Introducción La tecnología de transformación de plantas se ha convertido en una plataforma excelente para conseguir la mejora de cultivos así como para llevar a cabo el estudio de la función de los genes en las plantas. Este éxito representa la culminación de muchos años de esfuerzos en mejorar las técnicas de cultivo de tejidos, las técnicas de transformación y la ingeniería genética. Los cultivos modificados genéticamente se han creado con los siguientes fines:
• • • •
Aumentar la productividad de los cultivos mediante resistencia a plagas, enfermedades, herbicidas, sequías, suelos de elevada salinidad, etc. Incrementar la calidad del producto mediante la mejora de su aspecto, de su contenido nutricional o retrasando la maduración de los frutos para conseguir dilatar el tiempo de almacenamiento Regeneración de suelos contaminados por metales pesados con plantas transgénicas tolerantes a concentraciones elevadas de estos elementos. Producción de medicamentos. Se ha investigado la producción de anticuerpos monoclonales, vacunas y otras proteínas terapéuticas en plantas transgénicas de maíz y soja.
La obtención de plantas transgénicas es posible gracias a una característica propia de los vegetales: la totipotencia, según la cual cualquier célula de un vegetal tiene el potencial de regenerar una planta completa. En 1956, se descubrieron las hormonas vegetales, las citoquininas, lo que permitió desarrollar el cultivo de tejidos vegetales in vitro. Las células vegetales se pueden cultivar en un medio artificial y en condiciones estériles (para evitar infecciones de patógenos) que aporte los nutrientes necesarios para las divisiones celulares y la proliferación vegetativa. Existen tres aproximaciones para regenerar plantas completas in vitro:
• • •
El cultivo de embriones: Aislamiento de embriones zigóticos propiciando su crecimiento como planta en un medio artificial La embriogénesis somática o asexual: Generación de embriones a partir de tejidos somáticos, como microesporas o hojas La organogénesis: Generación de órganos como tallos o raices a partir de diversos tejidos
Dado que la manipulación genética requerida para introducir los transgenes actúa a nivel celular, es necesario desarrollar una tecnología de cultivo de tejidos in vitro adecuada para cada especie vegetal. De este modo, las células inicialmente transformadas regenerarán, mediante propagación vegetativa, una planta completa donde todas las células contendrán el transgen. Precisamente este paso es el factor limitante en la obtención de plantas transgénicas de determinadas especies. Sistemas de transformación de plantas Hoy en día existen tres técnicas que permiten obtener plantas transgénicas:
• • •
Transformación de protoplastos Transformación biolística (o bombardeo de microproyectiles) Transformación mediante Agrobacterium
El uso de cada técnica viene condicionado por el tipo de planta, ya que no siempre se han conseguido éxitos con los tres sistemas. Cada técnica se ha desarrollado con sistemas modelo, es decir con especies de plantas en las que las condiciones de manipulación y regeneración están bien establecidas, y para cada nueva especie es necesario establecer empíricamente las condiciones más efectivas y el mejor método de transformación. Transformación de protoplastos Se denominan protoplastos a las células vegetales desprovistas de pared celular. Su obtención se lleva a cabo mediante procesos mecánicos y enzimáticos de eliminación de la pared celular. Por ejemplo, se pueden obtener protoplastos de tabaco o petunia a partir de hojas, mediante la retirada de la epidermis y el tratamiento con celulasas y pectinasas (enzimas que digieren los componentes de la pared celular vegetal) en medio isotónico, para evitar su rotura (al carecer de pared no son capaces de soportar cambios osmóticos). Mediante este proceso se obtiene una suspensión con millones de células individuales susceptibles de ser transformadas. Los protoplastos se mantienen en un medio de cultivo y se adiciona el gen que se ha de transferir. Para conseguir la penetración del transgen es necesaria la permeabilización de la membrana, que se lleva a cabo mediante distintos procesos:
• • •
Electroporación: Consiste en aplicar al protoplasto descargas eléctricas de manera que la membrana se despolariza y se crean diminutos poros por los que puede penetrar el ADN Tratamiento con polietilenglicol para desestabilizar la membrana celular Fusión con la membrana de liposomas que contengan el ADN a transferir
Una vez incorporado el DNA, se requiere cultivar los protoplastos para permitir su división, y en las condiciones que permitan conseguir la regeneración de la planta que ha incorporado el transgen. Transformación biolística Se denomina biolística o biobalística a la introducción de DNA en células mediante la aceleración (disparo) de proyectiles de muy pequeño tamaño (microproyectiles). Generalmente los microproyectiles tienen alredededor de una micra (10 6 m) de diámetro, y son de un material inerte (oro o tungsteno). Los microproyectiles se pueden recubrir de DNA, y se pueden acelerar mediante pólvora, una descarga eléctrica, o utilizando gases a presión (por ejemplo helio comprimido). De esta forma se puede introducir DNA en prácticamente cualquier tejido de cualquier especie vegetal.
No obstante, el proceso tiene una desventaja, la falta de control sobre la integración del gen en el genoma de la planta. Puede suceder que el transgen se rompa durante el proceso y por tanto se integren fragmentos del ADN de partida, o que se integren demasiados transgenes y por tanto la planta reaccione silenciandolo, es decir, impidiendo que el gen se exprese. Transformación con Agrobacterium El cocultivo de células o tejidos con Agrobacterium tumefaciens es el procedimiento más utilizado para transformar plantas dicotiledóneas. Hasta hace muy poco no era posible emplearlo en monocotiledóneas, grupo que abarca a las gramíneas, muy importantes en la nutrición humana, pero ya se ha conseguido con arroz y maíz. Las bacterias del género Agrobacterium son patógenos de plantas capaces de inducir una malformación llamada tumor de agalla. Penetran en los espacios intercelulares a traves de pequeñas heridas presentes en la planta, atraída por sustancias que la planta excreta en sus zonas abiertas. La formación del tumor tiene lugar por la transferencia a los nucleos de las células infectadas de un segmento de ADN presente en un plásmido del Agrobacterium, el TDNA. De esta forma, la bacteria establece con la planta una especie de "colonización genética", obligándola a fabricar una sustancia de la que sólo se puede nutrir el Agrobacterium y que es segregada en el tumor. El estudio del plásmido mencionado, permitió observar la existencia de genes de virulencia y de genes inductores de tumores. Estos últimos están flanqueados por unas secuencias de nucleotidos características en el borde izquierdo y derecho. Mediante manipulación genética se consiguió obtener cepas de Agrobacterium sin genes tumorales pero manteniendo los bordes izquierdo y derecho. De esta forma, cualquier gen integrado dentro de estos bordes será transferido a las células de la planta. Una vez introducido el transgen en el Agrobacterium, es necesario proceder a cocultivar las células de la planta con la bacteria. Para ello se emplean tejidos vegetales que deben ser heridos con el fin de activar los genes de virulencia bacterianos y así inducir la introducción del transgén. Los tejidos vegetales empleados pueden ser de hoja, de cotiledones, fragmentos de tallo o incluso semillas en germinación. Este sistema es más fiable que otros ya que la transformación es más estable y sólo se introduce una copia del transgen Selección de transformantes Todos los sistemas de transformación desarrollados hasta el momento requieren seleccionar aquellas plantas que contengan el transgén introducido, eliminando el resto. El sistema más sencillo es incorporar al transgen otro gen con resistencia a un antibiótico o a un herbicida, de forma que, al realizar el cultivo in vitro en presencia del agente de selección (antibiótico o herbicida), se garantiza que únicamente sobrevivirán aquellas que hayan sido transformadas. Este método de selección ha provocado el rechazo por parte de ciertos sectores de la opinión con el argumento de que su uso haría proliferar la presencia en la Naturaleza de genes de resistencia a antibióticos o herbicidas. Para evitar esta crítica en los últimos años se han desarrollado técnicas de selección que no necesitan del uso de estos genes de resistencia. Por ejemplo se han utilizado genes que confieren a los tejidos transformados la capacidad de utilizar como nutrientes fuentes de carbono diferentes a las habituales. De esta forma, si en el medio de cultivo se incluye únicamente la fuente de carbono selectiva, sólo prosperarán aquellas células que contengan el transgen. Ejemplos de plantas transgénicas Las plantas transgénicas tienen en potencia múltiples aplicaciones y muchas de ellas ya están implantadas en cultivos agrícolas. Por ejemplo, los cultivos de maiz, soja y algodón transgénico resistentes a insectos ocupaban 50 millones de hectáreas en el 2001 (datos de la FAO) Algunos de los ejemplos más importantes son: Resistencia a herbicidas La resistencia a herbicidas se basa en la transferencia de genes de resistencia presentes en bacterias y algunas especies vegetales como la petunia. Así se ha conseguido que plantas como la soja sean resistentes al glifosato, a glufosinato en la colza y bromoxinil en algodón. La resistencia a herbicidas de estos cultivos simplifica el control de las malas hierbas para el agricultor sin perjudicar a las plantas. Resistencia a plagas y enfermedades Hace varios años que se descubrió en la bacteria Bacillus thurigiensis la presencia de una proteina que resultaba tóxica para muchos insectos, pero no para otros organismos. La introducción del gen que codifica esta proteína en algunos cultivos aporta una serie de ventajas muy importantes para el agricultor, consumidores y medio ambiente. Se reduce el consumo de insecticidas para el control de plagas, se disminuye el empleo de envases dificilmente degradables, y se aumentan las poblaciones de insectos beneficiosos. Los casos más avanzados de plantas resistentes a enfermedades son los de resistencias a virus en tabaco, patata, tomate, pimiento, calabacín, soja, papaya, alfalfa y albaricoquero. Existen ensayos avanzados en campo para el control del virus del enrollado de la hoja de la patata, mosaicos de la soja, etc. Mejora de las propiedades nutritivas y organolépticas El conocimiento del metabolismo de las plantas permite mejorar e introducir mejoras en sus características, como por ejemplo en el tomate se ha logrado mejorar la textura y la consistencia impidiendo el proceso de maduración, al incorporar un gen que inhibe la formación de pectinasa, enzima que se activa en el curso del envejecimiento del fruto y que produce una degradación de la pared celular y la pérdida de la consistencia del fruto. También se han desarrollado plantas transgénicas en las que sus propiedades alimenticias están mejoradas, como el arroz dorado de Potrikus, que aumenta la producción de precursores de vitamina A, o las patatas transgénicas creadas por científicos hindúes, con genes que la hacen más rica en aminoácidos esenciales Resistencia a estrés ambiental
La productividad de muchos cultivos se ve comprometida por gran variedad de presiones ambientales, como sequía, heladas, etc. A menudo la resistencia a las condiciones adversa suele venir determinada por varios genes, siendo pues dificil de conseguir, por el momento, mediante la biotecnología. Un ejemplo de mejora de la resistencia de la planta a una condición adversa como son las heladas se ha llevado a cabo mediante las bacterias Pseudomonas syringae y Erwinia herbicola, cuyos hábitat naturales son las plantas. Estas bacterias son en gran parte responsables de los daños de las heladas y el frío en muchos vegetales, al facilitar la producción de cristales de hielo con una proteína que actúa como núcleo de cristalización. La separación del gen implicado permite obtener colonias de estas bacterias que, una vez inoculadas en grandes cantidades en la planta, le confieren una mayor resistencia a las bajas temperaturas. Otras aplicaciones La ingeniería genética también se ha aplicado en horticultura para obtener variedades coloreadas imposibles de obtener mediante cruzamiento o hibridación, como por ejemplo la rosa azul obtenida a partir de la introducción de un gen de petunia responsable de la síntesis de delfinidinas (pigmento responsable del color azul). Otra aplicación es la producción de plásticos biodegradables mediante plantas en las que se les ha introducido genes codificadores del polibhidroxibutirato. Por último, tambien se han desarrollado plantas transgénicas capaces de producir vacunas frente enfermedades como el tétanos, malaria (en plantas de banana, lechuga o mango) etc.
Fuentes: Hansen and Wright (1999) Recent advances in the transformation of plants. Trends in Plant Science, 4 (6), 22630. Aplicaciones de la biotecnología en la agricultura (Apartados del 1. al 3.). Infoagro Una visión general sobre la biotecnología de plantas. Imán El Mansouri y Miguel Angel Quesada Plantas transgénicas. J. F. Carrasco Métodos de la biotecnología vegetal. Enrique Iáñez ¿Cómo se hacen las plantas transgénicas?