años. Núm. 3 • 2011
37