Manual preparacion de medios de cultivo

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

PROGRAMA DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO

SANDRA LUCIA SAAVEDRA

TABLA DE CONTENIDO 1. Objetivo 2. Introducci贸n 3. Bioseguridad 4. Control de calidad 5. Agar Nutritivo 6. Agar Sangre 7. Agar Mc Conkey 8. Agar Muller Hinton 9. Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato 10. Hektoen Enteric Agar 11. Agar Manitol Salino 12. Agar Dnasa 13. Agar Eosin-Methylene-Blue-Lactosa-Sucrosa 14. Agar Salmonella- Shigella 15. Agar Cetrimide 16. Agar Esculina-Bilis 17. Agar Bismuto Sulfito 18. Agar Glucosa 2% Sabouraud 19. Agar Mycosel 20. Agar Patata Glucosa 21. Agar Malta 22. Agar Almid贸n 23. Agar Gelatina 24. Agar Mossel 25. Agar Palcam 26. Agar Oxford 27. Agar Rambach 28. Agar Oxidaci贸n Fermentaci贸n

PRUEBAS BIOQUIMICAS 29. TSI 30. LIA 31. MOTILIDAD 32. SIM 33. UREA 34. CITRATO 35. FENILALANINA

36. MALONATO 37. RM-VP 38. Caldo Caso 39. Caldo Muller Hinton 40. Caldo Nutritivo 41. Caldo Tetrationato 42. Caldo Estreptococo faecalis (SF) 43. BibliografĂ­a

OBJETIVO

1. Establecer los fundamentos teóricos para la preparación de medios de cultivo para los laboratorios del programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico de la Universidad de Santander.

2. Aprender la clasificación y uso de los medios de cultivo.

3. Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave.

INTRODUCCION LA EVOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

Un método fundamental para estudiar los microorganismos es cultivarlos en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar.

Los medios de cultivo Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante.

Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras.

Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra ( Cultivo axénico o puro) formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, por ejemplo cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias.

En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre.

De acuerdo a la composición química los medios de cultivo se clasifican en:  GENERALES: Que permiten el crecimiento de cualquier tipo de microorganismo.  MEDIOS SINTETICOS: ó químicamente definidos, contienen fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales que suplen iones (Fe, Mg, K, P, Ca), sustancias estimuladoras del crecimiento y siempre en concentraciones conocidas.  MEDIOS COMPLEJOS: ó de composición no definida, llevan ingredientes como extractos de levaduras, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa o cuantitativa de sus nutrientes.  MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: Son medios complejos con aditivos adicionales para facilitar el crecimiento de determinados microorganismos particularmente heterótrofos exigentes.  MEDIOS SELECTIVOS: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento especifico de un microorganismo en particular. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiota mixta.

 MEDIOS DIFERENCIALES: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.  MEDIOS DE MANTENIMIENTO: suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células.

El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriológicos. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C. De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:  LIQUIDOS: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.  SEMISOLIDOS: Contienen 0.5% de agar en su formulación. Se utilizan para estudiar la movilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelo).  SOLIDOS: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación. Estos medios inmovilizan a las células, permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Las colonias permiten al microbiólogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia no provienen de un cultivo puro. Las placas de agar también se utilizan para la determinación de células viables (recuento en placas).

Se deben tener en cuenta unas recomendaciones especiales para preparar los medios de cultivo como:          

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Siempre preparar los medios con agua destilada Es necesario ajustar el pH Todos los utensilios deben estar perfectamente limpios Los medios se preparan en matraces cónicos ó erlenmeyer, se debe utilizar de capacidad al doble de la cantidad de medio que se vaya a preparar.

Se pesa la cantidad de medio requerido, se disuelve y se suspende en agua.

Se calienta en estufa, teniendo la precaución de que los medios de cultivo son muy sensibles al calentamiento, por este motivo no debe calentarse más de lo estrictamente necesario.

A medida que se calienta se debe agitar para homogenizar la solución y para evitar que el medio se queme en el fondo del recipiente.

Todos los medios deben esterilizarse, se autoclava de 15 a 20 minutos a 121ºC y 15 libras de presión.

Algunos medios de cultivo no pueden ser autoclavados por lo tanto se debe esterilizar cada uno de los materiales por separado y al final se unen.

Los medios de cultivo deben conservarse en lugar fresco (15 – 30ºC), seco, contra la luz y en envases bien cerrados, que cuando se utiliza la cantidad que se necesita deben cerrarse muy bien y almacenarlos correctamente, se debe tener en cuenta la fecha de vencimiento, tras periodos de almacenamiento mas prolongados se presenta una alteración del pH que puede reajustarse con acido clorhídrico estéril o hidróxido de sodio.

Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos. Los medios líquidos se sirven en tubos, se tapan se etiquetan y se esterilizan. Los medios sólidos se sirven en tubos, se etiquetan y se autoclavan, dejándolos solidificar rectos o inclinados, y

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también se pueden servir en cajas de petri, a una temperatura de 45 a 55ºC para evitar la formación de góticas por condensación del agua.

Las cajas de petri deben estar previamente estériles por autoclave y frías.

Las burbujas que se forman en la superficie del medio se eliminan abanicando brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen.

Se debe hacer prueba de calidad de los medios de cultivo elaborados dejando 24 horas en horno a 37ºC, para mirar contaminación.

Se refrigeran para ser utilizados posteriormente.

Evitar que los medios de cultivos se deshidraten una vez refrigerados, por lo tanto se deben usar en el menor tiempo posible o si se conservan durante bastante tiempo se debe colocar una cinta adhesiva en le borde lateral de la caja para impedir fugas o guardarlas en varias bolsas de plástico impermeables al aire, los tubos deben cerrarse con capuchones impermeables al aire. La perdida de agua puede provocar precipitados o hacer que cristalicen ciertas sustancias del medio de cultivo así como originar grietas en las placas que contengan medio de cultivo.

 Principales problemas en la preparación y usos de los medios de cultivo:

ANOMALIA Deshidratación

CAUSA PROBABLE

Conservación deficiente Contenido de agua incorrecto Gel blanco Pesada o mezcla incorrecta pH ácido que provoca hidrolisis Deficiente disolución sobrecalentamiento pH incorrecto Uso de vidrio alcalino o contaminado Medida de pH a temperatura incorrecta precipitado Pesada o mezcla incorrecta sobrecalentamiento Perdida de propiedades Pesada o mezcla incorrecta sobrecalentamiento Fundiciones repetidas Ennegrecimiento y/o sobrecalentamiento cambios de color Error de pH Recipientes contaminados contaminación Deficiente esterilización Deficiente conservación

BIOSEGURIDAD El Centro de Preparación de Medios cuenta con criterios de bioseguridad los cuales son medidas preventivas que se deben tener en cuenta para proteger al personal, la comunidad, y el medio ambiente.

Entre las medidas tomadas en el Laboratorio se consideran:  Mantener el lugar de trabajo en óptimas condiciones de higiene y aseo.  Evitar fumar, beber y comer cualquier alimento en el sitio de trabajo.  No guardar alimentos, en las neveras ni en los equipos de refrigeración de sustancias contaminantes o químicos.  Manejar todo muestra como potencialmente contaminada  Lavar cuidadosamente las manos antes y después de cada procedimiento e igualmente si se tiene contacto con material patógeno.  Utilizar en forma sistemática guantes plásticos o de látex en procedimientos que conlleven manipulación de elementos biológicos y/o cuando maneje instrumental o equipo contaminado.  Abstenerse de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.  Emplear mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que puedan generar salpicaduras.  Usar batas o cubiertas plásticas en aquellos procedimientos en que se esperen salpicaduras, aerosoles o derrames.  Mantener sus elementos de protección personal en óptimas condiciones de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso.  Aplicar en todo procedimiento las normas de asepsia necesarias.  Utilizar las técnicas correctas en la realización de todo procedimiento.  Realizar desinfección y limpieza a las superficies, elementos, equipos de trabajo al final de cada procedimiento y al finalizar la jornada.  Esta prohibido pipetear con la boca, para ello se emplean los dispositivos adecuados (peras, pipeteado res, etc.).  Emplear los equipos según las instrucciones, de igual manera emplee los protocolos correspondientes en la labor del laboratorio.  En caso de derrame o contaminación accidental sobre superficies de trabajo, cubrir con papel u otro material absorbente; luego verter hipoclorito de sodio a 5.000 ppm (o cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después limpiar nuevamente la superficie con desinfectante a la misma concentración y realizar limpieza con agua y jabón. El personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.  En caso de ruptura de material de vidrio contaminado deberá procederse de igual forma que un derrame y los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor, nunca con las manos.  Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material irrompible y cierre hermético. Deben tener preferiblemente el tapón de rosca.  Manipular, transportar las muestras disponiéndolas en bandejas debidamente

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rotuladas.

En caso de contaminación externa accidental del recipiente, este debe lavarse con hipoclorito de sodio al 0.01% (1.000 ppm) y secarse.

Restringir el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico al personal no autorizado, al que no utilice los elementos de protección personal necesarios y a los niños.

Disponer el material patógeno en bolsas resistentes, de color rojo que lo identifique con símbolo de riesgo biológico.

Todo el personal debe prestar especial cuidado en evitar el contacto directo de la piel con material potencialmente patógenos, con este fin debe emplearse guantes para la manipulación de muestras o cultivos que contengan posibles patógenos, jamás se saldrá del área de trabajo con los guantes puestos, ni se tocara teléfonos, papel y demás.

Todas las superficies de trabajo se limpiaran y desinfectaran diariamente.

Uso de mascaras faciales y gafas protectoras si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles, los cuales se evitaran al máximo Las heridas y cortes deberán ser reportadas al Jefe del Laboratorio y convenientemente vendadas.

El personal del laboratorio deberá lavarse frecuentemente las manos durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y se utilizara jabón bactericida y el secado de las manos se hará con servilleta desechable

CONTROL DE CALIDAD Dada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es preciso hacer controles periódicos que permitan comprobar que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de células aisladas (colonias aisladas), además, que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los medios de cultivo se denomina econométrico.

PRUEBA DE PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD PARA MEDIOS SÓLIDOS METODO ECOMÉTRICO  Dividir las placas en cuatro cuadrantes y marcar de forma conveniente.  A partir del microorganismo en fase estacionaria, que desea evaluar su selectividad y productividad en el medio de cultivo deseado y del interferente tomar una asada calibrada de 1 microlitro y trazar sobre la superficie del medio cinco estrías paralelas en cada cuadrante y una estría central, de forma progresiva, sin recargar ni torcer el asa.  Hacer lo mismo con el medio de referencia  Incubar las placas en posición invertida por el tiempo necesario y la temperatura adecuada según el método  Asignar un valor de 0.2 a cada estría, multiplicar por el numero estría en las cuales se observa y determinar el Índice de Crecimiento Absoluto (ICA); si hay crecimiento en las cinco estrías de los cuatro cuadrantes y la estría central (valor1), el ICA es igual a cinco  El Índice de Crecimiento Relativo (ICR) es la comparación entre el ICA del medio en estudio y el medio de referencia  Para el criterio de evaluación de la propiedad se mide teniendo en cuenta que las cepas esperadas en un medio selectivo debieron dar un ICA no menor de 2.5-3.  Con respecto a la selectividad hay que tener en cuenta que las cepas no esperadas en medios selectivos deberían dar un ICA no mayor de 2.0. El ICA de las cepas deseadas no debe ser menor de 2.5.  Registrar los resultados en un formato

MEDIO Agar Baird Parker Agar EMB Agar XLD Agar Rambach Agar VRBA Agar Enterococos

MICROORGANISMOP DESEADO S. aureus E. coli Salmonella spp Salmonella spp E. coli Str. faecalis

TIEMPO INTERFERENTE E. Coli Salmonella spp E. coli E. coli Salmonella spp S. aureus

48 horas 24 horas 24 horas 24 horas 24 horas 24 horas

CONTROL DEL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN AUTOCLAVE Evaluación con STERIKON  Colocar las ampollas de Sterikon en cada autoclave a evaluar.  Para evitar contaminación en caso de ruptura fortuita de la ampolla se recomienda situar esta en un vaso de precipitado.  Las ampollas deben colocarse en aquellos sitios donde de acuerdo con la experiencia existan las condiciones de esterilización mas desfavorables, es decir, en el espacio inferior y medio de la autoclave.  Después de la esterilización se toman las ampollas y se incuban a 63ºC +/- 20C durante 24 horas. Como control debe incubarse simultáneamente una ampolla no esterilizada.  No se recomienda empleo a más de 1250C de temperatura en el esterilizador debido a un posible daño del bioindicador.

Evaluación En caso de esterilización suficiente las esporas de Geobacillus stearothermophilus quedan destruidas. El color contenido de las ampollas permanece violeta-rojizo y transparente.

En caso de esterilización insuficiente sobreviven las esporas de Geobacillus stearothermophilus. El contenido de las ampollas muestra generalmente ya dentro 24 horas de incubación viraje de color hacia amarillo-naranja por la formación de acido como consecuencia de la fermentación del azúcar, así como una turbidez debida al crecimiento.

En caso de daño parcial de las esporas puede retrasarse la reacción. El contenido de la ampolla vira igualmente hacia amarillo-naranja y se enturbia.

AGAR NUTRITIVO (AN) FUNDAMENTO: Es un medio usado para propósitos generales para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La peptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano.

El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras Sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

COMPOSICIÓN: Peptona, extracto de carne, cloruro sódico y agar-agar. (Cuyas concentración dependen de la casa comercial) pH final: 7.3 +/- 0.2

PREPARACIÓN: Disolver la cantidad de medio (depende de la casa comercial) destilada, esterilizar en autoclave y verterse en cajas de petri.

en un litro de agua

El medio también se puede servir en tubos, etiquetar, cerrar los tubos y autoclavar, después se dejan en posición vertical si se necesitan rectos o se colocan sobre el mesón del laboratorio inclinado sobre una pipeta si se necesitan con bisel.

Características del medio: ámbar claro a medio ligeramente opalescente.

AGAR SANGRE (AS) FUNDAMENTO: Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis.

También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate. Sin la adición de sangre es importante para la realización de hemocultivos y como base para la preparación de diversos medios de cultivo especiales.

COMPOSICIÓN: Sustrato nutritivo (Extracto de corazón y peptonas), cloruro sódico, agar-agar. Aditivo de sangre de 15 a 20 ml de glóbulos rojos empaquetados o de 20 a 25 ml de sangre total por cada 500 ml de medio. (Cuyas concentración dependen de la casa comercial) pH final: 6,8 +/- 0.2 PREPARACIÓN: Disolver la base de sangre (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave, dejar enfriar a 45 - 50ºC, incorporar la cantidad de sangre desfibrinada y verter en placas.

El medio de cultivo preparado es, antes de la adición de la sangre, claro y amarillo parduzco y posteriormente a la adición de la sangre del color de la misma y no hemolizado.

Guardamos en nevera, las placas, listas para su uso, son utilizadas durante tres meses como máximo.

AGAR CHOCOLATE (AGAR SANGRE COCIDO) Es una variante del agar sangre, se procede igual, la diferencia esta en que cuando se agrega la sangre se calienta a 80ºC en baño de vapor de agua durante 10 minutos, agitando constantemente, hasta que el medio de cultivo tome un color chocolate. A continuación verter en placas.

AGAR CHOCOLATE CON TELURITO DE POTASIO Es una variante del agar sangre, se procede igual que el agar chocolate, solo que antes de verter en las placas y alcance la temperatura de 45-50ºC se agrega 0,1 ml de telurito de potasio estéril al 1% por cada litro de medio de cultivo. Se utiliza para aislamiento de colonias de Corynebacterium especialmente de bacterias diftericas y pseudodiftericas en raspados o frotis nasales, faríngeos o vaginales y en otros materiales objeto de investigación, las colonias de Corynebacterias y de otros microorganismos reducen el telurito de potasio, muestran coloración gris hasta negra.

Los gérmenes de acompañamiento resultan parcialmente inhibidos.

AGAR McCONKEY FUNDAMENTO: Agar selectivo para el aislamiento de bacilos gram negativos de fácil desarrollo aerobio y anaerobios facultativos, Salmonellas, Shiguellas y bacterias coliformes, a partir de muestras clínicas. Las sales biliares y el violeta cristal inhiben considerablemente la microbiota gram positiva. Permite diferenciar microorganismos que utilizan o no la lactosa. La lactosa, junto con el indicador de pH Rojo neutro, sirve para la comprobación de la degradación de dicho azúcar. En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.

Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

COMPOSICIÓN: Peptona de caseína, peptona de carne, cloruro sódico, lactosa, mezcla de sales biliares, rojo neutro, violeta de cristal, agar-agar (Cuyas concentración dependen de la casa comercial) pH final: 7,1 +/- 0.2

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas.

Los medios de cultivo preparados son claros y de color rojo parduzco.

AGAR MUELLER HINTON (MH) FUNDAMENTO: Se utiliza para ensayos de sensibilidad, o para ensayos de resistencia de agentes patógenos médicamente importantes frente a antibióticos y sulfamidas. Se usa para la realización del ensayo de difusión en placas. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomendó su uso en forma rutinaria para la realización del antibiograma en medio sólido, debido a una serie de factores: • Presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad.

• Su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclina es bajo.

• La mayoría de los patógenos crece satisfactoriamente.

COMPOSICIÓN: La composición de estos medios de cultivo garantiza, por una parte, condiciones favorables de crecimiento y por otra parte, cuenta con la ausencia, muy considerable, de antagonistas de las sulfamidas.

Para mejorar de forma considerable el crecimiento de microorganismos exigentes, puede añadirse sangre al agar mueller hinton. Esto puede sin embargo conducir a resultados erróneos en el ensayo de Enterococos frente a aminoglicósidos.

Infusión de carne, hidrolizado de caseína, almidón y agar-agar (Cuyas concentración dependen de la casa comercial) pH final: 7.4 +/- 0.2

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave con cuidado, enfriar y verterse en placas. Si se desea hacer la variante con sangre se deja enfriar eventualmente a 45-50ºC para incorporar del 5 al 10% de sangre desfibrinada.

Las placas con medio de cultivo sin la sangre son claras y de color parduzco y si contienen sangre quedan del color de la sangre.

AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD) FUNDAMENTO: Se emplea para el aislamiento y diferenciación de Enterobacterias patógenas, especialmente de especies de Shigella y Salmonella.

En combinación con un enriquecimiento adecuado ç, con el agar XLD se puede detectar un numero notablemente mayor de salmonellas y shigellas que con otros medios de cultivo selectivos. La degradación a acido de la xilosa, lactosa y sacarosa produce un viraje a amarillo del rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro revelan la formación de acido sulfhídrico por la precipitación de sulfuro de hierro negro en las colonias. Las bacterias que descarboxilan la lisina, produciendo cadaverina, se reconocen por la presencia de un color rojopurpúreo, debido al aumento del pH, alrededor de sus colonias. Varia de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o sucesivamente, lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de pH, o a un viraje de amarillo a rojo en el transcurso de una incubación mas prolongada. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil.

COMPOSICIÓN: Extracto de levadura, cloruro sódico, D (+)-xilosa, lactosa, sacarosa, L (+)-lisina, desoxicolato sódico, tiosulfato de sodio, citrato de amonio y hierro, rojo de fenol y agaragar (Cuyas concentración dependen de la casa comercial). pH final: 7.4 +/- 0.2

PREPARACIÓN: Primero se debe esterilizar el agua destilada, después al lado del mechero se agrega la cantidad de medio (Depende de la casa comercial), se mezcla, se coloca en la estufa para que se disuelva el medio agitando con suavidad y constantemente para evitar que se formen precipitados en el fondo del erlenmeyer quedando atrapadas las sales de hierro, cuando hierva se deja e3nfriar y se vierten en las cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son de color rojo y casi siempre claras. Los precipitados que se presentan ocasionalmente no perjudican la capacidad de rendimiento de este medio de cultivo. Pueden eliminarse por filtración del medio de cultivo todavía líquido.

HEKTOEN ENTERIC AGAR (HE) FUNDAMENTO: Agar selectivo para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas, inclusive Shigella, a partir de los más diversos materiales. Frente a otros medios de cultivo selectivos, como por ejemplo agar SS, agar BPL y agar BS, el agar para Enterobacterias de Hektoen aun cuando posee suficiente efecto represor de la microbiota de acompañamiento, ejerce escasa inhibición de Salmonellas y Shigellas y por lo tanto, permite la obtención de altos rendimientos en estos gérmenes. Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fascina acida, las colonias lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosa negativas. Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y mas fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos.

La combinación de tiosulfato, como sustancia reaccionante, y una sal de hierro como indicador, da una coloración negra a las colonias H2S-positivas. Una mezcla de sales biliares inhibe a una gran parte de la microbiota acompañante.

COMPOSICIÓN: Peptona, cloruro sódico, sacarosa, extracto de levadura, lactosa, salicina, tiosulfato sódico, citrato de amonio y hierro, mezcla de sales biliares, azul de bromotimol, fascina acida y agar-agar (Cuyas concentración dependen de la casa comercial). pH final: 7.7 +/- 0.2

PREPARACIÓN: Primero se debe esterilizar el agua destilada, después al lado del mechero se agrega la cantidad de medio (Depende de la casa comercial), se mezcla, se coloca en la estufa para que se disuelva el medio agitando con suavidad y constantemente para evitar que se formen precipitados en el fondo del erlenmeyer quedando atrapadas las sales de hierro, cuando hierva se deja enfriar y se vierten en las cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son de claras y de color azul verdoso.

AGAR MANITOL SALINO FUNDAMENTO: Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patógenos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria. También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la peptona, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.

Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.

COMPOSICIÓN: Extracto de carne, peptona, manitol, cloruro de sodio, agar-agar, rojo de fenol, (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH final: 7.4 +/- 0.1

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son claras y de color rojo.

AGAR DNASA FUNDAMENTO: Las colonias formadoras de DNasa hidrolizan, a su alrededor, al ácido desoxirribonucleico (DNA) contenido en el medio de cultivo. Posteriormente se acidifica el conjunto con HCL 1N, con lo cual precipita el DNA (turbidez), en tanto que las colonias DNasa-positivas presentan a su alrededor los correspondientes halos de aclaramiento. Como signo complementario para la diferenciación de Estafilococos, tambien puede recurrirse a la demostración de su consumo de manitol con formación de acido, para lo cual se complementa el medio de cultivo, durante su preparación, con manitol y un indicador de pH. COMPOSICIÓN: Triptosa, cloruro sódico, acido desoxirribonucleico, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH final: 7.3 +/- 0.1

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son ligeramente opalescentes.

Adición del manitol: Antes de esterilizar el medio de cultivo en el autoclave se le añaden, mezclando bien, 10 gr. por litro de medio de cultivo y como indicador de pH 0,025gr por litro de medio de azul de bromotimol o rojo de fenol.

AGAR EOSIN-METHYLENE-BLUE LACTOSA SUCROSA (EMB) FUNDAMENTO: Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Este medio obtiene un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos.

La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas.

Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico.

Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes, Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas.

En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

COMPOSICIÓN: Peptona, lactosa, sacarosa, fosfato dipotásico, agar-agar, eosina, azul de metileno (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH final: 7.1 +/- 0.1

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son ligeramente opalescentes.

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) FUNDAMENTO: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.

La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.

La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro.

COMPOSICIÓN: Peptona, lactosa, bilis de buey, citrato sódico, tiosulfato sódico, citrato de amonio y hierro, verde brillante, rojo neutro y agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH final: 7.0 +/- 0.1

PREPARACIÓN: Primero se debe esterilizar el agua destilada, después al lado del mechero se agrega la cantidad de medio (Depende de la casa comercial), se mezcla, se coloca en la estufa para que se disuelva el medio agitando con suavidad y constantemente para evitar que se formen precipitados en el fondo del erlenmeyer quedando atrapadas las sales de hierro, cuando hierva se deja enfriar y se vierten en las cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son claros y de color rojo naranja.

AGAR CETRIMIDE FUNDAMENTO: Se utiliza para el aislamiento y diferenciación de pseudomonas aeruginosa, a partir de diversos materiales.

El cetrimide (cetiltrimetilamoniobromuro), recomendado por Lowbury y otros autores, sirve para conseguir una notable inhibición de la microbiota acompañante. De acuerdo con una proposición hecha por Lowbury y Collins una concentración de 0,3 gr/L ejerce una suficiente inhibición de los organismos acompañantes, perjudicando mínimamente el crecimiento de las Pseudomonas aeruginosa. El desarrollo de color a cargo de las Pseudomo0nas aeruginosa transcurre sin obstáculos en este medio de cultivo.

Para aumentar el efecto inhibidor sobre la microbiota acompañante se recomienda añadir 15 ug/ml de acido nalidixico.

COMPOSICIÓN: Peptona de gelatina, cloruro de magnesio, sulfato potásico, N-acetil-N, N, N,trimetilamoniobromuro (cetrimide), agar-agar(Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). .

Aditivo glicerina 10ml por cada litro de medio. pH final: 7.1 +/- 0.1

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son ligeramente opalescentes.

AGAR ESCULINA - BILIS FUNDAMENTO: Para la investigación preliminar de Enterococos (Grupo serológico D).

La hidrólisis de la esculina y la tolerancia a la bilis son consideradas como características fidedignas y constantes de los Enterococos.

En tanto que los Enterococos que toleran la presencia de bilis, pueden multiplicarse sin impedimento, numerosas bacterias acompañantes resultan notablemente inhibidas en su crecimiento por las sales biliares.

Los Enterococos hidrolizan al glucósido Esculina convirtiéndolo en glucosa y Esculetina.

Esta última sustancia, con iones hierro (III) forma un complejo de color verde-oliva hasta negro. Añadiendo suero de caballo al medio de cultivo puede optimizarse el crecimiento de Enterococos.

En presencia de Enterococos, se produce por lo general ya al cabo de las primeras 24 horas una coloración oscura del medio de cultivo alrededor de las colonias en crecimiento.

Cuando éstas son numerosas y llegan a confluir, el oscurecimiento producido puede llegar a afectar a la totalidad del medio de cultivo en placa.

COMPOSICIÓN: Extracto de carne, peptona de carne, bilis de buey, Esculina, citrato férrico y agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH final: 6,6 +/- 0.2

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (La cantidad depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri. NO RECALENTAR. Las placas con medio de cultivo preparadas con claras y de color pardo-azulado.

AGAR BISMUTO SULFITO FUNDAMENTO: Agar selectivo para aislamiento y diferenciación de Salmonella tiphy y otras Salmonellas, a partir del material clínico y otras clases.

El verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente a los gérmenes de acompañamiento. Las colonias de Salmonella H2S-positivas presentan ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. La reducción de los iones bismuto a bismuto metálico produce brillo metálico alrededor de las correspondientes colonias.

COMPOSICIÓN: Extracto de carne, peptona de carne, D(+)-glucosa, hidrogenofosfato disódico, sulfato ferroso, verde brillante, indicador bismuto-sulfito, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH final: 7.6 +/- 0.2

PREPARACIÓN: NO AUTOCLAVAR. Primero se debe esterilizar el agua destilada, después al lado del mechero se agrega la cantidad de medio (Depende de la casa comercial), se mezcla, se coloca en la estufa para que se disuelva el medio agitando con suavidad y constantemente para evitar que se formen precipitados en el fondo del erlenmeyer quedando atrapadas las sales de hierro, cuando hierva se deja enfriar y se vierten en las cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo obligadamente turbias, deben presentar un color tenue hasta verde pálido. En caso de coloración parduzca el medio de cultivo no es utilizable.

El medio de cultivo, recién preparado, es muy inhibidor y, por este motivo, se recomienda su uso en casos de contaminación intensa. Por lo general, el brillo metálico de las colonias aparece en este medio solo al cabo de 48 horas. Tras un almacenamiento de 4 días a 4ºC, el medio de cultivo pierde algo de su potencia inhibidora, siendo entonces adecuado para la investigación de material ligeramente contaminado. En este caso, el brillo metálico aparece ya al cabo de poco tiempo de incubación.

AGAR GLUCOSA 2%. SABOURAUD FUNDAMENTO: Este medio de cultivo se ha recomendado para dermatofitos. Además es adecuado para el ensayo de sensibilidad de hongos. Algunos autores han recomendado añadir cichoheximida, penicilina y estreptomicina para inhibir a los gérmenes acompañantes no patógenos y hacerlo selectivo.

Un pH bajo de aproximadamente 5,6 y la alta concentración de glucosa son condiciones favorables para el crecimiento de todos los hongos.

A veces se emplean algunas variantes como el agar sabouraud glucosa 4%, sabouraud 4% maltosa, sabouraud 1% dextrosa y 1% maltosa, COMPOSICIÓN: Peptonas, D(+)-glucosa, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 5,6 +/- 0,1.

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.

AGAR MYCOSEL FUNDAMENTO: Es un medio selectivo para el aislamiento de hongos patógenos a partir de muestras con gran cantidad de flora de otros hongos y bacterias. No son medios de uso general para el aislamiento de todos los hongos ( Incluidos mohos y levaduras saprofitas). La cicloheximida inhibe el crecimiento de hongos saprofitos y el cloranfenicol inhibe el crecimiento bacteriano.

Dado que varían la patogenecidad de los hongos y el estado inmunológico de los pacientes, se debe tener cuidado cuando se utiliza un medio con cicloheximida solo para el aislamiento de hongos, porque pueden perderse ciertos hongos oportunistas. El cloranfenicol es un antibiótico de amplio espectro con efecto inhibidor para una amplia variedad de bacterias gram negativas y positivas, pero puede inhibir varios hongos patógenos.

COMPOSICIÓN: Digerido papaico de harina de soja, glucosa. Cicloheximida, cloranfenicol, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 6,9 +/- 0,2

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.

AGAR PATATA – GLUCOSA (PDA) FUNDAMENTO: Importante para el cultivo, aislamiento y determinación del numero de gérmenes de levaduras y mohos, a partir de alimentos y otros materiales.

Los hidratos de carbono y la infusión de patata favorecen el crecimiento de levaduras y mohos, en tanto que, debido al bajo valor de pH, la microbiota bacteriana de acompañamiento queda parcialmente inhibida en su desarrollo. Para la numeración de hongos se recomienda bajar aun más el pH, haciéndolo descender hasta aproximadamente 3,5.

Las características morfológicas típicas de los hongos se desarrollan bien en este medio de cultivo.

COMPOSICIÓN: Infusión de patata, D (+)-glucosa, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 5,6 +/- 0,1

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.

Para ajustar el pH, incorporar al medio de cultivo a 45 – 50ºC, una solución estéril de acido tartárico al 10%, a razón de 14 ml por litro.

NO FUNDIR DE NUEVO.

AGAR MALTA FUNDAMENTO: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de hongos y levaduras.

COMPOSICIÓN: Extracto de malta, peptona, D (+)-glucosa, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 5,6 +/- 0,2 Como podemos ver la concentración de azúcares es mayor en los medios para hongos y el pH es sensiblemente menor. Estas condiciones hacen los medios selectivos para el crecimiento de hongos. Esto se debe a que como se discutió en la sección anterior, los hongos son capaces de crecer a pH y actividades de agua más bajas que las bacterias.

Sin embargo muchas bacterias pueden crecer igualmente en estas condiciones. Para hacer que los medios aumenten la selectividad, se puede agregar un antibiótico que actúe contra bacterias y no contra hongos, por ejemplo, sulfato de estreptomicina.

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las cajas con el medio ya preparado se observan claras de color amarillento.

AGAR ALMIDON FUNDAMENTO: Medio de cultivo utilizado para evidenciar una reacción de algunas bacterias como el Bacillus cereus, quien tiene la capacidad de hidrolizar el almidón dejando un halo claro alrededor de la colonia.

COMPOSICIÓN: Peptona, extracto de carne, cloruro sódico, almidón, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial).

PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Cantidad que depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Las cajas con el medio ya preparado se observan claras e incoloras.

AGAR GELATINA FUNDAMENTO: Estos medios de cultivo se usan para la determinación del número de gérmenes en aguas y para la demostración de microorganismos degradadores de la gelatina. Especialmente utilizada para la identificación del Bacillus cereus.

COMPOSICIÓN: Peptona, extracto de carne, peptona de gelatina (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 7,0 +/- 0,2 PREPARACIÓN:

Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar con mucho cuidado ( 10 minutos a 115ºC) en autoclave y verter en placas o cajas de petri.

Los tubos con el medio ya preparado se observan claras e incoloras y se sirven en tubos con el medio inclinado, el medio solo se solidifica cuando se coloca en nevera y debe ser usado frio, para evitar que se ablande la gelatina, después de ésto la bacteria ejerce su función y la licua hasta dejarla liquida.

AGAR MOSSEL FUNDAMENTO: Se utiliza para el enriquecimiento selectivo de todas las enterobacterias, a partir de alimentos y otros materiales de investigación.

La microbiota indeseable acompañante es ampliamente inhibida por el verde brillante y la bilis de buey.

El contenido en glucosa favorece el crecimiento de todas las enterobacterias. El fuerte tamponamiento de este medio nutritivo impide el descenso del pH y la consiguiente inhibición en el crecimiento del cultivo.

COMPOSICIÓN: Peptona, d (+)-glucosa, bilis de buey, verde brillante, hidrogenofosfato disódico y dihidrogenofosfato dipotásico (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 7,3 +/- 0,1 PREPARACION Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en un litro de agua destilada, esterilizar en autoclave.

Cuando alcance una temperatura de 45-50ºC se le debe añadir yema de huevo sin telurito de potasio (Comercial), la cantidad depende de la casa comercial que se utilice.

AGAR PALCAM FUNDAMENTO: Es un medio altamente selectivo y diferencial para el aislamiento y detección de Listeria en muestras de origen clínico y biológico así como en alimentos y muestras de origen ambiental fuertemente contaminados.

Mediante este medio puede aislarse cuantitativamente Listeria monocytogenes al tiempo que las bacterias gram-negativas y la mayoría de gram-positivas, presentes en la muestra como microbiota acompañante, son inhibidas.

La selectividad del medio se debe a las sustancias inhibidoras del crecimiento, tales como polimixina B-sulfato, acriflavina, cloruro de litio y ceftacidina.

L-monocytogenes hidroliza el glucósido esculina formándose glucosa y esculetina. Esta ultima, con el hierro trivalente, produce un complejo de color entre verde oliva y negro y se observan al medio como colonias verde grisáceas con un halo marrón-negro.

Las bacterias manitol-positivo, como por ejemplo laos Estafilococos, crecen en tanto en cuanto no sean inhibidas, formando colonias de color amarillo.

COMPOSICIÓN: Peptona, almidón, cloruro sódico, agar-agar, D(-)-manitol, citrato de amonio y hierro, esculina, cloruro de litio, rojo de fenol (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 7,0 +/- 0,1

PREPARACION Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en 500 ml de agua destilada, esterilizar en autoclave, dejar enfriar hasta 50ºC y añadir un vial de PALCAM suplemento selectivo preparado con 1 ml de agua estéril para disolver el liofilizado, mezclar bien y verter en las placas.

AGAR OXFORD FUNDAMENTO: Es un medio altamente selectivo y diferencial para el aislamiento y detección de Listeria en muestras de origen clínico y biológico así como en alimentos y muestras de origen ambiental fuertemente contaminados.

Mediante este medio puede aislarse Listeria monocytogenes al tiempo que las bacterias gram-negativas y la mayoría de gram-positivas, presentes en la muestra como microbiota acompañante, son inhibidas.

La selectividad del medio se debe a las sustancias inhibidoras del crecimiento.

COMPOSICIÓN: Agar base Columbia, esculina, citrato férrico de amonio, cloruro de litio (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 7,0 +/- 0,2 PREPARACIÓN: Disolver el medio de cultivo (Depende de la casa comercial) en 500 ml de agua destilada, esterilizar en autoclave, dejar enfriar hasta 50ºC y añadir un vial de OXFORD suplemento selectivo preparado con 1 ml de agua estéril para disolver el liofilizado, mezclar bien y verter en las placas.

AGAR RAMBACH FUNDAMENTO: Medio de cultivo para diagnostico diferencial para identificación de Salmonella en alimentos y muestras clínicas.

Los substratos de sustancias alimentarias contenidas en el agar RAMBACH permiten un buen crecimiento de enterobacterias. El desoxicolato sódico produce una inhibición de la microbiota acompañante gram-positiva.

El agar RAMBACH, mediante un nuevo procedimiento de patente solicitada, permite diferenciar las Salmonellas claramente de otras bacterias. Esto es posible por la adición de propilenglicol al medio de cultivo. Las Salmonellas forman ácido a partir del propilenglicol y en combinación con el indicador de pH producen colonias rojas características.

Para diferenciar las coliformes de las Salmonellas el medio de cultivo contiene un cromógeno, que indica la presencia de la separación de B-galactosidasa característica para los coliformes. Los microorganismos coliformes crecen en forma de colonias verde azuladas/violeta azuladas., otras enterobacterias y bacterias gram negativas como por ejemplo el Proteus, Pseudomonas, Shigella, Salmonella tiphy, Salmonella paratiphy A, crecen en forma de colonias incoloras / amarillentas.

COMPOSICIÓN: Peptona, cloruro sódico, desoxicolato sódico, mezcla cromogena, propilenglicol, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial). pH: 7,3 +/- 0,2 a 25ºC. PREPARACIÓN:  Mezclar 1 frasco del suplemento en 250 ml de agua destilada estéril y a temperatura ambiente, agitar bien por balanceo hasta distribución completa  Introducir 1 frasco del medio de cultivo en polvo en el recipiente de mezcla, agitar bien por balanceo hasta q1ue le medio de cultivo este completamente en suspensión.

Seguidamente se transfiere el recipiente de mezcla en un baño de agua hirviendo y se hierve bajo agitación constante por balanceo. El medio de cultivo esta disuelto si en las paredes del recipiente tras breve balanceo ya no es visible ninguna partícula.

EL MEDIO DE CULTIVO NO DEBE SOMETERSE A CALOR POSTERIOR ALGUNO.  Enfriar rápidamente el medio de cultivo en el baño de agua (45-50ºC). Durante el enfriamiento agitar regularmente por balanceo y seguidamente verter en placas.  Las placas de los medios de cultivo son opalescentes y rosa claro  El medio preparado solo dura tres semanas.

AGAR OXIDACION-FERMENTACION (OF) FUNDAMENTO: Medio de cultivo de ensayo para el reconocimiento de la degradación oxidativa y fermentativa de carbohidratos. Sirve especialmente para la diferenciación y clasificación de bacterias intestinales gram negativas.

En cada caso, se añade al medio de cultivo un determinado carbohidrato, cuya degradación a ácido se pone de manifiesto por el viraje a amarillo del indicador de pH Azul de bromotimol. La degradación se estudia tanto con aporte de aire ( Degradación oxidativa y fermentativa) como sin aire (degradación fermentativa).

La coloración amarilla en los tubos no recubiertos y en los recubiertos significa que ha habido degradación fermentativa del correspondiente carbohidrato, en tanto que la coloración amarilla exclusivamente en los tubos no recubiertos significa que la degradación oxidativa tiene lugar en la superficie del medio de cultivo . por ultimo hay que comprobar además, si la turbidez de crecimiento se presenta únicamente a lo largo del canal de la picadura (cepa inmóvil) o si está presente en la totalidad del medio (cepa móvil).

COMPOSICIÓN: Peptona de caseína, extracto de levadura, cloruro sódico, hidrogenofosfato dipotásico, azul de bromotimol, agar-agar (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial).

Aditivo: carbohidrato (Glucosa, xilosa, manitol, sacarosa, fructosa, arabinosa, rafmnosa, lactosa, maltosa y otros…). pH: 7,1 +/- 0,1. los carbohidratos se usan al 1%, 1 gr de carbohidrato por cada 100 ml de medio de cultivo. Se autoclavan por separado carbohidratos y medio de cultivo.

PREPARACIÓN: Disolver la cantidad de medio de cultivo según la casa comercial, cocinar para homogenizar y autoclavar. Dejar enfriar hasta 50ºC e incorporar el carbohidrato previamente autoclavado.

Distribuir en tubos preparados y tambien previamente autoclavados hasta alcanzar unos 4 a 5 cm de altura.

El medio de cultivo preparado, listo para el uso es claro y de color verde.

PRUEBAS BIOQUIMICAS (BATERIAS )

En el laboratorio disponemos de numerosas técnicas para la caracterización bioquímica de una especie. Además de los productos finales de los procesos metabólicos, también se necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, como ocurren paso a paso las reacciones químicas, cuáles enzimas intervienen, cuales son los productos intermediarios además de que se deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioquímicas que tienen lugar dentro de la célula.

En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva específica o sustrato y después de la incubación del cultivo se examina para ver los cambios químicos que hayan ocurrido.

TSI FUNDAMENTO Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.

La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.

El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido.

El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

COMPOSICION Extracto de carne, pluripeptona, cloruro de sodio, lactosa, sacarosa, glucosa, sulfato de hierro y amonio, tiosulfato de sodio, rojo de fenol, agar-agar. pH final: 7.3 0.2

PREPARACION Suspender la cantidad de medio de cultivo en agua destilada. Mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en pico de flauta profundo ( Ligeramente inclinados).

Características del medio preparado: rojo

LIA FUNDAMENTO Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.

La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa.

El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico.

El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.

La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.

La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Resultados 1- Decarboxilación de la lisina: 2-Desaminación de la lisina:

3-Producción de ácido sulfhídrico:

Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.

Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.

Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)

COMPOSICION Peptona de gelatina, extracto de levadura, glucosa, lisina, citrato de hierro y amonio, tiosulfato de sodio, purpura de bromocresol, agar-agar pH final: 6,7 +/- 0,2 PREPARACION Suspender la cantidad de medio de cultivo en agua destilada. Mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en pico de flauta profundo ( Ligeramente inclinados).

Características del medio preparado: color violeta.

MOTILIDAD FUNDAMENTO Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.

La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo.

Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol que difunde más allá de la línea de inoculación.

La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio.

Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo.

La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.

Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.

El indol, es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo.

Resultados 1-Movilidad: Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

2-Ornitina decarboxilasa: Resultado positivo: color púrpura.

Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.

3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina.

Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.

Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro amarillento.

COMPOSICION Dextrosa, extracto de levadura, peptona, tripteína, clorhidrato de L-ornitina, agar-agar, purpura de bromocresol. pH final: 6,5 +/- 0,2 PREPARACION Suspender la cantidad de medio de cultivo en agua destilada. Mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 6 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en posición vertical.

Características del medio preparado: ámbar y ligeramente opalescente.

SIM FUNDAMENTO Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol.

En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovac’s s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.

Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Resultados Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más allá de la línea de siembra.

Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.

Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.

Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac’s s o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

COMPOSICION Tripteína, peptona, sulfato de hierro y amonio, tiosulfato de sodio, agar-agar. pH final: 7,3 +/- 0,2 PREPARACION Suspender la cantidad de medio de cultivo en agua destilada. Mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en posición vertical.

Características del medio preparado: ámbar.

UREA FUNDAMENTO Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureásica.

Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.

El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrógeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo.

Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros géneros.

COMPOSICION Urea, fosfato monopotásico, fosfato disódico, extracto de levadura, rojo de fenol, agaragar.

Aditivo adicional: Urea 40% pH final: 6,8 +/- 0,2 PREPARACION Disolver la cantidad de medio de cultivo según la casa comercial, cocinar para homogenizar y autoclavar. Dejar enfriar hasta 50ºC e incorporar la urea al 40%, 5 ml por cada 100 ml de medio de cultivo ( Se puede conseguir comercialmente listo para usar o preparar en el laboratorio de una solución madre de urea. Distribuir en tubos preparados y previamente autoclavados hasta alcanzar unos 3 cm de altura.

Características del medio preparado: anaranjado.

CITRATO DE SIMMONS FUNDAMENTO Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Resultados Positivo: Negativo:

crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

COMPOSICION Citrato de sodio, cloruro de sodio, fosfato dipotásico, fosfato monoamónico, sulfato de magnesio, azul de bromotimol, agar-agar.

Aditivo adicional: Urea 40% pH final: 6,9 +/- 0,2

PREPARACION Suspender la cantidad de medio de cultivo en agua destilada. Mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en pico de flauta profundo ( Ligeramente inclinados).

Características del medio preparado: color verde.

FENIL ALANINA FUNDAMENTO Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayoría de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, en base a la presencia de la enzima fenilalanina deaminasa.

En el medio de cultivo, el extracto de levadura aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano.

El aminoácido fenilalanina sufre la desaminación oxidativa catalizada por la enzima fenilalanina deaminasa (es una flavoproteína), para producir ácido fenilpirúvico y amoníaco. La presencia del ácido fenilpirúvico se demuestra con el agregado de cloruro férrico en medio ácido, con el cual se forma un quelato de color verdoso entre el ácido fenil pirúvico y los iones Fe3+.

Además, en este medio se suele poner en evidencia la producción de pigmentos melánicos, como en el caso de Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, etc.

Resultados: Positivo: desarrollo de color verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de condensación.

Negativo: sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del reactivo cloruro férrico.

COMPOSICION Extracto de levadura, DL-fenilalanina, fosfato disódico, cloruro de sodio, agar-agar. pH final: 7,3 +/- 0,2 PREPARACION Suspender la cantidad de medio de cultivo en agua destilada. Mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 6 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en pico de flauta profundo ( Ligeramente inclinados).

Características del medio preparado: amarillo – ámbar.

MALONATO FUNDAMENTO Es un medio de cultivo liquido que se utiliza para diferenciación de coliformes de otros microorganismos como Enterobacter y Escherichia coli, basándose en el consumo de Malonato.

El extracto de levadura proporciona vitaminas. La dextrosa es la fuente de energía. El cloruro de sodio ayuda a mantener el ambiente osmótico. La degradación del Malonato origina alcalinización del medio que se manifiesta por vire de verde a azul, el indicador es el purpura de bromotimol (Reacción positiva). Cuando no se utiliza el Malonato es una reacción negativa y no hay cambio de color.

COMPOSICION Azul de bromotimol, cloruro de sodio, Extracto de levadura, dextrosa, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico, Malonato de sodio, sulfato de amonio. pH final: 6,7 +/- 0,2

PREPARACION Suspender la cantidad de medio de cultivo en agua destilada. Mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en posición vertical.

Características del medio preparado: claro y verde.

ROJO DE METILO-VOGES PROSKAUER (RM-VP) FUNDAMENTO Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia Es un medio de cultivo líquido o caldo que se utiliza para la diferenciación bioquímica, especialmente dentro del grupo coli-Aerogenes.

Algunas de las bacterias utilizan glucosa con gran formación de acido, de forma que el valor del pH del medio desciende a menos de 4,4. Otras bacterias producen menos ácido, reduciendo en menor medida el pH del medio. Esta distinción puede hacerse visible a través del rojo de metilo, que presenta un color amarillo por encima de un pH de 5,1 y solo presenta color rojo cuando el pH desciende a 4,4.

La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína.

COMPOSICION Peptona, glucosa, fosfato dipotásico, rojo de metilo. pH final: 6,9 +/- 0,1

PREPARACION Suspender la cantidad de medio de cultivo en agua destilada. Mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 1,5 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en posición vertical.

Características del medio preparado: claro e incoloro.

CALDO CASO FUNDAMENTO Medios de cultivo universales, exentos de sustancias inhibidoras y de indicadores , concebidos para su utilización en un amplio espectro de aplicaciones.

Por su rica y abundante base nutritiva estos medios de cultivo líquidos son apropiados para el cultivo de microorganismos exigentes. Se utilizan como tales o como base para la fabricación de medios especiales de cultivo.

COMPOSICION Peptona de caseína, peptona de harina de soya, cloruro sódico, D(+)-glucosa, hidrogenofosfato dipotásico. pH final: 6,9 +/- 0,1

PREPARACION Disolver la cantidad de medio recomendado por la casa comercial, en un litro de agua destilada, mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en posición vertical.

Características del medio preparado: claro e incoloro

CALDO MULLER HINTON FUNDAMENTO Medio nutritivo adecuado para facilitar el crecimiento de numerosos microorganismos.

Al igual que su presentación en forma de agar, el caldo Mueller Hinton muestra buena reproducibilidad de los resultados lote a lote, tiene un bajo contenido de inhibidores especialmente para sulfamidas, trimetoprim y tetraciclina. Puede ser suplementado para el crecimiento de bacterias exigentes y con ciertos cationes para el antibiograma de Pseudomonas frente a aminoglucósidos.

Este medio ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad de los antimicrobianos en medio líquido.

COMPOSICION Infusión de carne, hidrolizado de caseína y almidón. pH final: 7,4 +/- 0,2 PREPARACION Disolver la cantidad de medio recomendado por la casa comercial, en un litro de agua destilada, mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en posición vertical.

Características del medio preparado: claro e incoloro

CALDO NUTRITIVO FUNDAMENTO Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales.

Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrógeno necesarias para el adecuado desarrollo bacteriano.

Puede ser utilizado además, como preenriquecimiento en la búsqueda de Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar células dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.

Resultados Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificación bioquímica. El caldo nutritivo puede emplearse como medio de enriquecimiento excelente para Listeria monocytogenes, añadiéndole 0,05% de telurito de potasio.

COMPOSICION Peptona de carne, extracto de carne. pH final: 7,0 +/- 0,2

PREPARACION Disolver la cantidad de medio recomendado por la casa comercial, en un litro de agua destilada, mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en posición vertical.

Características del medio preparado: Ámbar claro.

CALDO TETRATIONATO FUNDAMENTO Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos tóxicos.

La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompañante.

Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada.

El verde brillante sirve, sobre todo para inhibir la microbiota gram positiva. Dado que el medio de cultivo con verde brillante posee un efecto inhibidor muy intenso, resulta ventajoso a veces suprimir la adición de verde brillante a fin de obtener un rendimiento satisfactorio de Salmonellas. El Proteus es inhibido por la adición de 0,04 gr/L de Novobiocina.

Resultados: Salmonella typhi: Salmonella typhimurium: Salmonella enteritidis: Escherichia coli:

Crecimiento escaso Crecimiento bueno – excelente.

Crecimiento bueno - excelente Crecimiento escaso

COMPOSICION Peptona de caseína, peptona de carne, sales biliares, carbonato de calcio, tiosulfato de sodio.

Aditivo: yoduro potásico, yodo y eventualmente verde brillante. pH final: 7,0 +/- 0,1

PREPARACION Suspender el medio de cultivo según recomendaciones de la casa comercial en 1 litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullición. Enfriar a 45ºC o menos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Agregar 20 ml de solución iodurada. Mezclar y distribuir 3 ml por tubo, en tubos estériles. No debe calentarse luego de agregar la solución iodada.

El medio base puede mantenerse a 4ºC , dura varios meses, pero una vez agregada la solución iodada debe usarse en el mismo día.

Medio preparado: Suspensión blanco lechosa.

CALDO STREPTOCOCO FAECALIS (SF) FUNDAMENTO Es un medio selectivo para la detección de Estreptococo faecalis. Se utiliza para la diferenciación de la especie Enterococo del grupo estreptococo bovis y otros estreptococos. Su uso esta recomendado en los análisis de aguas y otros materiales para detectar la presencia de Estreptococos fecales como indicador de contaminación.

La peptona de caseína y la dextrosa aportan los nutrientes requeridos para el crecimiento de los Enterococos. La ázida sódica muestra un efecto bacteriostático en las bacterias gram negativas por su acción inhibidora en las enzimas del sistema de transporte de electrones. El purpura de bromocresol es un indicador de pH. Una reacción positiva se evidencia mediante turbidez y un color amarillo-marrón debido a la fermentación de dextrosa y el cambio de color resultante del indicador purpura de bromocresol. Una reacción negativa se indica mediante la ausencia de cambio en el color morado del medio.

COMPOSICION Digerido pancreático de caseína, dextrosa, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico, ázida sódica, cloruro sódico y purpura de bromocresol. (Cuyas concentraciones dependen de la casa comercial).

El ázida de sodio es bastante explosiva si tiene contacto con las tuberías de plomo o de cobre cuando se eliminan por el desagüe por tanto se debe lavar con abundante agua.

PREPARACION Disolver la cantidad de medio recomendado por la casa comercial, en un litro de agua destilada, mezclar muy bien, cocinar para homogenizar, hervir, llenar los tubos de ensayo con 3 ml, tapar los tubos, etiquetar y esterilizar en autoclave. Enfriar en posición vertical.

Características del medio preparado: Purpura claro.

BIBLIOGRAFÍA www.scribd.com/.../Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquímicas.

Merck. MANUAL DE MEDIOS DE CULTIVO-Alemania 1994 Universidad de Pamplona, MANUAL DE MEDIO DE CULTIVO. quimicosclinicosxalapa04.spaces.live.com/.../cns!204AC1C68E772D5!1206.entry www.wikilearning.com/...medios_de_cultivo...medios_de_cultivo/17561-3 Microbiología (t. 2): bacteriología. Medios de cultivo y pruebas bioquímicas. Micología general. Parasitología general de granados Pérez, Raquel y Villaverde peris, maría Carmen Thompson paraninfo 1997