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Hepatic Stem Cells: Methods and Protocols Naoki Tanimizu

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Methods in Molecular Biology 1905

Hepatic Stem Cells

Methods and Protocols

M ETHODSIN M OLECULAR B IOLOGY

SchoolofLifeandMedicalSciences

UniversityofHertfordshire Hatfield,Hertfordshire,AL109AB,UK

Forfurthervolumes: http://www.springer.com/series/7651

HepaticStemCells

MethodsandProtocols

SapporoMedicalUniversity,Sapporo,Hokkaido,Japan

Editor NaokiTanimizu

SapporoMedicalUniversity

Sapporo,Hokkaido,Japan

ISSN1064-3745ISSN1940-6029(electronic) MethodsinMolecularBiology

ISBN978-1-4939-8960-7ISBN978-1-4939-8961-4(eBook) https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8961-4

LibraryofCongressControlNumber:2018962407

© SpringerScience+BusinessMedia,LLC,partofSpringerNature2019

Thisworkissubjecttocopyright.AllrightsarereservedbythePublisher,whetherthewholeorpartofthematerialis concerned,specificallytherightsoftranslation,reprinting,reuseofillustrations,recitation,broadcasting,reproduction onmicrofilmsorinanyotherphysicalway,andtransmissionorinformationstorageandretrieval,electronicadaptation, computersoftware,orbysimilarordissimilarmethodologynowknownorhereafterdeveloped.

Theuseofgeneraldescriptivenames,registerednames,trademarks,servicemarks,etc.inthispublicationdoesnotimply, evenintheabsenceofaspecificstatement,thatsuchnamesareexemptfromtherelevantprotectivelawsandregulations andthereforefreeforgeneraluse.

Thepublisher,theauthors,andtheeditorsaresafetoassumethattheadviceandinformationinthisbookarebelievedto betrueandaccurateatthedateofpublication.Neitherthepublishernortheauthorsortheeditorsgiveawarranty, expressorimplied,withrespecttothematerialcontainedhereinorforanyerrorsoromissionsthatmayhavebeenmade.

Thepublisherremainsneutralwithregardtojurisdictionalclaimsinpublishedmapsandinstitutionalaffiliations.

CoverIllustration:Biliaryepithelialcells(BECs)labeledwithtdTomatoproliferatetoexpandtheCK19+biliaryepithelial tissuestructureuponinjury,indicatingthatpre-existingBECscontributetothe“ductularreaction”.(Theimagerelated toChapter7hasbeenprovidedbyDr.KenjiKamimoto).

ThisHumanaPressimprintispublishedbytheregisteredcompanySpringerScience+BusinessMedia,LLC,partof SpringerNature.

Theregisteredcompanyaddressis:233SpringStreet,NewYork,NY10013,U.S.A.

Preface

Thelivercontainstwotypesofepithelialcells,namely,hepatocytesandcholangiocytes (biliaryepithelialcells).Therefore,liverstem/progenitorcells(LPCs)aredefinedasbipotentialcellsthatcandifferentiateintohepatocytesandcholangiocytes.Hepatoblasts,fetal LPCs,splitintohepatocytesandcholangiocytesinmid-gestation.BipotentialLPCsalso havebeenisolatedfromneonatalliver.Ontheotherhand,itisstillcontroversialwhether bipotentialLPCscontributetomaintenanceofcellularhomeostasisinhealthyadultliver. Recentworksdemonstratedthatbothhepatocytesandcholangiocytesareheterogeneous cellpopulationsandmaycontaincommittedprogenitors.Thisbookfirstcontainsmethods forisolationandexpansionofbipotentialLPCsfromfetalandneonatalliver,foradult clonogeniccholangiocytesandforhepatocyteprogenitors.

Theliverhasthestrongregenerativecapability:ithasbeengenerallyconsideredthat self-duplicationofhepatocytesorcholangiocytescompensatesthelosttissueafteracute injuries,whereasLPCsareactivatedandsupplynewhepatocytesafterchronicinjuries. However,recentworksdemonstratedthatdedifferentiationandlineageconversionof liverepithelialcellsalsocontributetoliverregeneration.Theseresultshighlightthatliver regenerationcanbeachievedbymultiplemodesofcellularresponses.Inthesecondpart, thisbookcontainsexperimentalmethodsforidentifyingandcharacterizingprogenitorcells involvedinliverregenerationinvivoaswellasthoseforinvestigatingmolecularmechanisms regulatingprogenitorcell-drivenliverregeneration.

Itiscrucialtoexpandfunctionalhepatocytesandcholangiocytesexvivoforimplementingregenerativemedicinesuchascelltherapyandforestablishingdrugscreeningsystems. Recently,novelculturemethodshavebeenestablishedtosupplyhepatocytesand/or cholangiocytesfrompluripotentstemcellsaswellassomaticterminallydifferentiated cells.Inaddition,itwasdemonstratedthatinvivoconversionoffibrogenicstellatecells intohepatocytescouldbeusefultoameliorateliverfibrosis.Inthethirdpart,thisbook containsculturemethodsforgeneratinghepatocytesandcholangiocytesfrommultiple cellularsourcesandatechniqueconvertingfibroblastsintohepatocytesinvivo.

Liverepithelialcellsformthree-dimensional(3D)tissuestructures,whichareindispensableforthelivertoperformtheirphysiologicalfunctions.Facingvarioustypesofinjuries, 3Dhepatictissuestructuresaredynamicallyrearrangedtoavoidfatalliverdamages.Thus, thisbookalsocontainsexperimentalmethodsforthereconstitutionof3Dtissuestructures exvivoaswellasfortheinvestigationofthedynamicstructuralchangesinducedafter injuriesandduringregeneration.

Fibrosisisthemajorpathologyoftheliver.Anotherissueislivercancers.Itisimportant toestablishanovelstrategytoresolveliverfibrosisandtounderstandetiologiesofhepatocellular(HCC)andcholangiocellularcarcinomas(CC).Therefore,thelastpartofthisbook includesmethodsresolvinghepaticfibrosisbybonemarrowtransplantationaswellastwo novelmousemodelsofHCCsandCCs.

Inadditiontoexperimentalprotocols,eachauthorprovidesagreatintroductionsummarizingthebackgroundofeachtopic.Thisbookwouldhelpresearchersunderstandthe currentconceptabouthepaticstem/progenitorcellsandperformbasicandtranslational worksrelatedtoliverbiologyandpathophysiology.

Sapporo,Hokkaido,JapanNaokiTanimizu

Preface.. ...................................................................v

Contributors .................................................................ix

PART IISOLATIONOF PROGENITOR

CELLS

1Long-TermCultureofMouseFetalHepaticStem/ ProgenitorCells ........................................................3 AtsunoriTsuchiyaandShujiTerai

2IsolationofBipotentialLiverProgenitorCellsfromNeonatal MouseLiver ............................................................9 NaokiTanimizu

3IdentificationandIsolationofClonogenicCholangiocyteinMouse... ........19 BinLi,CraigDorrell,PamelaS.Canady,andLeslieWakefield

4IsolationandExpansionofRatHepatocyticProgenitorCells.. ...............29 JunichiKino,NorihisaIchinohe,MasayukiIshii,andToshihiroMitaka

PART IICHARACTERIZATIONOF LIVER PROGENITORS IN VIVO

5GeneticLineageTracingofBiliaryEpithelialCells... .......................45 TeresaRubio-Toma ´ s,BeatrizAguilar-Bravo,andPauSancho-Bru

6SpecificLabelingandLineageTracingofPeriportalHepatocytes UsingTwo-StepGeneticRecombination ..................................59 NicoladePrisco,EleanorStout,andJoanFont-Burgada

7AnalysisfortheHeterogeneityofLiverProgenitorCells .....................71 KenjiKamimoto

8ChemicalScreeningUsingaZebrafishModelforLiverProgenitor Cell-DrivenLiverRegeneration ...........................................83 SungjinKoandDonghunShin

PART IIIGENERATIONOF

HEPATOCYTES,CHOLANGIOCYTES, AND THEIR PROGENITORS

9ConversionofFibroblaststoHepatocytesInVitro... .......................93 PengyuHuang,LuluSun,LudiZhang,andLijianHui

10ConversionofFibroblaststoHepatocyte-LikeCellsInVivo.. ...............103 GuangqiSong,QinggongYuan,ZhenDai,Hsin-ChiehTsay, XizhongShen,MichaelOtt,andAmarDeepSharma

11ChemicallyInducedLiverProgenitors(CLiPs):ANovelCellSource forHepatocytesandBiliaryEpithelialCells.. ..............................117 TakeshiKatsudaandTakahiroOchiya

12InductionofFunctionalHepatocytesfromHumaniPSCs ...................131 TaketomoKidoandYutaKoui

13CultureSystemofBileDuct-LikeCysticStructuresDerivedfrom Human-InduciblePluripotentStemCells ..................................143 AkihideKamiya,KazuyaAnzai,KotaTsuruya,andHiromiChikada

PART IVRECONSTITUTIONOF LIVER TISSUE STRUCTURES

14GenerationofHepaticTissueStructuresUsingMulticellular SpheroidCulture... ....................................................157 FumiyaTao,HirotakaMihara,andNobuhikoKojima

15ReconstructionofHepaticTissueStructuresUsingInterstitial FlowinaMicrofluidicDevice ............................................167 RyoSudo

16GenerationofHepaticOrganoidswithBiliaryStructures ....................175 TakeshiKatsuda,TakahiroOchiya,andYasuyukiSakai

17AnalysisforRemodelingofHepaticTissueStructuresin3D DuringRegeneration ....................................................187 KotaKaneko

PART VLIVER INJURY MODELS

18CanineLiverFibrosisModeltoAssesstheFunctionsofInfused AutologousBoneMarrow-DerivedCells ..................................201 TaroTakami,KenjiTani,YasuhoTaura,andIsaoSakaida

19ARodentModelforCellTransplantationofHepaticProgenitorCells ........211 SeiKakinumaandAkihideKamiya

20MouseModelforHepatocellularCarcinomaandCholangiocarcinoma OriginatedfromMatureHepatocytes .....................................221 MasahiroYamamoto,BingXin,andYujiNishikawa

21MouseModelforCholangiocarcinomafromPeribiliaryGlands...............237 HayatoNakagawa,NobumiSuzuki,andKazuhikoKoike

Contributors

BEATRIZ AGUILAR-BRAVO Institutd’InvestigacionsBiome`diquesAugustPiiSunyer (IDIBAPS),Barcelona,Spain

KAZUYA ANZAI DepartmentofGastroenterology,TokaiUniversitySchoolofMedicine, Isehara,Kanagawa,Japan

PAMELA S.CANADY OregonStemCellCenter,OregonHealthandScienceUniversity, Portland,OR,USA

HIROMI CHIKADA DepartmentofMolecularLifeSciences,TokaiUniversitySchoolof Medicine,Isehara,Kanagawa,Japan

ZHEN DAI DepartmentofGastroenterology,HepatologyandEndocrinology,Hannover MedicalSchool,Hannover,Germany

NICOLADE PRISCO CancerBiologyProgram,FoxChaseCancerCenter,Philadelphia,PA, USA

CRAIG DORRELL OregonStemCellCenter,OregonHealthandScienceUniversity, Portland,OR,USA

JOAN FONT-BURGADA CancerBiologyProgram,FoxChaseCancerCenter,Philadelphia, PA,USA

PENGYU HUANG SchoolofLifeScienceandTechnology,ShanghaiTechUniversity,Shanghai, China

LIJIAN HUI SchoolofLifeScienceandTechnology,ShanghaiTechUniversity,Shanghai, China;StateKeyLaboratoryofCellBiology,CASCenterforExcellenceinMolecularCell Science,ShanghaiInstituteofBiochemistryandCellBiology,ChineseAcademyofSciences, UniversityofChineseAcademyofSciences,Shanghai,China

NORIHISA ICHINOHE DepartmentofTissueDevelopmentandRegeneration,Research InstituteforFrontierMedicine,SapporoMedicalUniversitySchoolofMedicine,Sapporo, Japan

MASAYUKI ISHII DepartmentofTissueDevelopmentandRegeneration,ResearchInstitute forFrontierMedicine,SapporoMedicalUniversitySchoolofMedicine,Sapporo,Japan; DepartmentofSurgery,SurgicalOncologyandScience,SapporoMedicalUniversitySchool ofMedicine,Sapporo,Japan

SEI KAKINUMA DepartmentofGastroenterologyandHepatology,TokyoMedicalandDental University,Tokyo,Japan;DepartmentofLiverDiseaseControl,TokyoMedicalandDental University,Tokyo,Japan

KENJI KAMIMOTO DepartmentofDevelopmentalBiology,WashingtonUniversitySchoolof MedicineinSt.Louis,St.Louis,MO,USA

AKIHIDE KAMIYA DepartmentofMolecularLifeSciences,TokaiUniversitySchoolof Medicine,Isehara,Kanagawa,Japan;CenterforMatrixBiologyandMedicine,Graduate SchoolofMedicine,TokaiUniversity,Isehara,Kanagawa,Japan

KOTA KANEKO DepartmentofPathology,SchoolofMedicine,UniversityofCalifornia,San Diego,CA,USA

TAKESHI KATSUDA DivisionofMolecularandCellularMedicine,NationalCancerCenter ResearchInstitute,Tokyo,Japan

TAKETOMO KIDO LaboratoryofCellGrowthandDifferentiation,InstituteofMolecular andCellularBiosciences,TheUniversityofTokyo,Tokyo,Japan

JUNICHI KINO DepartmentofTissueDevelopmentandRegeneration,ResearchInstitutefor FrontierMedicine,SapporoMedicalUniversitySchoolofMedicine,Sapporo,Japan; TokushimaResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.Ltd.,Tokushima,Japan

SUNGJIN KO DepartmentofDevelopmentalBiology,McGowanInstituteforRegenerative Medicine,PittsburghLiverResearchCenter,UniversityofPittsburgh,Pittsburgh,PA,USA

KAZUHIKO KOIKE DepartmentofGastroenterology,TheUniversityofTokyo,Tokyo,Japan

NOBUHIKO KOJIMA DepartmentofLifeandEnvironmentalSystemScience,Graduate SchoolofNanobioscience,YokohamaCityUniversity,Yokohama,Japan

YUTA KOUI LaboratoryofCellGrowthandDifferentiation,InstituteofMolecularand CellularBiosciences,TheUniversityofTokyo,Tokyo,Japan

BIN LI OregonStemCellCenter,OregonHealthandScienceUniversity,Portland,OR, USA

HIROTAKA MIHARA DepartmentofLifeandEnvironmentalSystemScience,Graduate SchoolofNanobioscience,YokohamaCityUniversity,Yokohama,Japan

TOSHIHIRO MITAKA DepartmentofTissueDevelopmentandRegeneration,Research InstituteforFrontierMedicine,SapporoMedicalUniversitySchoolofMedicine,Sapporo, Japan

HAYATO NAKAGAWA DepartmentofGastroenterology,TheUniversityofTokyo,Tokyo,Japan

YUJI NISHIKAWA DivisionofTumorPathology,DepartmentofPathology,Asahikawa MedicalUniversity,Asahikawa,Hokkaido,Japan

TAKAHIRO OCHIYA DivisionofMolecularandCellularMedicine,NationalCancerCenter ResearchInstitute,Tokyo,Japan

MICHAEL OTT DepartmentofGastroenterology,HepatologyandEndocrinology,Hannover MedicalSchool,Hannover,Germany

TERESA RUBIO-TOMA ´ S Institutd’InvestigacionsBiome`diquesAugustPiiSunyer (IDIBAPS),Barcelona,Spain

YASUYUKI SAKAI InstituteofIndustrialScience,TheUniversityofTokyo,Tokyo,Japan

ISAO SAKAIDA DepartmentofGastroenterologyandHepatology,YamaguchiUniversity GraduateSchoolofMedicine,YamaguchiUniversity,Ube,Yamaguchi,Japan

PAU SANCHO-BRU Institutd’InvestigacionsBiome`diquesAugustPiiSunyer(IDIBAPS), Barcelona,Spain;CentrodeInvestigacionBiome´dicaenReddeEnfermedadesHepa ´ ticasy Digestivas(CIBERehd),Barcelona,Spain

AMAR DEEP SHARMA DepartmentofGastroenterology,HepatologyandEndocrinology, HannoverMedicalSchool,Hannover,Germany

XIZHONG SHEN DepartmentofGastroenterology,ZhongshanHospital,FudanUniversity, Shanghai,China

DONGHUN SHIN DepartmentofDevelopmentalBiology,McGowanInstitutefor RegenerativeMedicine,PittsburghLiverResearchCenter,UniversityofPittsburgh, Pittsburgh,PA,USA

GUANGQI SONG DepartmentofGastroenterology,ZhongshanHospital,FudanUniversity, Shanghai,China

ELEANOR STOUT CancerBiologyProgram,FoxChaseCancerCenter,Philadelphia,PA, USA

RYO SUDO DepartmentofSystemDesignEngineering,KeioUniversity,Yokohama,Japan

LULU SUN StateKeyLaboratoryofCellBiology,CASCenterforExcellenceinMolecular CellScience,ShanghaiInstituteofBiochemistryandCellBiology,ChineseAcademyof Sciences,UniversityofChineseAcademyofSciences,Shanghai,China

NOBUMI SUZUKI DepartmentofGastroenterology,TheUniversityofTokyo,Tokyo,Japan

TARO TAKAMI DepartmentofGastroenterologyandHepatology,YamaguchiUniversity GraduateSchoolofMedicine,YamaguchiUniversity,Ube,Yamaguchi,Japan

KENJI TANI DepartmentofVeterinarySurgery,JointFacultyofVeterinaryMedicine, YamaguchiUniversity,Yamaguchi,Yamaguchi,Japan

NAOKI TANIMIZU DepartmentofTissueDevelopmentandRegeneration,ResearchInstitute forFrontierMedicine,SapporoMedicalUniversitySchoolofMedicine,Sapporo,Hokkaido, Japan

FUMIYA TAO DepartmentofLifeandEnvironmentalSystemScience,GraduateSchoolof Nanobioscience,YokohamaCityUniversity,Yokohama,Japan

YASUHO TAURA DepartmentofVeterinarySurgery,JointFacultyofVeterinaryMedicine, YamaguchiUniversity,Yamaguchi,Yamaguchi,Japan

SHUJI TERAI DivisionofGastroenterologyandHepatology,GraduateSchoolofMedicaland DentalScience,NiigataUniversity,Niigata,Japan

HSIN-CHIEH TSAY DepartmentofGastroenterology,HepatologyandEndocrinology, HannoverMedicalSchool,Hannover,Germany

ATSUNORI TSUCHIYA DivisionofGastroenterologyandHepatology,GraduateSchoolof MedicalandDentalScience,NiigataUniversity,Niigata,Japan

KOTA TSURUYA DepartmentofGastroenterology,TokaiUniversitySchoolofMedicine, Isehara,Kanagawa,Japan

LESLIE WAKEFIELD OregonStemCellCenter,OregonHealthandScienceUniversity, Portland,OR,USA

BING XIN DivisionofTumorPathology,DepartmentofPathology,AsahikawaMedical University,Asahikawa,Hokkaido,Japan

MASAHIRO YAMAMOTO DivisionofTumorPathology,DepartmentofPathology,Asahikawa MedicalUniversity,Asahikawa,Hokkaido,Japan

QINGGONG YUAN DepartmentofGastroenterology,HepatologyandEndocrinology, HannoverMedicalSchool,Hannover,Germany

LUDI ZHANG StateKeyLaboratoryofCellBiology,CASCenterforExcellenceinMolecular CellScience,ShanghaiInstituteofBiochemistryandCellBiology,ChineseAcademyof Sciences,UniversityofChineseAcademyofSciences,Shanghai,China

IsolationofProgenitorCells

Long-TermCultureofMouseFetalHepatic Stem/ProgenitorCells

AtsunoriTsuchiyaandShujiTerai

Abstract

Mousefetalliverincludesabundanthepaticstem/progenitorcells(HSPCs).Easyexpansionwithpassageof HSPCsisnecessarytoobtainsteadydata.However,itisoftendifficulttoenrichonlyHSPCs,andHSPCs candiewhenusualtrypsinisusedforreplating.Here,weintroduceserum-freelong-termculturewith passageofHSPCsusingfetalmouseliverwithoutacellsorter.

Keywords Hepaticprogenitorcell,Spheroid,Serum-freeculture,Colony,Mouse

1Introduction

Mousefetalliverincludesabundanthepaticstem/progenitorcells (HSPCs)surroundinghematopoieticcells,endothelialcells,mesenchymalcells,andothercells.Owingtothehighexpansionability ofHSPCs,itisveryconvenienttousethesecellsafterexpansionfor invitroandinvivostudies.TherearetwomainproblemsinlongtermcultureofHSPCs.First,whileHSPCshaveahighexpansion ability,othercells,suchashematopoieticcells,endothelialcells,and mesenchymalcells,alsohavehighexpansionability.Sometimes whenfetallivercellsareculturedwithoutenrichmentwithserum, mesenchymalcellsoccupymostoftheculturedish.Adoptingacell sorterisaverygoodapproachtoisolateonlyHSPCsbyusingthe markersCD45 Ter119 c-kit CD29+CD49f+/low [1, 2],epithelial celladhesionantigen(EpCAM)[3],CD13[4, 5],anddelta-like 1homolog(DLK1)[6, 7].However,culturefromsinglecellsisnot easy,andnotalllaboratoriescanapplythisapproach.Second, HSPCscandiewhenusualtrypsinisusedforreplating.Toovercometheseproblemsandachievelong-termcultureofHSPCs,we developedanapproachinvolvingspheroidculturefollowedby two-dimensional(2D)culturewithreplatingusingdilutedtrypsin [8](Fig. 1).

NaokiTanimizu(ed.), HepaticStemCells:MethodsandProtocols,MethodsinMolecularBiology,vol.1905, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8961-4_1, © SpringerScience+BusinessMedia,LLC,partofSpringerNature2019

Culture

Dissociated E13.5 fetal liver cells

For 6 days

Floating culture

Plating culture

Hepatic spheroid formation

Monolayer colony formation

Subpassage with maintaining colony formation

With trypsin diluted by KSR and CaC12

Expansion of fetal hepatic stem/progenitor cells

Flow cytometry

Immunocytochemistry

RT-PCR

Transplantation

AnalysisDifferentiation +OSM etc.

DMEM/F12 (1:1)

+B27+ITS+

20 ng/ml EGF+

20 ng/ml bFGF+

20 ng/ml HGF

DMEM/F12 (1:1)

+B27+ITS+

20 ng/ml EGF+

20 ng/ml bFGF+

10 ng/ml HGF

E13.5 fetal liver cell

Hepatic spheroid

Ultra-low attachment plate

Expanding monolayer colony

2.1Isolationof HSPCs

2.2ForSpheroid Culture(Floating Culture)

1.Mice:ApregnantC57BL/6mouseatday13.5ofgestation wasusedasasourceoffetalliver.Otherstainswerenot attemptedforculture.

2.Tweezers.

3.Tissueculturedishes(100mm,polystyrene).

4.Phosphate-bufferedsaline(PBS).

5.1mLpipettetips.

1.Medium:Dulbecco’sModifiedEagleMedium/F12 (DMEM/F12).

2.Supplement:B27supplement(50 ),ITSmixture(100 ),and HEPES(finalconcentration:10nmol/L)(see Note1).

3.Antibiotics:Penicillin-streptomycinliquid(see Note1).

4.Growthfactors:Epidermalgrowthfactor(EGF;finalconcentration20ng/mL),hepatocytegrowthfactor(HGF;final concentration20ng/mL),andbasicfibroblastgrowthfactor (bFGF;finalconcentration20ng/mL).

5.Dish:Six-wellultralowattachmentplates(see Note2).

Type-1 collagen coated dish
Fig.1 Flowdiagrampresentingourculturesystem

2.3For2DCulture (PlatingCulture)

2.4DilutedTrypsin

1.Medium:Sameasthatinthespheroidculture.

2.Supplement:Sameasthatinthespheroidculture.

3.Antibiotics:Sameasthatinthespheroidculture.

4.Growthfactors:Sameasthatinthespheroidculture.Itis possibletoreducetheconcentrationofeachgrowthfactor (20–10ng/mL).

5.Dish:Six-wellcollagentypeI-coatedplates(see Note2).

1.Trypsin(0.25%)100mL(finalconcentration0.2%).

2.Knockoutserumreplacement(KSR)25mL.

3.CaCl2 (finalconcentration1mmol/L)(see Note3).

4.Dilutedtrypsin:Mix1–3tomakedilutedtrypsin.Aliquot 15mLtoaFalcontube,andfreezeat 30 Cuntiluse. WarmtheFalcontubeat37 Cbeforeuse.

3Methods

3.1SpheroidCulture

3.22DCulture

1.Beforeperforming2Dculture,createspheroidsusinganultralowattachmentplate.

2.KillapregnantC57BL/6mouseatday13.5ofgestationusing isoflurane,andperformcesareandelivery.

3.RemoveanddissectfetalliversusingtweezersincoldPBS.

4.Dissociatethedissectedfetalliversusinga1mLpipettetip,and collectthefragmentswithcentrifugationat500rpmfor3min (see Note4).

5.Countandplatethecollectedcells(see Note5)atadensityof 5 105 cells/mLinthemediumwithgrowthfactorsmentionedinSubheading 2.2 ona6-wellultralowattachmentplate (2mL/well).

6.Add2mLofmediumandgrowthfactorsatdays2and 4.Hepaticspheroidswillformandincreaseinsizefor6days (Fig. 2)(see Note6).

1.CollectthehepaticspheroidsformedinSubheading 3.1 by centrifugationat300rpmfor2min.

2.PlatethespheroidsonatypeIcollagen-coatedplatewiththe mediumandgrowthfactorsmentionedinSubheading 2.2. Eachspheroidwillformacolony(Fig. 3a)inthe6-wellcollagen-coatedplate(see Note7).Hepaticprogenitorcellswillbe highlyenrichedinthisserum-freecondition(see Note8).

3.Changethemediumandgrowthfactorsevery3days.

4.Afterreachingapproximately80%oftheconfluency,collect cellsaccordingtothemethodmentionedbelow.

3.3Replating

Fig.2 Spheroidsformedfor6daysbyspheroid(floating)culture.Thesizeof spheroidswasapproximately50–250 μm,comprisingapproximately20–150 cells

1.RemovethemediumandwashwithPBS.

2.Add1mLofdilutedtrypsinwarmedat37 Ctothe 6-wellcollagen-coatedplate,andwarmtheplateat37 Cfor 2–5min.

3.Checkthestatusofthecoloniesbymicroscopyevery2–3min. Ifthecoloniesarepartiallyremovedfromtheplateswhile maintainingcell-cellcontact,addmediumandstoptheenzymaticdigestion/reaction(see Note9).

4.Pressa2mLor5mLpipettetotheplates,andremove colonieswiththestronghydraulicpressureofthepipette (Fig. 3b).

5.Collecttheremovedcolonieswithlow-speedcentrifugation (500rpmfor3min).

6.Dividethecoloniesinto2or3aliquots,andreplateonnewly preparedcollagen-coatedplates(Fig. 3c).Thisprocedurecan berepeatedtoexpandthemousefetalHSPCsformorethan tenpassages.AschemeofthecultureisshowninFig. 1 (see Note10).

7.Collectedcoloniescanbepreservedat 80 Cforseveral weeksorinliquidnitrogenforyearsbyusing STEM-CELLBANKER®.CELLBANKER® 2canalsobe used(see Note11).

Fig.3 Imagesofthe2D(plating)cultureandreplating.Coloniesareformedfromeachspheroid(a).Collected coloniesbydilutedtrypsin(b)arereplatedontonewlypreparedcollagen-coatedplates(c).Duringpassage, cell-cellcontactwasmaintained

4Notes

1.B27supplement(50 ),ITSmixture(100 ),andpenicillinstreptomycinliquid(100 )canbepurchasedfromThermoFisherScientific.

2.Anytypeofplatemaybeappropriateifcellscannotattachto theplate.WepurchasedplatesfromCorning.

3.Wemade100mMCaCl2 solution(100 )bydissolvingCaCl2 indistilledwaterandthenfilteringthesolution.Thesolution wasaddedtothemixtureoftrypsinandKSR.

4.Fastercentrifugationmightbebetter.However,500rpmfor 3minissufficienttocollectdissociatedfetallivercells.

5.Duringcounting,redbloodcellsobviouslydistinguishedby sizewereexcluded.

6.Weexaminedtheefficacytoformspheroidsthroughgrowth factormatching.MatchingwithEGF,HGF,andbFGFwasthe mostappropriatetoobtainmanyspheroids.

7.Spheroidsfromeach6-wellplatewereplatedoneachwellof 6-wellcollagentypeI-coatedplates.

8.Hematopoieticcellsandmesenchymalcellswereincludedin theculture.However,mostofthecellsdisappearedafter2–3 passages(confirmedbycellmorphologyandflowcytometry).

9.Ifcoloniesaredifficulttoremovefromtheplates,thetimefor trypsintreatmentcanbeextendedto10–15min.Maintaining cell-cellcontactisthemostimportantpointforsuccessful replating.

10.Thereplatingmethodusingdilutedtrypsincanbeemployed foradultmousehepaticprogenitorcells[9, 10].

11.ThecellbankerscanbepurchasedfromZENOAQ.

References

1.SuzukiA,ZhengY,KondoRetal(2000) Flow-cytometricseparationandenrichmentof hepaticprogenitorcellsinthedeveloping mouseliver.Hepatology32:1230–1239

2.SuzukiA,ZhengYW,KanekoSetal(2002) Clonalidentificationandcharacterizationof self-renewingpluripotentstemcellsinthe developingliver.JCellBiol156:173–184

3.SchmelzerE,ZhangL,BruceAetal(2007) Humanhepaticstemcellsfromfetalandpostnataldonors.JExpMed204:1973–1987

4.KamiyaA,KakinumaS,YamazakiYetal (2009)Enrichmentandclonalcultureofprogenitorcellsduringmousepostnatalliver developmentinmice.Gastroenterology 137:1114–11261126e1-14

5.KakinumaS,OhtaH,KamiyaAetal(2009) Analysesofcellsurfacemoleculesonhepatic stem/progenitorcellsinmousefetalliver.J Hepatol51:127–138

6.TanimizuN,NishikawaM,SaitoHetal(2003) IsolationofhepatoblastsbasedontheexpressionofDlk/Pref-1.JCellSci116:1775–1786

7.TanimizuN,TsujimuraT,TakahideKetal (2004)ExpressionofDlk/Pref-1definesasubpopulationintheovalcellcompartmentofrat liver.GeneExprPatterns5:209–218

8.TsuchiyaA,HeikeT,FujinoHetal(2005) Long-termextensiveexpansionofmouse hepaticstem/progenitorcellsinanovel serum-freeculturesystem.Gastroenterology 128:2089–2104

9.TsuchiyaA,HeikeT,BabaSetal(2007)Longtermcultureofpostnatalmousehepaticstem/ progenitorcellsandtheirrelativedevelopmentalhierarchy.StemCells25:895–902

10.LuWY,BirdTG,BoulterLetal(2015) Hepaticprogenitorcellsofbiliaryoriginwith liverrepopulationcapacity.NatCellBiol 17:971–983

IsolationofBipotentialLiverProgenitorCellsfromNeonatal MouseLiver

Abstract

Liverstem/progenitorcells(LPCs)aredefinedasbipotentialcellsdifferentiatingintobothhepatocytesand cholangiocytes.TheNotch,TGFβ,andHippopathwayshavebeenimplicatedinlineagedeterminationof LPCsduringdevelopmentandregeneration.However,themolecularmechanismsgoverningthelineage specificationhavenotbeenfullyelucidated,yet.Epithelialadhesionmolecule(EpCAM)isamarkerof cholangiocytesandofLPCs.WefoundthatEpCAM+ cellsisolatedfromneonatallivercontainLPCsthat clonallyproliferateandarebipotentialinvitroandinvivo.Furthermore,EpCAM+ progenieskeepthe capacityofbidirectionaldifferentiationevenafterlong-termculture.Thesecellsareusefultoinvestigatethe molecularmechanismsregulatinglineagecommitmentandepithelialdifferentiationofLPCs.

Keywords Tissuestemcell,Liver,Neonate,Bipotential,Hepatocyte,Cholangiocyte,Liverstem/ progenitorcell,Fluorescence-activatedcellsorting,Colonyassay,Clonalculture

1Introduction

Liverstem/progenitorcells(LPCs)aredefinedasbipotentialcells differentiatingintotwotypesofliverepithelialcells,hepatocytes andcholangiocytes.LPCshavebeenisolatedfromnormaland injuredliversbasedonexpressionofsurfaceantigensincluding EpCAM(epithelialadhesionmolecule),CD13,andCD133 [1].However,thegeneticlineagetracingdoneinthepast5years suggeststhatLPCssignificantlycontributeneithertocellularturnovernorregeneration[2, 3].Incontrast,recentresultsshowedthat cholangiocytessupplynewhepatocyteswhenhepatocytesare almostcompletelydepletedortheproliferativecapabilityofhepatocytesisimpaired[4, 5],suggestingthatpartofcholangiocytes mayhaveplasticitytoactasfacultativeLPCs.Althoughtheheterogeneityofcholangiocyteshasbeendemonstrated[6, 7],itisstill difficulttolabelthosecellsinvivoandtoprospectivelyisolatethe sauceoffacultativeLPCsinnormalandinjuredadultliver.

NaokiTanimizu(ed.), HepaticStemCells:MethodsandProtocols,MethodsinMolecularBiology,vol.1905, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8961-4_2, © SpringerScience+BusinessMedia,LLC,partofSpringerNature2019

WeisolatedEpCAM+ cellsfromtheliverbetweenE17and 12Wafterbirthandshowedthatcolony-formingcellsareenriched inthisfraction[8].WefurtherfoundthatneonatalEpCAM+ cells differentiatetohepatocytesandcholangiocytesinvitroandinvivo, thoughtheygraduallylosesuchdifferentiationcapabilityduring thesubsequentdevelopmentalprocess.ItisalsopossibletoestablishbipotentialliverprogenitorcelllinesfromneonatalEpCAM+ cells.ThischapterincludestheprotocolsforisolatingEpCAM+ cellsfrom1Wmouseliver,expandingtheminvitroandinducing theirdifferentiationtoeitherhepatocyteorcholangiocytes.

2Materials

2.1CellIsolation

1.Isoflurane.

2.Hanks’balancedsaltsolution(HBSS).

3.Pre-perfusionsolution:0.5mMEGTAinHBSS.

4.Twenty-seven-gaugeneedle.

5.Tenmillilitersyringe.

6.Collagenase:1mg/mLinHBSS.

7.6cmplasticdish.

8.Liverperfusionmedium:Liverperfusionmedium(Thermo FisherScientific,Cat.No.17701038)orHBSS containingEGTA.

9.PBS(+/+):100mg/mLMgCl2 and100mg/mLCaCl2 in phosphatebuffersaline(PBS).

10.LiberaseTM(RocheDiagnostics,Basel,Switzerland):Itisthe blendzymeofcollagenaseandthermolysin.DissolveinPBS, makealiquots,andstoreat 80 C.Dilutethestocksolution 50timesinPBS(+/+)beforeuse.

11.70 μmcellstrainer.

12.Hemolysisbuffer:10mMTris-HCl,50mMNH4Cl.Pass througha0.22 μmporefiltertosterilize.

2.2CellSorting

2.3CellCulture

1.Antibodies:FITC-conjugatedanti-mouseCD329/EpCAM, APC-conjugatedanti-mouseCD31,andAPC-conjugated anti-CD45andAPC-Cy7-conjugatedanti-mouseTER119.

2.Washbuffer:Add2%FBStoPBS.Storeat4 C.

3.Propidiumiodide(PI)(1mg/mL).

1.Growthfactor-reducedMatrigel® (MG)(BDBiosciences,Bedford,MA):ThawthebottleofMGonice,andmakealiquotsin 1.5mLtubes.Freezethosetubesinliquidnitrogen,andstore

themat 30 C.ThawMGinatubeonicebeforeuse(see Note1).

2.CollagentypeIPC(KokenCo.,Ltd.,Tokyo,Japan).

3.Collagenreconstitutionbuffer:2.2%NaHCO3,0.2M HEPES,and50mMNaOH.Passthrougha0.22 μmpore filtertosterilize.

4.10 Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM)/Ham’s F-12NutrientMixture(1:1)(DMEM/F-12)medium.

5.Lamininsolution:Thawlaminin-111inaglassbottleat4 C. Transferittoa1.5mLtube,andstoreat4 C.DiluteitinPBS at10 μg/mL.Add1mLdilutedsolutionto35mmplate.Wait about1handremovethesolutionbeforeplatingcells(see Note2).

6.Gelatinsolution:AutoclavePBScontaining0.1%gelatin.Add 300 μLgelatinsolutiontoeachwellof24-wellplate.Aspirate gelatinsolutionandwashwellswithPBSonce.

7.Basalmedium:PrepareDMEM/F-12mediumsupplemented with10%fetalbovineserum,10mMnicotinamide,and10 μg/ mLgentamicin.

8.Growthmedium:Add1 insulin/transferrin/selenium(ITS), 1 10 7 Mdexamethasone(DEX),10ng/mLepidermal growthfactor(EGF),and10ng/mLhepatocytegrowthfactor (HGF)tothebasalmedium.

9.Differentiationmedium:Add1 ITS,1 10 7 MDEX,and 1%dimethylsulfoxide(DMSO)tothebasalmedium.Add 10ng/mLoncostatinM(OSM)or5%MGbeforeuse.

10.LysissolutionforRNAextraction.

11.Cloningring:Autoclaveglassorstainlessrings.ApplyautoclavedVaselineonthebottomoftheringbeforesurroundinga colony.

12.Trypsin/EDTA:Dissolve0.25%trypsininPBS,makealiquots, andstoreat 30 C.Dilutethestocksolution5timeswith PBSandaddwith1mMEDTAbeforeuse.

13.Blockingsolution:DissolveBlockAceinPBS.

14.Bovineserumalbumin(BSA).

15.PFS:Dissolve0.7%fishgelatin,0.07%saponin,and0.02% sodiumazide.Storeat4 C.

16.Paraformaldehyde(PFA)solution:4%PFAinPBS.

17.Permeabilizationbuffer:0.2%TritonX-100inPBS.Make10% TritonX-100andkeepitatroomtemperature.Dilutethe stocksolutionby50timeswithPBS.

3Methods

3.1CellIsolation

3.1.1Collagenase Perfusion

3.1.2Enzymatic DigestionoftheRemaining TissueAfterCollagenase Perfusion

1.Anesthetizeamousebyisoflurane.Opentheabdomen,and thencutthediagramandribtoexposetheheart.

2.Attachaneedletoa10mLsyringefilledwithpre-perfusion mediumthatispre-warmedat37 C.Inserttheneedleintothe leftventricle,andinjectpre-perfusionmedium.Cuttheinferior venacavaafterconfirmingthelivertissuebecomesenlarged duetopressure(Fig. 1).Changethesyringetoonefilledwith perfusionmedium.Injecttheperfusionsolutionslowly.

3.Isolatetheliverandplaceitona6cmplasticdish.Add5mLof HBSS.Holdtheliverwithaforceps,andscrapeoffhepatocytes fromundigestedlivertissueusinganotherforceps.(Useundigestedtissueforfurtherenzymaticdigestion.Seethenext paragraph.)Passthecellsuspensionthrougha70 μmcell strainer.

4.Centrifugethecellsuspensionat50 g for1min.Collectthe supernatantandcentrifugeitat350 g for4min(see Note1). Resuspendthepelletin1mLofbasalmedium.

1.Mincetheundigestedtissueaftercollagenaseperfusion.Suspendtissuepiecesin3mLofliverperfusionmedium,and collectthemina15mLtube.Centrifugeat150 g for3min.

2.Resuspendthepelletin1mLofLiberaseTMsolution(see Note3).Incubatethecellsuspensionat37 Cfor15min. Dissolvethetissuebypipetting(see Note4).Add1–2mLof

Fig.1 Schematicviewofperfusionforaneonatalmouse.Amouseisfixedona boardwithtapes.Afterexposingtheheartandidentifyingtheleftventricle,a needleisattachedtoa10mLsyringefilledwithpre-perfusionmedium

3.1.3Hemolysis

3.2CellSorting

basalmediumtostopenzymaticdigestion.Passthecellsuspensionthrougha70 μmcellstrainer.

3.Centrifugationat50 g for1min.Then,centrifugethe supernatantat350 g for4mintocollectdissociatedcells. Resuspendcellsin1mLofbasalmedium.

1.CombinethecellsuspensionsfromSubheading 3.1.1, step4, andSubheading 3.1.2, step3, intoanew15mLtube.Centrifugeat350 g for4min.

2.Resuspendpelletin1mLofhemolysisbuffer.Incubateat4 C for5min.Then,add1–2mLofbasalmedium,andpass througha70 μmcellstrainer.Centrifugeat350 g for4min.

3.Resuspendthepelletin200 μLofbasalmedium,andcountthe numberofcells.

1.Centrifugethecellsuspensionat350 g for4min.Resuspend cellsin100 μLofbasalmedium.

2.Add1 μLofanti-CD16/CD32antibody,andincubateat4 C for20mintoavoidnon-specificbindingofantibodiesby maskingFcγ receptors.Addice-coldwashbufferandcentrifuge at350 g for4min.

3.Resuspendcellsin100 μLofbasalmedium,andthenadd1 μL eachofFITC-conjugatedanti-mouseEpCAM, APC-conjugatedanti-CD31,APC-conjugatedanti-CD45, andAPC-Cy7-conjugatedanti-TER119(see Note5).

4.Foranisotypecontrol,addFITC-conjugatedratIgG, APC-conjugatedratIgG,andAPC-Cy7-conjugatedratIgG.

5.Incubatecellswithantibodiesat4 Cfor20min.

6.Add2mLofice-coldwashbufferandcentrifugeat350 g for 4min.Resuspendcellsin300 μLofbasalmediumcontaining 1 μg/mLPI.Passthrough40 μmcellstrainerbeforeanalysis onFACSAriaII(BDBiosciences).

7.SelectCD31 CD45 TER119 cellsinPI singletcellsby gatingonFACSAriaII.IdentifyandcollectEpCAM + cells inCD31 CD45 fractionintoa5mLtube(Fig. 2).

8.Transferthecollectedcellsintoa15mLtube.Centrifugeat 350 g for8min.Resuspendcellsandadd7mLofbasal mediumandcentrifugeat350 g for8min.Resuspendcellsin 1mLofbasalmedium.

Fig.2 IsolationofEpCAM+ cellsbyFACS.AftergatinglivesingletCD31 CD45 cells,EpCAM+ cellscanbe identifiedandisolated

3.3Culture

3.3.1ColonyAssay

3.3.2Hepatocyte Differentiation

1.Resuspendcellsingrowthmedium.Plate5000cellsin35mm dishcoatedwithlaminin.

2.Atday7,fixcellsin4%PFAat4 Cfor15min.Wash1mLof PBSfor3times.Permeabilizewith0.7mLof0.02%Triton X-100,andincubateatroomtemperaturefor5min.Washcells with1mLofPBSfor2times.Add1mLofBlockAceand incubateatroomtemperaturefor30min.

3.Replaceblockingsolutionto1mLofPBScontaining1%BSA and1 μLeachofrabbitanti-mousecytokeratin19(CK19)and anti-mousealbumin(ALB)antibody.Incubateat4 Cfor4h. WashcellswithPBSthreetimes.AddPBScontaining1%BSA, 0.5 μLeachofAlexaFluor488-conjugatedanti-rabbitIgGand AlexaFluor555-conjugatedanti-goatIgGand1 μLeachof Hoechst33342.Incubateat4 Cfor2h.Washcellswith PBSthreetimesbeforeexaminationofthenumberofcells andexpressionofALBandCK19underafluorescencemicroscope.AtypicalbipotentialcolonyisshowninFig. 3a.

1.Plate5000EpCAM+ cellsinawellof24-wellplatecoatedwith gelatin.

2.ReplacebasalmediumtothedifferentiationmediumcontainingOSMandincubatefor2days.Replacethemediumtoone containing5%MG.Keepthecultureforadditional3days.

3.Toexamineexpressionofhepatocytemarkergenes,dissolve cellsinalysissolutionandextracttotalRNA.SynthesizecDNA andperformPCRwithgene-specificprimers.

4.Toexamineexpressionofhepatocytemarkerproteins,treat cellswithSubheading 3.3.1, step2.Incubatecellswithrabbit anti-hepatocytenuclearfactor4 α (HNF4α)andgoatanti-ALB orwithrabbitanti-CCAATenhancerbindingprotein α (C/EBPα)andgoatanti-carbamoylphosphatesynthetaseI (CPSI)antibody.Typicalimagesbeforeandafterthetreatment ofOSMandMGareshowninFig. 3b

Fig.3 ProliferationandhepatocytedifferentiationofneonatalEpCAM+ cells.AEpCAM+ cellclonally proliferatesandformsabipotentialcolonycontainingALB+ hepatocytesandCK19+ cholangiocytes.(a)Part ofEpCAM+ cellsexpressesALBandHNF4α beforeinducinghepatocytedifferentiation,whereastheybecome HNF4α+ALB+ hepatocytesinthepresenceofOSMandMG.(b)Barsrepresent100 μm

3.3.3Cholangiocyte Differentiation

1.AddPBS,collagenreconstitutionbuffer,10 DFmedium, andcollagenIPCat4:3:3:20(v:v:v:v)ratioina15mLtube onice.Pipetteupanddowngentlytomixthoroughly.

2.MixcollagengelwithMGat1:1ratio.Add80 μLofthemixed geltoeachwellof8-wellcoverglasschamber.Incubateitat 37 Cfor30min.

3.Plate1 104 cellsin150 μLofgrowthmedium,andincubate for5min.Add150 μLofgrowthmediumcontaining10%MG.

3.3.4Isolationof BipotentialClones

4.Toexamineexpressionofcholangiocytemarkergenes,dissolve cellsinalysissolution,andextracttotalRNA.Synthesize cDNAandperformPCRwithgene-specificprimers. Toexamineexpressionofcholangiocytemarkerproteins,fix cellsin4%PFAandpermeabilizein0.02%TritonX-100.Wash cellswithPBSonce,addPFS,andincubateatroomtemperaturefor30min.IncubatecellswithPFScontainingprimary antibodiessuchasanti-CK19,anti-integrinbeta4,anti-protein kinaseCzeta,andanti-aquaporin1antibodyfollowedbyAlexa Fluordye-conjugatedantibodiesandHoechst33342.Examine thelocalizationofcholangiocytemarkersunderaconfocallaser scanningmicroscope.

1.Keepclonalcultureforabout4weeks.

2.WashcellswithPBSonce,andthensurroundeachcolonywith acloningring.Add100 μLoftrypsin/EDTA,andincubatefor 5–10minat37 C.Pipetteupanddownfor3–4times,and transferthecellsuspensioninto1mLofbasalmediumin 15mLtube.Centrifugeat350 g for3min.

3.Resuspendcellsingrowthmedium,andplatethemontoawell of24-wellplatecoatedwithlaminin-111(see Note6).

4Notes

1.Ittakesabout2htodissolveanaliquotof500 μLMGonice.

2.Thedilutedlamininsolutioncanbereuseduptothreetimesto coattissueculturedishes.Weusuallyrecoverthelamininsolutionandstoreitina15mLtubeat4 C.

3.Forscale-up,undigestedtissuescanbepooledatthisstep.The tissuepiecesderivedfrom2to3micearecollectedina15mL tubeandthenaddedwith2mLofLiberaseTM.Fordigesting tissuepiecesfrommorethanthreemice,makeanothertubefor Liberasedigestionandthenpooledcellsuspensionsintoone tubeafterLiberasedigestion.

4.Pipetteupanddownfor20–30timestodissociatethemostof cellsfromconnectivetissue.

5.Countthenumberofcells.Use1 μLofeachantibodytolabel cellslessthan1 107 cells.Increasethequantityofantibodies accordingtotheamountofcells.

6.Thesizeofcultureisgraduallyincreasedto12-wellplateand then35mmdish.EpCAMexpressionisexaminedbyFACSto acquireEpCAM+ clones.EpCAM+ clonesarereplatedevery 4daysbyplating5 104 cellsin35mmdishcoatedwith laminin.Hepatocyteandcholangiocytedifferentiationcanbe

inducedusingthesameprotocolastheprimaryEpCAM+ cells, whicharedescribedinSubheadings 3.3.2 and 3.3.3

Acknowledgments

IthankDr.ToshihiroMitakaandDr.NorihisaIchinoheforhelpful discussionandMs.YumikoTsukamotoandMs.MinakoKuwano fortechnicalassistance.ThisworkissupportedbytheMinistryof Education,Culture,Sports,ScienceandTechnology,Japan, Grants-in-AidforScientificResearch(C)(25460271, 16K08716),andGrants-in-AidforScientificResearchonInnovativeAreas“StemCellAgingandDisease”(17H05653).

References

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IdentificationandIsolationofClonogenicCholangiocyte inMouse

BinLi,CraigDorrell,PamelaS.Canady,andLeslieWakefield

Abstract

Cholangiocytesareproliferativeandareoneofthesourcesforliverprogenitorcells.Clonogeniccholangiocytesaredefinedascellscapableofclonallyproliferatinganddifferentiatingcholangiocytesbothinvitro andinvivo.Inthisprotocol,wedescribethemethodforisolationofprimarycholangiocytesfrommouse. Tostudytheheterogeneityofcholangiocytes,weusedflowcytometry-basedcellsortingtoisolatedifferent subsetsofcholangiocytes.Organoid-formingefficienciesfromsortedsinglecellsarecomparedwithin differentcholangiocytepopulationstoidentifyclonogeniccholangiocytes.

Keywords Ductcells,ST14,FACS,Organoid

1Introduction

Liverductcells,so-calledcholangiocytes,arehighlyproliferative invitroandinvivo.Inourpreviousreportfoundinthenormaland injuredmouseliver,MIC1-1C3+ liverductcellsareproliferative: theyformedcolonyinvitro,andgeneexpressionshowedMIC11C3+ cellsthatareexpressingSox9,aprogenitormarker[1].Moreover,MIC1-1C3+ coloniescouldengraftinthe Fah / mouse,a transgenicmousemodelforliverinjury,andthetransplantedliver cellscouldreplacethedamagedhostliver[2],indicatingthestem/ progenitorcapabilitiesofdonorcells.Thus,MIC1-1C3isusedas anovalcellmarker.Lgr5,amemberofWntsignalpathway,has beenpreviouslyfoundasaliverstemcellmarker.Incontrastto MIC1-1C3,normalliverdoesn’texpressLgr5[3],whereas,under chronicliverinjury,liverductcellsinmousebecomeLgr5+.Those Lgr5+ cellsareproliferativeandformliverorganoidinvitro.Moreover,transplantationofLgr5+ organoidscouldengraftintothe hostliver,indicatingthestemcellcapability[4].Furtherreport demonstratedthatMIC1-1C3+ ductcellsinbothnormalliverand pancreasformorganoidsinvitro[5].ST14(suppressoroftumorigenicity14protein)isamarkerforpancreaticcancer;however,not

NaokiTanimizu(ed.), HepaticStemCells:MethodsandProtocols,MethodsinMolecularBiology,vol.1905, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8961-4_3, © SpringerScience+BusinessMedia,LLC,partofSpringerNature2019

anyresearchhasstudiedST14intheliver.Inourpreviousreport, withthecellsurfacemarkersMIC1-1C3[5]andST14[3],we demonstratedthatnormalmousecholangiocytesareheterogeneous:ST14hiMIC1-1C3+ cellsarehighlyproliferative;theyform single-cell-derivedorganoidmoreefficientlythanST14loMIC11C3+ cholangiocytes[3].Herewewilldescribethemethodfor isolatingcholangiocytesvialiverperfusion.ST14hiMIC1-1C3+ cellsinprimarylivernon-parenchymalcells(NPCs)aredirectly sortedinto96-wellplatebyfluorescence-activatedcellsorting (FACS).Inthisformatofcolony-formingassay,clonogeniccholangiocytesformsingle-cell-derivedorganoids.Inaddition,organoidsculturedfor~3monthsareusedforthedifferentiationassay examiningtheirbidirectionaldifferentiationpotential.

2Materials

2.1LiverPerfusion

1.Solution1:10mMHEPESand0.5mMEGTAinEarle’s BalancedSaltSolution(EBSS)withoutCa2+/Mg2+,pH7.4 (~30mLpermouse).

2.Solution2:10mMHEPESinEBSSwithCa2+/Mg2+,pH7.4 (~20mLpermouse).

3.Solution3:0.1%collagenaseIIinsolution2(~50mLper mouse) see Note1.

4.NPCdigestionsolution:2.5mg/mLcollagenaseIVand 0.1mg/mLDNaseIinsolution2(~5mLpermouse).

5.Washmedium:10%FCSand0.1mg/mLDNaseinDMEM. 6.0.05%trypsin.

7.Phosphate-bufferedsaline(PBS). 8.70%ethanol.

9.Cottonapplicators(sterile).

10.Intravenous(IV)infusionset.

11.24-gaugecatheters.

12.Peristalticpump.

13.Forceps,scissors(sterile).

14.Tape.

15.100 μmcellstrainer.

16.60mmpetridish.

17.Anestheticsolution.

18.Centrifuge,setat10 C.

19.Mouse:8-week-oldC57B/L6malemouse.Allanimalexperimentationwasconductedinaccordancewithprotocol IP00445oftheInstitutionalReviewCommitteeatOregon HealthandScienceUniversity.

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The Project Gutenberg eBook of Prinzessin

Sidonie (Band 2/3)

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Title: Prinzessin Sidonie (Band 2/3)

Author: Julius Bacher

Release date: November 13, 2023 [eBook #72113]

Language: German

Original publication: Leipzig: Verlag von Friedrich Fleischer, 1870

Credits: Hans Theyer and the Online Distributed Proofreading Team at https://www.pgdp.net (This transcription was produced from images generously made available by Bayerische Staatsbibliothek / Bavarian State Library.)

*** START OF THE PROJECT GUTENBERG EBOOK PRINZESSIN SIDONIE (BAND 2/3) ***

Anmerkungen zur Transkription:

Das Original ist in Fraktur gesetzt; Schreibweise und Interpunktion des Originaltextes wurden übernommen; lediglich offensichtliche Druckfehler sind korrigiert worden.

Eine Liste der vorgenommenen Änderungen findet sich am Ende des Textes Worte in Antiquaschrift sind "kursiv" dargestellt.

Das Umschlagbild wurde vom Bearbeiter geschaffen Ein Urheberrecht wird nicht geltend gemacht Das Bild darf von jedermann unbeschränkt genutzt werden.

Prinzessin Sidonie.

Roman von Julius Bacher.

Zweiter Band.

Leipzig, Verlag von Friedrich Fleischer. 1870.

Erstes Kapitel.

Etwa zwei Monate waren über die näher bezeichneten Vorgänge dahin gegangen. Den lichten, milden Herbsttagen waren die trüben und rauhen Verkünder des nahenden Winters gefolgt. Nachtfröste und die nie fehlenden Winde hatten Bäume und Gesträuche allgemach entblättert und die Menschen in die behaglichen Wohnungen gedrängt, von wo aus sie dem Walten in dem Naturleben gesicherter zuschauten und sich nun an den häuslichen Vergnügungen ergötzten.

Dies war namentlich in den Hofkreisen der Fall, woselbst man eifrig bedacht war, sich Amusements aller Art zu bereiten und in solcher Weise den unbequemen Winter angenehm zu vertändeln.

Es war die eilfte Vormittagsstunde und wir sehen den Fürsten in einem nichts weniger als prunkvollen, sondern vielmehr ziemlich einfach ausgestatteten Gemach mit der Durchsicht einiger vor ihm liegenden Papiere beschäftigt.

In dem Kamin brannte ein helles Feuer, obwol die Luft nur frisch, jedoch nicht frostkalt war. Ebenso war der Fürst sehr warm gekleidet, namentlich waren die Füße durch wärmende Hüllen und Decken geschützt. Die rauhe Jahreszeit hatte sein altes Leiden, die Gicht, mit vermehrter Heftigkeit herbei geführt und quälte ihn nun schon seit mehren Wochen, indem es ihn zugleich am Arbeiten und dem Genuß der frischen Luft hinderte und ihm überdies alle Lust an seinen gewöhnlichen Zerstreuungen raubte. Die Stimmung des Fürsten war daher auch keine gute, trotz der Bemühungen seiner vertrauten Freunde.

Während seiner Beschäftigung wurde ihm der Kammerherr, Chevalier Boisière gemeldet, und der Fürst befahl, denselben sogleich eintreten zu lassen. Der Chevalier besaß das besondere Vertrauen des Fürsten und wurde von diesem zu mancherlei delicaten Diensten verwendet, wozu der Franzose ganz ausgezeichnete Talente besaß.

Am Hofe in Paris alt geworden, in alle Intriguen desselben eingeweiht und mit den reichen Erfahrungen eines genußvollen Lebens ausgestattet, eignete er sich vortrefflich zu dem vertrauten Diener eines Fürsten, an dessen Hof es nicht besser zuging, als an dem französischen.

Durch Genüsse erschöpft, war der einst sehr schöne Chevalier nur noch ein Schatten von seiner ehemaligen Herrlichkeit. Er war sechzig und einige Jahre alt, sein Antlitz mit feinen Runzeln durchfurcht, der Mund wegen der Zahnlosigkeit eingefallen. Obgleich dürr und hinfällig, glänzte doch sein dunkles Auge lebensvoll und verrieth die Frische des Geistes, die ihm trotz seiner körperlichen Schwäche geblieben war. Er besaß eine feine Bildung, Geist und Witz, die er in einer angenehmen Weise geltend zu machen wußte, und war überdies in Haltung und Benehmen ein vollendeter Hofmann. Kleidung und Toilette waren stets sauber und geschmackvoll, ja der Chevalier verschmähte sogar Schminke und Schönpflästerchen nicht, um seinen graubraunen Teint zu verbessern und demselben einen jugendlichen Anstrich zu verleihen. Diese Sorgfalt war denn auch der Grund, daß er um zehn Jahre jünger erschien, als er es in der That war. Seiner geistigen Vorzüge, namentlich jedoch seiner Geschicklichkeit in Ausführung der angegebenen Dienste wegen schätzte ihn der Fürst ganz besonders und hatte ihn auch heute in seinem persönlichen Interesse zu sich rufen lassen.

»Nun, Chevalier, bringen Sie Neuigkeiten?« fragte der Fürst, den Eintretenden mit einem vertraulichen Kopfnicken begrüßend.

»Nichts von Bedeutung, mein gnädigster Fürst. Der Winter eignet sich eben so wenig zum Krieg wie zum Hervorbringen von anderen interessanten Vorgängen. Die Elemente wirken tiefer auf den

Menschen, als er eingestehen will, und die Kälte und todte Natur schläfern die Leidenschaften ein; Winter und Alter verlangen nach Ruhe oder werden vielmehr durch die ersteren dazu genöthigt.«

»Wie ich hier, par exemple, nicht wahr? Und Sie wollten mich wahrscheinlich durch den Hinweis auf das allgemeine Naturgesetz mit meinem Leiden aussöhnen? Ich danke Ihnen, Chevalier, wenngleich ich Ihnen bekenne, sehr wenig Trost darin zu finden, da trotz alledem meine Schmerzen kein Ende nehmen wollen. Doch Sie haben noch etwas anzuführen vergessen, nämlich, daß die unfreundliche Jahreszeit uns auch unsere Sorgen ernster erscheinen läßt, als dies sonst zu sein pflegt.«

»Sollte das bei meinem gnädigsten Fürsten etwa der Fall sein?«

»Ja, Chevalier, und ich darf Ihnen meine Sorgen wol nicht näher bezeichnen, Sie kennen dieselben.«

»Diese beziehen sich also auf den Prinzen?«

»Natürlich; denn trotz aller meiner Bemühungen und alles Abwartens währt die unselige Trennung zwischen ihm und der Prinzessin fort. Ich sehe das Ende dieses Haders nicht und so mehrt sich die Sorge um die Thronfolge. Ich bin alt und krank genug, um an das Sterben zu denken. Der Tod kann mich überraschen, ehe die Erbfolge gesichert ist; da gebe es dann bei des Prinzen Charakter dereinst viel Unruhe und Gefahr, und diese möchte ich dem Staat gern ersparen.«

»In der That, ein übler Umstand,« bemerkte der Chevalier gedankenvoll.

»Ich bin überzeugt, die Prinzessin trägt keinen kleinen Theil der Schuld, daß keine Aussöhnung zu Stande kommt. Zwar war des Prinzen Treiben bisher allerdings nicht zu loben; er hat jedoch meinen Vorstellungen Gehör gegeben, wie ich zu meiner Freude bemerkt habe. Seit mehren Monaten verkehrt er fast gar nicht mehr mit der Residenz; die Debauchen haben aufgehört, und er lebt seit dieser Zeit ziemlich eingezogen und befleißigt sich der Staatsgeschäfte, ohne, so viel ich weiß, eine Liaison zu haben. Er hat sich also sehr zum Vortheil geändert, und dieser Umstand ließ

mich mit Bestimmtheit die Herstellung eines guten Einvernehmens mit der Prinzessin hoffen; statt dessen höre ich, daß sie sich noch eben so fern als früher, ja man meint sogar, noch ferner stehen.«

»Nach den Mittheilungen der Baronin Mühlfels — die, wie mein gnädiger Fürst weiß, meine vertraute Freundin ist — muß ich diesen Umstand durchaus bestätigen.«

»Nun, da sehen Sie, Chevalier, wie die Sache steht, und werden erkennen, daß ich genöthigt bin, auf Mittel zu denken, diesem Uebel auf irgend eine Weise sicher zu begegnen!« rief der Fürst, durch das Vernommene sichtlich verstimmt.

Der Chevalier schaute bedenklich vor sich hin und der Fürst fuhr fort:

»An eine Trennung der Ehe mag ich nicht denken; ich scheue einen solchen Eclat, wobei der Prinz und ich selbst, da ich diese Ehe gestiftet habe, nicht eben gut fortkommen würden. Freilich ist an diesem Zerwürfniß mehr der Prinz als die Prinzessin schuld; denn es hätte Alles gut sein können, würde er die Prinzessin besser behandelt oder ihr die schuldigen Rücksichten geschenkt haben. Denn sie war anfangs ein stilles, geduldiges Wesen, bis es der Prinz zu toll machte, und nun ist sie uns über den Kopf gewachsen. Sie hat in der letzten Zeit eine Festigkeit und Selbstständigkeit bewiesen, die ich bei dieser zarten Frau nie erwartet hätte. So ist an eine Erfüllung meines Wunsches nicht zu denken, und das macht mich sehr besorgt und läßt mich auf Mittel denken, diesem Uebelstande in einer geeigneten Weise abzuhelfen. Was meinen Sie dazu?«

»Ich unterwerfe mich der Weisheit meines Fürsten,« entgegnete der Chevalier, das feine Spitzentuch an die Lippen führend.

»Ja,« fuhr der Fürst, von dem Interesse des besprochenen Gegenstandes erfüllt, eifrig fort, »ja, ließe sich der Prinzessin irgend eine bedenkliche Schwäche mit Bestimmtheit nachweisen, so würde man einen Anhaltpunkt für die Trennung gewinnen; s o jedoch ist darauf nicht zu hoffen. Sie ist zu tugendhaft, oder besser gesagt, sie besitzt keine Leidenschaft.«

Der Chevalier hüstelte und ein feines, schlaues Lächeln umspielte seinen Mund.

»Ihre Mienen deuten mir an, daß Sie meine Ansicht über der Prinzessin Charakter nicht theilen,« bemerkte der Fürst, den Chevalier fest anschauend.

»O, Pardon, mein Fürst! Wie sollte ich nicht?!« fiel der Letztere ein, sich anmuthig verneigend, und fügte mit einem eigenthümlichen Ton und Blick hinzu: »Mein hoher Gebieter weiß, daß der Hof Ludwig des Fünfzehnten mich erzog und ich an demselben meine Erfahrungen über weibliche Tugend gesammelt habe; ein Bedenken über Ihre Besorgniß, mein Fürst, dürfte mir daher wohl gestattet sein. Ich meine, wir Menschen besitzen im Allgemeinen keinen Ueberfluß an moralischen Vorzügen, und aus dem einfachen Grunde, weil diese Vorzüge nicht beliebt, nicht amüsant und — auch nicht in der Mode sind. Dieses letztere ist sehr wichtig in Bezug auf die Frauen, namentlich auf diejenigen, welche das Glück genießen, die Luft des Hofes einzuathmen und aus ihren Elementen sich die Grundsätze zu ihrem Leben zu bilden. Damit wäre ich denn auch bei dem Tugend-Ueberfluß der Prinzessin angelangt,« schloß der Chevalier lächelnd.

»So nehmen Sie das letztere an, Mangel an Leidenschaft, gewöhnlich die Quelle unverdienter Tugenden!« fiel der Fürst ein, der durchaus Recht behalten wollte.

Wiederum schaute der Kammerherr schweigend vor sich hin, während das frühere bezeichnende Lächeln sich auf’s Neue geltend machte.

»Auch die zweite Voraussetzung scheinen Sie nicht zu billigen,« bemerkte der Fürst nach kurzer Pause.

»Ich gestehe, mein Fürst, es ist so. Der Schein trügt am meisten bei den Frauen, namentlich wenn sie noch so jung wie die Prinzessin sind. Jede Frau besitzt nach meinen Erfahrungen hinreichende Leidenschaften, um sich durch sie zu Thorheiten verleiten zu lassen; es kommt nur darauf an, dieselben in der geeigneten Weise hervor zu rufen. Vorhanden sind sie alle Zeit,

welche Erkenntniß uns nur zu häufig überrascht. So, meine ich, ist es auch mit der Prinzessin.«

»Wenn ich Ihnen auch Recht geben muß, so bin ich dadurch doch in meinen Entschlüssen um keinen Schritt weiter gekommen. Was helfen alle Betrachtungen, da die Situation ein bestimmtes Handeln fordert,« fiel der Fürst ein. »Sie wissen, daß des Prinzen Tochter nach den Staatsgesetzen zur Thronfolge nicht berechtigt ist; bei der gegenseitigen Abneigung ist an keinen Thronerben zu denken; eine Versöhnung des Paars ist eben so wenig zu erwarten, als eine Trennung der Ehe zulässig: was läßt sich da thun?« —

Der Chevalier blickte den Fürsten mit einem Ausdruck in seinen Zügen an, der unschwer den Zweifel an der Rathlosigkeit seines Gebieters erkennen ließ; alsdann bemerkte er in vertraulichem Ton:

»Corriger la nature!« —

Der Fürst schaute nachdenkend vor sich hin und bemerkte nach kurzer Pause:

»Das ginge; doch ich zweifle, daß sich die Prinzessin dazu verstehen dürfte. Ich glaube, sie besitzt nicht den Muth dazu und hegt zu viele Gewissensscrupel.«

»Der Muth wird sich finden, sobald sie weiß, daß der fürstliche Oheim ihre Neigung nicht nur billigt, sondern dieselbe sogar als ein nothwendiges Mittel zu Staatszwecken betrachtet.«

»Sie können Recht haben.« —

»Die Legitimität mancher Fürsten ist angezweifelt worden. — Mein Fürst kennt die Geschichte Ludwig des Vierzehnten.«

Der Fürst neigte beistimmend das Haupt, indem er lachend bemerkte:

»Lassen wir das! Wollten wir uns um die Erforschungen der Legitimität der Menschen bemühen, wir würden da überraschende Dinge erfahren. Also bleiben wir dabei: Corriger la nature!«

»Es wäre daher nur noch ein Bedenken zu beseitigen,« bemerkte der Chevalier.

»Welches?« —

»Hinsichts des Prinzen. Man weiß, daß manche Väter durch den Segen des Himmels oft sehr unangenehm überrascht werden.« —

»Ah, pah! Der Prinz ist über dergleichen fort! Es wird meine Sache sein, seine Zustimmung zu unserm Plan zu erhalten; denn ich bin überzeugt, er wird sehr zufrieden sein, sich in solcher Weise mit der Ehe abfinden zu können.«

»Fast möchte ich es glauben; denn man spricht bereits von einer neuen Liaison des Prinzen,« bemerkte der Chevalier.

»Wirklich? Nun um so besser! Wer ist die Dame?«

»Man kennt sie nicht; sie soll nicht in der Stadt wohnen, und der Prinz beobachtet große Vorsicht, sie nicht zu verrathen. Man sagt, es sei eine Fremde, aber jung und schön, und der Prinz sei bis über die Ohren in das Mädchen verliebt.«

»O, nun erkläre ich mir sein Hiersein und eingezogenes Leben. Wie konnte ich auch an eine wirkliche Besserung glauben. Der Prinz ist unverbesserlich und ändert nur seine Neigungen. Aber ich wäre zufrieden, würde er dadurch von dem wilden Treiben in der Residenz abgehalten. Forschen Sie weiter, lieber Chevalier; ich möchte diese Angelegenheit genau kennen, um ein richtiges Urtheil darüber zu gewinnen. Ihre Nachricht kommt mir sehr gelegen; denn nun darf ich nach Wunsch handeln. Es fragt sich nur, ob die Prinzessin mit angenehmen Männern umgeht. Wie ich vernommen, empfängt sie meist nur ältere Männer der Wissenschaft und Künste; von solchen, die unserm Plan entsprechen dürften, weiß ich nichts.«

»Doch, mein Fürst, doch!« fiel Boisière ein und fügte mit einem vertraulichen Lächeln hinzu: »Da ist der Baron Mühlfels, des Prinzen Adjutant, bei den Frauen sehr beliebt und durch seine persönlichen Vorzüge zu der ihm bestimmten Rolle sehr geeignet.«

»Sie haben Recht, Chevalier. Der Baron ist ein hübscher und gewandter Mann, wir können das Beste von ihm erwarten,« bemerkte der Fürst.

»Der überdies bereits Ihren Wünschen entgegen kommt, mein Fürst.« —

»Wie das?«

»Seitdem der Prinz nicht mehr so viel in der Residenz lebt, hat man ihn häufig bei der Prinzessin gesehen, ja man will bemerkt haben, daß er sich um deren Gunst bewirbt und ihm Durchlaucht mit nicht gewöhnlichem Wohlwollen entgegenkommt.«

»Das ist ja herrlich!« rief der Fürst erfreut. »So würde denn ohne unser Zuthun vielleicht unser Wunsch erfüllt werden.«

»Das wäre allerdings noch eine Frage, wenn ich Sie recht verstehe, mein Fürst —«

»Ah so!« fiel dieser ein. »Sie haben Recht. Nun, Sie könnten den Baron mit meinen Wünschen bekannt machen und ihm dann wol alles Uebrige überlassen.«

»Wenn Sie es befehlen, mein Fürst, soll es geschehen, und ich bin gewiß, den Baron dadurch auf das Höchste zu beglücken.«

»Ich denke, der Prinz wird sich um so leichter über etwaige Bedenken fortsetzen, wenn er erfährt, daß sein ihm so ergebener Freund von uns ausersehen ist,« entgegnete der Fürst und fuhr alsdann fort: »Ihre Mittheilungen haben mir in der That eine große Sorge genommen, mein lieber Chevalier, und ich danke Ihnen bestens dafür. So wäre denn diese Angelegenheit in der besten Weise geordnet und ich gestatte Ihnen hinsichts derselben freies Handeln. Auch trifft es sich gut, daß des Barons Mutter die Oberhofmeisterin der Prinzessin ist; diese Dame steht in dem Ruf großer Geschicklichkeit, dergleichen Angelegenheiten zu ordnen, und ihr Einfluß auf die Prinzessin müßte nicht ohne Werth sein, falls wir desselben bedürfen sollten und sich die Sache nicht auch ohne diesen nach Wunsch gestaltet.«

»Es dürfte nicht schaden, der Baronin einige passende Andeutungen zu machen, um sie zu einem entsprechenden Handeln zu veranlassen.« —

»Das könnte geschehen, und Ihre Klugheit wird das Richtige zu wählen wissen. Beobachten Sie den Fortgang dieser Angelegenheit recht sorgsam, Chevalier, und bringen Sie mir, sobald irgend etwas von Bedeutung geschehen sollte, sogleich Nachricht. Sie wissen, wie viel mir an der Sache liegt. Mit dem Prinzen gedenke ich erst dann zu sprechen, wenn es die Umstände erfordern.«

Mit diesen Worten entließ der Fürst den Chevalier, der, durch die Unterredung sehr befriedigt, bereits die ihm durch die zarte Angelegenheit in Aussicht gestellten namhaften Vortheile erwog, welche ihm seiner Ueberzeugung nach und bei den von ihm gehegten Ansichten von dem moralischen Gehalt der Menschen nicht entgehen konnten.

Wie er Sidoniens Charakter beurtheilte, haben wir erfahren; seine Klugheit sollte das Uebrige thun, dessen war er gewiß.

Gewöhnt, die Ausführung seiner Absichten nie zu verzögern, begab er sich sogleich zu Mühlfels, den er zu Hause fand und der weit entfernt war, die Veranlassung des Besuchs zu ahnen.

Der Chevalier ließ sich bequem in einen Fauteuil nieder, und nachdem er mit dem Baron allerlei Hofneuigkeiten besprochen, bemerkte er, die Spitzenmanschette fältelnd, wie beiläufig:

»A propos, lieber Baron, man sagt, Sie machten Prinzessin Sidonie den Hof —«

»Entschuldigung, Chevalier, wer sagt dies?« fragte Mühlfels lächelnd.

»Eine sonderbare Frage in der That! Was könnte ich Ihnen nicht Alles darauf antworten! Ich könnte Diesen und Jenen, oder besser ,D i e s e und J e n e nennen; aber um discret zu bleiben, nenne ich Ihnen nur die Luft, die Ihre Leidenschaft verrathen hat,« scherzte Boisière.

»Die Luft, die Luft!« rief Mühlfels lachend. »Sie haben Recht, lieber Chevalier, die Luft hier ist zum Verrath von Geheimnissen hinreichend, und so sehe ich nicht ein, warum ich mit dem Bekenntniß zurückhalten soll, daß mir die Prinzessin gefällt.« —

»Gefällt, und weiter nichts?« fragte der Chevalier mit einem zweifelnden Blick.

»Was soll ich Ihnen noch sagen?« lachte Mühlfels.

»Nun, was Sie mir verschweigen, daß auch Sie der Prinzessin gefallen.«

»Möglich!« warf Mühlfels selbstgefällig hin.

»Man sagt, Sie wären oft bei ihr, sie zeichnete Sie durch Aufträge aus, die sie Ihnen giebt, kurz, man meint, Sie erfreuten sich ihrer Gunst —«

»Halt, halt, mein lieber Chevalier, Sie sprechen da vielerlei Dinge in einem Athem, ohne zu erwägen, daß man dergleichen Subtilitäten ein wenig discreter auffaßt!« rief Mühlfels lachend.

»Daß ich diese nicht anders berühre, muß Ihnen ein Zeichen sein, nicht durch leidige Neugier, sondern durch eine wichtigere Veranlassung dazu bestimmt worden zu sein,« bemerkte der Chevalier mit Nachdruck.

»Wie das?« — fragte Mühlfels aufhorchend.

»Sie fragen und scheinen nicht zu bedenken, daß eine intimere Liaison mit der Prinzessin unter den obwaltenden Umständen eine hohe Bedeutung gewinnen kann. — Ich denke, Sie verstehen mich, Baron.« —

»Bei Gott, Chevalier, Sie belieben sich in sehr ausschweifenden Vermuthungen zu ergehen!« fuhr Mühlfels auf.

»Pah, pah, mein Freund! Eine Liaison mit einer schönen jungen Dame gestattet dergleichen. Doch ich denke, wir kennen uns genügend, um einander Vertrauen zu schenken.« —

»Gewiß, doch vergesse ich die Ehre nicht, in Ihnen den Vertrauten des Fürsten zu sehen!« entgegnete Mühlfels lachend.

»Und ich versichere Sie, daß Sie dies nicht zu beklagen haben. Nehmen Sie an, der Fürst interessirte sich für diese Liaison —«

»Ah!« stieß der Baron voll Ueberraschung hervor und blickte den Chevalier forschend an.

Dieser hatte den Handschuh der rechten Hand abgezogen und seine feinen, weißen und mit Ringen verzierten Finger nestelten wie vorher an der Manschette, ohne daß er den Baron anschaute.

»Das überrascht Sie?« fragte er. »Ich finde es natürlich, da Sie ja kaum ahnen konnten, daß Ihre Bemühungen um die Prinzessin von dem Fürsten bemerkt werden würden.«

»In der That, in der That, so ist es, Chevalier!« fiel Mühlfels erregt ein.

»Regen Sie sich nicht auf, lieber Baron; denn ich wiederhole Ihnen, der Fürst interessirt sich für Sie.«

»Billigt er etwa meine Verehrung der Prinzessin?«

»Bevor ich Ihnen diese Frage beantworte, muß ich erst wissen, wie Sie mit dieser stehen.«

»Viel gefordert, ohne dafür genügend gegeben zu haben,« entgegnete Mühlfels lachend.

»Nun denn, ich gebe Ihnen mein Ehrenwort, daß Ihr Vertrauen in keiner Weise gemißbraucht werden, noch Ihnen zum Schaden gereichen soll,« betheuerte der Chevalier ernst und voll Nachdruck.

»Ah so! die Sache ist ernst. Nun denn, so vernehmen Sie, daß mein Verhältniß kein anderes ist, als Sie es vorher bezeichneten —«

»Sie haben jedoch Hoffnung, Ihre Bewerbungen angenommen zu sehen?« —

»Sie wissen, Chevalier, wenn man liebt, hofft man auch.«

»Sie weichen mir aus. Das paßt in unserm Fall nicht. Sie haben in der Liebe Erfahrungen gesammelt, sind bei den Frauen beliebt, besitzen also in dergleichen Dingen ein Urtheil; also nochmals, was erwarten Sie von der Prinzessin?« —

»Sidonie ist keine gewöhnliche Dame; sie ist tugendhaft und« — bemerkte der Baron mit einem Anstrich von Bedenklichkeit, die

jedoch irgend welchen Eindruck auf den Chevalier nicht hervorzurufen schien, indem dieser ziemlich gleichmüthig einfiel:

»Sie fürchten, nicht ohne besondere Mühe ihre Gunst zu erlangen?«

»Ich muß es vermuthen.« —

»Haben Sie ihr Ihre Zuneigung zu erkennen gegeben?«

»So weit es mir ihre Zurückhaltung gestattete.«

»Jedenfalls ist also die Prinzessin damit bekannt und mißbilligt dieselbe nicht?«

»Ich glaube, dies bejahen zu dürfen —«

»Warum führten Sie bisher nicht eine Entscheidung herbei? Die Gelegenheit dazu, meine ich, hat Ihnen nicht gemangelt.«

»Allerdings, doch hielt mich ein besonderer Umstand davon zurück. Die Prinzessin, scheint es, nimmt trotz des ehelichen Zerwürfnisses noch zu viel Rücksicht auf ihren Gemahl.« —

»So, so« — warf der Chevalier hin und bemerkte alsdann nach kurzer Pause: »Sie glauben das; wie aber wenn Sie sich täuschen und es nur eines geschickten Versuchs von Ihrer Seite bedürfte, um das Gegentheil davon zu erfahren? — Möchten Sie einen solchen wagen, wenn ich Sie versichere, daß dieser so wie alles Weitere von dem Fürsten nicht nur gebilligt, sondern sogar gern gesehen würde?« —

»Sie setzen mich in Erstaunen!« rief Mühlfels und schaute Boisière fragend an.

»Ich glaube es; aber ich glaube dieses Erstaunen noch wesentlich zu steigern, indem ich Ihrer Erwägung anheimgebe, in wie weit Sie diesen Vortheil benutzen wollen, um auch etwaige Bedenken der Prinzessin zu beseitigen.« —

»Sie haben da ein bedeutsames Wort ausgesprochen, Chevalier; das ist mehr, als ich zu hoffen wagte. Dieser Vortheil wiegt schwer, und ich zweifle an seiner guten Wirkung nicht.«

»Das denke ich auch; die Frauen haben es gern, ihren Schwächen ein moralisches Mäntelchen umhängen zu können.«

»Aber der Prinz?!« fragte Mühlfels und schaute den Chevalier bedenklich an.

»Den übernimmt der Fürst; Sie haben nichts von dem zu besorgen« — bemerkte Boisière einfach und ruhig.

»Wie? So wäre diese Angelegenheit also schon in dem Cabinet erwogen?«

Der Chevalier nickte vertraulich, während er den Handschuh anzog und alsdann glättete.

»Impossible!« rief der Baron überrascht und fragte dann: »Wie aber erfuhr der Fürst meine Zuneigung?«

»Durch mich, lieber Baron,« entgegnete der Chevalier vertraulich und unbefangen. »Ich hoffe Ihnen damit einen guten Dienst geleistet zu haben; denn unter so hohem Schutz genießt sich die Liebe einer fürstlichen Dame viel angenehmer,« fügte er mit einem cynischen Lächeln hinzu.

»In der That, lieber Chevalier, ich bin Ihnen von Herzen für Ihre Freundschaft dankbar; denn das Vernommene kommt meinen Wünschen überraschend entgegen.«

»Von Ihnen wird es also abhängen, den Fürsten zufrieden zu stellen. Alle Möglichkeiten sind erwogen, um, wenn es erforderlich wird, der Welt eine passende Comödie vorzuspielen, wozu sich der Prinz leicht verstehen dürfte, da, wie ich vernommen, er den Reizen einer schönen Dame in ungewöhnlicher Weise huldigen soll, über welche er seine alten Freunde und ihr wildes Treiben vergessen hat.« —

Er blickte Mühlfels fragend an; dieser legte jedoch mit einem verneinenden Achselzucken die Hand auf den Mund und Boisière fuhr fort:

»Nun, nun, ich verlange keine Indiscretion! Aus den Wirkungen pflegt man gemeinhin auf die Ursachen zu schließen, und wenn ich diesen Satz auf den Prinzen anwende, so komme ich zu der

Voraussetzung, daß des Prinzen Geliebte ein ganz besonderes Mädchen sein muß, da sie es verstanden hat, den flatterhaften Mann so sehr zu verwandeln. Der Fürst ist damit zufrieden, da diese Liaison so vortheilhaft auf den Prinzen gewirkt hat. Nun, wir werden hoffentlich bald Näheres darüber erfahren, denn unsere Damen hier sind viel zu neidisch auf die der Unbekannten geschenkte Gunst, um sich dabei leidend zu verhalten. Bald, denke ich, werden sie das sonderbare Geheimniß ausgekundschaftet und damit die erwünschte Gelegenheit gefunden haben, ihre scharfe Zunge daran zu letzen: Es ist ein trauriges Schicksal der Fürsten und Großen, keine Geheimnisse haben zu dürfen. Sein Sie bedacht, mein theurer Baron, daß die verehrte Prinzessin diesem Schicksal nicht gleichfalls unterliegt. Doch Sie sind ein kluger und vorsichtiger Mann, und ein solches Geheimniß verbirgt sich leichter im offenen, freien Umgange als in dem Versteck der Einsamkeit und der Nacht.«

Der Chevalier erhob sich, ergriff des Barons Hand und bemerkte in vertraulichem Ton:

»Ich muß noch eine Bitte aussprechen. Sie kennen das Interesse des Fürsten für Ihre Angelegenheit, und es kann Sie daher der Wunsch desselben nicht überraschen, mit dem Fortgang derselben bekannt gemacht zu werden. Wollen Sie mir also zu seiner Zeit Mittheilungen darüber machen?«

»Des Fürsten Wunsch befreit mich von jeder Antwort.«

»Gut, gut, mein lieber Baron. Ich verlasse mich ganz auf Sie. Also viel Glück! O, wer wie Sie noch jung und schön wäre! Aber, tempi passati! O, Sie Beneidenswerther! Sidonie ist mehr interessant als schön; doch das läßt noch keinen Schluß zu, was sie in der Liebe ist. Da erscheinen die Frauen oft mit ganz neuen, nicht geahnten Reizen. O die süßen kleinen Frauen! Au revoir, mon cher ami, au revoir!«

Er umarmte den Baron zärtlich und entfernte sich alsdann, um der Oberhofmeisterin einen Besuch zu machen und bei dieser Gelegenheit die von dem Fürsten gewünschten Notizen über des Prinzen neue Liaison zu sammeln.

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