Diseño de un protocolo en campo para la determinación de compatibilidad

DISEÑO DE UN PROTOCOLO EN CAMPO PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA EN BOVINOS

CINDY DAJANA NIEVES ZARAZA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

DISEÑO DE UN PROTOCOLO EN CAMPO PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA EN BOVINOS

CINDY DAJANA NIEVES ZARAZA Cód. 1101081040

Trabajo de grado para obtener el título de MÉDICO VETERINARIO

Director MAURICIO BOYACÁ QUINTANA Médico Veterinario y Zootecnista UPTC Esp. Laboratorio clínico Veterinario.

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

NOTA DE ACEPTACIÓN

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_______________________________________

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Director

______________________________________ Dr. Mauricio Boyacá Quintana

Jurado

______________________________________ Dra. Ana Consuelo González Patiño

Jurado

______________________________________ Dra. Claudia Patricia Torres

A Dios, que ha hecho de este logro un gran significado para mi vida, agradezco a mis padres que han hecho de mĂ­ una mejor persona y a todos los docentes y compaĂąeros que han compartido conmigo sus conocimientos y amistad durante este recorrido.

Cindy Nieves.

AGRADECIMIENTOS

A Dios y la virgen por permitirme culminar esta etapa de mi vida de la mejor manera posible, y compartirla con las personas que más quiero.

A mis padres y hermanos, que gracias a ellos pude alcanzar esta meta y siempre me han apoyado incondicionalmente.

Al Dr. Mauricio Boyacá Quintana, Médico Veterinario y Zootecnista y director del laboratorio clínico veterinario Microzoo, por toda su ayuda y colaboración para que el desarrollo de esta investigación fuera satisfactorio.

A los docentes, que me aportaron todos sus conocimientos

y compartieron

conmigo su experiencia.

A mi compañero Andrés Peña, por su ayuda brindada en el desarrollo de este trabajo y por su amistad

TABLA DE CONTENIDO

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RESUMEN ABSTRAC INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………….. 21 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………………….. 24 2. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………….. 26 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA………………………………………………... 28 4. OBJETIVOS………………………………………………………………………….. 29 4.1 OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………….. 29 4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS……………………………………………………… 29 5. MARCO REFERENCIAL……………………………………………………………. 30 5.1 ESTADO DEL ARTE………………………………………………………………. 30 5.2 MARCO TEÓRICO………………………………………………………………… 34 5.2.1 TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA………………………………………………….. 34 5.2.2 Compatibilidad sanguínea……………………………………………………… 34 5.2.3 Elección del donante……………………………………………………………. 36 5.2.4 Toma de muestra………………………………………………………………… 36 5.2.5 Transporte de la muestra……………………………………………………….. 37 5.3 PRUEBAS CRUZADAS…………………………………………………………… 38 5.3.1 Prueba de compatibilidad cruzada (Cross Match)…………………………... 38 5.3.2 Técnica……………………………………………………………………………. 38

5.4 REACCIONES TRANSFUSIONALES ADVERSAS…………………………… 39 5.4.1 Reacciones inmunomediadas…………………………………………………. 39 5.4.2 Reacciones no- inmunomediadas……………………………………………… 40 5.4.3 Hemólisis………………………………………………………………………….. 40 5.4.4 Fiebre y anafilaxia……………………………………………………………….. 41 5.4.5 Consideración de los efectos adversos……………………………………….. 41 6. MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO………………………………………….. 43 7. MARCO LEGAL…………………………………………………………………….. 44 8. METODOLOGÍA…………………………………………………………………….. 46 8.1 TIPO DE ESTUDIO……………………………………………………………….. 46 8.2 POBLACIÓN, MUESTRA Y UNIDADES EXPERIMENTALES………………. 46 8.3 DISEÑO EXPERIMENTAL……………………………………………………….. 47 8.4 MATERIALES Y MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN……………………………. 49 8.4.1 Materiales…………………………………………………………………………. 49 8.4.2 Métodos…………………………………………………………………………… 49 9. RESULTADOS Y ANÁLISIS……………………………………………………….. 51 9.1 Análisis estadístico………………………………………………………………... 58 CONCLUSIONES………………………………………………………………………. 61 IMPACTO………………………………………………………………………………... 63 RECOMENDACIONES………………………………………………………………… 64 BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………………………. 65 ANEXOS………………………………………………………………………………… 71

LISTA DE TABLAS

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Tabla 1…………………………………………………………………………………... 55 Tabla 2………………………………………………………………………………….. 56 Tabla 3…………………………………………………………………………………... 59 Tabla 4…………………………………………………………………………………... 60

LISTA DE GRÁFICAS

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GRAFICA 1…………………………………………………………………………... 58

LISTA DE FIGURAS Pág.

Figura 1…………………………………………………………………………………. 43 Figura 2…………………………………………………………………………………. 48 Figura 3…………………………………………………………………………………. 48 Figura 4…………………………………………………………………………………. 53 Figura 5…………………………………………………………………………………. 54 Figura 6…………………………………………………………………………………. 57

LISTA DE ANEXOS Pág.

Anexo 1…………………………………………………………………………………. 71 Anexo 2…………………………………………………………………………………. 72 Anexo 3…………………………………………………………………………………. 73 Anexo 4…………………………………………………………………………………. 74 Anexo 5…………………………………………………………………………………. 74

GLOSARIO

Aglutinación: Es la formación de grumos o agregados de un antígeno particulado que reacciona con su anticuerpo específico. La aglutinación es la base de múltiples técnicas serológicas como la determinación de los grupos sanguíneos o el diagnostico de algunas enfermedades infecciosas.

Aloanticuerpo: Anticuerpo sérico que reacciona de forma específica con un antígeno procedente de un individuo de la misma especie (isoantígeno).

Anafilaxia: Es un síndrome clínico de riesgo vital, caracterizado por su rápida instauración y sus manifestaciones multisistémicas. Estado de hipersensibilidad tipo I del organismo, a una sustancia que previamente ha sido administrada y que desencadena una respuesta hiperérgica violenta. Este cuadro clínico se produce como resultado de la acción de los mediadores químicos liberados de forma súbita por mastocitos o basófilos.

Anemia: Anemia se define como una concentración baja de hemoglobina en la sangre. Se detecta mediante un análisis de laboratorio en el que se descubre un nivel de hemoglobina en sangre menor de lo normal.

Anticoagulante: Un anticoagulante es una sustancia endógena o exógena que interfiere o inhibe la coagulación de la sangre, creando un estado antitrombótico.

Anticuerpo: Es una inmunoglobulina que pueden encontrarse de forma soluble en la sangre u otros fluidos corporales de los vertebrados, producida por un clon de linfocitos B en respuesta a su estimulación por un antígeno específico.

Antígeno: Es una sustancia que desencadena la formación de un anticuerpo y puede causar una respuesta inmunitaria.

Centrífuga: Es una máquina que pone en rotación una muestra para acelerar por fuerza centrífuga la decantación o sedimentación de sus componentes o fases (generalmente una sólida y una líquida), en función de su densidad.

Coagulación: Proceso por el cual la sangre pierde su liquidez, tornándose similar a un gel en primera instancia y luego sólida, sin experimentar un verdadero cambio de estado.

Compatibilidad sanguínea: Determina si el tipo de sangre del individuo (donante) es compatible con el individuo (receptor). Es la tolerancia del sistema defensivo del organismo a la presencia de una materia extraña o células cancerígenas.

Eritrocito: También llamados glóbulos rojos, son células sanguíneas que contienen en su interior la hemoglobina. Los glóbulos rojos son los principales portadores de oxígeno a las células y tejidos del cuerpo.

Grupo sanguíneo: Un grupo sanguíneo es una forma de agrupar ciertas características de la sangre en base a la presencia o ausencia de determinadas moléculas, llamadas antígenos, en la superficie de los glóbulos rojos.

Hematíes: También llamados eritrocitos, son los elementos cuantitativamente más numerosos de la sangre.

Hematocrito: Es el porcentaje del volumen total de la sangre compuesta por glóbulos rojos. Es una parte integral del hemograma, junto con la medición de la hemoglobina, y el conteo de leucocitos y plaquetas.

Hemoderivados: Sustancia derivada de la sangre o plasma.

Hemoglobina: Proteína presente en los glóbulos rojos, cuya misión fundamental es el transporte de oxígeno a través de la sangre.

Hemolisis: Es el fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o hematíes).

Hemoterapia: Parte de la hematología que se ocupa de la obtención de la sangre y sus componentes, así como de su administración. Básicamente consiste en hacer una transfusión total de sangre o de alguno de sus componentes (plasma, plasma fresco congelado, etc.) a un paciente enfermo.

Hipovolemia: Es una disminución del volumen circulante de sangre o cualquier otro

líquido

corporal

debido

a

múltiples

factores

como

hemorragias,

deshidratación, quemaduras, entre otros.

Ictericia: Es la coloración amarillenta de la piel y mucosas debida a un aumento de la bilirrubina que se acumula en los tejidos.

Incompatibilidad: falta de compatibilidad entre dos grupos sanguíneos, que son antigénicamente distintos.

Inmunoglobulinas: Las inmunoglobulinas son glicoproteínas que actúan como anticuerpos. Pueden encontrarse circulando en sangre, en las secreciones o unidas a la superficie de las membranas de los linfocitos B. In vitro: Se refiere a una técnica para realizar un determinado experimento en un tubo de ensayo, o generalmente en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo.

Isoantígeno: Antígeno capaz de provocar la formación de anticuerpos (isoanticuerpos) en un individuo de la misma especie.

Plasma: Es la fracción líquida y acelular de la sangre, es decir, se obtiene al dejar a la sangre desprovista de células como los glóbulos rojos y los glóbulos blancos.

Del volumen sanguíneo total, el 55% esta compuesto por plasma. Es un líquido

amarillento, no contiene células y está constituido por agua, electrolitos, proteínas, sales inorgánicas, nutrientes, hormonas, enzimas, gases y materiales de desecho de las células.

Protocolo:

Conjunto

de

procedimientos

destinados

a

estandarizar

un

comportamiento humano o sistémico artificial frente a una situación específica.

Reacción: Las reacciones adversas son de etiología diversa y pueden suceder durante el acto transfusional, inmediatamente después, o posteriormente. Por ello, independientemente de su etiología, se clasifican en inmediatas y retardadas.

Reactivo: Sustancia que interactúa con otra en una reacción química que da lugar a otras sustancias de propiedades, características y conformación distinta, denominadas productos de reacción o simplemente productos.

Sangre: Es un líquido viscoso que circula por todo el cuerpo a través de vasos cerrados y contiene como pigmento respiratorio la hemoglobina.

Sedimentación: Es el proceso por el cual la materia en movimiento se deposita.

Serotipificación: Es una prueba de aglutinación para identificar la compatibilidad de los grupos sanguíneos.

Sistema inmunitario: Es aquel conjunto de estructuras y procesos biológicos en el interior de un organismo que le protege contra enfermedades identificando y matando células patógenas y cancerosas. Detecta una amplia variedad de agentes, desde virus hasta parásitos intestinales, y necesita distinguirlos de las propias células y tejidos sanos del organismo para funcionar correctamente.

Suero: Líquido que queda después de eliminar los elementos sólidos de la sangre.

Terapia: Tratamiento que se pone en práctica para curar una enfermedad.

Tipificación: Determinación del grupo al que pertenece la sangre de un individuo.

Es un requisito indispensable antes de proceder a una transfusión de sangre.

Transfusión sanguínea: Es la transferencia de sangre o de un componente sanguíneo de un individuo a otro.

Urgencia: urgencia médica es toda situación que requiera una acción médica inmediata.

Volemia: Puede definirse como el volumen total de sangre circulante de un individuo.

RESUMEN

Actualmente la transfusión de sangre ha logrado un proceso con gran potencial de uso en la medicina de urgencias; sin embargo, una práctica transfusional adecuada requiere de una constante y crítica valoración clínica, si se tiene en cuenta que la transfusión sanguínea continúa siendo una riesgosa, el desarrollo, implica que su uso debe estar basado en estudios y conocimientos actualizados, con el fin de brindar los mejores beneficios a los pacientes que requieren de esta práctica de urgencia. Para ello es necesario utilizar un método de fácil manejo y de bajo costo, que evite el envió de muestras al laboratorio y que permita identificar compatibilidad sanguínea, sin tener riesgo de provocar una reacción adversa.

Por este motivo se desarrolló un protocolo de rápida aplicabilidad clínica, que permite identificar si son o no compatibles los grupos sanguíneos del donante y del receptor al momento de realizar una transfusión sanguínea en campo; ya que en este medio es muy complicado tener los materiales necesarios a la mano para el desarrollo de esta técnica; Se tomó como muestra, sangre entera de 30 bovinos sanos entre hembras y machos, los machos como donantes y las hembras como receptoras; El estudio se realizó en la ciudad de Tunja (Boyacá); y las muestras fueron analizadas en el laboratorio clínico Veterinario Microzoo, ubicado en la ciudad de Tunja (Boyacá). Se tomaron muestras de sangre diferentes; del donante y del receptor, almacenadas en tubos vacutainer tapa lila con anticoagulante EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacetico ) y tubos vacutainer tapa roja sin anticoagulante para obtención del suero ,posteriormente se realizó la prueba Cross Match mayor para determinar compatibilidad sanguínea en el laboratorio, con el fin de seleccionar 2 muestras compatibles y 2 incompatibles, las cuales fueron el motivo del estudio; después de obtener resultados, se empezó a trabajar con los reactivos: 1. Solución de lavado (SL-L) y 2. Solución de suspensión (SLSUS); tratando de adaptar los volúmenes para acoplarlos a medidas realizables en campo; luego de esto se desarrolló el procedimiento del protocolo, donde se

evaluó cada una de las muestras seleccionadas20 veces sucesivas para obtener mayor grado de estandarización y precisión.

Se demostró que los resultados obtenidos con el protocolo en campo son iguales a los resultados obtenidos en el análisis de laboratorio, indicando 1grado de libertad y un nivel de confianza del 95% , dado que la prueba x2 es mayor que el valor obtenido en la tabla de distribución de valores chi- cuadrado empleada para el estudio, por lo tanto, se rechaza la hipótesis nula H0 de independencia entre los resultados obtenidos en el laboratorio, con respecto a los del protocolo en campo, aceptando por tanto la hipótesis alternativa H1 la cual demuestra que los resultados obtenidos por ambos métodos son equivalentes; de tal forma se identifica que el protocolo en campo planteado para la determinación de compatibilidad sanguínea en bovinos es confiable y efectivo.

PALABRAS CLAVE: Transfusión sanguínea, compatibilidad, reacción, hemolisis, donador, receptor.

ABSTRACT

Nowadays, blood transfusion has had a great impact in emergency medicine; nevertheless, this procedure requires a constant and critical clinical supervision, because blood transfusion still continues to be very risky. This practice must be carried on based on studies and up to date knowledge in this field, in order to provide the best benefits to patients who needs this emergency technical. To do this is compulsory to use an easy use, low cost method which avoid the samples to be sent to the laboratory and can be identified the blood compatibility, without having the risk of causing an adverse reaction.

For these reasons it is necessary to use a clinical and rapid protocol with the intention of identifying whether or not the blood group is compatible between the donor and the receiver at the time of doing the blood transfusion. Given the fact that in this way is complicated to have the necessary materials for the development of this clinical practice. In this procedure was taken as sample, blood from both thirty healthy male and female bovines, the male bovines were the donors and the female bovines were the receiver; this study was carried on Tunja (Boyacรก); and all samples were analysed in the clinical laboratory Microzoo, located in the city of Tunja (Boyacรก). Different blood types were taken from the donor and the receiver and were stored in Vacutainer tubes (lavender top) with anticoagulant EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) and Vacutainer tubes (red top) without anticoagulant to obtain serum; afterwards, the Cross Match higher Test is applied in the laboratory in order to determine the blood compatibility, with the intention of selecting two compatible samples and 2 incompatible samples, which were the subject of study; after obtaining the results, it is important to start working with the reagents: 1. lavage solution (SL-L) and 2. Suspension solution (SL-SUS), trying to adapt the measures to test made in the field, afterwards, a protocol procedure was made to evaluate each one of tests selected twenties times in order to be more accurate and standardized.

It was shown that the protocol results are equal to the results obtained in laboratory tests, this indicates a degree of freedom and a confidence level of 95 percent, given that x2 test is higher than the value obtained in the distribution table chisquaredvalues used in this study. Therefore, it is rejecting the null H0hypothesis of independence between the results obtained on the lab, in relation to those obtained in the protocol field, and accepting the H 1 alternative hypothesis which demonstrates that the obtained results by both methods are equivalents.

The

evidence shows that the use of the protocol mentioned above is reliable and effective.

Keywords: Blood transfusion, Compatibility, Reaction, Hemolysis, Donor, Receiver.

INTRODUCCIÓN

La primera trasfusión sanguínea terapéutica se intento alrededor del año 1665 la cual fue heteróloga, se experimentó con sangre de ovejas o terneras para pacientes mentales con el fin de tratar algunos trastornos del comportamiento (Diamond, 1980; Hosgood, 1990). En éste mismo año, el anatomista inglés Richard Lower(1665),logró realizar la primera transfusión sanguínea entre animales de la misma especie (caninos), extrayendo sangre de la arteria carótida de uno de ellos e introduciéndola al otro a través de la vena yugular; muchos de estos experimentos fueron realizados con animales de la misma especie como también de diferente especie La limitación más importante que se presenta a la hora de realizar una transfusión sanguínea es la existencia de distintos grupos sanguíneos entre los individuos lo cual identifica la compatibilidad entre ellos. El desarrollo de la transfusión sanguínea marcó el proceso progresivo de la técnica médica. La transfusión de sangre entera o de componentes sanguíneos (hemoderivados) está indicada en una gran variedad de situaciones clínicas, especialmente en medicina intensiva. El principal objetivo terapéutico de esta es mantener el transporte de oxígeno ante cualquier descenso del volumen sanguíneo que pueda provocar choque o muerte al animal (Álvarez et al., 2003).

Para verificar la compatibilidad sanguínea de donantes y receptores para

las

transfusiones a realizar, es necesario determinar los grupos sanguíneos tanto del donante como del receptor y realizar este procedimiento con los implementos necesarios para una mayor efectividad. En estas pruebas se busca una coexistencia armónica entre el producto sanguíneo transfundido y su receptor (Edwards, 2011). La Serotipificación es esencial para realizar la transfusión, dado que los eritrocitos expresan sustancias potencialmente antigénicas en su superficie. Dichos antígenos de superficies son lo que llamamos grupos

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sanguíneos. El conocimiento científico de los grupos sanguíneos constituyó un gran avance hacia la aclaración del mecanismo de algunas enfermedades hereditarias, pero por sobre todas las cosas fue una conquista terapéutica que posibilitó la transfusión de sangre entera sin riesgos. (Baezet al., 2002).

En medio de varios ensayos se ha comprobado que cada grupo sanguíneo viene determinado por un antígeno específico el cual se encuentra en la membrana de los eritrocitos; Cada individuo logra desarrollar inmunoglobulinas contra los antígenos eritrocitarios de otro de su misma especie, los cuales son denominados aloanticuerpos que pueden aparecer de forma natural en el animal independientemente de que haya habido una sensibilización previa. Por este mecanismo se explican muchas de las reacciones inmunológicas provocadas por la incompatibilidad de sangre implicada en una transfusión (López, 2005).

En medicina veterinaria son muchas las ocasiones en las que resulta necesario realizar una transfusión de sangre. Sus importantes beneficios terapéuticos han generado un considerable incremento en la demanda de transfusiones de sangre y sus derivados, pero hay que saber administrarlas correctamente ya que no están exentas de riesgos, todo esto con el fin de brindar mayor garantía en cuanto al manejo de los pacientes y la solución de muchos de sus problemas clínicos (García, 2009).

El uso de sangre como terapia no está lo suficientemente difundido en el medio, porque se le considera complejo y riesgoso. Sin embargo, luego de adquirir práctica en las maniobras necesarias y de contar con el material apropiado para la transfusión adecuada, lo cual no es costoso, el clínico podrá contar con un recurso de uso más frecuente en la clínica cotidiana (Sappía, 2006).

Teniendo en cuenta el riesgo que conlleva realizar una transfusión sanguínea en un individuo, las grandes distancias entre la finca y el laboratorio, y la urgencia de la necesidad de los resultados, se realizó mediante esta investigación una serie de

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experimentos para identificar la compatibilidad sanguínea entre donantes y receptores, se tomaron muestras de sangre entera de bovinos para la evaluación en el laboratorio y se realizó un protocolo para campo que disminuye el tiempo de evaluación de la muestra y ayuda al médico veterinario a tomar una decisión de urgencia para el tratamiento de un paciente que lo requiera.

En medicina veterinaria son pocos los estudios realizados sobre compatibilidad sanguínea y prácticas transfusionales en grandes animales (Bovinos, Equinos, ovinos y caprinos); por este motivo se realizó el diseño de un protocolo para identificar compatibilidad sanguínea en campo. El desarrollo de este protocolo, permite identificar la compatibilidad sanguínea entre bovinos en campo y dará a conocer el fácil manejo de un procedimiento que disminuirá los riesgos transfusionales y los accidentes post transfusionales ocasionados en el animal.

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Hay casos donde el clínico que desempeña su trabajo en campo, no cuenta con el tiempo suficiente para tomar y enviar pruebas de laboratorio, ni con los implementos necesarios para realizar una prueba de compatibilidad sanguínea; por tal razón requiere de una decisión inmediata, pero muchas veces se enfrenta a realizar una transfusión directa, llegando a alterar el funcionamiento normal del paciente, creando reacciones adversas ocasionadas por el mal manejo de las practicas transfusionales y la no identificación de compatibilidad sanguínea del donante con el receptor ( Sappía, 2006).

En la actualidad la terapia transfusional sigue en constante evolución, las ventajas de la transfusión de componentes individuales han limitado el empleo de sangre total y ha sugerido la utilización simplemente de sus componentes. Los beneficios de las terapias transfusionales son reales, sin embargo, pueden presentarse efectos adversos importantes por la presencia de incompatibilidad en el momento de realizar esta práctica, por eso se requiere una valoración profunda que garantizará un mejor aprovechamiento y éxito de la hemoterapia. (Roux, 2000).

La transfusión es un proceso normalmente realizado en una urgencia clínica, que ayuda a la recuperación del paciente. Los bovinos tienen al menos 13 grupos sanguíneos diferentes, ésta es la principal limitación a la hora de transfundir. Una de las principales características en la sangre de los bovinos es que los eritrocitos no aglutinan fácilmente; Por lo tanto, la primera transfusión al animal se puede realizar con pocos riesgos; pero se ha evidenciado que en cada transfusión existen reacciones adversas que se desencadenan en el momento de combinar grupos sanguíneos incompatibles del donador o del receptor, llegando a ocasionar cuadros clínicos severos (Gareth, 2006).

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Una de las prioridades del médico veterinario es realizar un procedimiento rápido para estabilizar al paciente cuando se encuentra en estado crítico; una de las principales maneras de actuar dependiendo a la gravedad de la enfermedad del paciente es realizando la técnica de compatibilidad sanguínea elaborada en laboratorios, con el fin de determinar la incompatibilidad entre el donante y el receptor y así poder desarrollar una práctica segura (Sappía, 2006).

Por consiguiente, el clínico no tiene a la mano, una herramienta de fácil y rápido manejo para determinar la compatibilidad o incompatibilidad del donante con el receptor en el momento de una urgencia en el trabajo de campo; por lo cual es necesario el diseño de un protocolo que ofrezca la solución decisiva para estos casos. Tal protocolo incluirá las cantidades de reactivos necesarios, las cantidades de sangre del donante y del receptor requeridas y los instrumentos precisos para la realización del protocolo en campo, además de otras observaciones relacionadas con el manejo del procedimiento en el área rural.

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2. JUSTIFICACIÓN

En medicina veterinaria, uno de los grandes inconvenientes ha sido la identificación de compatibilidad sanguínea en animales que se encuentran en campo, ya que no se tiene a la mano los materiales e instrumentos necesarios para determinar la compatibilidad de los grupos sanguíneos de pacientes que requieren de una transfusión de forma rápida y confiable.

Las ventajas que se obtienen al realizar un protocolo para su desarrollo en campo, permite hacer un procedimiento más efectivo y rápido para solucionar problemas en los pacientes enfermos. En casos como estos, el clínico no cuenta con el tiempo suficiente para tomar pruebas y enviarlas al laboratorio, por tal razón el médico veterinario debe adoptar las mejores soluciones para controlar las enfermedades encontradas en el paciente (Sappía. 2006).

En la actualidad, no es posible determinar en cualquier laboratorio la identidad antigénica eritrocitaria del animal donante y del receptor. Mediante la Prueba de compatibilidad sanguínea, se puede determinar si ambos individuos son compatibles para una transfusión, independientemente que ignoremos sus respectivos grupos sanguíneos (Sappía, 2006).

Uno de los mecanismos más importantes para poder manejar algunos problemas encontrados en campo, ha sido utilizar protocolos de manejo en las transfusiones sanguíneas que identifiquen la compatibilidad de los grupos sanguíneos de los animales a tratar, los cuales puedan adaptarse al medio de trabajo y que sean de bajo costo con el fin de favorecer al médico veterinario como al propietario, ya que la utilización del laboratorio para el manejo de muestras sería una posibilidad que no ayudaría a reducir el tiempo y la gravedad en la que se presenta la urgencia.

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La prioridad de este trabajo será la identificación fácil y rápida de compatibilidad sanguínea en campo para bovinos, que al hacer una comparación con la técnica de laboratorio se pueda confirmar que este nuevo protocolo es eficaz y viable para ser desarrollado e implementado en el medio.

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3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Se podría desarrollar un protocolo que determine compatibilidad sanguínea de los bovinos en campo?

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la identificación de

4. OBJETIVOS

4.1 GENERAL

Diseñar un protocolo en campo para la determinación de compatibilidad sanguínea en bovinos.

4.2 ESPECÍFICOS



Comparar la efectividad de la prueba diseñada para campo, con la prueba estándar de laboratorio Cross Match mayor.



Identificar los materiales requeridos para el desarrollo del protocolo en campo y la implementación del mismo.



Establecer las proporciones de la solución de lavado (SL-L) y la solución de suspensión (SL-SUS), necesarias para el desarrollo del procedimiento planteado.



Plasmar la propuesta escrita de los pasos del procedimiento operativo para la realización de la prueba de compatibilidad en campo.

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5. MARCO REFERENCIAL

5.1 ESTADO DEL ARTE

Rosales et al. (2000), en su artículo habla sobre los componentes de la sangre; los cuales son definidos como una mezcla de diversas poblaciones celulares y proteínas plasmáticas en un medio acuoso. Cada uno de estos elementos tiene una función bien definida. El objetivo de la transfusión es remplazar el producto sanguíneo deficitario en el paciente desde el punto de vista cuantitativo o cualitativo. El empleo de sangre fresca de menos de 24 horas es una práctica transfusional del pasado. Una unidad de sangre total contiene hematíes, leucocitos, plaquetas, proteínas plasmáticas, globulinas, anticuerpos, factores estables de la coagulación, etc., y 63 ml de anticoagulantes.

Rosales (2008), publicó en el Weblog “divulgación científica de la química clínica”, un artículo llamado “grupos sanguíneos en animales”, en el cual habla acerca de la existencia de marcadores de superficie eritrocitaria parcialmente solubles, mejor conocidos como grupos sanguíneos, los cuales expresan mecanismos de antigenicidad y receptores específicos determinados por un sistema de histocompatibilidad mayor y menor, semejante al antígeno leucocitario humano.

Bujacich (2002), reporta que la hemoterapia es un recurso terapéutico de suma utilidad y por el momento irremplazable en animales enfermos, sobre todo si deben ser sometidos a una cirugía; en este artículo reporta que hay 15 antígenos eritrocitarios diferentes y que solo han sido tipificados 8. Es ventajoso elegir como donantes animales sanos de buena condición corporal para mejores resultados en el procedimiento, el VCA (hematocrito), tiende a ser más elevado y se puede extraer mayor volumen de sangre del donante.

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García (2004), demostró en la publicación de su artículo que las reacciones de aglutinación y de precipitación son la base de la mayor parte de las técnicas inmunológicas. Su principio se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, aquí plantea la idea que sugiere Coombs donde explica que existen 3 requerimientos principales en las pruebas de aglutinación: 1. Disponibilidad de una suspensión estable de células o de partículas, 2. Presencia de uno o más antígenos cercanos a la superficie, 3. Conocimiento de que los anticuerpos "incompletos" o no aglutinables no son localizables sin modificación (reacciones antiglobulina).

García (2004), da como definición que la compatibilidad proviene del latín compatibilis, que significa compadecerse. Definición acorde con la finalidad de las pruebas de compatibilidad sanguínea en donde buscan una coexistencia armónica entre el producto sanguíneo transfundido y su receptor. En este artículo se explica el desarrollo de la prueba cruzada, la cual se divide en 2: la prueba mayor que hace referencia a 2 volúmenes del suero del paciente frente a 1 volumen de eritrocitos lavados del donador y la prueba menor que identifica 2 volúmenes de plasma del donante frente a 1 volumen de eritrocitos lavados del receptor. Auto testigo: Eritrocitos más suero del paciente.

Dumfries et al. (2012), en su estudio realizado demostró que las decisiones son claves para encontrar la causa de la pérdida de sangre en un bovino. Sin embargo, con una cuidadosa selección de los pacientes éstos serán capaces de subir y volver a buenas producciones de leche muy rápidamente después de la transfusión. Una vaca donante es seleccionada idealmente para ser capaz de donar de 2 a 4L de sangre dependiendo de su peso corporal. El tipo de sangre no se requiere en las vacas. En los bovinos el volumen total de la sangre es más o menos el 8% de su peso corporal, por lo que alrededor de 60L en una vaca de 700kg con seguridad podemos tomar hasta 8 litros necesarios pero por lo general

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4L o 5L es suficiente para mejorar significativamente el volumen de sangre funcional del receptor.

Tarragó (2004), dice que la transfusión de sangre, tiene como objeto reponer el volumen sanguíneo (volemia) y la desintoxicación en procesos infecciosos que cursan con pérdida de sangre. El volumen sanguíneo depende del peso corporal.

Su importancia de la dinámica circulatoria es tal, que se mantiene a pesar de: Ingestión periódica de agua, producción metabólica de agua y pérdida de agua; Incluso en grandes pérdidas de sangre por hemorragia el restablecimiento del volumen normal es muy rápido gracias al paso del líquido intersticial al sistema vascular. El volumen eritrocítico es más lento ya que el aporte de glóbulos rojos a la sangre no se realiza hasta 72 horas después de la pérdida de los mismos. Los primeros procedimientos para averiguar el volumen sanguíneo consistía en sangrar al animal hasta su muerte seguido de un lavado de la sangre que sobra, que se unirá a la recogida anteriormente.

Betancourt (2007), demuestra que la realización de una trasfusión de sangre autóloga evita los riesgos inmunológicos e infecciosos de las transfusiones. La autotransfusión se puede realizar en circunstancia pre- operatorias, recogiendo la sangre presente en las grandes cavidades, pleural y peritoneal, y reinfundiéndola, obviamente a través de un filtro. Esta técnica sólo se debe realizar cuando el estado clínico del paciente sugiera que la transfusión es imprescindible. Más práctica es la autotransfusión preoperatoria, pudiendo recoger del paciente hasta 20 ml/kg PV semanalmente, durante 2-3 semanas, refrigerándola a 4°C hasta el momento de la operación quirúrgica. A estos individuos es recomendable suplementarles con hierro vía oral, durante este tiempo.

Sappía (2006), determinó que de acuerdo al tratamiento que se quiera implementar, se puede transfundir sangre entera, glóbulos rojos concentrados

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mediante centrifugación o plasma. La transfusión de sangre entera se la indica en pacientes con anemia arregenerativa, cuando el VCA desciende al 15% en el perro o al 10% en el gato. Se indica en las hemorragias agudas cuando el VCA cae hasta el 20%. Sin embargo, en las hemorragias agudas el hematocrito puede mantenerse en valores normales hasta 6 horas post hemorragia. Cuando se repone la volemia por mecanismos fisiológicos o médicos, el VCA desciende y ese valor es más representativo. Los parámetros físicos para estimar la pérdida son: color de las mucosas, tiempo de llenado capilar, frecuencia cardiaca y respiratoria, producción de orina, presión venosa central y presión arterial.

Salinas et al. (2009), da a conocer que las normas oficiales vigentes señalan que el transporte de paquetes globulares debe hacerse en condiciones óptimas de temperatura para preservarlos, pero no es claro cuáles pueden ser los tipos de contenedores que deben utilizarse. Diseñar un contenedor «caja fría» de fácil adquisición y elaboración que cumpla con los requisitos mínimos de calidad y seguridad para el transporte de paquetes globulares. Un sistema conformado por una caja de unicel que usa como sistema refrigerante botellas con agua congelada y pañales desechables fue elegido como modelo de «caja fría».

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5.2 MARCO TEÓRICO

5.2.1 TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA

Las transfusiones sanguíneas son importantes en medicina veterinaria, usándose principalmente en las alteraciones hemodinámicas graves que aparecen tras traumatismos intensos o cirugía, y en las anemias, al objeto de mantener la capacidad de transporte de oxígeno. (López et a., 1997).

Los grupos sanguíneos hacen referencia a antígenos que se expresan sobre la membrana de los eritrocitos. La gran mayoría son glicoproteínas o glucolípidos y son específicos de cada especie. Los anticuerpos dirigidos contra antígenos presentes en otros individuos de la misma especie se denominan aloanticuerpos (Álvarez et al., 2003). Estos grupos se transmiten hereditariamente. Para los diferentes sistemas, que incluyen genes (alelos) dominantes, codominantes y recesivos, se conocen más de 300 antígenos en la superficie del glóbulo rojo. La interacción de un enorme número de locus y alelos implica una alta posibilidad de recombinación y expresión. Los anticuerpos también son numerosos (Báez et al., 2002).

La principal aplicación en la medicina es la transfusión sanguínea sin riesgos. Las transfusiones de sangre entera están indicadas en animales que presentan hipovolemias del shock traumático o quirúrgico, anemias crónicas, intoxicaciones, hipocoagulabilidad, desnutrición, enfermedad hemolítica del recién nacido y otras afecciones (Báez et al., 2002).

5.2.2 Compatibilidad sanguínea

Al principio se creía que cada uno de los factores antigénicos era controlado por un sistema genético separado, pero investigaciones posteriores demostraron que 34

los grupos sanguíneos en el bovino son controlados por alrededor de 11 diferentes genes (Johansson y Rendel, 1968). Una principal consideración debe darse al factor J. Stormon (1949) demostró que el factor J no es originalmente un grupo sanguíneo antigénico si no un factor sérico. Esta sustancia está presente en el suero sanguíneo de los terneros cuando están alrededor de una semana de edad.

L de los Bovinos, que consiste en dos alelos que controlan un sistema aloantigénico único. B, contiene varios cientos de alelos o fenogrupos que, junto con los otros grupos sanguíneos del ganado bovino, puede producir millones de combinaciones de grupos sanguíneos únicos (R. Gatica, 1988).

En el momento de realizar transfusiones sanguíneas compatibles, es necesario determinar los grupos sanguíneos implicados en las reacciones transfusionales, tanto del donante como del receptor. Para tipificar los grupos sanguíneos se requiere de antisueros específicos frente a los antígenos eritrocitarios. En vista de la dificultad de poder tipificar en la práctica diaria a los animales, se debe recurrir a otros procedimientos para comprobar que los eritrocitos transfundidos no van a ser atacados por el sistema inmune del receptor. (Rosales, 2008).

Existen distintos métodos para realizar una prueba de compatibilidad mediante cruzamiento de la sangre del donante y del receptor, con distintos niveles de complejidad. Como norma general cuanto más sencilla es una prueba, también es menos sensible, detectando sólo aquellos plasmas con elevados títulos de aloanticuerpos, aunque puede ser útil cuando no se dispone del tiempo o del material necesario para realizar una técnica más compleja. La prueba de cruzamiento principal comprueba si el receptor posee aloanticuerpos frente a los antígenos de los eritrocitos del donante, mientras que la secundaria comprueba si el plasma del donante lleva aloanticuerpos frente a los antígenos de los hematíes del receptor. Una incompatibilidad secundaria es menos importante desde el punto de vista transfusional, ya que los aloanticuerpos transfundidos se diluyen mucho en la sangre del receptor (López et al., 1997).

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5.2.3 Elección del donante

El mejor sitio para obtener sangre de un donante es a nivel de la vena yugular, requiriéndose una tranquilización previa, debiendo obviamente recogerla de forma aséptica y conservándola de manera que se evite la proliferación bacteriana (Montaña, 1997).

Un buen donante requiere: buen estado corporal, edad entre 2 y 8 años, tener un temperamento tranquilo, si no sedar (inmovilización química), Hematocrito mayor al 24%, estar clínicamente sano, Hacer prueba de coagulación

y pruebas

cruzadas (prueba de compatibilidad cruzada Cross Match). Cualquier buen donante debe estar libre de infecciones y parasitismos transmitidos vía hematica, variando el control que se debe realizar según la localización geográfica (Hohenhaus, 2000).

5.2.4 Toma de muestra

La posición adecuada y sujeción efectiva del animal son esenciales para un muestreo con éxito. La práctica apacible y suave deberá minimizar la necesidad de manejo físico humano. No solo deben ser minimizados los trastornos físicos y psíquicos sobre bases humanitarias, sino también porque la sangre tomada de un animal asustado, adrenalizado, puede originar resultados equivocados en varios análisis (Edwars, 2008).

En los bovinos la sangre es obtenida de las venas yugular, mamaria (abdominal subcutánea) y caudales y de las arterias carótida, caudal y braquiales. La vena yugular puede ser destacada presionando con los dedos el canal yugular o usando un cordón. El vaso prominente se ve bien en la mayoría de las vacas lecheras y se palpa fácilmente en los animales obesos. Tiene aproximadamente 2 cm de

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diámetro. Se introduce en la vena una aguja larga calibre 14 y de 5 cm de longitud, o calibre 16 y 10 cm de longitud (Rincón, 2000).

La sangre se debe obtener sobre combinaciones de anticoagulantes y conservantes para su mantenimiento. Se tomara en los pacientes sangre entera.

El uso de bolsas con citrato-fosfato-dextrosa-adenina permite la conservación de la sangre alrededor de 35 días a 4°C. El citrato actúa de anticoagulante, siendo usado porque se metaboliza en el hígado del receptor, mientras que si se usan otros anticoagulantes que no son metabolizados, como la heparina, se puede crear un estado de hipocoagulabilidad, con la aparición de hemorragias (Eduars, 2008).

5.2.5 Transporte de la muestra

El cuidado de la muestra sanguínea hasta que es analizada en el laboratorio es importante, debe ser correctamente rotulada y conservada para las pruebas bioquímicas. Para el transporte y conservación del suero se debe esperar la retracción del coágulo, en nuestro medio, la sangre de los animales se coagula entre 20-30 minutos. Para el transporte y conservación del plasma no hay necesidad de esperar que la sangre se sedimente, después de obtenida debe ser refrigerada para su envío al laboratorio en nevera portátil con hielo seco o picado (Montoro, 2009).

El suero y el plasma no deben ser conservados más de 6 horas en refrigeración sin ser separados de los demás componentes sanguíneos, porque esto trae como consecuencia alteración en los diferentes metabolitos de la sangre a determinar y por lo tanto errores en los resultados del laboratorio. Para la conservación de la muestra se emplean anticoagulantes apropiados para algunas determinaciones (Hohenhaus, 2000).

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5.3 PRUEBAS CRUZADAS

Para disminuir las posibilidades de la aparición de incompatibilidad sanguínea se realizan dos procedimientos, la prueba mayor o principal y la menor. La prueba de reacción cruzada mayor comprueba si el receptor posee anticuerpos frente a los antígenos eritrocitarios del donante (poniendo en contacto plasma del receptor con GR del donante), mientras que la menor comprueba si el plasma del donante contiene anticuerpos frente a los antígenos de los eritrocitos del receptor (García, 2009).

5.3.1 Prueba de compatibilidad cruzada (Cross Match)

Como en la actualidad no es posible determinar en cualquier laboratorio la identidad antigénica eritrocitaria del animal donante y del receptor, mediante la Prueba de Compatibilidad Cruzada o Cross Match, podemos determinar si ambos individuos son compatibles para una transfusión, independientemente que ignoremos sus respectivos grupos sanguíneos. El Cross Match es una prueba de enfrentamiento in Vitro entre una muestra de sangre del donante y del receptor. Si hay reacción antígeno-anticuerpo se manifestará provocando hemólisis y/o aglutinación en la preparación (Montoro, 2009).

5.3.2 Técnica Se remiten al laboratorio 1ml de sangre con anticoagulante EDTA del receptor y la misma cantidad de los posibles donadores. Se realizan dos pruebas distintas para poder identificar la compatibilidad de los grupos sanguíneos y asi poder realizar una transfusión segura de la siguiente manera:

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1) Cross Match mayor: Se enfrentan glóbulos rojos del donante con suero del receptor. La presencia de aglutinación o hemólisis revela anticuerpos en el suero del receptor contra los glóbulos rojos del donante.

2) Cross Match menor: Suero del donante con glóbulos rojos del receptor.

Detecta anticuerpos en el suero del donante contra los glóbulos rojos del receptor.

Un Cross Match compatible no debe dar evidencias de hemólisis o aglutinación.

De existir una leve incompatibilidad evidenciada en el Cross Match menor y ante una emergencia se podría realizar la transfusión, ya que los anticuerpos del donante se diluirán rápidamente en el torrente sanguíneo del receptor (Sappía, 2006).

5.4 REACCIONES TRANSFUSIONALES ADVERSAS

Para evitar una reacción del sistema inmunológico al realizar una transfusión de sangre, tendremos que encargarnos de que los donantes sean individuos completamente sanos y que guarden el mayor grado de compatibilidad con el receptor. La técnica de extracción-infusión debe se llevada a cabo con minucioso cuidado y precaución para evitar cualquier reacción. Se clasifican en: inmunomediadas y no-inmunomediadas. La mayoría de ellas pueden evitarse si se selecciona de forma adecuada el donante y el producto sanguíneo, y aplicando técnicas de manejo/administración correctas. (García, 2009).

5.4.1 Reacciones inmunomediadas

Son las más peligrosas. Están provocadas por reacciones de hipersensibilidad de tipo I o tipo II. Las de tipo I (inmediata), pueden ocasionar signos de shock anafiláctico, mientras que las de tipo II (dependiente de anticuerpo), suelen cursar con hemólisis intravascular aguda por reacción de anticuerpos del receptor contra los eritrocitos del donante. Los signos aparecen generalmente 1-2 horas tras el

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inicio de la transfusión, consistiendo en temblores, taquicardia, taquipnea, aumento de la temperatura, vómitos, urticaria y Hemoglobinemia /hemoglobinuria (García, 2009).

5.4.2 Reacciones no-inmunomediadas

Suelen producirse como consecuencia de alteraciones de los productos sanguíneos durante su obtención o almacenaje o por administración de volúmenes/velocidades excesivos. La sobrecarga de volúmenes se manifiesta por aumento de la presión venosa central (distensión yugulares), taquipnea-disnea, tos, congestión de mucosas y auscultación de crepitaciones húmedas en pulmón (García, 2009).

En esta reacción puede intervenir tanto el sistema inmune del individuo que recibe la sangre como los componentes defensivos que se encuentran en la unidad transfundida. Las alteraciones que vamos a encontrar como consecuencia de una transfusión sanguínea podemos encuadrarlas en tres tipos generales: hemólisis, fiebre y anafilaxia (Rojas, 2002).

5.4.3 Hemólisis

Estas reacciones se producen cuando los grupos sanguíneos enfrentados son incompatibles, cuando hay aloanticuerpos presentes en el organismo del animal trasfundido, o cuando ha habido algún tipo de accidente en la manipulación de la sangre. Un aloanticuerpo

se define como aquel que reacciona ante un

aloantígeno o isoantígeno. Esto es, contra un antígeno que suele estar presente en los miembros de una misma especie. Según el momento en que se observen los síntomas, las reacciones hemolíticas se clasifican como agudas o retardadas.

La reacción hemolítica aguda se produce, pocos minutos después del tratamiento, cuando hay una incompatibilidad entre glóbulos rojos y en la reacción retardada

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los síntomas no se observan hasta una o dos semanas después. En este caso los anticuerpos se desarrollaron como consecuencia de una transfusión anterior. Al momento de la nueva, el título en anticuerpos es todavía bajo y la hemólisis no se hace aparente. Puede producirse también un efecto de destrucción de las plaquetas que se manifiesta como hematomas en la piel (Rojas et al., 2002).

5.4.4 Fiebre y anafilaxia.

Este mecanismo puede desencadenarse en dos casos: cuando hay anticuerpos anti glóbulos blancos presentes en la unidad transfundida o como consecuencia de la liberación de citosinas desde los glóbulos blancos mientras la sangre permaneció almacenada. La anafilaxia se manifiesta a los pocos segundos y se explica como una reacción del sistema complemento. Los síntomas pueden resumirse en: Hipotensión y bradicardia, apnea, micción, defecación, vómitos, signos neurológicos: letargia, decúbito lateral, convulsiones, nistagmos. En raras ocasiones se produce la muerte (Dipet al., 2002).

5.4.5 Consideración de los efectos adversos

Otra razón fundamental para apoyar el uso de componentes sanguíneos incluye una lista innumerable de posibles efectos adversos que pueden resultar de la transfusión innecesaria de constituyentes sanguíneos. Cualquier reacción a la transfusión significa que la transfusión no está cumpliendo con su propósito y, de manera importante, ha creado otra carga en el paciente que ya tiene además, una carga previa por el estado fisiológico por el cual requería la transfusión. La sensibilización a las células sanguíneas puede inducir resultados refractarios en subsecuentes transfusiones. La transfusión de múltiples unidades de sangre entera de manera secuencial para poder alcanzar un cierto hematocrito, puede también producir edema pulmonar debido a la sobrecarga de volumen.

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Toda terapia de transfusión produce sólo una mejoría transitoria en la condición del paciente. A menos que el paciente sea capaz de producir endógenamente el déficit de los componentes, serán necesarias más transfusiones. Además de esto, las transfusiones disminuyen la respuesta fisiológica a la deficiencia del constituyente sanguíneo (Feldman, 2008).

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6. MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO

TUNJA (BOYACÁ) Tunja es una ciudad colombiana, capital del departamento de Boyacá. Cuenta con una población estimada para 2012 de 177. 974 habitantes. Se encuentra situada sobre la cordillera oriental de los Andes, 130 km al noreste de la ciudad de Bogotá.

El principal recurso hídrico de la ciudad es la Represa de Teatinos, que abastece en su totalidad el área urbana. La altura sobre el nivel del mar de la cabecera municipal es de 2.775 metros, altura máxima 3.200 metros.

Figura 1. Ubicación geográfica de Tunja en el departamento de Boyacá.

Fuente: http://www.tunja-boyaca.gov.co/nuestromunicipio.shtml Visitado 02 enero de 2013.

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7. MARCO LEGAL

Para el desarrollo de este proyecto se tuvo en cuenta leyes, decretos y normatividades donde resaltan el buen manejo de esta técnica experimental.

LEY 576 DE 2000 (febrero 15)

Por la cual se expide el Código de Ética para el ejercicio profesional de la medicina veterinaria, la medicina veterinaria y zootecnia y la zootecnia.

El congreso de Colombia decreta:

TITULO I DE LAS DISPOSICIONES GENERALES CAPITULO I Declaración de principios

Artículo 1º. La medicina veterinaria, la medicina veterinaria y zootecnia y la zootecnia, son profesiones basadas en una formación científica, técnica y humanística que tienen como fin promover una mejor calidad de vida para el hombre mediante la conservación de la salud animal, el incremento de las fuentes de alimento de origen animal, la protección de la salud pública, la protección del medio ambiente, la biodiversidad y el desarrollo de la industria pecuaria del país.

Artículo 2º. Los profesionales a quienes se les aplica esta ley, deben tener presente que son principios

éticos y morales, rectores indiscutibles ajenos a

cualquier claudicación, entre otros, el mutuo respeto, la cooperación colectiva, dignificar la

persona, acatar los valores que regulan las relaciones humanas,

convivir en comunidad, cumplir voluntariamente los principios que guían, protegen y encauzan la actitud del hombre frente a sus deberes, obligaciones y derechos.

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Artículo 3º. Los profesionales objeto de la presente ley, como integrantes de la sociedad, deberán preocuparse por analizar los diferentes problemas de la vida nacional en el campo de su ejercicio profesional,

teniendo la responsabilidad

social de contribuir eficazmente al desarrollo del sector agropecuario del país.

Artículo 78°. Los trabajos de investigación podrán ser divulgados o publicados con la debida autorización de sus autores, de conformidad con las normas sobre Derechos de Autor.

LEY 84 DE 1989

Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales y se crean unas contravenciones y se regula lo referente a su procedimiento y competencia.

Artículo 1°: A partir de la promulgación de la presente Ley, los animales tendrán en todo el Territorio Nacional especial protección contra el sufrimiento y dolor, causados directa o indirectamente por el hombre.

Artículo 2°: Las disposiciones de la presente Ley tienen por objeto: • Prevenir y tratar el dolor y sufrimiento de los animales.

• Promover la salud y el bienestar de los animales, asegurándoles higiene, sanidad y condiciones apropiadas de existencia.

• Erradicar y sancionar el maltrato y los actos de crueldad para con los animales.

• Desarrollar programas educativos a través de medios de comunicación del Estado y de los establecimientos de educación oficiales y privados que promuevan el respeto y cuidado de los animales.

• Desarrollar medidas efectivas para la preservación de la fauna silvestre.

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8. METODOLOGÍA

8.1 TIPO DE ESTUDIO

Para el desarrollo de la investigación se planteo realizar un estudio de tipo experimental y descriptivo.

Para el desarrollo del estudio se utilizaron muestras de sangre entera de 30 bovinos sanos entre machos y hembras (Anexo 1), seleccionados mediante examen clínico general (Anexo 2), para buscar 2 pacientes compatibles y 2 incompatibles, se decidió dejar los machos como donantes y las hembras como receptoras, teniendo en cuenta que esta decisión no afecta en nada el protocolo si se decide trabajar con el mismo sexo (hembra y hembra o macho y macho).

8.2 POBLACIÓN, MUESTRA Y UNIDADES EXPERIMENTALES

La investigación se realizó en el laboratorio clínico veterinario Microzoo ubicado en la carrera 11ª N° 23-62, en la ciudad de Tunja, en el departamento de Boyacá. La población sometida para la investigación fueron 30 bovinos entre hembras y machos sanos seleccionados mediante examen clínico general.

La muestra usada fue sangre entera de los 30 bovinos seleccionados con anterioridad; cada una de las muestras fue debidamente recolectada en tubos tapa roja y tubos tapa lila, para su posterior evaluación en el laboratorio.

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8.3 DISEÑO EXPERIMENTAL El procesamiento de las muestras se realizó de la siguiente manera:

1. Se tomaron muestras de sangre entera de la vena yugular de 30 bovinos seleccionados previamente (Anexo 3); estas muestras fueron almacenadas en tubos tapa lila con anticoagulante para evitar la pérdida de sus componentes y tubos tapa roja sin anticoagulante para poder obtener el suero (Figura 2); posteriormente son transportadas en neveras para su valoración en el laboratorio.

2. Se realizó la prueba de laboratorio cruzada Cross Match mayor, para determinar compatibilidad o incompatibilidad sanguínea entre el donante y el receptor, de los cual se seleccionaron 2 muestras compatibles y 2 muestras incompatibles para el desarrollo del protocolo propuesto en ellas.

3. A las dos muestras seleccionadas, tanto las compatibles como las incompatibles se les realizó el protocolo propuesto 20 veces (20 repeticiones) teniendo la certeza que todas las veces que se desarrollara el procedimiento debía hallarse el mismo resultado 4. Se modificaron en el laboratorio los volúmenes de los reactivos (Figura 3), 1.

De solución de lavado (SL- L) y 2. De solución de suspensión (SL-SUS), respecto a la técnica estándar de laboratorio, siendo esto necesario para determinar las cantidades acordes a utilizar en las condiciones de campo.

5. Luego de las 20 repeticiones en secuencia con cada par de muestras compatibles y cada par de muestras incompatibles, se logró hallar los volúmenes necesarios y adecuados de los reactivos y de la sangre evaluada, los cuales fueron planteados para el desarrollo del protocolo final.

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Figura 2. Muestras de sangre entera de los bovinos seleccionados.

Figura 3. Reactivos de laboratorio para el desarrollo de la tĂŠcnica.

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8.4 MATERIALES Y MÉTODOS

8.4.1 Materiales (Anexo 4):

1. Tubos tapa lila con anticoagulante EDTA 2. Tubos tapa roja sin anticoagulante 3. Tubos de ensayo de 4cm.

4. Tubos de ensayo de fondo cónico 5. Láminas portaobjetos 6. Láminas cubreobjetos 7. Micropipetas 8. Centrífuga (Anexo 5).

9. Gotero 10. Reactivo SL-L (solución de lavado).

11. Reactivo SL-SUS (solución de suspensión).

8.4.2 Métodos:

El desarrollo del experimento se realizó teniendo en cuenta la prueba de compatibilidad cruzada estándar de laboratorio Cross match mayor, la cual se describe a continuación paso a paso para su elaboración en el laboratorio: PASOS DE LA PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA MODIFICADA DE LA PRUEBA CRUZADA CROSS MATCH MAYOR 1. Separe alícuota de 9ml de SL por cada donante a evaluar.

2. Traslade 3ml de SL en un tubo de ensayo.

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3. Traslade con cuidado 200 mcl de eritrocitos concentrados del donante al tubo del paso 2, mezcle con suavidad.

4. Deje sedimentar o centrifugue a 1000 rpm durante 5 minutos.

5. Elimine el sobrenadante.

6. Re suspenda el sedimento (eritrocitos) en 3ml de SL. Repita el paso 4.

7. Re suspenda el sedimento (eritrocitos) en 3ml de SL. Repita el paso 4.

8. Los eritrocitos están listos para la suspensión (SUS).

9. Recolecte los eritrocitos obtenidos en el paso 7, re suspenda en 1ml de SUS. 10. Tome 100mcl de células suspendidas y mézclelas en 100mcl de suero del receptor en un tubo de ensayo.

11. Homogenice con suavidad, incube a temperatura ambiente 18 a 25 °C, durante 15 minutos.

12. Deje sedimentar o centrifugar a 1000 rpm durante 2 minutos.

13. Evaluación de resultados RESULTADOS: observe con detalle el tubo del paso 4.

A. Presencia de hemolisis. HAY INCOMPATIBILIDAD. B. Ausencia de hemolisis, mezcle con suavidad y observe con detalle, si hay aglutinación visible, HAY INCOMPATIBILIDAD. C. Si no hay aglutinación visible, coloque 20mcl (1gota) de la muestra del tubo del paso 4 en una lámina porta objetos, cubra con una laminilla, observe a 4, 10 y 40X, si hay micro aglutinación, HAY INCOMPATIBILIDAD. D. Si no hay hemolisis en el paso A, no hay aglutinación en el paso B, y no hay micro aglutinación en el paso C, HAY COMPATIBIIDAD y los pacientes son aptos para una transfusión sanguínea Fuente: Modificado de la Técnica de Compatibilidad Cruzada Cross Match mayor, por Boyacá, 2011.

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9. RESULTADOS Y ANÁLISIS

Se determinaron las 2 muestras compatibles y las 2 muestras incompatibles por medio de la técnica de laboratorio estándar descrita anteriormente. Con estas muestras se realizaron las evaluaciones necesarias con la técnica propuesta con el objetivo que esta pueda ser aplicada en campo, de lo cual se obtuvo el siguiente protocolo final.

PASOS DEL PROTOCOLO FINAL ESTABLECIDO EN CAMPO PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA EN BOVINOS

MATERIALES: 

Tubos de ensayo marcados respectivamente (1,2 y 3).



2 laminas portaobjetos



1 gotero



Solución de suspensión (SL- SUS) en frasco X 5ml.

PROCEDIMIENTO: 1.

Tome el tubo 1 y mezcle 100mcl (4 gotas) de sangre del donante con 100mcl (4 gotas) de suero del receptor.

2.

Homogenice con suavidad; incube a temperatura ambiente (18 a 25°) durante 5 minutos.

3.

En el tubo 2, mezclar 100mcl (4 gotas) de sangre del donante con 100mcl (4 gotas) de la solución de suspensión (SL-SUS). Mezclar con suavidad. Deje actuar por 3 minutos.

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4.

En el tubo 3, mezclar 100mcl (4 gotas) de sangre del receptor con 100mcl (4 gotas) de la solución de suspensión (SL-SUS). Mezclar con suavidad. Deje actuar por 3 minutos.

5.

Colocar una gota del contenido del tubo 2, y una gota del contenido del tubo 3 en la lámina portaobjetos. Unir las dos gotas en forma circular mezclando con suavidad. Deje actuar por 2 minutos.

RESULTADOS: A.

Si en el tubo 1 encuentra el sobrenadante con una leve coloración roja (hemolisis), HAY INCOMPATIBILIDAD. (Figura 4).

B.

Si no se evidencia esta coloración roja, deslice el contenido por las paredes del tubo y observe si hay presencia de grumos (aglutinación); entonces, HAY INCOMPATIBILIDAD. (Figura 4).

C.

Si en el paso 5 encuentra presencia de grumos haciendo un leve movimiento de la lámina; entonces, HAY INCOMPATIBILIDAD. (figura 4).

D.

Si no hay presencia de hemolisis en el paso A, no hay aglutinación en el paso B, y no hay presencia de grumos en el paso C; entonces, HAY COMPATIBILIDAD. (Figura 5).Los pacientes son aptos para la transfusión.

Datos adicionales: 

Precaución: lave el gotero entre cada paso con la solución de lavado (SL-L), la cual va integrada en el protocolo final, esto con el fin de que la muestra no sea contaminada y que los resultados sean mas satisfactorios en el momento del desarrollo del protocolo.



Las proporciones de cada reactivo, vendrán acordes a la cantidad de las muestras a realizar.



Tener en cuenta las normas necesarias para la obtención y preservación de la muestra.

52



Seguir los pasos tal cual se describen en el protocolo para mejores resultados.

Figura 4: Resultados de INCOMPATIBILIDAD

SI AGLUTINACIÓN

SI GRUMOS (aglutinación)

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Figura 5: Resultados de COMPATIBILIDAD

NO AGLUTINACIÓN

NO GRUMOS

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Como fue anteriormente mencionado, se desarrollo este protocolo final en las 2 muestras compatibles y las 2 muestras incompatibles en 20 repeticiones para cada par de muestras, lo cual se evidencia en las tablas 1 y 2 de tabulación de resultados descritas a continuación: Tabla 1. Tabulación de resultados de las 20 repeticiones de las 2 muestras compatibles y las 2 incompatibles realizadas con la prueba de laboratorio estándar

TÉCNICA ESTÁNDAR DE LABORATORIO CROSS MATCH MAYOR

N° DE MUESTRAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

COMPATIBILIDAD Bovino hembra – Bovino macho. compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+)

INCOMPATIBILIDAD Bovino hembra – Bovino macho. incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-)

En efecto se logro determinar la incompatibilidad y la compatibilidad en cada caso de manera coincidente con la prueba cruzada mayor en los 20 resultados previamente clasificados como compatibles e incompatibles. De igual manera se

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desarrollo la técnica con los materiales y los reactivos necesarios respectivamente para un mejor procedimiento.

Tabla 2. Tabulación de resultados de las 20 repeticiones, de las 2 muestras compatibles y las 2 incompatibles realizadas con el protocolo en campo.

PROTOCOLO DE IDENTIFICACIÓN DE COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA EN CAMPO

N° DE MUESTRAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

COMPATIBILIDAD Bovino hembra – Bovino macho. compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+) compatible (+)

INCOMPATIBILIDAD Bovino hembra – Bovino macho. incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-) incompatible (-)

Se logró identificar la compatibilidad y la incompatibilidad en cada caso con el nuevo protocolo para campo, identificando que los resultados del experimento fueron 100% compatibles y 100% incompatibles respectivamente.

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Se establecieron los materiales y los pasos necesarios para el desarrollo del protocolo en campo y se pudo identificar la diferencia entre las muestras compatibles y las muestras incompatibles. (Figura 6).

Figura 6. Comparación de los resultados de incompatibilidad con los resultados de compatibilidad.

De acuerdo a los resultados generales obtenidos, se evidencian un 100% de efectividad del procedimiento realizado, por tanto el protocolo final planteado en el objetivo principal de la investigación se ha cumplido con éxito, además se ha realizado la validación de esta prueba a través del programa estadístico SPSS versión 19 y una tabla de distribución para evidenciar la efectividad del protocolo.

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9.1 Análisis estadístico:

El análisis de la información se llevo a cabo mediante el programa estadístico SPSS versión 1.9; Como en este caso se evalúan variables cualitativas, la validación se hizo a través de la prueba de distribución chi- cuadrado donde se explica a continuación la interpretación de los resultados.

Grafica 1. Comparación de los resultados de compatibilidad e incompatibilidad en bovinos obtenidos en el laboratorio, con respecto a los del protocolo en campo.

Muestras

COMPARACIÓN RESULTADOS OBTENIDOS LABORATORIO FRENTE AL PROTOCOLO EN CAMPO 40 35 30 25 20 15 10 5 0

LABORATORIO CAMPO

COMPATIBLE

INCOMPATIBLE Resultado

De forma evidente se observa que los resultados obtenidos con el protocolo propuesto para desarrollar en campo son iguales que los resultados obtenidos en el análisis de laboratorio. Las muestras compatibles obtenidas con el protocolo de campo son equivalentes a las obtenidas en el laboratorio. De igual forma se evidencia en los resultados de incompatibilidad.

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Tabla 3. Tabla de contingencia de la prueba de laboratorio vs el protocolo de campo.

La tabla de contingencia 2x2 anterior nos permite determinar la relación entre la variable de las filas y la variable de las columnas. Para el caso de la variable resultados compatibles de la prueba de laboratorio, se concentra el 100% dentro de los resultados compatibles obtenidos en el protocolo de campo. Los resultados incompatibles de la prueba de laboratorio, se concentran en un 100% dentro de los resultados incompatibles obtenidos en el protocolo de campo.

La hipótesis nula a contrastar H0 será la independencia entre los resultados obtenidos

en el laboratorio, con respecto a los del protocolo en campo. La

hipótesis alternativa H1 demuestra que los resultados obtenidos por ambos métodos son similares. De tal manera se demuestra que: Nivel de significancia =0.05 Grados de libertad= (f-1)*(c-1) Grados de libertad= (2-1)*(2-1)=1

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Tabla 4. Prueba chi- cuadrado prueba laboratorio – resultados prueba campo

En la tabla anterior se muestra el resultado obtenido de la prueba chi- cuadrado de las variables de los resultados obtenidos para bovinos, de la prueba efectuada en laboratorio y el protocolo de campo, este cálculo nos determina que x2 = 80.

Observando la tabla de distribución de valores críticos de la distribución chicuadrado, con un (1) grado de libertad y un nivel de confianza del 95% (5% nivel de significación), se encuentra que x2 (1, 0.05) = 3.84 Dado que el estadístico de prueba x2 es mayor que el valor obtenido en la tabla, se rechaza la hipótesis nula H0 de independencia entre los resultados obtenidos en el laboratorio, con respecto a los del protocolo en campo, aceptando por tanto la hipótesis alternativa H1 la cual demuestra que los resultados obtenidos por ambos métodos son equivalentes.

Dando como resultado que el protocolo es confiable, y su efectividad es significativa en el 95% de confiabilidad; por tal motivo se procede a realizar la propuesta escrita del protocolo final para su posterior desarrollo en campo.

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CONCLUSIONES

1. Se acepta la hipótesis alternativa H1, la cual demuestra que los resultados obtenidos por ambos métodos son equivalentes; por tal motivo el protocolo diseñado para la identificación de compatibilidad sanguínea en campo para bovinos es confiable y efectivo.

2. El diseño del protocolo para la determinación de compatibilidad sanguínea en campo es el 95% efectivo en comparación a la prueba estándar de laboratorio, ya que determina la compatibilidad e incompatibilidad entre los individuos.

3. Se lograron establecer

los materiales requeridos para el desarrollo del

protocolo en campo a través de la modificación de la técnica estándar de laboratorio.

4. Se determinaron las proporciones necesarias de los reactivos para la elaboración del protocolo en campo identificando que la utilización del reactivo de solución de lavado (SL-L) no era tan necesario para la realización de las pruebas, por tal motivo se implemento solo el reactivo de solución de suspensión (SL-SUS) como método más eficiente.

5. Se logro modificar el tiempo entre cada paso del protocolo final con el fin de desarrollarlo en campo en el menor tiempo posible, utilizando 15 minutos en comparación a la prueba estándar de laboratorio la cual es de 45 minutos, teniendo en cuenta que el envió de la ya no será necesario.

6. Se eliminaron pasos de la técnica estándar con el propósito de hacer un protocolo más rápido y efectivo que pueda ser desarrollado en campo.

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7. Se observaron las reacciones de hemolisis y aglutinaci贸n presentes en el procedimiento de cada muestra incompatible siendo evidente el resultado de la misma.

8. Se identificaron las diferencias entre una muestra compatible y una muestra incompatible en el momento de la observaci贸n del procedimiento.

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IMPACTO

El impacto de la investigación realizada es de gran utilidad para el profesional que desarrolla su trabajo en campo, siendo una herramienta de fácil manejo para la identificación de la compatibilidad de los grupos sanguíneos en los bovinos. Esta práctica transfusional indica un desarrollo rápido de métodos de diagnóstico para pacientes de urgencia y brinda un ahorro de tiempo para el profesional en cuanto a las ayudas clínicas. El propósito final del diseño del protocolo, es evitar accidentes post transfusionales en los pacientes a tratar y evitar la presentación de reacciones adversas que afecten la salud del animal.

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RECOMENDACIONES

El estudio de hematología en bovinos, es un tema complejo y de poca investigación. Por tal motivo se puede seguir investigando acerca del tema y se puede llegar a conocer más técnicas para la ayuda del profesional. La idea planteada para la continuidad de esta investigación es poder elaborar el kit completo para la implementación en campo y poder darlo a conocer a los médicos veterinarios que se desempeñan en esta área.

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veterinaria.

70

de

bioquímica

sanguínea

ANEXOS Anexo 1. Elecci贸n de la muestra machos donantes y hembras receptoras

71

Anexo 2. Examen clínico general

EXAMEN CLÍNICO GENERAL I. RESEÑA DEL ANIMAL

Propietario: Luis Peña Dirección: Sotáquira Finca: La primavera Nombre: Margarita Especie: Bovino Raza: Holstein Edad: 2 años Color: Negro con Blanco peso:300kg sexo: Hembra Aptitud: Leche

II. EXÁMEN FÍSICO GENERAL

Estado general: Animal alerta Frecuencia cardiaca: 60 ppm Frecuencia respiratoria: 36 rpm pulso: fuerte.

Tiempo de llenado capilar: 2 seg Temperatura corporal: 39.3°C Enfermedades anteriores: No reporta Vacunación: No reporta OBSERVACIONES:_________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________

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Anexo 3. Toma de muestras de la vena yugular de los bovinos a evaluar

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Anexo 4. Materiales de laboratorio para el desarrollo de la investigaci贸n.

Anexo 5. Centr铆fuga

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