ODREĐIVANJE NEKIH FENOLSKIH KISELINA I RUTINA U LISTU KADULJE

PRIREDILA: Aida Etminan dipl. ing. hemije RUBRIKA: Hemija

ODREĐIVANJE NEKIH FENOLSKIH KISELINA I RUTINA U LISTU KADULJE, SALVIA OFFICINALIS L., (LABIATAE) VISOKOTLAČNOM TEKUĆINSKOM KROMATOGRAFIJOM I ELEKTRO‐ KEMIJSKOM DETEKCIJOM (HPLC‐ED)

SADRŽAJ:

1. UVOD__________________________________________________________________4 1.1. Polifenolna jedinjenja____________________________________________________4 Fenolske kiseline____________________________________________________________7 Klorogenska kiselina________________________________________________________10 Ruzmarinska kiselina________________________________________________________11 Galna kiselina______________________________________________________________12 Kafena kiselina_____________________________________________________________12 1.2. Heterozidi (glukozidi, glikozidi)____________________________________________13 Kemijske osobine heterozida__________________________________________________16 Flavonoidni heterozidi_______________________________________________________16 Fizičko – kemijske osobine flavonoida__________________________________________19 Rutin_____________________________________________________________________20 1.3. Kromatografija_________________________________________________________22 Visokotlačna tekućinska kromatografija (HPLC)__________________________________22 Tipovi HPLC_____________________________________________________________24 Komponente uređaja za HPLC________________________________________________25 Detektori u HPLC sistemu____________________________________________________27 Elektrokemijski detektori (ED)________________________________________________27 2. CILJ RADA_____________________________________________________________28 3. MATERIJAL I METODE _________________________________________________29 Biljni materijal_____________________________________________________________29

1

Kadulja, Salvia Officinalis L., (Labiatae)________________________________________29 Kemikalije i reagensi_______________________________________________________31 Pribor i oprema____________________________________________________________32 Priprema standardne otopine_________________________________________________33 Priprema uzorka___________________________________________________________33 Priprema mobilne faze______________________________________________________34 Osnovne komponente HPLC-ED sistema_______________________________________34 4. REZULTATI___________________________________________________________36 Kromatogrami standardnih otopina fenolskih kiselina (klorogenska, galna, kafena i ruzmarinska kiselina) i rutina_________________________________________________37 Kromatogram fenolskih kiselina (klorogenska, galna, kafena i ruzmarinska kiselina) i rutina u suhom listu kadulje porijeklom iz Antalije_______________________________________42 Kromatogram fenolskih kiselina (klorogenska, galna, kafena i ruzmarinska kiselina) i rutina u suhom listu kadulje porijeklom iz Dalmacije_____________________________________43 Kromatogram fenolskih kiselina (klorogenska, galna, kafena i ruzmarinska kiselina) i rutina u suhom listu kadulje porijeklom iz Mosora_______________________________________44 5. DISKUSIJA____________________________________________________________46 6. ZAKLJUÄŒAK___________________________________________________________47 7. LITERATURA__________________________________________________________49

Â

2

1. UVOD

1.1. Polifenolna jedinjenja Polifenolima pripadaju različita jedinjenja, ali su uglavnom to jedinjenja fenolne, odnosno polifenolne strukture. U prirodi se polifenolna jedinjenja nalaze slobodna ili u obliku glikozida, a mogu da stvaraju i komplekse sa nekim drugim molekulima. Ova jedinjenja su najčešće prisutna u biljkama, ali ih ima i u životinjama i mikroorganizmima. Polifenolna jedinjenja, odnosno aromatski prstenovi u prirodi mogu da nastanu na više načina. Fenoli su jedinjenja koja za aromatsko jezgro imaju vezanu bar jednu hidroksilnu grupu (Mattila i sar., 2006). Najvažniji put sinteze polifenolnih jedinjenja, koji se odvija u višim biljkama, je ciklus šikiminske kiseline. Kondenzacijom eritroza-4-fosfata i fosfoenolpirogrožđane kiseline, preko niza međuproizvoda, nastaje šikiminska kiselina, ključni intermedijer po kome je ova sinteza i dobila naziv. Iz šikiminske kiseline dobijaju se aromatske amino kiseline, L-fenilalanin i Ltirozin. Daljim transformacijama L-fenilalanina i L-tirozina dobijaju se različite klase polifenolnih jedinjenja. Šikiminska kiselina se preko fenilalanina, prevodi u cimetnu kiselinu, odnosno phidroksicimetnu kiselinu, koja je ključni intermedijer u biosintezi fenilpropanskih struktura, fenilpropena, kumarina, lignana i lignina. S druge strane, u reakciji p-hidroksicimetne kiseline sa tri malonatne jedinice nastaju flavonoidi, odnosno izoflavonoidi (najbrojnije klase biljnih polifenola), ksantoni, stilbeni i proantocijanidini, odnosno kondenzovani tanini. U literaturi se navode različite podjele fenolnih jedinjenja.

Smatra se da polifenolna jedinjenja ispoljavaju antioksidativnu aktivnost na sljedeće načine: predajom H-atoma, direktnim vezivanjem („hvatanjem“) slobodnih kisikovih i azotovih radikala, heliranjem prooksidativnih metalnih jona (Fe, Cu) i inhibicijom prooksidativnih enzima (lipooksigenaza, mijeloperoksidaza, ksantin-oksidaza, NAD(P)H oksidaza, enzimi citohroma P-450) (Robbins, 2003). Polifenoli manje molekulske mase su odlični antioksidanti. S porastom molekulske mase antioksidativna aktivnost se smanjuje.

3

Slika 1.

Bio osinteza poliifenolnih jeddinjenja

U Tabeli 1. je prikaznaa podjela ffenolnih jed dinjenja preema broju konstitutivnnih ugljikovihh atoma vezzanih za osnnovni skelet fenola. Poslljednjih godina su mnogga polifenolnna jedinjenjaa privukla pažnju p naučnnika koji see bave mediicinom i kem mijom hranee zbog svojih antioksiddativnih,

a antiflamatorn nih,

antim mutagenih,

antikanceroogenih,

an ntibakterijskiih,

antiviraln nih, antiproliferativnih, vazodilatoornih osobinna, kao i njihove sp posobnosti da d mijenjajuu funkciju neekih ključnih h ćelijskih ennzima (Mattiila i sar., 20006).

Tabela 1. Podjela fennolnih jedinjjenja

Fenolskee kiseline

Fenolske kiseline su velika grupa fenolnih jeedinjenja kooja se nalazee u hrani biljjnog porijekkla (Mattila i sar., 2006).. Fenolske kiiseline su hiddroksilovanii derivati bennzojeve i cim metne kiselinne (Slika2.).. Najzastupljeniji hidrooksi derivatti benzojeve kiseline su: p-hidrooksibenzojevva, vanilinskka, galna, protokatehinsska, siringinnska, gentizzinska i elaaginska kiseelina, koje su s prisutne uglavnom u u obliku glukoozida u biljkkama (Herrm mann, 1989).

Slikka 2. Benzoevva i cimetnaa kiselina

Sliika 3. Struktturne formulle najva탑nijih h fenolskih kkiselina

Protokatehinska kiselina je prisutna u biljkama različitih familija, a galna kiselina je komponenta mnogih taninskih materija (galotanini). Pored slobodnih hidroksilnih grupa za aromatično jezgro mogu biti vezane i metoksi grupe kao što je to slučaj kod vanilinske kiseline: Prokatehinska kiselina

Galna kiselina

Vanilinska kiselina

Slika 4.

Molekuli

galne

kiseline

mogu

da

grade

novu

C-C

vezu,

pri

čemu

nastaje

heksahidroksidifenska kiselina, koja eliminacijom daje elaginsku kiselinu:

Slika 5. Elaginska kiselina Najzastupljeniji hidroksi derivati cimetne kiseline su: p-kumarinska, kafena, ferulna i sinapinska kiselina (Slika 6.) koje su često prisutne u hrani kao estri sa kvinskom kiselinom ili glukozom. Najpoznatiji ester kafene i kvinske kiseline je klorogenska kiselina.

7

p-Kum marinska kiseelina Kafen na kiselina

Ferulna kiselina k

Sinapinska kiselina

Slika 6. g svoje spossobnosti da predaju p voddik Fenolske kiseline su poznati antiioksidanti ne samo zbog ili elektrron već i zato što njihhovi stabilnii interemedijeri radikalla sprječavaaju oksidacij iju različitih komponentti žitarica, naročito maasnih kiselinna i ulja. A Antioksidativvna aktivnoost p n na fenolskihh kiselina jee povezana sa strukturoom tj. supstituentima i njihovim položajem aromatičn nom prstenuu i strukturo om bočnog nniza. Smatraa se da je pprisustvo CH H=CH-COO OH grupe kod hidroksi derivata d cimeetne kiselinee razlog za znatno z višu antioksidatiivnu aktivnoost nego COOH grupe kod k hidroksi derivata bennzoeve kiselline. Takođeer, veći broj hidroksilnihh i metoksilnnih grupa i naročito prrisustvo o-ddihidroksi grrupe na fennolnom prsteenu povećavva antioksiddativnu aktiv vnost kao na primjer kodd kafene kiseeline. Fenolske kiseline imaju i različiite funkcije u biljkama uključujući asimilacijuu hranljivih materija, siintezu proteina, aktivnoost d benzoeve i cimettne kiseline ssu prisutni u hrani biljnoog enzima i fotosintezu. Hidroksi derivati s u svim djjelovima biljjaka u sjemeenu, korijennu, porijekla (voće, povrrće, žitarice)) tj. nalaze se Robbins, 20003). Samo m manji dio fenoolskih kiseliina se nalazii u slobodnoom lišću, stabbljici itd. (R obliku dook je većinna povezanaa estarskom,, etarskom ili acetalnom m vezom sa strukturniim komponeentama biljak ka (celulozoom, proteinima i ligninoom), ili sa polifenolima p a (flavonoidii), manjim organskim o m molekulima (glukoza, kkvinska, maaleinska i vvinska kiseliina) i drugiim prirodnim m proizvodim ma (terpeni)). Fenolske kiseline nissu jednako raspodijeljeene u biljnoom tkivu. Poored toga, tookom različčitih stadijum ma rasta prisutne su raazličite feno olske kiselinne.

Uslovi raasta, kao što o je temperaatura, tako nne utiču na sadržaj fennolskih kisellina (Robbinns, 2003).

Klorogenska kiselina

Najpoznatiji ester kafene i kvinske kiseline je klorogenska kiselina. Ova tvar je dugo poznata kao antioksidans, također usporava oslobađanje glukoze u krvotok nakon obroka.

Strukturalno, klorogenska kiselina (CGA) je ester formiran između kafene i kvinske kiseline.

Slika 7. Strukturna formula klorogenske kiseline

Ova kiselina je bitan faktor u metabolizmu biljaka. Igra važnu ulogu kao intermedijer u biosintezi lignina. Posjeduje anti-kancerogena svojstva, te može smanjiti pojavu učestalosti raka i hroničnih degenerativnih bolesti. Ona je također antioksidant i tvrdi se da ima antiviralna, antibakterijska i antifugalna svojstva. Antioksidanti su jedinjenja koja kada su prisutna u nižim koncentracijama, u odnosu na supstrate koje oksidišu, mogu da spreče ili značajno umanje njihovu oksidaciju (Pejin, 2009). Klorogenska kiselina je “biomarker” stupnja zrelosti ploda. Što je sadržaj klorogenske kiseline u plodu niži plod je zreliji.

9

Ruzmarinska kiselina

Ruzmarinska kiselina, kemijske formule C18H16O8, je prirodni polifenolni antioksidant karboksilne kiseline pronađen u raznim biljkama, prvenstveno u ruzmarinu koji se upotrebljava uz ostalo i kao začin. To je crveno-narandžasti puder koji se teže otapa u vodi, a lako u organskim otapalima. Pripada skupini fenolnih sekundarnih metabolita. Ester je kafene kiseline i 3,4-dihidroksifenil-mliječne kiseline.

cimetna kiselina glukoza

4-hidroksicimetna kiselina

L-Phe

OH

O

Šikiminska kiselina

O

OH

OH

kava kiselina

ružmarinska kiselina

O HO OH

ružmarinska kiselina 3,4-dihidroksifenilmliječna kiselina

L-Tyr

4-hidroksifenilpiruvat

4-hidroksifenilmliječna kiselina

Slika 8. Biosinteza ruzmarinske kiseline

10

Galna kiiselina

Galna kiiselina je organska o kiiselina poznnata i kao 3,4,5-trihiddroksibenzojjeva kiselinna.

Kemijskaa formula gaalne kiseline je C6H2(OH))3COOH. Pozznata je u sloddodnom stanju, a i kao dioo u sastavu taanina. Uobičaajena joj je upotreba u u farrmaceutskoj industriji za razne lijekovee za bolesti kaao što su dijabetes i psorrijaze. Takođ đe se upotrebbljava i kao početni p materrijal u sintezi psihodeličnnih alkaloida. Ponaša se kaao antioksidanns i pomaže u zaštiti čelija od oštečenja.

Slika 9.

9 Strukturnaa formula gaalne kiseline

Kafena kiselina

Kafena kiselina k se može m naći u svim biljkkama jer je ključna u bbiosintezi liignina koji je osnovni izvor i biomaase. Katalizirrana enzimiima transforrmira se u fu furalnu kiselinu. Pokazuuje imunomo odulatorne i antiupalne aktivnosti, a a također je poznata p kaoo antioksidannt in vitro i in vivo. Nijje povezanaa sa kofeino om, niti su joj dokazaana kanceroogena svojsttva iako neeki eksperim menti pokazujju takve efekkte.

Slika 10 0. Strukturnaa formula kaf afene kiselinee

1.2.Heterozidi (glukozidi, glikozidi)

Značajnu grupu farmakološki aktivnih i terapijskih korisnih sekundarnih metabolita biljaka predstavljaju heterozidi, glukozidi ili glikozidi. Kemijska struktura ove grupe metabolita je veoma raznovrsna. U osnovi, to su kompleksi šećera (glikona) sa nekim drugim, organskim, nešećernim jedinjenjem (aglikonom). Povezanost ova dva dijela ostvaruje se eterskom, glikozidnom vezom, pa od toga i potiče njihov naziv. Kada je razjašnjena struktura prvih izolovanih jedinjenja, vladalo je mišljenje da samo glukoza, odnosno glikoza, kako se tada zvala, učestvuje u njihovoj izgradnji. Zbog toga je ova grupa jedinjenja nazvana, glikozidi.

Kemijski definisan naziv heterozidi sadrži podatke o šećerima i načinu njihovog povezivanja međusobno i sa aglikonom. Tako, rutin je kvarcetin – 3 – rutinozid, odnosno 3,3' ,4', 5,7pentahidroksiflavon- 3- rutinozid. Karakterističan dio heterozida prestavlja aglikonska komponenta.

Podjela

heterozida

je

izvršena

baš

na

osnovu

kemijske

prirode

aglikona.Heterozidi su specifični biljni metaboliti, kompleksne strukture. Pod uticajem enzima, kiselina, baza ili zagrijavanjem dolazi do njihove razgradnje (hidroliza glikozidne veze). Tada se oslobađaju šećeri (jedna ili više molekula monosaharida) i neko organsko, nešećerno jedinjenje (aglikonska komponenta). Heterozidi su široko rasprostranjeni u biljkama. Naročito je interesantno da jedna ista biljna vrsta, sadrži i po nekoliko različitih grupa heterozida. Pošto su hidrosolubilni, u ćeliji se nalaze u vakuolama, rastvoreni u ćelijskom soku (Kovačević, 2002). Određeni broj heterozida je obojen (neki flavonoidi, ksantoni), pa se već i golim okom ili mikroskopski, može utvrditi njihova lokalizacija u tkivu i ćeliji. Kao droge se koriste oni dijelovi biljke koji sadrže najveću količinu ovih metabolita, ranije se do ovih podataka dolazilo na osnovu zapažanja i iskustva, danas na osnovu ispitivanja, kvalitativne i kvantitativne analize sirovine. Nekada su u biljkama pored heterozida, u malim količinama akumulirani i njihovi slobodni aglikoni. Takav je slučaj kod flavonoidnih i antrahininskih heterozida. Funkcija heterozida u biljci u kojoj nastaju nije u potpunosti razjašnjena. Njihova uloga je sigurno povezana s kemijskom prirodom aglikona.

Neke vrste heterozida su pigmenti odgovorni za boju listova, cvijetova i plodova biljaka.

Neke vrste heterozidnih jedinjenja su neophodne za funkcionisanje određenih enzimskih sistema biljne ćelije. Za biljku je veoma važno i zaštitna uloga koju imaju heterozidi. Veliki broj ovakvih struktura pokazuje in vitro antimikrobnu aktivnost, a zovu se fitoaloksini. Ovim pojmom su obuhvaćeni svi sastojci biljaka koje one sintetišu kao odgovor na infekciju

12

bakterijam ma, virusimaa i gljivama. Zaštitna uloga heteroziida ogleda see i u njihovo oj sposobnossti apsorpcije ljubičastoog dijela sunnčevog spekktra. Biljka se štiti od štetnog djellovanja nekkih npr. cijanidnnog jona) tak ko što ga veezuje u obliiku heterozidda produkataa svoga mettabolizma (n (Kovačevvić, 2002).

Slika 11.

Razliičite strukturre aglikonskkih heterozidda

Povezivaanjem sa šeććerom, značčajno se mijenjaju osobine aglikonsske komponnente, a timee i njihova toksičnost. t Heterozidi se međusobbno razlikujju po kemiijskoj prirod di aglikonskke komponeente, pa su na n osnovu tooga izdvojenne grupe i izzvršena podjjela droga koje k ih sadržže.

Aglikonsske kompon nente, nastajju različitim m biosintetsskim putevim ma.Veliki broj b različittih polifenolnnih, terpenskih i steroiddnih jedinjenja se u bilj ljkama nalazzi povezan sa s šećerima u obliku heeterozida.U šećernom š dij ijelu molekuula heterozidda, najčešće ssu zastupljenni jednostavvni šećeri i to t heksoze i pentoze, koje k su uobiččajno prisutnne u tkivu bbiljke (glukooza, galaktozza, manoza). Šećeri prrirodnih heeterozida suu β-D konnfiguracije, lijevogiri i najčešće u p se s poluacetaalnom oblikku. Sekundaarna, alkohoolna, poluaccetalna gruppa šećera povezuje protonom m koji je poriijeklom iz agglikona, izdvvaja se voda i stvara se hheterozid.

Proton može biti izdvojen sa različitih hidroksilnih, aminogrupa ili se odvaja direktno sa ugljika osnovnog skeleta aglikona. Zato postoje različite vrste označene kao O, S , N, ili C heterozidi. Stabilnost ovih heterozida je različita, najteže hidroliziraju C heterozidi. Procesi formiranja odvijaju se u prisustvu više ili manje specifičnih enzima. Slično, i razgradnja heterozida je posljedica aktivnosti odgovarajućih enzima npr. glukozidaze, hidrolaze i drugih.

Najčešće su enzimi “razgraditelji” prostorno odvojeni od heterozida u tkivu biljke. Vjerovatno se na ovaj način biljka štiti od štetnog djelovanja oslobođenih aglikonskih komponenata. U okviru šećernog dijela molekula heterozida pojavljuju se monosaharidi, disaharidi ili oligosaharidi, oligosaharidi od četiri molekule šećera su povezani za aglikon u kardiotoničnim heterozidima. Šećer je najčešće vezan samo za jedno mjesto na aglikonu (monozid), sreću se heterozidi sa dva lanca šećera (biozidi), rjeđe sa više od tri niza. Processinteze aglikonskih komponenata i formiranje heterozida u stalnoj je dinamičkoj ravnoteži, a uslovljen je potrebama biljnog tkiva, prisustvom

odgovarajućih enzima i supstrata, te njihovim

prostornim kontaktom.

Slika 12.

Mehanizam vezivanja šećera za aglikon

14

Kemijske osobine heterozida

Izolovani iz biljnog tkiva, heterozidi su čvrsta jedinjenja, kristalne ili amorfne strukuture.

Rastvorljivi su u vodi, alkoholima i uopšte, polarnim rastvaračima. U zavisnosti od vrste, heterozidi mogu biti obojeni i predstavljaju značajne biljne pigmente (neki flavonoidi, ksantoni, antocijani). Više ili manje su gorkog okusa. Aglikonske komponente su uglavnom kristalne strukture. Najčešće su neisparljivi, a neke vrste aglikona zagrijavanjem sublimiraju (kumarinski i neki fenolni aglikoni). Optički su aktivni. Lipofilni su i rastvaraju se u nepolarnim rastvaračima (acetonu, hloroformu, eteru). Za dokazivanje heterozida u biljkama ili drogama najčešće se koriste hemijske reakcije. Jedino zajedničko za sve grupe heterozida je činjenica da se poslije njihove hidrolize dobijaju redukujući šećeri. Međutim, pošto su šećeri univerzalni sastojci biljnog tkiva, ne mogu biti iskorišteni za dokazivanje prisustva heterozida. U ovakve svrhe se može iskoristiti prisustvo specifičnih šećera, takav primjer su deoksi – šećeri iz kardiotoničnih heterozida. Svaka specifična grupa heterozida može se dokazati na osnovu fizičkih i hemijskih osobina aglikonske komponente . U stvari, hetorozidi se najčešće dokazuju u biljkama i drogama na osnovu hemijske reakcije na aglikonsku komponentu .Kao i za dokazivanje prisustva heterozida u drogama tako i za njihovo određivanje, izbor metode je povezan sa hemijskom prirodom aglikonske komponente. Ako se posmatraju propisi za definisanje kvaliteta oficinalnih heterozidnih droga, primjećuje se velika raznovrsnost metoda. Najčešće se koriste kolorimetrijske i uopšte spetroskopske metode (flavonoidni, fenolni, antocijanski heterozidi). Nekada su to gravimetrijske, organoleptičke ( droge sa gorkim heterozidima ) i biološke metode ( Kovačević, 2002 ).

Flavonoidni heterozidi

Kao aglikonska komponenta ovih heterozida, javlja se molekul flavonoida. Osnovno jedinjenje je Kostanesku izolovao 1895. godine i nazvao '' flavon ''

(latinski flavus-žut), pa

je po njemu i velika grupa kemijskih sličnih jedinjenja dobilo ime. U osnovi molekula aglikona, nalazi se a.) γ-piron (piranon-4), b.) benzo-γ-piron (hromon) i c.) 2-fenil-benzo-γpiron (flavon).

15

a.)

b.)

c.)

Slika 13. noidnih aglikkona Osnovnee strukture skeleta flavon

Flavonoiddi predstavljjaju najvećuu grupu biljnnih polifenolla. U prirodi se javljaju kao sloboddni ili u oblik ku heterozid da. Do sada je j izolovanoo preko 5000 0 jedinjenja koji k pripadaj aju ovoj gruppi. Široko suu rasprostraanjeni u biljjnom svijetuu. Najveća raznovrsnost struktura flavonoidnnih heterozidda nalazi see kod skrivenosjemenjaača, tako daa je u vrsttama familijje Asteraceaae identifikoovano preko o 30 različitiih flavonoiddnih tipova. To su biljni pigmenti. Heterozidi ssu rastvorni u vodi i naalaze se u ćelijskom sokku, u vakuoolama epiderrmalnih i ćeelija mezofilla. ni su za bojju cvjetova, plodova i llistova biljakka. Kada niisu sami po sebi obojenni, Odgovorn flavonoid di se javljaju u kao kopigm menti. Flavoonoidi imajuu karakteristtičan apsorppcioni spektaar.

Zato, i kaada ih ljudskko oko ne primjećuje p kao boju laticca cvijeta, ooni su vidljiv vi za insektee i usmjeravvaju ih ka centralnom c dijelu cvijeeta gdje se nalazi nekktar i polen,, medna šaara (Kovačevvić, 2002). Heterozidi su koncenttrisani u epidermalnim ćelijama. Smatra S se da d ovakva lokalizacija štiti biljku od štetnih efekata e ultraaljubičastog zračenja. Zaštitna Z ulogga da ogleda see i u njihovvoj antimikrobnoj aktivnnosti, a za bbiljku u kojjoj nastaju su s flavonoid značajni i kao sastavvni dijelovi enzimskih sistema, neoophodnih zaa obavljanje metaboličkkih o možže da sadržži 1, 2 ili 3 procesa. U okviru flavonoidnihh heterozida, šećerni ostatak ovezani. Najjčešće se gluukozidna vezza monosaharida, koji su međusbnoo linearno ilii račvasto po

ostvarujee preko fennolnih grupaa aglikona. Gotovo daa je praviloo da flavonni grade 7-0heterozidde, a flavonooli,

3-O-hheterozide. Flavonoidi F čeesto grade cc-heterozide.. Ove stabilnne

heterozidde grade flavvoni, flavonnoli i halkonni. Dolazi do o povezivannja asimetriččnog C atom ma šećera sa C6 ili C8 ag glikona (Slikka 14.).

Slika 14. fl a aglikoni i hetterozidi Najrasprosstranjeniji flavonoidni

Strukturu glikozida flavonolskog tipa pokazuje glikozid rutinozid, prvi put izoliran iz droge (Herba Rutae graveolens) koji hidrolizom daje šećere glukozu i ramnozu (glukoza + ramnoza = rutinoza) te aglukon kvercetin (5,7,3 , 4 - tetraoksiflavonol).

Slika 15. Struktura rutinozida

Slika 16. Struktura kvercetina

Fizičko –kemijske osobine flavonoida

Flavonoidni heterozidi su rastvorni u vodi, alkoholima i polarnim rastvaračima. Aglikoni su lipofilni i rastvaraju se u nepolarnim rastvaračima. Heterozidi i aglikoni imaju specifičan apsorpcioni spektar, najčešće s dva maximuma. Obično se javljaju 2 trake apsorpcije od 300 do 380 nm (potiče od prstena b) ; 240-280 nm (potiče od prstena a). Flavonoidi su rijetko vidljivi pri dnevnom osvjetljenju a pod ultraljubičastom svjetlosću floresciraju. Za dokazivanje prisustva flavonoida u biljkama i drogama, može biti iskorištena specifična flurescencija kompleksa ovih jedinjenja sa oksalnom i bornom kiselinom. Takođe, u kiseloj sredini ( klorovodonična kiselina ) uz prisustvo redukcionog sredstva ( opiljci magnezijuma ili cinka ), flavonoidi, u metanolnom ekstraktu droge, prevode se u crveno obojene antocijane.

Pojava narandžaste, crvene ili bordo boje, ukazuje na prisustvo različitih tipova flavonoida.

Ovo je ''cijanidinska reakcija '', brza je i pouzdana. Za odredjivanje flavonoidnih jedinjenja, najčešće se primjenjuju kolorimetrijske ili spektrofotometrijske metode. Sve više se koristi i metoda tečne kromatografije, jer je brza i omogućava definisanje odnosa jedinjenja u okviru smjese metabolita u drogama. Za prečišćavanje i izolaciju pojedinačnih jedinjenja koriste se preparativne kromatografske tehnike, kromatografija na tankom sloju poliamida, celuloze ili

18

sefadeksa. Sve se više koristi tečna kromatografija na kolonama popunjenim reverznom fazom (C8 i C18) uz mješavinu vode ili acetonitrila i kiselog metanola. Osnovna farmakološka aktivnost flavonoida, povezana je s njihovim djelovanjem na zid krvnih sudova periferne cirkulacije. Smanjuje permeabilnost i krtost, a povećavaju elastičnost i osnovni tonus zida kapilara. Jedno vrijeme je zbog ovakvih djelovanja flavonoidima pripisivan vitaminski karakter i nazvali su ih vitaminom P, danas se ovaj naziv sve manje koristi.

Djelovanje flavonoida na kapilare može biti objašnjeno njihovom sposobnošću, da kao donori protona, spriječavaju redukciju dehidroaskorbinske kiseline i na taj način štite vitamin C. Flavonoidne droge, koncentrovani ekstrakti ili pojedinačne supstance se koriste u terapiji različitih oboljenja koja su uslovljena poremećajem i insuficijencijom krvnih i limfnih sudova periferne cirkulacije. Primjenjuju se kod insuficijencije koronarnih i cerebralnih krvnih sudova. Neki flavonoidi inhibiraju enzim fosfodiesterazu i smanjuju agregaciju trombocita, pa se koriste u profilaksi i kao dodatna terapija oboljenja povezanih s pojavom tromboze. Brojni su primjeri antimikrobne, citostatske, antioksidativne aktivnosti i aktivnosti vezivanja slobodnih radikala flavonoidnih jedinjenja iz biljnih ekstrakata. Flavonoidne droge, pojedinačne ili u mješavinama, koriste se za izradu različitih galenskih oblika. Danas se proizvode standardizovani ekstrakti flovonoidnih droga, koncentrati flavonoidnog kompleksa ili pojedinačna jedinjenja (diosmin, rutin). Ove droge pored flavonoidnih heterozida, sadrže i druga jedinjenja (druge vrste heterozida, tanine ili etersko ulje), pa su terapijski efekti primjenjene droge ili ekstrakta, najčešće rezultat djelovanja ukupnog kompleksa sastojaka.

Ekstrakti, smjese flavonoida ili izolovana jedinjenja, predstavljaju osonovu za izradu fitopreparata. Posljednjih godina flavonoidi su izuzetno interesantni za istraživače, shodno tome, na svjetskom tržištu se nalaze brojni fitopreparati koji su zasnovani na aktivnosti ove grupe jedinjenja (Kovačević, 2002).

Rutin

RUTIN kvercetin-3-O-rutinozid C27H30O16 x 3H2O, glikozid, žutozeleni ili svijetložut prah, bez ukusa. Molekulska tezina 664.59 ,tačka topljenja oko 190 °C , raspada se na 215°C. Slabo se rastvara u hladnoj vodi , znatno bolje u vreloj vodi i vrelom etanolu. Rastvara se u izopropil alkoholu, piridinu talijum i natrijum – hidroksidu. Upotrebljava se u medicini (Kostić, 1980).

19

Slika17. Struktura rutina

Rutin je heterozid koji hidrolizom daje kvercetin, glukozu i ramnozu. Rutin je dobio ime po ruti, jer je u njoj otkriven (Tucakov, 1978). Rutin je možda najznačajniji i najviše korišteni flavonoidni heterozid. Predstavljao je najvažniju komponentu kompleksa, bioflavonida ili vitamina P. Ovaj heterozid je široko zastupljen u biljkama, ali je samo u pojedinim vrstama akumuliran u većoj količini.

Rutin se najviše dobiva iz pupoljaka japanskog bagrema. Ekstrakcija se radi ključalom vodom, a do odvajanja praha rutina dolazi već tokom hlađenja. Prekristalizacija se vrši iz etanola. Polusintetski derivati se pripremaju da bi se poboljšala rastvorljivost (Kovačević, 2002).

20

1.3. Kromatografija

Kromatografija je metoda separacije komponenata smjese koja se bazira na razlici u raspodijeli komponenata između dvije faze, koje se ne miješaju. Jedna faza je pokretnamobilna faza, a druga je nepokretna-stacionarna faza. Kao stacionarna faza primjenjuju se čvrste ili tečne supstance, dok se kao mobilna faza koriste tečnosti ili gasovi. Pri razdvajanju i analizi organskih supstanci koriste se slijedeći oblici hromatografije.

Plinska kromatografija prema karakteristikama razdvajanja se dijeli na: plinsko-čvrsta kromatografija je oblik kromatografije u kome se razdvajanje vrši pomoću mobilne gasne faze, koja prelazi zajedno sa analiziranom smjesom preko čvrstog adsorbensa, plinsko-tečna kromatografija kod koje kao stacionarna faza služi organska supstanca koja kod temperature izvođenja kromatografije prelazi u tečno stanje.

Gel kromatografija ili gel filtracija vrši separaciju na principu molekularnog sita.

Jonoizmjenjivačka kromatografija koristi različite afinitete jona iz otopine prema jonoizmjenjivačkim centrima suprotne polarnosti u stacionarnoj fazi.

Kromatografija na tankom sloju je oblik kromatografije kod koga se tanki sloj adsorbensa nanosi na staklenu ploču ili aluminijsku foliju Papirna kromatografija je oblik podione kromatografije kod koje je stacionarna faza voda, nosač papir a mobilna faza organsko otapalo Tekućinska kromatografija može biti: Tečno-adsorpciona kod koje se koristi razlika u afinitetu komponenata prema čvrstoj stacionarnoj fazi.

Tečno podiona koristi razliku u topivosti između tečne mobilne faze i tečne stacionarne faze koja se nalazi na inertnom nosaču.

HPLC kromatografija je poseban oblik tečne kromatografije. To je kromatografija pod visokim tlakom.

Visokotlačna tekućinska kromatografija (HPLC)

Kromatografska analiza služi za odjeljivanje, identifikaciju i kvantitativno određivanje hemijskih sastojaka prisutnih u složenim smjesama. Nijedna druga metoda hemijske analize

21

nije tako moćna i nema tako svestranu mogućnost primjene kao kromatografija. Teško je precizno definirati rijec „kromatografija“, jer se njome označava velik broj analitičkih sistema i tehnika. Međutim, svim kromatografskim postupcima zajedničko je postojanje stacionarne (nepokretne) i mobilne (pokretne) faze. Pri kromatografskim analizama plinovita ili tekuća mobilna faza nosi sastojke uzoraka kroz stacionarnu fazu, a odjeljivanje sastojaka temelji se na njihovim različitim brzinama kretanja kroz stacionarnu fazu. Visokotlačna tekućinska kromatografija (high pressure liquid chromatography) ili (high performance liquid chromatography) je proces u kojem je mobilna faza tečna i kvantitativno se razdvajaju komponente tekuće smjese. Primjena visokog pritiska čini ovu metodu još efikasnijom. Ova vrsta kromatografije je tehnika sa najvećom primjenom za odjeljivanje većine složenih smjesa. Razdvajanja kod klasičnih kromatografija mogu trajati satima, dok HPLC analiza traje 5-30 minuta. Posebno je pogodna za analizu jedinjenja koja je teško analizirati gasnom kromatografijom. Termolabilna jedinjenja mogu se analizirati HPLC tehnikom na sobnoj temperaturi, polarna jedinjenja mogu se kromatografirati bez prethodne derivatizacije, a mogu se analizirati i visokopolimerne supstance. Priprema uzorka je manji problem nego kod gasne kromatografije. Biološke tečnosti serum, urin i likvor često se mogu injicirati direktno u kolonu bez prethodnog postupka ekstrakcije. Glavni cilj tečne kromatografije jeste da se dobije zadovoljavajuće razdvajanje komponenti analizirane smjese u što kraćem vremenu.

Vrijeme zadržavanja, retenciono vrijeme, tR, je vremenski period od trenutka injiciranja uzorka do trenutka kada je signal ispitivane komponente uzorka dostigao maksimum. Tokom prolaska kroz kolonu, molekule supstance jedan dio vremena provedu u mobilnoj fazi i kreću se brzinom kojom protiče i mobilna faza. Drugi dio vremena molekule supstance provedu u stacionarnoj fazi i tada se ne pomjeraju. Prvi signal koji se javlja u hromatogramu nakon injiciranja predstavlja rastvarač, a njegovo zadržavanje tM odgovara vremenu koje supstance uzorka provedu u mobilnoj fazi.

Razlika vremena zadržavanja zadržane komponente i nezadržanog rastvarača: t'R = tR -tM predstavlja vrijeme koje molekule supstance provedu u stacionarnoj fazi. Veličina t'R naziva se retenciono vrijeme zadržavanja. Kada se analizira uzorak sa više komponenti, svaka komponenta će provesti isto vrijeme u mobilnoj fazi, ali će, pod uslovom da se razdvajaju, svaka komponenta provesti različito vrijeme u stacionarnoj fazi (Nikolin, 1998).

22

Tipovi HPLC

Na osnovu polarnosti razlikuje se LC na normalnim i obrnutim fazama: a) Kromatografija na normalnim fazama Ova metoda koristi polarnu stacionarnu fazu i nepolarnu mobilnu fazu, a koristi se kada je supstanca koja se analizira polarna. Polarna supstanca se adsorbira i zadržava na česticama stacionarne faze. Jačina adsorpcije je veća što je veća polarnost supstance, a samim time je veće i vrijeme zaržavanja. Korištenje polarnijih rastvarača u mobilnoj fazi smanjuje retenciono vrijeme. Ovaj tip kromatografije je napušten 1970-tih sa razvojem HPLC-a na obrnutim fazama, zbog slabe reproducibilnosti, uslijed promjena na česticama stacionarne faze pod uticajem rastvarača. b) Kromatografija na obrnutim fazama HPLC na obrnutim fazama (RP-HPLC) koristi nepolarnu stacionarnu fazu i polarnu mobilnu fazu. Najčešća stacionarna faza je silikatna, tretirana sa RMe2SiCl, gdje je R alkilna grupa ravnog lanca kao C18H37 ili C8H17. Vrijeme zadržavanja je duže za manje polarne supstance. Vrijeme zadržavanja se povećava dodatkom polarnih rastvarača u mobilnu fazu a smanjuje se dodatkom hidrofobnih rastvarača. RP-HPLC funkcioniše na principu hidrofobnih interakcija, koje su rezultat odbijajućih sila između polarnog rastvarača i relativno nepolarne supstance koja se analizira i nepolarne stacionarne faze. Na brzinu eluiranja utiče pH, zbog mogućnosti promjene polarnosti supstance. Zbog toga se često u mobilnu fazu dodaju puferi.

Kolone za RP-HPLC ne bi trebalo koristiti sa jakim bazama, zbog mogućnosti razgradnje silikatnih čestica.

Mobilna faza za visokotlačnu tečnu kromatografiju mora biti napravljena od supstanci visoke čistoće, mora se koristiti voda HPLC čistoće, zbog velike osjetljivosti instrumenta. Nakon pripreme mobilna faza se filtrira na aparaturi za filtriranje, a zatim degazira na ultrazvučnom kupatilu.

HPLC ima osnovne faze: Uvođenje uzorka u sistem (donošenje uzorka na kolonu) Separacija komponenata smjese na koloni

23

Detekcija razdvojenih komponenata i kvantizacija (obrada onoga što izlazi iz kolone) Prednosti HPLC tehnike su: Brza separacija Visoka rezolucija i osjetljivost

Komponente uređaja za HPLC

HPLC je moderna analitička tehnika kod koje se mobilna faza dovodi pomoću pumpe.

Uzorak se ubacuje pomoću manualnog ili automatskog injektora. Kolone za HPLC su punjene silikatnim ili polimernim materijalom.

Postoji više tipova detektora za HPLC. Najčešće se koristi UV-VIS detektor, a osim njega i fotodiodni, fluorescentni, elekrohemijski i drugi. Razdvajanje na normalnim fazama podrazumijeva da je stacionarna faza polarna (npr. silikatna), a mobilna faza nepolarna (npr. heksan). Kod razdvajanja na obrnutim fazama stacionarna faza je nepolarna (npr. C-18 hidrokarbon), a mobilna faza polarna, (npr. voda i metanol ).

24

Slikaa 18. Shema jjednog HPLC sistema

gdje je : A-rezervooar mobilne faze; B-ventil za z miješanjee i pumpa; C-drain ventil; v D-uređaj za kontrolu pritiska; E-komoraa za miješan nje (mikser); F-injektor; G-kolonaa; I-detektorr; J-kontrolor; K-kompjuuter; L-štampaač;

Detektori u HPLC sistemu

Postoje detektori koji se zasnivaju na različitim tehnikama određivanja supstanci. To su: UV-VIS detektori PDA detektori fluoroscencijski detektori detektori koji se zasnivaju na mjerenju indeksa loma elektrokemijski detektori detektori koji se zasnivaju na mjerenju vodljivosti

Elektrokemijski detektori ( ED )

Kombinacija elektrokemijskog detektora i visokotlačne tekućinske kromatografije rezultuje dobijanjem jako selektivnog i osjetljivog alata za analizu. Rad elektrokemijskog detektora zasniva se na mjerenju struje koja nastaje kao posljedica redoks reakcije koja se odvija na površini elektroda. Najčešće korišteni elektrokemijski detektor u kombinaciji sa visokotlačnom tekućinskom kromatografijom je amperometrijski detektor.Princip rada ovog detektora je da mjeri struju elektrona koja nastaje u redox reakciji pri konstantnom potencijalu, potenciostatska amperometrija. Za kvantifikaciju amina (5HT) najbolje je koristiti single electrode EC. Potencijal joj se podešava prema Ag/AgCl referentnoj elektrodi.

Vrijednosti potencijala kada započinje oksidacija za pojedine grupe iznosi: -

kateholi (dopamin,N-acetildopamin, epinefrin, norepinefrin, dihidroksibenzilamin)

-

mV, E ½=400-500 mV

-

indoli 400 mV, E ½=500 mV

-

vanilinski spojevi 700 mV, E ½=850 mV

-

monohidroksifenoli 800 mV, E ½=950 mV

Elektrokemijsko ponašanje biogenih amina zavisi od pH vrijednosti eluenta, pošto proces oksidacije uključuje proton transfer.

26

2. CILJ RADA

Cilj rada je bio pomoću HPLC – ED kvantificirati sadržaj klorogenske, galne, kafene i ruzmarinske kiseline i rutina u suhom listu kadulje kultivisane na različitim lokacijama.

27

2. MATERIJAL I METODE

Biljni materijal Salvia officinalis L. kadulja ili žalfija -list, suhi Porijeklo: Dalmacija, Južna Turska Kvantitativno određivanje fenolskih kiselina (klorogenska, galna, kafena i ruzmarinska kiselina) i rutina vršeno je pomoću HPLC-ED metode u suhom listu kadulje.

KADULJA

Salvia officinalis L., kadulja ili žalfija razvija se kao grmić sa višegodišnjom i drvenastom stabljikom i s jakim korijenom, koji zalazi duboko u zemlju. Stabljiku su i ogranke gusto obrasli usko ovalni, dosta čvrsti i trajni, obično sa obje strane gusto dlakavi i zbog toga sivi listovi, na kojima je rub vrlo nježno nazubljen. Na krajevima se ogranaka razvijaju u prividnim klasovima pršljenaste nakupine ljubičastih i izrazito usnatih cvjetova. Čitava je biljka ugodnog i vrlo jakog mirisa. Samo u zemljama oko Sredozemnog mora uspjeva kao samonikla biljka. Izvan toga područja raste samo u kulturi.

Poznato je više podvrsta ljekovite kadulje, od kojih je svaka vezana za određeno područje Sredozemlja. Kadulja - Salvia officinalis jedina je Ijekovita, dok ostale: kadulja Ijepljiva (S. glutinosa), livadska (S. pratensis), šumska (S. silvestris), austrijska, etiopska i američka služe samo kao ukras u bašćama.U staroj Grčkoj se vrlo rano počela koristiti kao lijek. Od tada je kadulja u stalnoj upotrebi ne samo u narodnoj već i u službenoj medicini. U tu se svrhu sabire lišće i to obično prije cvatnje, u doba kada ima najviše jakosti. Sastojci: kalij, kalcij, natrij, oko 2,5% eteričnog mirisnog ulja, u kojemu ima cineola, koji uz mnogobrojne dlačice spriječava isparavanje vode. Zbog toga kadulja može izdržti velike suše. Lišće djeluje adstringentno i antiseptički. Tanin i gorke tvari, koje su također Ijekovite, daju joj ljut i gorka okusa.

Primjena kadulje je vrlo raznolika. Najviše se upotrebljava u obliku čaja za ispiranje grla i usta, kod svježe angine i kod raznih upala u ustima, na zubnom mesu, kod kašlja i prehlade.

Osim toga žalfijom se liječe smetnje u menstruaciji, hemeroidi, upale mjehura, razne bolesti jetara i bubrega, reumu, proljev, razne rane, živčane bolesti, jako znojenje, grčevi u želucu, razne ženske bolesti itd. Medicina se služi kaduljom kao sredstvom za suzbijanje noćnog znojenja kod tuberkuloznih bolesnika. Svježim se lišćem kadulje trljaju zubi i zubno meso da očvrsnu dok sok listova sa medom ublažava kašalj.

28

Slika 19. Kadulja svježa

Slika 20. Kadulja sušena

29

Kemikalije i reagensi 1. Voda [Aqua (UV-HPLC) para analisis instrumental ACS] Proizvođač Panreac 2. Metanol 99,8% CH3OH+ M=32,04 g / mol ρ=0,79 kg / L Proizvođač Sigma Aldrich 3. Acetatna glacijalna kiselina 99,8% CH3COOH M=60,05 g / mol ρ=1,05 kg / L Distributer Semikem-Sarajevo 4. Acetonitril M=41,05 g / mol ρ=0,780 kg / L Proizvođač Sigma-Aldrich 5. Filter papir filter Supelco Nylon 66 membrane 0,45 µm x 47 mm 6. Standard rutina (rutin trihidrat) Fluka Biochemika

30

Pribor i oprema Mješalicca-Vortex-Geenie 2 (Slikaa 21.)

D-78532, TY Centrifugga-Mikro 22 R Hettich Zentrifugen Z YP 1110; 2220-240 V; 50-60 H (Slikka 22.)

Aparaturra za filtriran nje mobilne faze-SUPEL LCO® 58062 2-U (Slika 233.)

Ultrazvuččno vodeno kupatilo, BR RANSON-Sm mith Kline company, c B--32; 150 W; 240 V; 50-660 Hz, (Slika 24.)

Slikaa 22. Centriffuga-Mikro 22 2 R Hettiich

Slika 21. Mješalicaa-Vortex--Geenie 2

Slika 233. Aparaturaa za filtriranjje ®

mobilnee faze SUPE ELCO 580662-U

Slikka 24. Ultrazzvučno vodenno kup patilo, BR Sm mith Kline coompany B-32

Priprema standardne otopine

Napravljene su matične otopine sljedećih standarda koncentracije 1mg/ml klorogenska kiselina ruzmarinska kiselina galna kiselina kafena kiselina rutin Kiseline su otopljene u mobilnoj fazi, a rutin u vodi za HPLC. Od matičnih standardih otopina napravljena su sljedeća razrijeđenja (Tabela 2.)

Tabela 2. Korištene koncentracije standardnih otopina

Jedinica mjere

Klorogenska kiselina

Ruzmarinska kiselina

Galna kiselina

Kafena kiselina

Rutin

mg/ml

0,005

0,005

0,001

0,003

0,01

µg/20µl

0,1

0,1

0.02

0,06

0,2

Priprema uzorka

Uzeta su 2g biljnog materijala kadulje porijeklom iz Turske (Antalija) i iz Hrvatske (Dalmacija) te macerirana u avanu uz dodatak 18ml vode za HPLC. Homogenizirani uzorci su kvantitativno prenešeni u balon okruglog dna. Tako pripremljeni uzorci su se zagrijavali uz povratno hladilo na vodenom kupatilu 30 min. Treći uzorak kadulje porijeklom iz Dalmacije (Mosor, Hrvatska) je pripremljen na isti način (2g uzorka + 18mL vode za HPLC) , no korištena je topla vodena ekstrakcija (bez povratnog hladila).

32

Nakon toga uzorci su filtrirani. Jedan dio uzorka ( oko 1ml) u Ependorfici centrifugiran je 20 min na +4 °C pri 15000 o/min. Nakon centrifugiranja, vršeno je dekantiranje. Od tako pripremljenih supernatanata vršeno je sljedeće razrijeđenje: R1=100µl supernatant + 9900µl HPLC vode Ovako pripremljeni uzorci su injicirani (20µl). HPLC analiza za svaki uzorak trajala je oko 50 min.

Priprema mobilne faze

Za pripremu mobilne faze potrebno je: metanol 99,8%, acetonitril, voda za HPLC, acetatna glacijalna kiselina (200:100:700:10). Mobilna faza je filtrirana na uređaju za vakum filtraciju, kroz filter papir (naylon 66 membranes; 0,45µm x 47mm). Profiltrirana mobilna faza prenešena je u čistu i suhu reagens bocu i degazirana 15 min.

Osnovne komponente HPLC-ED sistema

Naziv instrumenta HPLC: Shimadzu LCSOL SINGLE-LC EN Pećnica-CTO-10AS VP Pećnica je prostor za termostatiranje kolone, potrebna da bi imali stabilne uslove i mogućnost kontroliranja separacije na nižoj ili višoj temperaturi Kolona : ODS HYPERSIL 5μm 200x4,6mm HEWLET PACKARD Ova kolona je otporna, ima opću primjenu i visoko je retentivna.

Kontrolor- SCL-10A VP Kontrolor kontrolira cijeli sistem.

Detektor-BAS liquid chromatography CC-5E LC-4C Amperometric Detector Pumpa-LC-20AT Uloga pumpe u HPLC sistemu je da propušta mobilnu fazu kroz sistem.‐Degazer‐DGU

33

Slika 25. Instrument za visokotlačnu tekućinsku kromatografiju Radni uslovi- HPLC-ED HPLC: Shimadzu LCSOL Single-LCEN Kolona: ODS Hypersil 5µm 200x4,6 mm Hewlett Packard Mobilna faza: Metanol-acetonitril-voda-acetatna kiselina (200ml+100ml+700ml+10ml) Protok: 1,0 ml/min.

Injicirani volumen: 20μl Filter: 0,02Hz Temperatura: 25°C Radna elektroda: Glassy carbon, serijska Potencijal: 840 mV, Ag/AgCl referentna elektroda.

Pumpa: LC- 20 AT Degazer: DGU-20A3 Pećnica: CTO-10 ASVP

34

3. REZULTATI

Kvantitativno određivanje fenolskih kiselina (klorogenska, galna, kafena i ruzmarinska kiselina) i rutina u suhom listu kadulje vršeno je na osnovu retencionih vremena (tR) standardnih otopina i sadržaja određenih čistih supstanci u standardnim otopinama.

(Tabela 3.).

Tabela 3.

Redni broj

Standardne otopine

Retenciono vrijeme (min)

Koncentracija (mg/ml)

1.

Klorogenska kiselina

9,609

0,005

2.

Ruzmarinska kiselina

23,558

0,005

3.

Galna kiselina

3,540

0,001

4.

Kafena kiselina

6,863

0,003

5.

Rutin

15,579

0,01

Npr. Za klorogensku kiselinu: Klorogenska kiselina (mg/ml)=A(uzorak)/A(standard) x γ(mg/ml) Gdje je: A(uzorka)-površina pika klorogenske kiseline na osnovu retencionog vremena u uzorku A(standard)-površina pika standarda klorogenske kiseline γ(mg/ml)-koncentracija standarda klorogenske kiseline Sadržaj nekih fenolskih kiselina i rutina izražen je u miligramu po gramu sviježeg dijela uzorka (mg/g).

Kromatogrami standardnih otopina fenolskih kiselina (klorogenske, galne, kafene i ruzmarinske kiseline) i rutina:

35

Slika 26. Kromatograam standarddne otopine kklorogenske kiseline, konncentracije 0,1µg/20µl 0

j prikazan kromatogram k m 0,005 mg//ml standarddne otopine klorogenskee kiseline, čiije Na slici je retencionno vrijeme iznosi 9.609 min pri pootencijalu odd 840 mV i protoku odd 1,0 ml/miin.

Pomoću ove konceentracije staandardne otoopine je izzračunata kooncentracijaa klorogenskke kiseline u suhom listu u kadulje.

Slika 27. Kromatogra am standard dne otopine ruzmarinske r kiseline, konncentracije 0,1 µg/20µl

Na slici je j prikazan kromatogram k m 0,005mg/m ml standardnne otopine ruzmarinskee kiseline čiije retencionno vrijeme izznosi 23,558 min pri potencijalu od o 840 mV i protoku odd 1,0 ml/miin.

Pomoću ove koncentracije staandardne otoopine je izzračunata kooncentracija ruzmarinskke kiseline u suhom listu u kadulje.

Slika 28. Kromatogra am standard dne otopine galne kiselinne, koncentrracije 0,02 µg/20µl

mg/ml stanndardne otoppine galne kiseline čiije Na slici je prikazaan kromatoggram 0,001m retencionno vrijeme iznosi 3.5400 min pri pootencijalu odd 840 mV i protoku odd 1,0 ml/miin.

Pomoću ove koncenntracije stand dardne otoppine je izraččunata konceentracija gallne kiseline u suhom lisstu kadulje.

Slika 29. Kromatogra am standard dne otopine kafene k kiseline, koncentrracije 0,06 µg/20µl µ

Na slici je prikazann kromatogrram 0,003 mg/ml standardne otoppine kafene kiseline čiije retncionoo vrijeme izznosi 6,863 min pri pottencijalu od d 840 mV i protoku odd 1,0 ml/miin.

Pomoću ove koncentracije standdardne otopiine je izračuunata koncenntracija kafeene kiseline u suhom lisstu kadulje.

Slika 30. Kromatogra am standard dne otopine rutina, r konceentracije 0,22 µg/20µl

Na slici je j prikazan kromatograam 0.01 mg//ml standarddne otopine rutina čije je retencionno vrijeme 15,579 1 pri po otencijalu odd 840 mV i pprotoku od 1,0 ml/min. P Pomoću ove koncentraciije standardnne otopine jee izračunata koncentracijja rutina u suuhom listu kkadulje.

Kromatoogram fenolskih kiselin na (klorogeenska, ruzm marinska, gaalna i kafen na kiselina)) i rutina u suhom listu u kadulje (p porijeklom iiz Antalije).

Slika 31. Kromatogra am fenolskih h kiselina (kllorogenska, ruzmarinskaa, galna i kaf afena kiselina) Antalije). i rutina u suhom listuu kadulje (poorijeklom iz A Na slici je j prikazan kromatogram k m nekih fennolskih kiseliina i rutina sadržanih u 20 µl uzorkka suhog lissta kadulje (Antalija). Na N osnovu standarnih otopina o izraačunata je količina k nekkih fenolskihh kiselina i rutina u mg g/g suhom lista kadulje. Na osnovuu standarda izračunata je količina ruzmarinske r e kiseline (11,82 mg/g), klorogenskee kiseline (33,54 mg/g), galne kiselinne (0,18 mg//g), kafene kiseline k (0,91 mg/g) i ruttina (24,54m mg/g). (Tabella 4.)

Kromatoogram fenolskih kiselin na (klorogeenska, ruzm marinska, gaalna i kafen na kiselina)) i rutina u suhom listu u kadulje (p porijeklom iiz Dalmacijaa).

Slika 32. Kromatograam fenolskihh kiselina (kllorogenska, ruzmarinskaa, galna i kaf afena kiselina) Dalmacije). i rutina u suhom listuu kadulje (poorijeklom iz D Na slici je j prikazan kromatogram fenolskihh kiselina i rutina r sadržaanih u 20 µl µ uzorka lissta kukurjekaa. Na osnovvu standarniih otopina izračunata i jee količina nnekih fenolskih kiselinaa i rutina u mg/g uzorrka suhog lista l kaduljee. Na osnovvu standardda izračunatta je količinna m kloroogenske kisseline (4,544 mg/g), galne g kiselinne ruzmarinske kiseline (9,09 mg/g), (0,45mg//g), kafene kiseline (0,911 mg/g) i rutiina (2,09 mgg/g). (Tabelaa 5.)

Kromatoogram fenolskih kiselin na (klorogeenska, ruzm marinska, gaalna i kafen na kiselina)) i rutina u suhom listu u kadulje (p porijeklom iiz Mosora).

Slika 33. Kromatograam fenolskihh kiselina (kllorogenska, ruzmarinskaa, galna i kaf afena kiselina) Mosora). i rutina u suhom listuu kadulje (poorijeklom iz M Na slici je j prikazan kromatogram fenolskihh kiselina i rutina r sadržaanih u 20 µl µ uzorka lissta kukurjekaa. Na osnovvu standarniih otopina izračunata i jee količina nnekih fenolskih kiselinaa i rutina u mg/g uzorrka suhog lista l kaduljee. Na osnovvu standardda izračunatta je količinna ruzmarinske kiselinee (5,45 mg//g), klorogennske kiselin ne (0,36 mgg/g), galne kiseline k (0,009 mg/g), kaafene kiselinne (0,73 mg/gg) i rutina (111,8 mg/g). (Tabela ( 6.)

Tabela 4. Sadržaj klorogenske, galne, kafene, ruzmarinske kiseline i rutina u suhom listu kadulje (Antalija).

Vrsta jedinjenja

Koncentracija stand. mg/ml

Površina pika uzorka

Površina pika standarda

Ruzmarinska k

Retenciono vrijeme (min)

Koncen. u uzorku mg/g

0,005

6755292

26173019

24

11,82

Klorogen.k.

0,005

15233775

19707239

9,61

3,54

Galna k.

0,001

3942666

17215057

3,5

0,18

Kafena k.

0,003

8275061

27998173

6,9

0,91

Rutin

0,01

4785224

1783748

15,6

24,54

Tabela 5. Sadržaj klorogenske, galne, kafene, ruzmarinske kiseline i rutina u suhom listu kadulje (Dalmacija).

Vrsta jedinjenja

Koncentracija stand. mg/ml

Površina pika uzorka

Površina pika standarda

Retenciono vrijeme (min)

Koncen. u uzorku mg/g

Ruzmarinska k

0,005

52959011

26173019

24

9,09

Klorogen.k.

0,005

18974572

19707239

9,61

4,54

Galna k.

0,001

9065528

17215057

3,5

0,45

Kafena k.

0,003

10105799

27998173

6,9

0,91

Rutin

0,01

4190703

1783748

15,6

20,91

Tabela 6. Sadržaj klorogenske, galne, kafene, ruzmarinske kiseline i rutina u suhom listu kadulje (Mosor).

Vrsta jedinjenja

Koncentracija stand. mg/ml

Površina pika uzorka

Površina pika standarda

Retenciono vrijeme (min)

Koncen. u uzorku mg/g

Ruzmarinska k

0,005

33397656

26173019

24

5,45

Klorogen.k.

0,005

1799941

19707239

9,61

0,36

Galna k.

0,001

1998478

17215057

3,5

0,09

Kafena k.

0,003

7412561

27998173

6,9

0,73

Rutin

0,01

2412730

1783748

15,6

11,80

44

5. DISK KUSIJA

Kombinaacija elektroh hemijskog detektora d i vvisokotlačnee tekućinskee hromatograafije rezultuuje dobijanjuu jako selek ktivne

i osjetljive o

kvantifikacij ijske metodde. Pomoću ove metodde

kvantitatiivno je određen sadržaj fenolskih kiiselina (klorrogenska, gaalna, kafena i ruzmarinskka kiselina) i rutina u suhom s listu kadulje kulltivisane na različitim lokacijama. l Metoda ovoog nog sistema vrlo je jednnostavna, a ddetekcija i kvantifikacija k a vrlo pouzddana. HPLC – izokratičn ED pokaazala se vrloo prikladnom m za određivvanje nekih fenolskih kiiselina i rutina i u drugiim analizirannim biljnim uzorcima. Za Z sve uzorrke suhog liista kadulje kultivisane na različitiim lokacijam ma određenee su koncenttracije kloroogenske, ruzzmarinske, galne g i kafen ne kiseline te rutina. (G Graf 1.)

25 20 CGA

15

RA CA

10

GA

5

R

0 kad. Dalmacija mg/g

kad. Anta alija mg/g

kad. Mosorr mg/g

G Graf 1.

Evidentno je da je u svim s uzorcim ma suhog lissta kadulje najzastupljen n niji rutin. Najjviše ga imaa u porijeklom izz Antalije, Turska), T i to 24,54 mg/g g, dok je u drrugim uzorcima prisutann i kadulji (p nešto nižoj koncentraaciji i to: kaddulja ( porijeeklom iz Daalmacije, Hrvvatska) sadrži 20,91 mgg/g m iz Mosoraa, Hrvatska) 11,8 mg/g. Najmanje N je zastupljena galna kiselinna te kaduljaa (porijeklom i to u sljeedećim konccentracijamaa: kadulja (pporijeklom izz Antalije, T Turska) sadrrži 0,18 mg//g, kadulja (porijeklom ( iz Dalmacijje, Hrvatskaa)-0,45 mg/gg te kaduljaa (porijeklom m iz Mosorra, Hrvatska) sadrži 0,09 9 mg/g.

6. ZAKLJUČAK

Sadržaj fenolskih kiselina (klorogenska, galna, kafena i ruzmarinska kiselina) i rutina u suhom listu kadulje kultivisane na različitim lokacijama određen je visokotlačnom tekućinskom kromatografijom i elektrokemijskom detekcijom.

HPLC: l CSOl Single – Lcen, pečnica : Cto – 10ASVP je prostor za termostatiranje kolone, kolona : PHENOMENEX 006-0152-EO, HYPERSIL 5 μm C18 (ODS), 250×4,60×5 μm , mobilna faza: metSanol-Na-acetat-voda-sirćetna kiselina; Protok: 1,0 ml/min, injicirani volumen : 20 µl , filter : 0,02Hz , pri temperaturi 25 0 C;potencijal: 840 mV; radna elektroda : Glassy corbon, serijska, referentna elektroda : Ag/AgCl, degazer : DGU – 20A3, pumpa : LC – 20 AT. Protok je bio 1,0 ml/min.

U suhom listu kadulje (porijeklom iz Antalije, Turska) određene su koncentracije ruzmarinske, klorogenske, galne i kafene kiseline te rutina. One su iznosile: Ruzmarinska kiselina: 11,82 mg/g Klorogenska kiselina: 3,54 mg/g Galna kiselina: 0,18 mg/g Kafena kiselina: 0,91 mg/g Rutin: 24,54 mg/g U suhom listu kadulje (porijeklom iz Dalmacije, Hrvatska) određene su koncentracije ruzmarinske, klorogenske, galne i kafene kiseline te rutina. One su iznosile: Ruzmarinska kiselina: 9,09 mg/g Klorogenska kiselina: 4,54 mg/g Galna kiselina: 0,45 mg/g Kafena kiselina: 0,91 mg/g Rutin: 20,91 mg/g

46

U suhom listu kadulje (porijeklom iz Mosora, Hrvatska) određene su koncentracije ruzmarinske, klorogenske, galne i kafene kiseline te rutina. One su iznosile: Ruzmarinska kiselina: 5,45 mg/g Klorogenska kiselina: 0,36 mg/g Galna kiselina: 0,09 mg/g Kafena kiselina: 0,73 mg/g Rutin: 11,80 mg/g

47

7. LITERATURA

Mattila P., Hellström J., Törrönen R., (2006), Phenolic acids in berries, fruits, and beverages, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54: 71-93 Robbins R., (2003), Phenolic Acids in Food: An Overview of Analytical Methodology, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 25-28 Pejin J., (2009), Ispitivanje sadržaja i antioksidativne aktivnosti fenolnih kiselina u toku proizvodnje slada i piva, Doktorska disertacija, Tehnološki fakultet Univerziteta u Novom Sadu : 18-73 Kovačević N. ( 2002 ), Heterozid U: Osnovi Farmakognozije , Farmaceutski Fakultet Univerzitet u Beogradu: 122-152.

Kostić V. i Kostić Lj. ( 1980 ), Rutin U: Hemijsko-tehnološki Leksikon, 4. Izdanje Izdavačka Radna Organizacija ‘’ Rad ‘’ Beograd: 734.

Kušan F. ( 1956 ), Ljekovito i drugo korisno bilje , Poljoprivredni Nakladni Zavod Zagreb: 345-346.

Nikolin B. (1998), Metoda razdvajanja U: Analitika lijekova, Izdavačko Preduzeće Sarajevo Publishing, Sarajevo: 192-198.

Petričić J. (1970), Djelovanje tvari organskog karaktera. U : Farmakognozija , drugo dopunjeno i prerađeno izdanje Zagreb : 52-174.

Tucakov J. (1978), Ruta, U: Liječenje čajevima

ljekovitog bilja. Drugo dopunsko

izdanje, Zagreb : 250

48