Criopreservação de sémen em pequenos ruminantes
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do sémen. Mas o teste decisivo da determinação da sua capacidade fertilizante é a sua utilização “in vivo” através da inseminação artificial (IA). A obtenção de uma boa fertilidade é o principal indicador da capacidade fertilizante do sémen criopreservado (Barbas et al., 2013; Romão et al., 2013). Os principais fatores que influenciam a qualidade do sémen são os seguintes (Barbas e Mascarenhas, 2009; Barbas et al., 2013; Romão et al., 2013): - espécie, raça, fatores individuais; - época do ano, método de recolha do sémen e frequência de ejaculação; - temperaturas de avaliação e processamento do sémen; - metodologias de avaliação quantitativa e qualitativa dos ejaculados; - composição dos diluidores, concentração e tipo de crio-protetores e antioxidantes; - metodologias de criopreservação do sémen: 1 ou 2 etapas (momento da adição e concentração em glicerol ou outro crioprotetor interno) de adição da fração glicerolada do diluidor; - equipamentos, curvas (velocidades de arrefecimento do sémen) de refrigeração e congelação (temperaturas e duração); - protocolos de descongelação do sémen criopreservado. EFEITOS DA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÉMEN A qualidade do sémen criopreservado e a sua capacidade fertilizante são significativamente inferiores comparativamente ao sémen fresco e ou refrigerado. A criopreservação é uma biotecnologia complexa e dispendiosa que requer equipamento e pessoal especializado. É uma metodologia traumática para os ejaculados recolhidos cujos efeitos dependem de múltiplos fatores, salientandose a qualidade dos ejaculados, a espécie animal, fatores individuais, diluidores de criopreservação e os protocolos de criopreservação aplicados (Barbas et al., 2013; Barbas et al., 2017). Os principais efeitos traumáticos da criopreservação a nível das células espermáticas são as crio-lesões espermáticas, em consequência de vários fatores físicos e osmóticos, como a formação de cristais de gelo (intracelulares), modificações da estrutura e composição fosfolipídica das membranas plasmáticas e organelos intracelulares, os quais têm efeitos determinantes na motilidade espermática, integridade do acrossoma e DNA, e capacidade fertilizante in vitro e in vivo (Barbas et al., 2000; Barbas e Mascarenhas, 2009; Horta et al., 2010). Torna-se assim necessário minorar os efeitos traumáticos, nomeadamente a formação de cristais de gelo, a diminuição das lesões das membranas plasmáticas e organelos intracelulares e no aumento da sobrevivência à congelação e descongelação através de estratégias para 16
RUMINANTES | JUL/AGO/SET 2020
aumentar a crioresistência dos spz (Sousa et al., 2001; Barbas et al., 2013; Barbas et al., 2017). PROPOSTAS PARA MELHORAR A CRIOPRESERVAÇÃO DO SÉMEN Sendo a criopreservação uma metodologia traumática para as células espermáticas é essencial continuar os estudos sobre os múltiplos fatores que a influenciam, com o objetivo de melhorar a qualidade do sémen criopreservado (estratégias para melhorar a crioresistência) (Barbas et al., 2017), designadamente as suas características morfofuncionais e capacidade fertilizante in vitro e in vivo (Barbas e Mascarenhas, 2009; Romão et al. 2013). As principais etapas a explorar para melhorar a qualidade dos criopreservados são: - a seleção dos machos após a sua avaliação andrológica, o seu libido e a qualidade dos ejaculados frescos e crio-preservados, avaliados pelo CASA; - o estudo e a formulação de novos diluidores contendo antioxidantes e aditivos, que melhorem a qualidade do sémen criopreservado (Barbas et al. 2013; (Barbas et al. 2017); - a testagem e refinamento de protocolos de criopreservação e descongelação do sémen (Horta et al., 2014; Barbas et al., 2013); - a testagem dos machos “in vitro” através de fertilização homóloga e heteróloga; - a utilização do sémen criopreservado “in vivo” através da inseminação artificial (IA) recolhendo a informação reprodutiva, com enfoque na fertilidade dos efectivos utilizados na experimentação (Barbas e Mascarenhas, 2009; Romão et al., 2013). DESCONGELAÇÃO DE SÉMEN A qualidade do sémen descongelado é influenciada por múltiplos fatores, nomeadamente a espécie, a variabilidade individual, a metodologia de recolha do sémen, a qualidade dos ejaculados, a concentração espermática por dose, a composição do diluidor e os protocolos de refrigeração (tempo de equilíbrio, temperaturas e duração do processo) e criopreservação (velocidades de arrefecimento, duração, e temperaturas) (Barbas e Mascarenhas, 2009; Horta et al., 2014) . A descongelação do sémen é realizada durante as primeiras 48 horas após a criopreservação em água à temperatura de 38 ºC durante 1 minuto. Habitualmente é descongelada 1 palhinha por ejaculado/ animal/sessão de criopreservação. Posteriormente, o seu conteúdo (0,25 ml) é depositado num tubo de ensaio (em banho maria a 38 ºC) contendo 1 ml de soro fisiológico (diluição de 1:4), iniciandose as observações 5 minutos mais tarde. Habitualmente avalia-se a mobilidade individual, vitalidade e morfo-anomalias
espermáticas. Unicamente os ejaculados com MI e % de Spz vivos ≥ 35 %, e com <25% de morfo-anomalias espermáticas (sémen descongelado) são selecionados e conservados em contentores de azoto líquido (Valente et al., 2010; Barbas et al., 2013). O sémen crio-preservado tem múltiplas utilizações, designadamente para o Banco Português de Germoplasma Animal (BPGA), em investigação e desenvolvimento experimental (avaliação da capacidade fertilizante) e em programas de melhoramento genético de raças autóctones de pequenos ruminantes (Barbas et al. 2017). Alguns autores (Barbas e Mascarenhas, 2009; Barbas et al., 2013), após observação de diferenças individuais na qualidade do sémen e sua congelabilidade, sugeriram ajustamentos individuais dos diluidores e/ou dos protocolos de criopreservação de sémen em pequenos ruminantes. Ungerfeld et al., (2017) verificaram nas espécies selvagens e/ ou nas espécies recentemente domesticadas que existia uma maior variabilidade individual na congelabilidade do sémen, comparativamente a outras espécies há muito domesticadas. CONCLUSÕES E PERSPETIVAS • A tolerância dos ejaculados para a criopreservação é fortemente condicionada por múltiplos fatores, salientando a espécie, raça, qualidade dos ejaculados, variabilidade genética individual, época do ano, composição dos diluidores e os protocolos de criopreservação utilizados (Barbas et al., 2009). • A congelação é uma biotecnologia que diminui a qualidade do sémen acrescido do facto de haver uma percentagem importante de animais cujo sémen não é apto para a congelação (Barbas et al., 2017). • Podem verificar-se variações na qualidade do sémen congelado em função da espécie, raça, indivíduos e época do ano em que é recolhido o sémen. • Há que continuar o desenvolvimento de estudos para melhorar a crio-resistência do sémen e o aumento da sua capacidade fertilizante (Barbas et al., 2017). • Habitualmente, os ejaculados com maior mobilidade individual sugerem uma maior fertilidade. Todavia, estes resultados carecem ser confirmados em programas de inseminação artificial (Barbas et al., 2013) . • A utilização da inseminação artificial (IA) permite a utilização de sémen de reprodutores de alto valor genético para características desejáveis, como o aumento da produtividade e a qualidade dos produtos tais como a carne, leite, lã e/ou pelo (Barbas et al., 2016; Cavaco-Gonçalves et al., 2017).
As referências Bibliográficas serão disponibilizadas através dos emails dos autores. Agradecimentos: Trabalho realizado no âmbito do Projecto ALT-Biotech.
