Micologia generalidades

MICOLOGIA GENERALIDADES AUTORES DOCENTES MICROBIOLOGIA

CLAUDIA CLAVIJO ROMERO MARCELA GOMEZ GARZON ADRIANA JIMENEZ ROJAS DIANA ORTIZ JIMENEZ

PRACTICA MICOLOGIA # 1 Generalidades de micología

OBJETIVO DE LA PRACTICA Al finalizar la sesión Nº 1, el estudiante estará en capacidad de identificar en forma apropiada las estructuras de los hongos miceliales y levaduriformes Al finalizar la sesión Nº 1, el estudiante estará en capacidad de reconocer correctamente coloraciones especiales para la identificación de los hongos Al finalizar la sesión Nº 1, el estudiante estará en capacidad de reconocer puntualmente las muestras biológicas apropiadas para el diagnostico de laboratorio.

INTRODUCCION Los hongos pertenecen al reino Fungi, son microorganismos eucariotas muy abundantes en la naturaleza. Debido a la diversidad en su morfología micro y macroscópica, su identificación en el laboratorio, requiere de personal altamente especializado.

La clasificación de los hongos ha sufrido múltiples modificaciones en la última década. Actualmente, el reino Fungi está dividido en los subreinos Dikarya y Hongos Basales.

Las células de los hongos están rodeadas de una pared gruesa y rígida que contiene quitina y glucanos, y una membrana citoplasmática rica en ergosterol, sustancias blanco de muchos antifúngicos.

Los hongos se clasifican en dos grupos morfológicos, según su patrón de crecimiento: levaduras y Miceliales (también llamados mohos).

Característica

Levaduras

Miceliales

Número de células

Unicelulares

Multicelulares

Colonias

Cremosas

Algodonosas - arenosas

Tipo de reproducción

Gemación

Asexual y Sexual

Tiempo de crecimiento 24-48h

4-20 días

Temperatura óptima 37ºC de crecimiento

22ºC

Unidad estructural

Hifa

Levadura

Gráfico

En general los hongos mantienen a lo largo de su ciclo biológico su morfología de levaduras o micelios, sin embargo, algunos hongos patógenos para el hombre son dimórficos, es decir, pueden tener una de las dos morfologías dependiendo de la temperatura de crecimiento: levaduras (37ºC) y hongos miceliales (22ºC).

Algunas levaduras de importancia médica como Candida sp. o Malassezia sp. en su estado de mayor virulencia pueden formar simultáneamente micelios cortos.

La unidad estructural de los hongos miceliales es la hifa y su conjunto se denomina micelio. Algunos hongos producen melanina, sustancia que les confiere color oscuro a sus hifas, por lo cual se denominan hongos dematiáceos, los hongos que no la producen se llaman hongos hialinos. El citoplasma de algunas hifas está separado a intervalos regulares por septos, por lo cual se denominan hifas septadas. En otros casos no se presentan septos y se denominan hifas no septadas o cenocíticas.

REPRODUCCION DE HONGOS LEVADURIFORMES Los hongos levaduriformes se reproducen por gemación, se forma una yema en la célula madre, se duplica el material genético, la yema crece hasta separarse y da origen a una nueva levadura.

REPRODUCCION DE HONGOS MICELIALES La reproducción se realiza por medio de esporas o conidias y puede ser sexuada (telemorfa) o asexuada (anamorfa). Los hongos que presentan ambas formas se llaman holomorfos. La reproducción sexuada o perfecta se produce por la unión de dos núcleos, mientras que la asexuada o imperfecta (hongos mitospóricos) se da a partir de un micelio aéreo o reproductor que produce conidias, sin fusión de núcleos.

Las conidias pueden presentar diversas morfologías como artroconidias (por fragmentación de una hifa preexistente), macroconidias (conidias libres grandes), microconidias (conidias libres pequeñas) y esporangiosporas (formadas dentro de un saco cerrado).

El detalle de la diferenciación entre esporas y conidias está reservada para los micólogos.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO El diagnóstico de las infecciones por hongos se realiza mediante la combinación de los datos clínicos y los hallazgos de laboratorio. El éxito en el diagnostico inicia en la correcta recolección de las muestras.

MUESTRA

RECOLECCION ADECUADA

MUESTRA NO ADECUADA

Abscesos

Asépticamente por aspiración en jeringas

Hisopos

Biopsia

Ver tipo de tejido

Cepillado bronquial

Colocar en vial estéril o tubo con agua estéril

Cepillo en medio de transporte con carbón

Cornea

Cornea en 1ml de agua estéril

Muestras desecadas

Cutáneo y subcutáneo

En tubo estéril con 1ml de solución salina estéril

Hisopos

Escamas de piel

Limpiar con alcohol 70%, recolectar escamas con Hisopos bisturí en caja petri estéril

Esputo

1-5ml tomado en ayunas en frasco estéril

Saliva, secreción nasal, hisopados nasales, muestras tomadas hace 25H

Fluido ojos

Papel filtro y recoger con jeringa

Hisopos

Hígado

En tubo estéril con 1ml de solución salina estéril

Hisopos

Lavado bronquial

Tubo estéril

Lavado gástrico o As- Neutralizar igual volumen de carbonato de sodio pirado gástrico LCR

3ml en tubo estéril

Líquido sinovial, pleu- En tubo estéril o jeringa ral, peritoneal

Muestra <0.5ml Hisopos

Materia fecal

No debe procesarse para cultivo de hongos

Medula ósea

0.2-0.3ml en tubo estéril citratado

Muestra coagulada

MUESTRA

RECOLECCION ADECUADA

MUESTRA NO ADECUADA

Nódulo linfático

En tubo estéril con 1ml de solución salina estéril

Hisopos

Oído

Hisopo en tubo estéril

Muestras desecadas

Orina

25-50ml, primara del día en frasco estéril, Volúmenes pequeños y muestras tomadas hace muestra por catéter y suprapúbica son acepta- 25H das

Pelo

Pelo completo y escamas de cuero cabelludo en Pelos recortados caja de petri o envuelto en papel

Pleura

En tubo estéril con 1ml de solución salina estéril

Hisopos

Pulmón

En tubo estéril con 1ml de solución salina estéril

Hisopos

Rinocraneal

En tubo estéril con 1ml de solución salina estéril

Sangre

Sistema cerrado de hemocultivo

Uñas

Limpiar con alcohol 70%, recolectar escamas con Hisopos, pedazos completos de uñas bisturí en caja petri estéril

Vaginal

Hisopo con descarga en tubo con solución salina Hisopos en medios de transporte o desecados estéril

1. Examen Directo: Se procesan muestras de tejido (Biopsia), muestras de secreciones y de faneras (muestras de estrato córneo) en el laboratorio de microbiología. El examen microscópico directo de las muestras clínicas es una de las pruebas más sencillas, rápidas y útiles para el diagnóstico. Las muestras se colocan en un portaobjetos y se tratan con una gota de hidróxido de potasio (KOH), lo que clarifica todo el material y permite la visualización del hongo.

Existen tinciones especiales que se aplican a las muestras de tejido enviadas a patología, que permiten identificar a los hongos en los tejidos e incluso distinguir entre diversos grupos de hongos, como la tinción de metenamina argéntica de Gomori o Grocott, hematoxilina eosina (H&E) y la tinción con acido periódico de Schiff (PAS).

Para identificar la presencia de cápsula en algunas levaduras se trabajan las coloraciones de tinta china y mucicarmina.

2. Cultivo: El diagnóstico definitivo requiere el cultivo de la muestra en medios especiales que estimulen el crecimiento de los hongos. Los hongos miceliales crecen bien en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar Sabouraud y deben tenerse en cuenta las características del crecimiento tanto en la superficie del Agar (envés) como en la de la cara inferior (revés). Se pueden adicionar antibióticos a los medios para evitar la contaminación con bacterias, ya que el crecimiento de los hongos miceliales es lenta (1 a 4 semanas). Si se sospecha de la presencia de un hongo dimórfico, se siembran dos juegos de medios que se incuban a las dos temperaturas 22º y 37ºC. Las levaduras crecen rápidamente (48 horas) en medios de rutina como Agar Sangre, con colonias grandes, húmedas tipo mantequillosas y de diversos colores. Su forma puede ser observada en preparaciones en fresco con solución salina o coloración de Gram. Las estructuras de reproducción producidas por los hongos miceliales durante su cultivo se visualizan haciendo un montaje que se colorea con azul de lactofenol y se observa al microscopia para la identificación del género y la especie.

3. Pruebas de detección de anticuerpos: Las pruebas inmunológicas son útiles en el diagnostico de las enfermedades micóticas invasivas. Se utilizan técnicas de aglutinación de látex para la detección de anticuerpos IgM y técnicas de inmunodifusión doble y fijación del complemento para la detección de IgG. Son pocas las pruebas de inmunoensayo que existen en el comercio para detectar IgG e IgM. Las pruebas de hipersensibilidad cutánea sirven para evaluar la inmunidad del paciente y no son útiles para el diagnóstico.

4. Detección de antígenos fúngicos: Se determina la presencia de diferentes componentes fúngicos (antígenos) como marcadores de invasión, el más utilizado es el galactomanano. Comercialmente se han desarrollado técnicas de ELISA para la detección de este antígeno de Candida y Aspergillus. Determinar el nivel de galactomanano en sangre permite establecer un diagnóstico precoz de infección invasiva en pacientes que presentan riesgo de sufrir estas micosis.

5. Pruebas de sensibilidad antifúngicas: Son pocos los laboratorios que realizan pruebas de sensibilidad antifúngica, debido a problemas en la estandarización de las pruebas principalmente para los hongos miceliales. Se ha determinado resistencia de las levaduras a los azoles y 5-fluorocitosina, por lo cual se está comenzando a implementar una técnica comercial para establecer la concentración inhibitoria mínima de manera similar a como se hace con bacterias. ¿Cuándo se debe solicitar una prueba de sensibilidad para los hongos? Son cuatro los casos: a. En las micosis invasoras, en las que conviene conocer si la cepa es resistente al antifúngico con el que se está tratando el paciente. b. En las micosis orofaríngeas que no responden a tratamiento. c. Cuando se quiere conocer la prevalencia de cepas resistentes en un hospital. d. En las micosis producidas por patógenos emergentes.

GLOSARIO MICOLOGICO (Necesario para comprender los aspectos y reportes de laboratorio, no es un ejercicio de memoria) Anamorfo. Con reproducción asexual, hongo imperfecto.

Asca. Estructura de reproducción sexual característica de los Ascomycetes y que se encuentra sólo en ellos. Es un saco de paredes finas que contiene esporas.

Artroconidia. Conidia de reproducción asexual formada al partirse micelio preexistente.

Basidio. Órgano de reproducción sexual característico de Basiodiomycetes. En el basidio es donde se funden los dos núcleos de «sexo» opuesto, siguiendo a la fusión dos divisiones sucesivas para dar lugar a cuatro esporas.

Blastoconidia. Conidia formada por gemación y permanece unida a la levadura madre. (“La hija de la levadura”).

Clamidospora. Estructura de resistencia que forman los hongos.

Conidióforo. Hifa especializada que lleva conidios, bien en el ápice o, menos frecuentemente, a lo largo de ella. En algunos géneros el conidióforo acaba en una serie de ramificaciones, dispuestas según un patrón más o menos definido, en las que lleva los conidios.

Conidia. El término se aplica a las esporas originadas en la reproducción asexual.

Dematiáceo. Hongos con estructuras cafés o negras, debido a la producción de melanina.

Dicótoma. Hifa que se ramifica formando ángulo de 45º o 90º Dimórfico. Hongo que tiene dos formas de acuerdo a la temperatura. Se comportan como levaduras en los tejidos (37ºC) y como miceliales ambientalmente (22ºC).

Esporangio. Saco cerrado, generalmente redondo o piriforme, en el extremo superior de un tallo (esporangióforo) y que contiene un número indefinido de esporas. Los únicos mohos que producen esporas en esporangios son los Mucorale (ej.: Mucor, Rhizopus) Holomorfo. Hongo completo.

Seudohifa. Cadena de levaduras formadas por gemación que no se separan de la levadura madre y semejan un filamento.

Telemorfo. Estado de reproducción sexuada.

ACTIVIDADES 1) OBSERVE LOS CULTIVOS

HONGO LEVADURIFORME

HONGO MICELIAL

2) OBSERVE AL MICROSCOPIO

A PARTIR DE UN DIRECTO

ESCAMAS FAS CAMAS KOH 10%

FRESCO SOLUCION SALINA

KOH 10% HIESLEVADURAS

GOMORI BIOPSIA: LEVADURAS MULTIGEMANTES

GOMORI BIOPSIA: HIFAS SEPTADAS

PAS BIOPSIA: LEVADURAS, BLASTOCONIDIAS Y PSEUDOHIFAS

H&E BIOPSIA: HIFAS NO SEPTADAS

TINTA CHINA L.C.R: LEVADURA CAPSULADA

MUCICARMINA BIOPSIA : LEVADURA CAPSULADA

GRAM FLUJO VAGINAL: LEVADURAS, BLASTOCONIDIAS Y PSEUDOHIFAS

A PARTIR DE CULTIVOS CON AZUL DE LACTOFENOL

HIFAS SEPTADAS HIALINAS

HIFAS SEPTADAS DEMATIACEAS

HIFAS NO SEPTADAS HIALINAS

MICROCONIDIAS

MACROCONIDIAS



EJERCICIO: Complete la siguiente tabla con el color que toman los hongos en cada coloración:

COLORACION

COLOR DEL HONGO

ACIDO PERIODICO SCHIFF (PAS)

ROJO

AZUL DE LACTOFENOL

AZUL

GRAM

VIOLETA

METENAMINA ARGENTICA DE GOMORI o GROCOTT

NEGRO

MUCICARMINA

ROJO

TINTA CHINA

INCOLORO