Innowacyjne technologie: szybkie i proste
przygotowanie bibliotek NGS oraz interpretacja wyników
UMI – Unique Molecular Indices - Znaczniki (barcodes) do identyfikacji unikalnych cząsteczek DNA/miRNA/mRNA. UMI to krótkie, dwunastonukleotydowe, przypadkowe sekwencje, które są dodawane na etapie przygotowywania biblioteki NGS przed wzbogacaniem za pomocą PCR. Ich zadaniem jest „wyznakować” każdą cząsteczkę DNA/miRNA/mRNA jaką mamy w próbce. Jest ponad 16 milionów kombinacji UMI, zatem zakłada się, iż każda cząsteczka otrzyma swój niepowtarzalny znacznik. Analiza danych oparta na chmurze w GeneGlobe Data Analysis Center dla każdego produktu wykorzystującego UMI jest darmowa.
Fałszywie pozytywne wyniki: błąd PCR lub samego sekwencjonowania Konwencjonalne ukierunkowane sekwencjonowanie DNA / RNA
Ekson 21
*
Mutacja jest widoczna w 1 na 5 odczytów. Nie można dokładnie określić, czy mutacja jest: 1. Błędem PCR lub sekwencjonowania (np. Artefakt lub fałszywy wynik pozytywny) 2. Prawdziwą mutacją o niskiej częstotliwości UMI przed jakąkolwiek amplifikacją
Cyfrowe sekwencjonowanie z UMI
UMI
*
Fałszywy wariant występuje w niektórych fragmentach niosących ten sam UMI
UMI
** *** Prawdziwy wariant występuje we wszystkich fragmentach niosących ten sam UMI
Błędy i niedokładności w oznaczaniu ilościowym Ekson 21
Konwencjonalne ukierunkowane sekwencjonowanie DNA / RNA
Pięć odczytów, które wyglądają dokładnie tak samo Nie można stwierdzić, czy reprezentują: 1. Pięć unikalnych cząsteczek DNA / RNA, lub 2. Pięciokrotne powielenie tej samej cząsteczki DNA / RNA (duplikaty PCR) UMI przed jakąkolwiek amplifikacją
Cyfrowe sekwencjonowanie z UMI
Pięć unikalnych cząsteczek DNA / RNA wykryte za pomocą 5 różnych UMI
UMI
UMI
Pięciokrotne powielenie tej samej cząsteczki DNA / RNA (duplikaty PCR) wykryte za pomocą 1 UMI