Determinación de los valores séricos de la proteína c reactiva en caninos clínicamente sanos en la c

DETERMINACIÓN DE LOS VALORES SÉRICOS DE LA PROTEÍNA C REACTIVA EN CANINOS CLÍNICAMENTE SANOS EN LA CLÍNICA VETERINARIA ZOOMÉDICA DE LA CIUDAD DE TUNJA

Juan Carlos López Ballesteros

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2014

DETERMINACIÓN DE LOS VALORES SÉRICOS DE LA PROTEÍNA C REACTIVA EN CANINOS CLÍNICAMENTE SANOS EN LA CLÍNICA VETERINARIA ZOOMÉDICA DE LA CIUDAD DE TUNJA

Juan Carlos López Ballesteros

Proyecto presentado como requisito para obtener el título profesional

DIRECTORA ANA CONSUELO GONZALEZ PATIÑO Médica Veterinaria especialista en Pequeños Animales

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2014

NOTA DE ACEPTACIĂ“N

_______________________ _______________________ _______________________ _______________________

_______________________ Firma del director

_______________________ Firma jurado #1

_______________________ Firma jurado #2

DEDICATORIA Este proyecto se lo dedico a mis padres por el gran esfuerzo que han hecho durante varios años para brindarme la mejor educación, las largas noches de compañía mientras realizaba el proyecto, el apoyo que me brindaban cuando las circunstancias me hacían decaer y el tiempo me presionaba.

A los profesores y amigos que creyeron en mis capacidades y me ofrecieron su ayuda incondicional en el proceso de la elaboración del proyecto. A sí mismo, se lo dedico a todos los estudiantes que creen que algunas metas son difíciles de alcanzar por no tener las aptitudes para lograrlo; por experiencia propia, el mayor enemigo es uno mismo por no confiar en lo que se puede lograr, pero que si nos esforzamos y no nos ponemos nuestros propios obstáculos, seremos capaces de lograr cosas importantes. El objetivo no es ser el mejor, pero si dejar nuestra huella al destacarnos por las buenas cosas que hacemos.

AGRADECIMIENTOS En primer lugar le agradezco a Dios todopoderoso por permitirme llevar a cabo este proyecto, por acompañarme en todo el proceso, ayudarme a levantar cuando las circunstancias me hacían caer, darme la confianza para seguir adelante y por poner en mi vida personas valiosas que contribuyeron a que este proyecto fuera una realidad.

Agradezco a mis padres por dedicar varias horas del día en la búsqueda de los caninos incluidos en el estudio, los contactos que hicieron y la facilidad de transporte que prestaron. Les agradezco por la ayuda económica que me brindaron para los materiales que se utilizaron en el proyecto y, especialmente, les agradezco por el apoyo, la compañía y las fuerzas que me dieron en todo lugar y momento.

Agradezco a mi directora de tesis, Consuelo González, quien compartió conmigo sus conocimientos y su experiencia, atribuyendo a mi crecimiento profesional y como persona. Le agradezco por confiar en mis capacidades, ayudarme a mejorar cada día y por abrirme las puertas a oportunidades que me llevaran a destacarme en la profesión que escogí.

Agradezco a la profesora Juanita Andrade, quien dedicó varias horas cada día para hacer críticas constructivas de mi proyecto y poder mejorarle la calidad de presentación. Le agradezco por brindarme su apoyo y por el sentido de pertenencia que acogió con el desarrollo del trabajo. Así mismo, le agradezco por ofrecerme la oportunidad de recibir conocimientos acerca del procedimiento a seguir para realizar una buena metodología y estadística en los proyectos.

Por último, pero no menos importante, le agradezco a todos mis amigos que compartieron conmigo los altibajos que se viven en el transcurso de una carrera profesional, quienes a pesar del tiempo y las circunstancias siguen apoyándome y quienes aportaron su granito de arena en que mi proyecto fuese una realidad.

TABLA DE CONTENIDO

1. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................... 1 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................... 3 3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN (FORMULACIÓN DEL PROBLEMA) ......... 5 4. OBJETIVOS ...................................................................................................... 6 5. MARCO DE REFERENCIA ............................................................................... 7 6. METODOLOGÍA .............................................................................................. 18 7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................. 26 9. CONCLUSIONES ............................................................................................ 64 10.

RECOMENDACIONES ................................................................................ 65

11.

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 66

12.

ANEXOS ...................................................................................................... 77

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Individuos por raza y género seleccionados para el estudio....................26 Tabla 2. Individuos por género y edad (meses) seleccionados para el estudio.....26 Tabla 3. Estadística descriptiva para la concentración de la PCR para grupos de raza.........................................................................................................................34 Tabla 4. Estadística descriptiva para la concentración de PCR por grupos de edad........................................................................................................................36 Tabla 5. Valores de p obtenidos en la prueba de Mann-Whitney para comparaciones pareadas de PCR entre las razas. Valores menores a 0,05 indican diferencias significativas entre grupos....................................................................38 Tabla 6. Valores de p obtenidos en la prueba de Mann-Whitney para comparaciones pareadas de PCR entre los grupos de edad. Valores menores a 0,05 indican diferencias significativas entre grupos................................................39 Tabla 7. Estadística descriptiva para la concentración de la PCR para grupos de género.....................................................................................................................40 Tabla 8. Porcentaje de disimilitud entre los grupos de edad explicada por la concentración de PCR. *La variable que explica el mayor porcentaje de disimilitud es el recuento de neutrófilos segmentados............................................................43 Tabla 9. Porcentaje de disimilitud entre las razas de edad explicada por la concentración de PCR............................................................................................44 Tabla 10. Valores de Proteína C Reactiva para caninos clínicamente sanos determinados en los estudios revisados.................................................................47 Tabla 11. Estadística descriptiva e intervalos de confianza para la concentración de PCR en pacientes clínicamente sanos determinada con diferentes técnicas...52

Tabla 12. Valores de p obtenidos en la prueba de Mann-Whitney para comparaciones pareadas de PCR entre las técnicas utilizadas. Valores menores a 0,05 indican diferencias significativas entre grupos................................................54 Tabla 13. Valores de p obtenidos en la prueba de Mann-Whitney para comparaciones pareadas de PCR entre las razas incluidas en los artículos del mate-análisis. Valores menores a 0,05 indican diferencias signifcativas entre grupos.....................................................................................................................55 Tabla 14. Valores de la concentración sérica de PCR por grupos de patologías...57

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Recuento de leucocitos de individuos incluidos en el estudio. Valor de referencia (7 - 14 x103/mcl).....................................................................................31 Figura 2. Recuento de neutrófilos segmentados de individuos incluidos en el estudio. Valor de referencia (3,5 – 11 x109/L)........................................................31 Figura 3. Recuento de monocitos de individuos incluidos en el estudio. Valor de referencia (0,1 – 1,4 x109/L)...................................................................................32 Figura 4. Recuento de eosinófilos de individuos incluidos en el estudio. Valor de referencia (0,1 – 0,9 x109/L)...................................................................................32 Figura 5. Recuento de linfocitos de individuos incluidos en el estudio. Valor de referencia (1,0 – 4,9 x109/L)...................................................................................33 Figura 6. Concentración de PCR de individuos por raza incluidos en el estudio...34 Figura 7. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR en las razas incluidas en el estudio.......................................................35 Figura 8. Concentración de PCR de los individuos por grupos de edad incluidos en el estudio.................................................................................................................36 Figura 9. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR por grupos de edad de individuos incluidos en el estudio.....................37 Figura 10. Concentración de PCR de los individuos por género incluidos en el estudio....................................................................................................................40 Figura 11. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR por género de individuos incluidos en el estudio...................................41

Figura 12. Plano de MDS que muestra la ordenación de los pacientes según su similitud en las variables hematológicas y serológicas consideradas....................42 Figura 13. Análisis de Coordenadas Principales (PCO) que muestra la distribución de los caninos según los valores obtenidos en cada variable serológica y hematológica descrita.............................................................................................45 Figura 14. Gráfico de dispersión de los rangos “normales” establecidos en los diversos estudios revisados....................................................................................48 Figura 15. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR por técnica utilizada en los artículos con valores individuales en caninos clínicamente sanos.................................................................................................53 Figura 16. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR en las razas incluidas en los artículos del meta-análisis.......................56

GLOSARIO

Agudo: se refiere a la rapidez de presentación de un evento, constituyendo los minutos, horas, días e incluso unas pocas semanas.

Anamnesis: es la recopilación de información proporcionada por el propietario del paciente sobre el estado de salud e intervenciones médicas previas a la consulta.

Biomarcador: Es aquella sustancia que indica un estado biológico en el organismo.

Citoquinas pro-inflamatorias: son proteínas producidas por linfocitos y macrófagos activados para regular diferentes funciones celulares y permitir que el sistema inmunológico ingrese a los tejidos.

Coeficiente de variación: indica el nivel de heterogeneidad de los valores de una variable determinada.

Cuartiles: son aquellos valores determinados por la división porcentual equitativa de un grupo de datos ordenados, en cuatro partes iguales.

Desviación estándar: es una medida de dispersión que indica cuanto se alejan los valores del promedio en una distribución.

Diagrama de caja: es el grafico que representa la homogeneidad de la distribución de los valores por medio de la mediana y los cuartiles.

Eosinofilia: es el aumento fisiológico o patológico del número de eosinófilos por litro de sangre.

Homeotermo: es la capacidad que tiene un organismo de mantener su temperatura corporal dentro de unos límites, independiente de la temperatura del ambiente.

Homogeneidad: característica dada al resultado de la comparación de un grupo de valores que no tienen diferencia significativa.

Inmunocromatografía: método basado en la detección de anticuerpos o antígenos específicos de una sustancia química orgánica o de una enfermedad.

Inmunoturbidimetría: método basado en reacciones inmunológicas medidas por el nivel de turbidez de la sustancia.

Laboratoriales: métodos y técnicas que se llevan a cabo dentro de un laboratorio.

Leucocitosis: es el aumento fisiológico o patológico del conteo de células blancas en general.

Leucograma: recuento general de leucocitos con su diferencial celular.

Linfocitosis: es el aumento fisiológico o patológico del número de linfocitos por litro de sangre.

Media: es el promedio de los datos recopilados en un estudio determinado.

Mediana: es aquel valor central en un conjunto de datos ordenados de menor a mayor.

Meta-análisis: herramienta estadística utilizada para sintetizar datos provenientes de la recolección de diversos estudios.

Mucosa: tejido formado por un revestimiento de epitelio, capa subyacente de tejido conectivo y una fina capa de musculo liso, para cumplir las funciones de protección, secreción y absorción.

Neoplasia: es la formación de un tumor o una masa debido a proliferación o diferenciación celular.

Neutrofilia: es el aumento fisiológico o patológico en el número de neutrófilos por litro de sangre.

Pareadas: es la formación de un grupo con dos factores para comparar sus características.

Patognomónico: se refiere al conjunto de signos y síntomas propios de una sola enfermedad.

Patología: es la ciencia que estudia las enfermedades desde la etiología hasta las manifestaciones clínicas en el paciente.

Revisiones sistemáticas: es un artículo de investigación que recopila los datos de diversos estudios utilizando una metodología científica para responder una pregunta concreta.

Sérico: componentes integrados en el suero sanguíneo procedente de la centrifugación de la sangre realizada para quitar el coágulo restante.

Sistema de complemento: es el componente del proceso inmunológico que facilita la fagocitosis para potenciar la respuesta inflamatoria.

Terapéutica: medios farmacológicos utilizados para el tratamiento de una alteración en la salud.

Tisular: se refiere al tejido de las diferentes estructuras anatómicas del organismo.

Variable: es la propiedad que puede obtener varios resultados dependiendo de la variación que experimente.

RESUMEN La Proteína C Reactiva (PCR) es una proteína de fase aguda que aumenta su concentración ante eventos inflamatorios. Usando variadas técnicas de laboratorio se han hallado diferentes rangos considerados “normales” para los niveles séricos de la PCR, donde la raza, el género, ni la edad parecen haber influido sobre los resultados, pero sí las patologías específicas analizadas en cada estudio. A nivel local y nacional, dentro de la literatura revisada, no se encuentra ningún estudio que reporte este rango, siendo el objetivo de este proyecto determinar los valores séricos de la Proteína C Reactiva en perros clínicamente sanos de la ciudad de Tunja. La muestra (n=46) se obtuvo de los caninos entre 1 y 7 años de edad, de las razas Schnauzer, Cocker Spaniel, French Poodle y Shitzu, que ingresaron a la clínica veterinaria Zoomédica (Tunja, Boyacá) y previa autorización del propietario, se realizó un examen clínico y posterior toma de muestra de sangre de la vena yugular o la vena cefálica antebraquial, para conteo de células blancas (leucograma) y determinación de la concentración de la PCR por el método de inmunoturbidimetría. El resultado del leucograma se utilizó para verificar la condición clínicamente sana de cada paciente, para luego determinar el rango de concentración sérica de PCR asociada a ésta condición: 0,7 – 20,95 mg/L. El límite inferior del rango obtenido en éste estudio coincide con otros reportes publicados, sin embargo el límite superior es muy variable entre estudios. No se encontraron diferencias significativas (p > 0,05) entre los valores de la PCR por grupos de raza, edad y género, ni entre comparaciones pareadas de cada nivel de factor. No se encontró correlación entre la concentración de PCR y los parámetros considerados en el leucograma. En el meta-análisis realizado se encontró que el rango de concentración de PCR reportado para pacientes sanos en diferentes publicaciones es independiente de la técnica utilizada y del tamaño de la muestra.

La amplitud del rango reportado puede verse influenciada por las características de la muestra considerada, más que por el tamaño de la misma, pues la consideración de grupos heterogéneos de razas, edades, entre otras, puede

aumentar la variabilidad en los resultados. Los límites de rango para discriminar entre pacientes sanos y enfermos utilizando la concentración de PCR son imprecisos, sin embargo es evidente que las concentraciones son más elevadas en pacientes con procesos infecciosos como Erliquiosis y Piómetra (>200 mg/L).

La PCR constituye un biomarcador del proceso inflamatorio, con uso potencial como indicador de pronóstico y seguimiento de terapéuticas administradas a pacientes con estas afecciones.

PALABRAS CLAVE: lesión tisular, PCR, proceso inflamatorio agudo, proteína de fase aguda, suero sanguíneo

ABSTRACT C-reactive protein (CRP) is an acute phase protein that increases its concentration in inflammatory events. Using various laboratory techniques have found different range considered “normal” for serum CRP levels, where neather breed, gender, nor age seem to have influenced the results but the CRP had changes according the specific pathology analyzed in each study. At local and national level, within the literature reviewed, there is no study that reports this range, being the aim of this project to determine serum levels of C-reactive protein in clinically healthy dogs from Tunja city. The sample (n=46) was obtained from dogs between 1 to 7 years old, from the following breeds: Schnauzer, Cocker Spaniel, French Poodle and Shitzu, which were admitted to Zoomédica veterinary clinic (Tunja, Boyacá) and prior authorization of the owner, a clinical examination and subsequent sampling of blood from the jugular or cephalic antebrachial vein was performed, for making the white blood cell count and determining the concentration of CRP by an immunoturbidimetric method. The result of leukogram was used to verify clinically healthy condition of each patient, and then determine the range of serum CRP concentration associated with this condition: 0.7 - 20.95 mg/L. The lower limit of the range obtained in this study is consistent with other published reports; however, the upper limit is highly variable between studies. No significant differences (p> 0.05) between the values of CRP by breed groups, age and gender, or between paired comparisons of each factor level were found. No correlation between CRP and the parameters considered in the leukogram found.

In the meta-analysis, we found that the CRP concentration range reported for healthy patients in different publications is independent of the technique used and the size of the sample. The breadth of the range reported may be influenced by the characteristics of the sample considered, rather than the size of it, insomuch as the consideration of heterogeneous groups of breeds, ages, among others, may increase the variability in the results. The range limits to discriminate between healthy and diseased patients using CRP are uncertain, however it is clear that the concentrations are higher in patients with infectious processes such as Ehrlichiosis

and Pyometra (>200 mg/L). The CRP is an inflammatory process biomarker with potential use as a prognostic indicator and therapeutic administration monitoring to patients with these pathologies.

KEYWORDS: tissue injury, PCR, acute inflammatory process, acute phase protein, blood serum

INTRODUCCIÓN La Proteína C Reactiva (PCR) se considera una de las proteínas de fase aguda más importantes en el perro, ya que se evidencia la elevación de su concentración en sangre de forma muy rápida frente a diferentes estímulos (Jain, 1989). La PCR aumenta sus concentraciones séricas en afecciones inflamatorias, traumatismos, neoplasias malignas o enfermedades infecciosas entre otras, debido al daño tisular ocasionado (Ridker et al., 1997). Este disturbio en la homeostasis ocasionará una reacción local, en el cual se presenta la agregación plaquetaria para la formación del coagulo, el aumento de la permeabilidad de los vasos sanguíneos y la activación de granulocitos y células mononucleares, para liberar citoquinas pro-inflamatorias: IL-6, IL-1 y el Factor de Necrosis Tumoral, que activarán las proteínas de fase aguda (Martínez et al., 2004).

Se han realizado diferentes estudios para determinar las concentraciones en perros enfermos y su variación respecto a los perros utilizados como grupo control, evidenciando el incremento de las concentraciones en pacientes con procesos inflamatorios o patológicos activos, tales como piómetra, pancreatitis, post-operatorio, neoplasias malignas, entre otros, y su disminución relativa durante el tratamiento propuesto. Sin embargo, los rangos séricos normales de la Proteína C Reactiva varían de acuerdo a lo evaluado en cada estudio, donde algunos además aseguran que la raza, género y edad no tienen influencia alguna, como lo determinado por Yamamoto et al., (1994) y Kuribayashi et al., (2003). Al respecto, a nivel local y nacional, en la literatura revisada no se encuentra ningún estudio que determine el rango normal de esta proteína en sangre, dificultando su utilidad como apoyo de seguimiento de algún tratamiento.

El presente trabajo se enfoca en establecer los valores de referencia para las concentraciones séricas de la PCR en perros clínicamente sanos, realizando previamente exámenes clínico, físico y el recuento de células blancas para confirmar esta condición clínica. Se evalúa la influencia de la edad, el género y la

raza del canino en la concentración sérica de la proteína, y se establecen comparaciones con resultados obtenidos por otros autores, discutiendo la asociación de la concentración de la PCR con diferentes patologías estudiadas por ellos, los valores o rangos que podrían considerarse “normales” y el efecto de aspectos como la técnica de detección o el tamaño de la muestra sobre la variabilidad de los rangos hasta ahora reportados como “normales”. Se realiza un meta-análisis de los resultados publicados en otras investigaciones que involucran el análisis de la PCR en caninos sanos y afectados por diferentes patologías. Con los resultados obtenidos se espera proporcionar un valor o rango de referencia útil en la posterior identificación de procesos inflamatorios e infecciosos a partir de la medición de esta proteína de fase aguda.

1. JUSTIFICACIÓN La PCR es una proteína de fase aguda que ha sido empleada como monitor del curso de la inflamación y la infección (Gilsanz y Roses, 2004). Sin embargo, las mediciones de esta proteína son poco utilizadas en la práctica de la medicina veterinaria, ya que frecuentemente se emplea el recuento de células blancas para identificar un proceso inflamatorio, a pesar de que la PCR sea más específica ya que su concentración responde directamente a estos procesos (Yamamoto et al., 1993).

Rikihisa et al., (1994), Holm et al., (2004), Martínez-Subiela y Cerón (2005), Peña et al., y Saavedra et al., (2009), han encontrado rangos distintos de la PCR para pacientes sanos, dificultando su interpretación clínica en el seguimiento de tratamientos o como indicador de pronósticos; además, todos los autores coincidieron en que los rangos obtenidos son independientes de la raza, género o edad de los animales que entraron en el estudio. Sin embargo, el uso de esta proteína como indicador de pronósticos no se hace explícito en lo reportado por los autores, ya que en los estudios realizados se evidencian valores diferentes de “normalidad” para los individuos pertenecientes a cada muestra, dependiendo de los objetivos planteados y las características de los pacientes clínicamente sanos en relación a la enfermedad estudiada.

Uno de los obstáculos en la implementación del análisis de los valores de la Proteína C Reactiva como prueba de rutina, es la ausencia de un valor o rango de referencia que corresponda a la concentración en pacientes clínicamente sanos.

Identificar ésta concentración ayudará, por comparación, a evidenciar la presencia de eventos inflamatorios e infecciosos, así como la evolución del paciente con el tratamiento que se le está aplicando, y si es necesario restablecerlo o continuarlo a partir de los resultados de esta prueba, aumentando la relevancia de su utilidad en la práctica veterinaria, ya que constituiría un parámetro hematológico de respuesta más directa que el leucograma tradicionalmente utilizado.

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La condición “clínicamente sano” y la identificación de una concentración de PCR característica de esta condición, requiere del respaldo o validación con el Leucograma en cada paciente. De ésta forma, el valor de referencia de la PCR a obtener ayudará a médicos veterinarios profesionales, practicantes y estudiantes de medicina veterinaria a detectar un proceso inflamatorio o infeccioso, realizar el seguimiento de tratamientos y monitorear el estado de salud de los caninos clínicamente sanos. Además de un valor o rango de concentración de referencia, se busca identificar su relación con la edad, género y raza, ya que esto determina la generalidad de la interpretación y el uso de la PCR como herramienta diagnóstica y de monitoreo en los procesos mencionados.

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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La Proteína C Reactiva (PCR) es un reactante de fase aguda que aumenta su concentración en presencia de inflamación causada por infección o lesión tisular (Gomella, Cunningham, y Eyal, 2009). La etiología de los procesos inflamatorios puede ser o no infecciosa, de forma que en neoplasias, enfermedades inmunomediadas y exposición a agentes físico-químicos, entre otros, no exista una infección concomitante (López, 2008). La infección se produce a partir de la entrada de un patógeno al organismo, aumentando la concentración de la PCR por medio de la activación de citoquinas pro-inflamatorias.

Martínez et al., (2005), Lithgow y Covington (2005), William et al., (2007), Crossley et al., (2010), Maiorana et al., (2011) y Crossley et al., (2012) han hecho estudios de la valoración de la Proteína C Reactiva en diferentes tipos de enfermedades en caninos, como la afección del miocardio, enfermedades respiratorias obstructivas, presentación de tumores de glándula mamaria benignos y malignos, entre otras, evidenciando aumento en los niveles séricos de la PCR y su posterior disminución durante el tratamiento de la enfermedad. A pesar de esto, no se ha dado la relevancia de la utilidad clínica que debería tener el análisis de los valores de esta proteína de fase aguda en las diferentes afecciones que implican una inflamación de presentación rápida, y tampoco a su concentración en pacientes sin patología aparente.

Rikihisa et al., (1994), Peña et al., Holm et al., (2004), Martínez-Subiela y Cerón (2005) y Saavedra et al., (2009), han encontrado rangos normales distintos de la PCR donde se evidencia valores mínimos de 0.49 mg/l y valores máximos hasta de 13.94 mg/l en caninos, acordando que no existe influencia de la raza, género o edad, ni de las condiciones climáticas donde se evalúe esta proteína. Sin embargo, los rangos de valores séricos considerados “normales” obtenidos en cada estudio son muy distintos, pudiendo verse afectado por alguno de los

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factores mencionados anteriormente o por las caracterĂ­sticas del grupo de caninos utilizados como referencia.

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3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN (FORMULACIÓN DEL PROBLEMA) ¿Cuál es el rango de concentración sérica de proteína C reactiva asociado a la condición clínicamente sana en pacientes caninos? ¿Qué factores influyen en la concentración de la proteína C reactiva en caninos clínicamente sanos de la Clínica Veterinaria Zoomédica? ¿Cuáles son las fuentes de variación en los rangos de PCR reportados en la literatura para pacientes clínicamente sanos?

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4. OBJETIVOS Objetivo General Determinar los valores séricos de la proteína C reactiva en caninos clínicamente sanos en la Clínica Veterinaria Zoomédica de la ciudad de Tunja Objetivos Específicos 

Establecer el rango de concentración de Proteína C Reactiva para la muestra objeto de estudio y compararlo con los resultados reportados por otros autores



Comparar las concentraciones de Proteína C Reactiva entre grupos de edad, género y razas



Relacionar la concentración de Proteína C Reactiva con el conteo de células blancas en cada individuo estudiado



Revisar publicaciones de estudios que analicen la concentración de PCR en caninos y ejecutar un meta-análisis que permita identificar el efecto de diferentes factores sobre los rangos reportados para esta variable

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5. MARCO DE REFERENCIA 5.1 Estado del arte Las proteínas de fase aguda son secretadas a partir del hígado por la activación de las citoquinas pro-inflamatorias, aumentando sus concentraciones séricas dentro de las primeras 24-48 horas de iniciado el proceso patológico, siendo la más importante en los caninos la Proteína C Reactiva (Tizard, 2009).

Nakamura et al., (2008) argumentaron que la proteína C reactiva aumenta sus niveles séricos en relación con el incremento de la temperatura corporal de los perros; así mismo, evidenció que a mayores niveles de células blancas frente a un proceso patológico, hay mayores niveles de proteína C reactiva en el organismo; Sin embargo, en enfermedades tales como inflamación crónica intestinal y síndrome nefrótico, donde hay pérdida de proteínas, evidenció una mayor cantidad de albúmina plasmática que de proteína C reactiva, indicando así, que hay incremento en los niveles de proteína C reactiva en eventos de disminución de niveles de albúmina plasmática.

Caspi et al., (1984) dieron gran importancia a la proteína C reactiva en el análisis prematuro de un estímulo agudo, ya que en comparación con las demás proteínas de fase aguda y biomarcadores químicos, es la de mayor rapidez en cuanto a un aumento de niveles séricos, ya que se activa a las 4 horas después del proceso inflamatorio.

Maiorana et al., (2011) observaron que en las patologías que involucran un fallo cardíaco se producen lesiones endoteliales que causan una inflamación en los tejidos provocando la secreción de la proteína C reactiva, que a su vez, induce la producción de otras células inflamatorias, convirtiéndose de esta manera, en un componente principal del acumulo de lípidos en las paredes de los vasos sanguíneos. Así mismo, Carretón et al., (2012) demostraron que la proteína C reactiva también se activa en casos de dirofilariasis cardiopulmonar, ya que el

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parásito produce una endoarteritis pulmonar proliferativa, causando una lesión tisular, provocando la activación de citoquinas pro-inflamatorias y de esta manera la activación desde el hígado de la proteína C reactiva.

William y Scharf (2007) deducen que en algunas enfermedades respiratorias obstructivas se ha identificado un aumento en los niveles de la proteína C reactiva debido a la inflamación producida en las vías aéreas superiores por el mismo esfuerzo del animal para consumir aire, y por el riesgo de daño cardiovascular afectándose el miocardio por la falta de oxígeno que se genera. Además, Poncet et al., (2006) argumentan que la fuerza generada por el diafragma, en compensación de la falta de aire, produce daños a nivel orofaríngeo y regurgitación gastroesofágica que provoca la lesión tisular en la mucosa del órgano.

Según los estudios de Planellas et al., (2012), se demostró que los perros braquiocefálicos tienen una predisposición a tener aumentados los niveles séricos de proteína C reactiva, al generarse óxido nítrico y citoquinas pro-inflamatorias, debido a la resistencia del flujo de aire producido por la hipoplasia traqueal; pero aun así, no es información muy valiosa dentro del estudio de enfermedades obstructivas respiratorias, ya que el aumento de la PCR solo se presenta en pacientes afectados por sáculos laríngeos evertidos.

Lithgow y Covington (2005) notificaron que en los casos de neoplasias malignas se ha observado un aumento en los niveles séricos de la proteína C reactiva debido al proceso inflamatorio e infeccioso que los tumores malignos desencadenan en el organismo, categorizándose así cuando hay aumentos mayores a 8 mg/l con un 66% de probabilidad de malignidad. Mientras que Crossley et al., (2012) argumentan que en procesos neoplásicos benignos no se evidencia un incremento de los niveles de la proteína C reactiva ya que las células neoplásicas no se diferencian bien de las células del organismo. Martínez et al., (2004) concluyen que el grado de incremento de la proteína C reactiva dependerá

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del grado de malignidad que tenga el tumor, dentro de los cuales se encuentran principalmente el tumor de glándula mamaria, linfoma, leucemia, sarcoma, carcinoma y osteosarcoma.

Gow et al., (2012) exponen que se han descrito estudios de las mediciones de proteína C reactiva en animales con shunt portosistémico que desencadenan encefalitis hepática, donde por activación de citoquinas pro-inflamatorias, principalmente la interleuquina 6 (IL-6), se incrementan los valores séricos de la proteína C reactiva, difiriendo sus resultados de un caso de shunt portosistémico sin encefalitis hepática.

Shimada et al., (2002) afirman que en afecciones parasitarias por Ehrlichia canis la proteína C reactiva comienza a secretarse debido a la lenta multiplicación del parásito en la sangre, pudiéndose manifestar entre 4 y 16 horas. Así mismo, Rikihisa et al., (1994) notifican que en las infecciones por Ehrlichia canis, la concentración sérica de la PCR sube a más de 50 µg/ml y declina cuando se resuelven los signos clínicos, considerándose esta proteína de fase aguda como un indicador del pronóstico de esta patología parasitaria.

Fransson et al., (2004) demostraron mediante un estudio realizado para diferenciar el piómetra de la hiperplasia endometrial quística, que hay combinaciones en los parámetros utilizados como biomarcadores, tanto la PCR y el conteo de bandas, como el conteo de células blancas y la PCR, pero la que más sobresalió por su alto nivel de sensibilidad (97.7%) fue la de PCR y el conteo de bandas en los casos de piómetra, debido al proceso infeccioso generado a partir de la Escherichia coli, bacteria comúnmente aislada en los casos de piómetra en perras.

Además, Martínez-Subiela y Cerón (2005), determinaron un rango normal de 3.35 ± 2.86 mg/l para pacientes sanos y los rangos caracteristicos para Leishmaniasis y piómetra: 194,14 ± 49,78 mg/L y 30,58 ± 9,34 mg/L respectivamente. Este rango para las afecciones por Leishmaniasis difiere del identificado por Peña et al., quienes clasificaron a los pacientes afectados según su titulación baja, media o

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alta y señalan concentraciones de PCR de hasta 56,47 mg/L en los pacientes con titulación alta; los mismos autores señalan que la concentración promedio de PCR en pacientes sanos es de 13,94 mg/L sin indicar valores mínimo y máximo.

Holm et al., (2004) reportan un rango normal de la PCR de 1,5 ± 4,1 µg/ml en pacientes sanos, y lo compararon con un grupo de pacientes con pancreatitis aguda, cuyos niveles séricos de la PCR aumentan hasta 56,1 ± 12,7 µg/ml debido a una respuesta de fase aguda por parte del organismo, mayormente en el día 1 de aplicación del tratamiento.

Hayashi et al., (2001) establecen que debido a que la proteína C reactiva es activada en el daño tisular, cualquier cirugía que se le haga al paciente va a provocar lesión en tejidos y de esta manera un incremento en los niveles séricos de la PCR, evidenciados en la gastrostomía percutánea y en fractura de miembro anterior, cirugías hechas en pacientes de estudio. Igualmente Kjelgaard-Hansen et al.,

(2013)

aclara

que

en

procesos

de

vasectomía

en

machos

y

ovariohisterectomía en hembras, la PCR incrementa sus niveles acorde a la extensión del daño a los tejidos. Saavedra et al., (2009) mediante un estudio realizado para medir los niveles de la PCR en procesos de ovariohisterectomía, notificaron que los rangos normales, según su laboratorio, fueron de 2,36 a 3,44 mg/dl, niveles que se incrementaron posterior a la cirugía (26,08 – 29.03 mg/dl) y que fueron disminuyendo a medida que se iba reduciendo la inflamación, llegando a valores de 10,43 – 11,74 mg/dl para el día 7 postquirúrgico.

Wakshlag et al., (2011) afirman que en perros con sobrepeso se evidencia inflamación crónica sistémica por el aumento de la cantidad de adipocitos.

Además, German et al., (2009) observan que en la pérdida de peso de animales obesos disminuyen los niveles del TNF-α y por ende, disminuyen las concentraciones séricas de la proteína C reactiva. Al respecto, Tvarijonaviciute (2011) concluye que la concentración de la PCR no presenta cambio significativos entre caninos obesos y no obesos.

10

Otabe et al., (2000) manifiestan que las lesiones en las mucosas de las vísceras también activan la producción de las proteínas de fase aguda, así como se observó en la inflamación inducida por lesión a la mucosa gástrica con fármacos irritantes, donde la PCR incrementó sus niveles séricos poco tiempo después de la administración del fármaco y disminuyó sus niveles a medida que la irritación desaparecía.

Hayashi et al., (2001) concluyen que a pesar de todas las implicaciones de la proteína C reactiva en diversas patologías, su concentración no tiene un incremento significativo en animales menores a un mes de edad ni en afecciones virales. Así mismo, Nakamura et al., (2008) afirma que la proteína C reactiva no se altera en afecciones neurológicas ni endocrinas y en comparación con el conteo de células sanguíneas blancas, la PCR tiene cierta ventaja al incrementarse previamente a los niveles de células sanguíneas blancas.

5.2 Marco teórico Inflamación La inflamación es la respuesta inmunológica que tiene el organismo por diferentes factores: traumatismos, lesiones químicas y habitualmente por la entrada de un microorganismo patógeno, los cuales producirán un daño tisular (García, 2008). La inflamación se encarga de identificar el agente patógeno por medio de las líneas de defensa del organismo para eliminarlo y reparar el daño tisular (Rojas, 2004).

El proceso inflamatorio es útil para la reparación de los tejidos, pero cuando dura más de una semana, se vuelve perjudicial para el organismo, ya que puede originar

una

lesión

tisular,

enfermedades

inmunomediadas (Rojas, 2004).

11

articulares

degenerativas

e

Componentes celulares de la respuesta inflamatoria Dentro de estos componentes se encuentran las células de la línea blanca, plaquetas, células endoteliales y células epiteliales (Toro, 2009). Las células centinelas se encuentran principalmente debajo de las superficies corporales, ya que allí, se concentra más la entrada de patógenos al organismo, pudiendo activar rápida y eficazmente la cascada de la inflamación (Tizard, 2009). Las células activas en los procesos de inflamación son: 

Polimorfonucleares neutrófilos (PMN)

Son la primera línea de defensa del organismo y los responsables de atacar los microorganismos extracelulares como virus y bacterias (Toro, 2009). Los neutrófilos llegan al lugar de afección a través de mediadores como la IL-1 y el TNF, que cumplen su función en el endotelio de los vasos periféricos activando las quimoquinas, que se ligarán a los receptores del neutrófilo (Rojas, 2004). Estos neutrófilos llegaran a la circulación por medio de movimientos activos inducidos por agentes quimiotácticos como la C5a (fragmento del componente C5 del sistema de complemento) y el Leucotrieno B4 (producto de la lipooxigenasa) (Roitt et al., 2008). Los neutrófilos mueren al entrar en contacto con el patógeno agresor, pero pueden causar daño tisular en procesos inflamatorios crónicos (Rojas, 2004). 

Basófilos

Son potentes células pro-inflamatorias caracterizadas por fagocitar virus. Los basófilos contienen gránulos citoplasmáticos que almacenan sustancias como la histamina, la serotonina y la heparina. Su activación genera productos del ácido araquidónico y sustancias mediadoras de la inflamación (Toro, 2009). 

Eosinófilos

Pertenecen al grupo de los granulocitos, producidos por la médula ósea y controlados por los linfocitos T, con la función de liberar proteínas, enzimas y

12

leucotrienos, principalmente en infecciones por parásitos o en procesos de hipersensibilidad tipo 1 mediados por IgG e IgE (García et al., 2000). 

Linfocitos

Son los encargados de la inmunidad específica contra antígenos a través de la producción de sustancias generadas de sus tipos de células (Rojas, 2004). Los linfocitos Th1 se encargan de la producción de citoquinas pro-inflamatorias, las cuales modulan la producción de las demás células, principalmente fagocitos mononucleares, que están implicadas en el proceso inflamatorio mientras que los linfocitos Th2 se encargan de la producción de eosinófilos (Toro, 2009). Así mismo, los linfocitos B se encargan de la producción de anticuerpos capaces de activar el sistema de complemento, promover la fagocitosis, y activar mastocitos, eosinófilos y basófilos al entrar en contacto con el patógeno afectante (Rojas, 2004). 

Macrófagos

Los macrófagos son la segunda línea de defensa del organismo, tienen una gran actividad fagocitaria que está implicada en los procesos de reparación de daño tisular al eliminar células muertas o rotas (Tizard, 2009). Así mismo, estimula la producción de PMN a partir de la médula ósea, prostaglandinas y factores del complemento (Rojas, 2004). Su estadío inmaduro se denomina monocito, el cual circula en la sangre, y madura al momento de entrar en los tejidos, convirtiéndose en un macrófago que recibirá un nombre distinto en cada órgano en el que se encuentre (Tizard, 2009). 

Mastocitos

Se localizan en los vasos sanguíneos de la piel y de las mucosas del intestino y las vías respiratorias, difiriendo en su estructura y composición química, regulando el flujo sanguíneo y la migración celular (Tizard, 2009). Los mastocitos confinan moléculas inflamatorias como la IgE, histamina, serotonina, PAF y TNF- α (Toro,

13

2009). Los mastocitos pueden ser activados mediante mecanismos endógenos como exógenos, tales como citoquinas, quimioquinas, agentes químicos, estímulos físicos, péptidos, bacterias, virus y cambios en la temperatura corporal (Tizard, 2009). 

Plaquetas

Tienen funciones en el proceso de coagulación y también funciones proinflamatorias por la producción del factor activador de plaquetas, el cual ayuda en la adherencia de los neutrófilos al endotelio vascular (Rojas, 2004). 

Células endoteliales

Responden a la lesión del endotelio permitiendo la salida de proteínas y de células al sitio de la agresión, produciendo Prostaglandina I2, PAF (Factor Activador de Plaquetas) y óxido nítrico, incrementando la producción de selectinas e integrinas para permitir la movilización de los PMN hacia los tejidos (Rojas, 2004). Las células endoteliales se pueden activar por diversos factores como: la C5a, trombina y citocinas pro-inflamatorias, y así, promover la adhesión y migración de los leucocitos, activar el sistema de coagulación, inducir la vasodilatación y estimular la producción de leucocitos (Toro, 2009).

El hígado cumple una función importante en el proceso inflamatorio, ésta es el aumento de la producción de las proteínas de fase aguda, las cuales disminuyen sus concentraciones cuando la causa desaparece, siendo la más importante en infecciones por patógenos, la Proteína C Reactiva (Saavedra et al., 2009).

Proteína C Reactiva Esta proteína fue llamada así porque se une a la proteína C de los neumococos, siendo descrita por primera vez en 1930 por Tillet y Francis, quienes reportaron una reacción de precipitación que podía ser demostrada en el suero de pacientes que padecían neumonía lobar por cepas de neumococos (Garibay, 2006).

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Posteriormente se comprobó que la reacción resultaba positiva no sólo en los casos de infección por neumococo, sino también, en presencia de procesos infecciosos, traumáticos y post-quirúrgicos; en 1941 se demostró que sus concentraciones guardaban paralelismo con el curso de la enfermedad (Divo et al., 1990).

La PCR es la proteína de fase aguda más importante en primates, conejos, hámsters, cerdos y perros, descrita como una pentraxina (Tizard, 2009); por lo que tiene una estructura pentamérica con subunidades de 118 kD (kiloDalton) empalmadas en forma no covalente (Alvarado, 2003); con dos caras, una de las cuales se une a la fosfocolina, una cadena lateral presente en todas las membranas celulares, en muchas bacterias y protozoos, la otra cara es responsable de las uniones a los neutrófilos, a través de los receptores de anticuerpos FcɣRI y FcɣRIIa, y al componente C1q del sistema del complemento, de esta manera, la PCR promueve la fagocitosis y elimina las células muertas o deterioradas, así como los microorganismos (Tizard, 2009).

Está compuesta de cinco unidades idénticas de polipéptidos no glicolisados, cada una contiene 206 residuos de aminoácidos, arregladas como una formación plana y simétrica (Abbas et al., 1995). Esta estructura le permite sufrir cambios en su conformación espacial al entrar en contacto con el calcio iónico y su producción es disparada por la prostaglandina E1, apareciendo así, una especie de hendidura en la estructura plana de la proteína, lo que cumple un papel muy importante en la respuesta inmune (Abbas et al., 1995).

La PCR es una sustancia presente en la sangre, que el hígado produce cuando hay una infección o una inflamación (Rubin, 2007). Es producida por los hepatocitos, apareciendo en animales homeotermos 18-24 horas después de iniciado un proceso infeccioso o de la destrucción tisular (Baltz et al., 2006). La síntesis de la PCR es modulada por varias citocinas, dentro de las cuales se

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encuentran: Interleucina-1, IL-6, IL-8 y el factor de necrosis tumoral (Gomella et al., 2009).

La Proteína C Reactiva incrementa sus valores en enfermedades inflamatorias, necrosis tisular en general por isquemia o infarto (miocardio), tumores malignos, rechazo de trasplante de órganos o de medula ósea, traumatismos, fracturas o quemaduras y en infecciones particularmente las bacterianas (Ridker et al., 1997).

Después del inicio de la inflamación, la síntesis de Proteína C Reactiva aumenta dentro de las 4-6 horas, se duplica cada 8 horas, y alcanza un pico alrededor de las 36-50 horas, manteniéndose los niveles elevados si el cuadro de inflamación continúa, pero cuando remite, declinan con rapidez debido a una vida media corta de 4 a 7 horas (Gomella et al., 2009).

La vida media de la PCR en plasma es aproximadamente de 19 horas y es constante bajo todas las condiciones de salud y enfermedad (Clyne y Olshaker, 1999).

La determinación de la PCR se efectúa mediante diversas técnicas, entre las cuales se encuentra una reacción de aglutinación, técnica desarrollada por Senger, en donde moléculas de látex (inertes) se sensibilizan con anticuerpos antiPCR, obtenidos de animales de experimentación inmunizados con dicha proteína, siendo así, que las PCR presente en el suero del paciente sirve como antígeno, y cuando se mezcla con el látex se produce una reacción de aglutinación, visible macroscópicamente (Garibay, 2006).

5.3 Marco geográfico y climático El estudio se realizó en la ciudad de Tunja (Boyacá), cuya extensión territorial es de 121,4 km², de los cuales el 87% corresponde a área rural y el 13% a área urbana. Está ubicada en las coordenadas 5°32′7″N 73°22′04″O. La altura promedio es de 2820 msnm (Gamma, 2005).

16

En esta ciudad, el estudio se realizó en la Clínica Veterinaria Zoomedica, ubicada en la Transversal 11 # 23-54, en la cual se prestan los servicios de: consulta, consulta especializada, cirugía, RX, ecografía, hospitalización, urgencias, guardería, pet shop y peluquería.

5.4 Marco legal Así como los seres humanos, los animales también tienen derechos, los cuales se deben preservar y respetar. En Colombia existe la ley 84 de 1989, la cual aclara que en casos de experimentación e investigación que involucre el uso de animales, sean silvestres o domésticos, el estudio deberá ser supervisado por un comité de ética, el cual se encargará de velar por el bienestar animal en cuanto a la exposición al dolor que puede ser sometido (Arcken, 2010).

Así mismo, en la misma ley se establece que todo tipo de animal deberá tener buenas condiciones de higiene y sanidad para su existencia y que las personas a cargo de la investigación se abstendrán de causar cualquier tipo de daño o lesión al animal objeto de estudio. De esta manera, las personas están en la obligación de denunciar cualquier acto de maltrato animal y llegado el caso de que los investigadores violen esta ley, quedaran a disposición de las autoridades competentes.

17

6. METODOLOGÍA 6.1 TIPO DE ESTUDIO Este estudio es de tipo descriptivo ya que se busca identificar la concentración de la PCR en caninos clínicamente sanos; es de corte transversal porque no se abordaron las variaciones temporales de la concentración de la proteína pero sí entre individuos con diferentes características; además el estudio tiene un componente comparativo de los niveles de la PCR entre los caninos clínicamente sanos agrupados por raza, género y edad, para identificar el posible efecto de éstos factores en el comportamiento de la variable. Se realizaron comparaciones con publicaciones sobre el tema y los datos recopilados fueron incorporados en un meta-análisis que permite identificar el efecto de los factores mencionados sobre la concentración de la PCR. 6.2 DISEÑO EXPERIMENTAL Se realizó un muestreo aleatorio de los caninos haciendo selección por conveniencia para lograr la representación de diferentes factores en la muestra (raza, edad y género) y considerando un conjunto de criterios de exclusión: -

Razas medianas, grandes y gigantes (>15 Kg)

-

Perros <1 año y >7 años

-

Perros con tratamiento farmacológico o cirugías en los últimos dos meses

-

Individuos con neoplasias

-

Presentación de enfermedad dermatológica

-

Antecedentes de enfermedad crónica pre-existente

-

Presentación de afecciones gastro-intestinales

-

Trauma reciente

18

Factores Raza: en la muestra de este estudio se representaron en forma homogénea cuatro razas pequeñas: French Poodle (12 individuos), Schnauzer (12 individuos), Cocker Spaniel (11 individuos) y Shitzu (11 individuos).

Género: en el grupo de individuos de cada raza fueron representados machos y hembras en forma equitativa (5M y 6H o 6M y 5H).

Edad: se registró la edad aproximada en años de cada individuo incluido en la muestra para posteriormente explorar la posible influencia de éste factor en la concentración de PCR. 6.3

MATERIALES

Y

MÉTODOS

DE

INVESTIGACIÓN.

PROCESO

Y

PROCEDIMIENTOS APLICADOS 6.3.1 Procedimiento aplicado Teniendo el consentimiento informado por parte de los propietarios de los perros que llegaron al servicio de belleza y peluquería a la Clínica Veterinaria Zoomédica, se realizó el examen físico, clínico y la toma de la muestra de sangre procedente de la vena yugular o de la vena cefálica antebraquial, según la facilidad del manejo del paciente, con jeringa de 10 ml y aguja de 21 ½”, para extraer 8 ml de sangre, de los cuales se colocaron los otros 4 ml de sangre en un tubo tapa lila (recubiertos con EDTA) para posterior procesamiento por diferencial manual con tinción de Wright, el cual es un tipo de tinción Romanowsky, que según Muñoz y Morón en el 2005, se realiza a partir de un frotis sanguíneo dejándolo secar entre 15 y 20 minutos para posteriormente cubrirlo con el colorante de Wright. Se añadió solución amortiguada tamponada en partes iguales hasta obtener un brillo metálico, dejando 6 minutos adicionales. Finalmente se lavó con agua corriente y se dejó secar para observarlo al microscopio. Este procedimiento se realizó en el laboratorio Microzoo (Tunja, Boyacá), donde se determinó el conteo de células blancas cada muestra por aparte. Los caninos que no tuvieran alguna alteración

19

en el leucograma o que tuvieran alteraciones leves, se procedía a realizarles el análisis de la PCR. Se colocaron los 4 ml de sangre restante en tubos tapa roja para posterior procesamiento por el método de inmunoturbidimetría con látex, el cual según Grange et al., (1977) y Otsuji et al., (1982), se utiliza el reactivo A (tampón tris 20 mmol/L, azida sódica 0,95 g/L, sodio cloruro 150 mmol/L, pH 8,2), el reactivo B (suspensión de partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos anti-PCR humana, azida sódica 0,95 g/L) y el patrón de PCR de suero canino. El reactivo de trabajo se preparó vaciando el contenido de un vial de reactivo B en un frasco de reactivo A, homogeneizándolo suavemente. Se precalentó el reactivo de trabajo con el analizador a 37°C, se ajustó el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. Se pipeteó en una cubeta 1 ml del reactivo de trabajo y 5 µl de la muestra de sangre para colocarlo en el espectrofotómetro. Se leyó la absorbancia a 540 nm a los 10 segundos y a los 2 minutos. Se utilizó la máquina Analyzer A15 de BioSystems para determinar los niveles de la Proteína C Reactiva en el suero sanguíneo; este procedimiento se realizó en el laboratorio Meditest (Tunja, Boyacá).

6.3.2 Revisión sistemática y meta-análisis: Las revisiones sistemáticas y el meta-análisis han surgido de la necesidad de recopilar, sintetizar y valorar la información médica, tratando de encontrar la mejor evidencia científica ante un fenómeno concreto y, al mismo tiempo, presentando esta evidencia en forma clara, sintética, de fácil comprensión y discutida en el marco del conocimiento sobre el tema.

En las fuentes de información revisadas sobre investigaciones que consideran las concentraciones de PCR para analizar diversos procesos, se han incluido individuos con diferentes características y patologías. Factores como el género, edad, raza, peso, entre otros, no han sido considerados en el análisis de la variabilidad detectada, y en otros casos, donde sí se analiza la relación, se reporta independencia entre los factores mencionados y la concentración de PCR.

20

En este estudio se buscó utilizar las herramientas de revisión sistemática y metaanálisis para identificar claramente rangos de la proteína asociados a condiciones clínicas específicas y, para evaluar la posible asociación entre el género, la raza y la edad sobre las concentraciones de PCR. Estos dos aspectos fortalecieron la contribución del trabajo como referencia para el uso e interpretación clínica de las concentraciones de PCR. La búsqueda de la información se hizo en bases de datos físicas y disponibles en línea como: Scielo, ProQuest, Science, Doaj, OARE, Highwire Press, Agbios, Citebase, Medicina y Ciencias de la Vida, BULB, CINDOC, ERIC, Google Book Search, Highwire, Internet Invisible y Pub Med. Criterios de Selección de las Publicaciones -

Estudios que analicen la concentración sérica de la proteína C reactiva en caninos. La PCR es la proteína de fase aguda más importante en primates, conejos, hámsters, cerdos y perros. Las funciones de la PCR difieren según las especies y esto determina la interpretación de sus concentraciones (Tizard, 2009). Según el objetivo de éste trabajo y la aplicación esperada de los resultados sólo se consideraron los estudios específicos en caninos.

-

Estudios que describan las características y tamaño de la muestra. Es necesario identificar en el texto la condición clínica de los individuos considerados en cada estudio para poder discriminar y asociar un determinado estado de salud a concentraciones de PCR específicas.

Estudios que no especificaban el tamaño muestral y características de los animales como raza, edad y género fueron excluidos del análisis.

-

Estudios que indiquen la técnica utilizada para medir la concentración de la PCR. La sensibilidad de la técnica utilizada para medir la concentración de esta proteína influye sobre los valores mínimos y máximos que puede

21

detectar. Si el estudio no indicaba la técnica empleada para la medición era excluido del análisis.

Análisis de datos en el Meta-análisis Considerando que la concentración de la PCR es una variable continua, se utilizaron herramientas de estadística descriptiva como media, mediana, moda, coeficiente de variación, desviación estándar y varianza para identificar tendencias generales en los estudios. Las comparaciones entre trabajos o entre grupos de datos asociados a un factor, se realizó con pruebas de diferencia de medias como t-Student o ANOVA, una vez verificados los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas, o haciendo las transformaciones requeridas para el ajuste. Los factores considerados para agrupar los datos obtenidos sobre la variable son: raza, género, edad y tipo de patología: infecciosa, neoplásica o metabólica.

Para

identificar

la

posible

asociación

entre

patologías

específicas

y

concentraciones séricas de PCR, los datos extraídos de publicaciones se clasificaron según el tipo de enfermedad estudiada en cuatro grupos: 1. Neoplasias: Tumor mamario benigno y maligno, hemangiosarcoma, adenocarcinoma nasal, carcinoma colangio-celular, leucemia linfoblastica, histiocitosis

maligna,

linfoma,

mesotelioma

maligno,

síndrome

mielodisplasico, adenocarcinoma intersticial.

2. Infecciosas: Pancretitis aguda, leishmania, erliquiosis, piómetra, poliartritis idiopática, anemia hemolítica inmune, broncopneumonia, demodicosis, hepatitis crónica, trombocitopenia inmunomediada, dirofilaria.

3. Metabólicas y Endocrinas: obesidad, encefalopatía hepática por shunt portosistemico, hiperplasia endometrial quística, mucometra.

4. Traumáticas: inducidas por cirugía como gastrotomía, OVH; fracturas, osteoartritis por ruptura de ligamento cruzado.

22

6.4 UNIVERSO, POBLACIÓN, MUESTRA Y UNIDADES EXPERIMENTALES Para la determinación del tamaño de la muestra se utilizó la fórmula para la estimación de la media en una población finita:

Donde N es el tamaño de la población, zα es el valor del estadístico en la distribución normal, s2 es la varianza estimada de la variable en la población y d es la precisión deseada en la medición de la variable. A continuación se describe el procedimiento para la obtención de cada uno de los valores involucrados en la ecuación anterior.

-

Tamaño de la Población (N): se considera que el universo poblacional de este estudio son los caninos con propietario de la ciudad de Tunja, ya que todos ellos tienen probabilidad de asistir a la clínica veterinaria Zoomedica y ser parte de la muestra. El tamaño de la población canina se obtuvo a partir de la revisión del Censo de Caninos de la Zona Urbana del Municipio de Tunja, que realizó la Secretaría de Protección Social a Julio del 2014 como parte del Sistema de Gestión Integral para Salud Pública (SIGESAP). El documento revela que en las 26000 familias caracterizadas se encuentra un total de 20291 caninos.

-

Varianza estimada de la variable en la Población (s 2): como no se dispone de un estudio directo sobre la concentración de ésta proteína en pacientes caninos clínicamente sanos, la varianza esperada se estimó a partir de un conjunto de datos extraídos de publicaciones que reportan pacientes “normales”, “control” o “pre-tratamiento” (Otabe et al., 2000; Saavedra et al., 2009; Tvarijonaviciute et al., 2011). Se obtuvo un conjunto de 37 datos con concentraciones de PCR entre 1,45 y 17,6 mg/L, un

23

promedio de 5,69 mg/L y desviación estándar (s) de 5,16. La varianza esperada (s2) es entonces de 26,63.

-

Precisión en la estimación de la media: se quería conocer la concentración promedio de PCR en caninos clínicamente sanos usando la técnica de inmunoturbidimetría con látex. Ésta técnica tiene un límite inferior de detección de 1 mg/L y se hicieron estimaciones de ±2mg/L.

-

Estadístico z de distribución normal: su valor está asociado al nivel de confianza deseado en la estimación de la media, suponiendo una distribución normal de la variable. Para este estudio se establece un nivel de confianza del 99% y según la distribución normal el valor del estadístico z es de 2,58.

Al remplazar los valores de cada término en la ecuación anterior se obtiene un tamaño de muestra de 44,22≈44 caninos.

Las unidades experimentales son los caninos.

6.5 DEFINICIÓN Y OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES Y LOS INDICADORES La variable dependiente de interés en este estudio es la concentración sérica de proteína C reactiva en pacientes caninos clínicamente sanos de razas pequeñas entre 1 y 7 años de edad. Esta es una variable cuantitativa continua.

Los factores o variables independientes que se consideraron son el género, la raza y la edad. En la literatura revisada, la concentración de PCR parece ser independiente de estos factores; sin embargo, para el presente estudio se consideró importante identificar o descartar su influencia, ya que esto determina en parte la confiabilidad del valor o rango de referencia a reportar en pacientes clínicamente sanos.

24

6.6 TRATAMIENTO - PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN El análisis de la relación variable-factor se realizó por dos vías: la evidencia directa en el grupo de pacientes clínicamente sanos considerados en la muestra y los datos extraídos de una revisión sistemática de publicaciones sobre el tema y meta-análisis.

El análisis de los datos sobre la concentración de PCR en los caninos incluidos en la muestra se realizó utilizando técnicas de estadística descriptiva que permitían identificar la concentración promedio, el rango, el intervalo de confianza, la desviación estándar y la varianza. Los análisis descriptivos se realizaron para cada grupo de edad, raza y género. Las comparaciones entre grupos de cada factor se realizaron utilizando la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis y la prueba pareada posterior de Mann Whitney. La alternativa no paramétrica fue utilizada porque en todos los casos considerados se encontró heterocedasticidad y distribución asimétrica de los datos.

Además de análisis univariado que considera la concentración de PCR, se realizó un análisis multivariado que incorporó los parámetros del leucograma: leucocitos, neutrófilos segmentados, eosinófilos, linfocitos y monocitos. Las técnicas mltivariadas utilizadas incluyeron análisis de similitud cuantitativa (índice BrayCurtis), escalamiento multidimensional y análisis de coordenadas principales.

6.7 HIPÓTESIS 6.7.1 Hipótesis alterna Las concentraciones séricas de la PCR no son independientes de los factores raza, género y edad.

6.7.2 Hipótesis nula Las concentraciones séricas de la PCR son independientes de los factores raza, género y edad.

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7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 7.1 Resultados Como se planteó en el diseño metodológico, la muestra era de 44 caninos pero se lograron analizar 46 distribuidos casi equitativamente en cuatro razas pequeñas: Cocker Spaniel, French Poodle, Schnauzer y Shitzu, y en la cual se encuentran representados machos y hembras (Tabla 1) con edades entre uno y seis años (Tabla 2).

Tabla 1. Individuos por raza y género seleccionados para el estudio Etiquetas de fila

Hembra Macho

Total general

Cocker Spaniel

5

6

11

French Poodle

6

6

12

Schnauzer

7

5

12

Shitzu

6

5

11

Total general

24

22

46

Tabla 2. Individuos por género y edad (meses) seleccionados para el estudio Hembra Etiquetas de fila

Macho

Total

Mín. de Máx. de Mín. de Máx. de Mín. de Máx. de Promedio EDAD

EDAD

EDAD

EDAD

EDAD

EDAD

EDAD

Cocker Spaniel

12

36

12

72

12

72

25,45

French Poodle

36

72

13

60

13

72

39,6

Schnauzer

13

60

24

60

13

60

30,25

Shitzu

24

54

12

48

12

54

34,9

Total general

12

72

12

72

12

72

32,67

26

La selección de los individuos y la recolección de las muestras se realizaron durante un periodo de cuatro semanas, durante las cuales se examinaron 86 caninos que llegaron a recibir el servicio de belleza y peluquería en la clínica Zoomedica. Se le explicó a cada uno de los propietarios el objetivo del estudio y los procedimientos a practicar en cada mascota a ser incluida; una vez comprendida la finalidad y métodos del estudio, los propietarios firmaron un consentimiento informado, en el cual daban la autorización para la toma de una muestra de sangre con el fin de realizar los exámenes de leucograma y PCR (Anexo 1).

Una vez obtenido el consentimiento, se llenó un formato de historia clínica donde los propietarios aportaron información sobre las enfermedades que habían tenido sus mascotas anteriormente, los medicamentos que les administraron con su respectiva dosis, intervalo y duración, y el estado reproductivo en el que se encuentra la mascota: para las hembras, se les preguntó si estaban enteras o esterilizadas, la fecha del último celo y de ser el caso, cuántos partos habían tenido; para los machos se preguntó si estaban enteros o castrados (Anexo 2). Así mismo, se indagó sobre el estado de vacunas, desparasitación y el tipo de alimentación cotidiana.

De acuerdo a los criterios de exclusión indicados en el diseño metodológico, se revisó la historia clínica y el paciente fue descartado en caso de presentar alguna enfermedad crónica en curso, una infección bacteriana, viral, micótica, parasitaria, neoplasia, afección endocrina, neurológica, entre otras, o si había presentado algún trauma (arañazo, mordedura, fractura, caídas fuertes) o cirugía reciente (2 meses antes del estudio).

Las mascotas que no presentaron alteraciones relevantes en la anamnesis fueron sometidas a un examen clínico general, el cual tenía en cuenta la actitud, temperamento, peso, apetito, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria,

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temperatura, tiempo de llenado capilar, estado de las mucosas, de la orina y las heces (Imagen 1 y 2).

Imagen 1. Frecuencia cardiaca

Imagen 2. Toma de temperatura

Fuente: López, 2014

Fuente: López, 2014

Siguiente al examen clínico, se realizó el examen físico general, el cual incluía la revisión de ojos, oídos, nariz, cavidad oral, ganglios linfáticos, tegumento, genitales, sistemas respiratorio, digestivo, locomotor, nervioso y urinario (Imagen 3, 4, 5 y 6). La mascota que presentara cualquier tipo de afección evidente en el examen físico, como presencia de garrapatas, zonas de alopecia, otitis, gingivitis, sarro dental excesivo, cojeras, abdomen en tabla, dolor en la palpación de la columna vertebral, entre otras, se descartaba del estudio (Anexo 3).

Imagen 3. Examen cavidad oral

Imagen 4. Examen ganglios linfáticos

Fuente: López, 2014

Fuente: López, 2014

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Imagen 5. Examen de oídos

Imagen 6. Palpación abdominal

Fuente: López, 2014

Fuente: López, 2014

Aquellos caninos que no tenían alteración alguna en los exámenes clínico y físico, se les tomó una muestra de sangre (Imagen 7) recolectada en un tubo tapa lila que fue transportado al laboratorio clínico veterinario Microzoo, para la realización del Leucograma con el fin de evaluar el estado inmunológico de cada paciente, y en un tubo tapa roja que fue transportada al laboratorio clínico Meditest, donde fue centrifugada para separar el plasma del suero (Imagen 8). Con el suero obtenido de cada muestra, se procedió a almacenarla a 2°C mientras los resultados del leucograma eran entregados por el laboratorio.

Imagen 7. Toma de la muestra de sangre

Imagen 8. Almacenamiento de sangre en tubos

Fuente: López, 2014

Fuente: López, 2014

29

Una vez recibido el resultado del Leucograma se descartaron aquellos perros que tuvieran alteraciones celulares de grado moderado o mayor. Las muestras para PCR de los perros descartados fueron desechadas por el laboratorio clínico Meditest.

En total se descartaron del estudio 42 caninos: 22 caninos por enfermedades concurrentes en piel y sistema digestivo, pacientes con administración de medicamentos y cirugía reciente; 14 caninos por alteraciones en el examen físico debido a temperatura alta, dolor a la palpación abdominal, masa inguinal, obesidad, sarro dental, anorexia, infección ocular, presencia de garrapatas, ganglios linfáticos reactivos y presencia de celo en las hembras; y 6 caninos por alteraciones en el leucograma debido a linfocitosis alta, leucocitosis-linfocitosiseosinofilia y leucocitosis-linfocitosis.

Los pacientes que tuvieron alteración leve en un tipo de célula blanca y aquellos que no tuvieron ningún tipo de alteración en el leucograma, siguieron haciendo parte del estudio y se les realizó el análisis de la PCR. Al comparar por grupos de raza, se observó que los caninos incluidos tuvieron homogeneidad en el recuento de leucocitos (figura 1), así como en los diferentes tipos de células blancas como lo son: los neutrófilos segmentados (figura 2) y monocitos (figura 3); sin embargo, se admitieron pacientes que presentaran en el leucograma cualquier grado de eosinofilia (leve, moderado, alto y severo) (figura 4), ya que los eosinófilos se alteran en procesos parasitarios y alérgicos principalmente (Bush, 1982), y por ende no afectan la concentración sérica de la PCR; también se incluyeron pacientes que tuvieran solamente un grado leve de linfocitosis sin alteración en neutrófilos (figura 5), ya que a pesar de que la neutrofilia no es un signo patognomónico de infección e inflamación, se evidencia alteración en el número de neutrófilos circulantes durante la presentación de estos procesos (López, 2008), situación que no se evidenció en ningún individuo incluido en el estudio.

30

Número de células x103 /mcl

20,000 15,000 10,000 5,000 0,000 Cocker Spaniel

French Poodle

Schnauzer

Shitzu

RAZA Mín. de LEUCOCITOS2

Máx. de LEUCOCITOS

Promedio de LEUCOCITOS

Figura 1. Recuento de leucocitos de individuos incluidos en el estudio

Número de células x109/L

Valor de referencia (7 - 14 x103/mcl) 12 10 8 6 4

2 0 Cocker Spaniel French Poodle

Schnauzer

Shitzu

RAZA Mín. de NEUTROFILOS SEGMENTADOS Máx. de NEUTROFILOS SEGMENTADOS

Promedio de NEUTROFILOS SEGMENTADOS

Figura 2. Recuento de neutrófilos segmentados de individuos incluidos en el estudio Valor de referencia (3,5 – 11 x109/L)

31

Número de células x109/L

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Cocker Spaniel French Poodle

Schnauzer

Shitzu

RAZA Mín. de MONOCITOS

Máx. de MONOCITOS

Promedio de MONOCITOS

Figura 3. Recuento de monocitos de individuos incluidos en el estudio Valor de referencia (0,1 – 1,4 x109/L)

Número de células x109/L

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Cocker Spaniel French Poodle

Schnauzer

Shitzu

RAZA Mín. de EOSINOFILOS

Máx. de EOSINOFILOS

Promedio de EOSINOFILOS

Figura 4. Recuento de eosinófilos de individuos incluidos en el estudio Valor de referencia (0,1 – 0,9 x109/L)

32

Número de células x109/L

7 6 5 4 3 2 1 0 Cocker Spaniel French Poodle

Schnauzer

Shitzu

RAZA Mín. de LINFOCITOS

Máx. de LINFOCITOS

Promedio de LINFOCITOS

Figura 5. Recuento de linfocitos de individuos incluidos en el estudio Valor de referencia (1,0 – 4,9 x109/L) Seleccionados los caninos que ingresarían en el estudio, se realizó el análisis de la PCR por el método de inmunoturbidimetría. Para los 46 caninos incluidos en el estudio se evidenció que el valor de la concentración sérica de la PCR está en un rango entre 0,7 y 20,95 mg/L, con un promedio de 4,53 mg/L y desviación estándar de 4,76 mg/L. Los valores máximos y mínimos, el rango, el promedio y la desviación estándar presentaron variaciones entre las diferentes razas incluidas (tabla 3). El rango de los valores de la PCR para cada una de las razas es el resultado de la diferencia entre los valores máximos y mínimos de concentración de la proteína (Figura 6), y es más amplio en las razas Cocker Spaniel y Shitzu que presentan además la mayor varianza y desviación estándar; se considera que la concentración promedio es más representativa del grupo en las razas French Poodle y Schnauzer ya que tienen rango y desviación estándar menores.

33

Tabla 3. Estadística descriptiva para la concentración de la PCR para grupos de raza Raza

COCKER

FRENCH

SCHNAUZER

SHITZU

Parámetro

SPANIEL

POODLE

5,39

2,84

3,0

7,19

5,95

1,73

1,77

6,73

Varianza

35,39

2,99

3,14

45,30

Rango

19,09

5,66

5,75

19,55

Mínimo

1,21

0,7

1,15

1,4

Máximo

20,3

6,36

6,9

20,95

Media Desviación Estándar

Concentración de PCR en mg/L

25 20 15 10 5 0 Cocker Spaniel French Poodle

Schnauzer

Shitzu

RAZA Mín. de PCR

Máx. de PCR

Promedio de PCR

Figura 6. Concentración de PCR de individuos por raza incluidos en el estudio A través del diagrama de caja se puede representar la simetría de la distribución de los valores de la PCR teniendo en cuenta el valor mínimo, máximo y de la

34

mediana para cada raza. Para considerar simétrica una distribución, el valor de la mediana debe estar aproximadamente en la mitad del diagrama de caja; posiciones distintas indican un grado de asimetría hacia la derecha o izquierda de la distribución. En las razas incluidas en el estudio, solo hubo simetría en la distribución de los valores de la PCR para la raza french poodle, ya que el valor de la mediana se encontraba aproximadamente en la mitad del diagrama de caja, cuya magnitud representa la variabilidad dentro de cada grupo y muestra que individuos sanos de la misma raza pueden tener valores muy distintos de PCR en las razas Shitzu y Cocker Spaniel (figura 7).

Figura 7. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR en las razas incluidas en el estudio Así mismo, los valores máximos y mínimos (figura 8), el rango, el promedio y la desviación estándar de la PCR presentaron variaciones entre los grupos de edad de los caninos incluidos en el estudio (tabla 4). Debido a la variabilidad de la desviación estándar por diferencia de los rangos presentados en los grupos de

35

edad, el promedio solo es representativo en aquellos grupos donde hay valores bajos de desviación estándar.

Tabla 4. Estadística descriptiva de la concentración de PCR por grupos de edad Edad

1-1,5

2-2,5

3-3,5

4-4,5

5-5,5

Parámetro

años

años

años

años

años

5,13

6,70

3,49

4,41

2,41

1,51

4,36

8,08

2,84

3,67

1,81

0,71

Varianza

18,98

65,27

8,08

13,46

3,26

0,50

Rango

15,29

20,25

10,45

7,64

4,27

1,00

Mínimo

1,21

0,70

1,15

2,24

1,34

1,01

Máximo

16,50

20,95

11,60

9,88

5,61

2,01

Media Desviación estándar

6 años

Concentración de la PCR en mg/L

25 20 15 10 5 0 1-1,5 años 2-2,5 años 3-3,5 años 4-4,5 años 5-5,5 años

6 años

GRUPOS DE EDAD Mín. de PCR

Máx. de PCR

Promedio de PCR

Figura 8. Concentración de PCR de los individuos por grupos de edad incluidos en el estudio 36

Realizando el diagrama de caja para las concentraciones de la PCR agrupadas por edad, solo se evidenció simetría en la distribución de los valores de la PCR para individuos entre tres y tres años y medio. El resto de grupos por edad demostró asimetría en la distribución de los valores de la PCR (figura 9).

Figura 9. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR por grupos de edad de individuos incluidos en el estudio El análisis de varianza tradicional (ANOVA) exige el cumplimiento de dos supuestos o condiciones fundamentales: homogeneidad de varianzas y la distribución normal de los datos. Al observar los grupos de edad y raza (tabla 3 y 4), es evidente la heterogeneidad de varianzas que imposibilita la realización de un ANOVA para comparar el promedio de PCR por grupos. La comparación se hizo con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, la cual solo requiere que las muestras sean seleccionadas aleatoriamente, utilizando además comparaciones pareadas posteriores con una prueba de Mann-Whitney, por medio del software PAST versión 2.12 actualizado por Hammer y Harper en el 2011.

37

Realizando la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para los valores de PCR en las razas, se determinó el valor del estadístico H= 3,034 y el valor de p=0,3864.

Ya que el valor de p es mayor a 0,05 puede decirse con un 95% de confianza que no hay diferencias estadísticamente significativas en la concentración promedio de PCR entre las diferentes razas.

Haciendo uso de la prueba Mann-Whitney se hicieron comparaciones pareadas de los promedios entre las razas, donde los valores resultantes de p fueron mayores a 0,05 confirmando la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre pares específicos de razas (tabla 5).

Tabla 5. Valores de p obtenidos en la prueba de Mann-Whitney para comparaciones pareadas de PCR entre las razas. Valores menores a 0,05 indican diferencias significativas entre grupos

Razas

Cocker

French

Spaniel

Poodle

Cocker Spaniel

0,5588

French Poodle

Schnauzer

Shitzu

0,735

0,3246

0,8173

0,1316

Schnauzer

0,1661

Shitzu

Por medio de la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para los valores de PCR en los grupos de edad, se determinó el valor del estadístico H= 6,354 y valor de p=0,2733. Como el valor de p es mayor a 0,05 puede decirse con un 95% de confianza

que

no

hay

diferencias

estadísticamente

significativas

en

la

concentración promedio de PCR entre los diferentes grupos de edad.

Haciendo uso de la prueba Mann-Whitney se hicieron comparaciones pareadas de los promedios entre los grupos de edad, donde todos los valores resultantes de p

38

fueron mayores a 0,05 confirmando la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre grupos (tabla 6).

Tabla 6. Valores de p obtenidos en la prueba de Mann-Whitney para comparaciones pareadas de PCR entre los grupos de edad. Valores menores a 0,05 indican diferencias significativas entre grupos Grupos de

1 - 1,5

2 - 2,5

3 - 3,5

4 - 4,5

5 - 5,5

edad

años

años

años

años

años

0,9525

0,568

0,9601

0,09723

0,1175

0,9394

0,9358

0,1824

0,1949

0,7439

0,2124

0,0929

0,1113

0,1052

1 - 1,5 años 2 - 2,5 años 3 - 3,5 años 4 - 4,5 años 5 - 5,5 años

6 años

0,8465

6 años

Entre los grupos de género de los caninos incluidos en el estudio se presentaron variaciones en los valores máximos y mínimos, el rango, el promedio y la desviación estándar de la PCR. Se observa que las mayores concentraciones de PCR fueron obtenidas en las hembras caninas, sin embargo al comparar los valores promedio entre grupos, éstos no son muy distintos (tabla 7, figura 10).

39

Tabla 7. Estadística descriptiva para la concentración de la PCR para grupos de género Edad

HEMBRAS MACHOS

Parámetro Media

4,58

4,48

Desviación estándar

5,45

4,02

Varianza

29,73

16,15

Rango

19,94

15,80

Mínimo

1,01

0,70

Máximo

20,95

16,50

Concentración de la PCR en mg/L

25

20

15

10

5

0 Hembra

Macho GENERO

Mín. de PCR

Máx. de PCR

Promedio de PCR

Figura 10. Concentración de PCR de los individuos por género incluidos en el estudio

40

Por medio del diagrama de caja se observó que los valores de la concentración de la PCR tanto para machos como para hembras, tienen una distribución asimétrica respecto al valor de la mediana para cada grupo (figura 11).

Figura 11. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR por género de individuos incluidos en el estudio Al realizar la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para los valores de PCR entre machos y hembras, se determinó el valor del estadístico H= 0,09478 y valor de p= 0,7582. Como el valor de p es mayor a 0,05 puede decirse con un 95% de confianza

que

no

hay

diferencias

estadísticamente

significativas

en

la

concentración promedio de PCR entre el género de los individuos incluidos en el estudio.

Para considerar todas las variables hematológicas y serológicas en el análisis del grupo de pacientes, se utilizaron técnicas de estadística multivariada en el Software Primer 6. En primer lugar se hizo una transformación de los datos a raíz cuadrada para homogeneizar las magnitudes de los recuentos celulares y la concentración de PCR; posteriormente se construyó una matriz de similitud usando el índice cuantitativo de Bray-Curtis. La similitud en las variables entre los

41

46 caninos fue utilizada en un ordenamiento multidimensional visualizado en un plano de MDS. Éste plano permite la incorporación de variables de interés específicas y su magnitud en el diámetro de burbujas (Figura 12).

Figura 12. Plano de MDS que muestra la ordenación de los pacientes según su similitud en las variables hematológicas y serológicas consideradas (características de los pacientes en Anexo 4).

Hacia la izquierda del plano MDS se ubican los pacientes que presentaron los mayores valores séricos de PCR, y éstos corresponden en su mayoría a caninos de las razas Cocker Spaniel y Shitzu, donde se encontraron los mayores promedios en ésta variable: 5,39 y 7,19 mg/L respectivamente.

Sobre la matriz de datos transformados se ejecutó la rutina SIMPER (Similarity Percentage) para identificar las variables que explican la ordenación obtenida de los pacientes. El resultado del análisis muestra que la variable que explica un mayor porcentaje de la disimilitud entre los pacientes por grupos de edad es la concentración de PCR (excepto en la comparación entre 5 y 6 años), sin embargo

42

este porcentaje no es superior al 50% en ninguna de las comparaciones hechas entre grupos de edad (Tabla 8).

Tabla 8. Porcentaje de disimilitud entre los grupos de edad explicada por la concentración de PCR. *La variable que explica el mayor porcentaje de disimilitud es el recuento de neutrófilos segmentados GRUPO DE

1-1,5

2-2,5

3-3,5

4-4,5

5-5,5

EDAD

años

años

años

años

años

40,52

32,09

32,5

30,75

31,43

37,03

39,05

37,36

35,59

27,6

24,17

27,48

29,5

31,14

1-1,5 años 2-2,5 años 3-3,5 años 4-4,5 años 5-5,5 años

6 años

18,6*

6 años

Al realizar la comparación por razas, nuevamente la PCR es la variable que explica el mayor porcentaje de disimilitud entre los individuos de cada grupo pero siempre menor al 50% (Tabla 9).

43

Tabla 9. Porcentaje de disimilitud entre las razas de edad explicada por la concentración de PCR

RAZA

FRENCH

COCKER

POODLE

SPANIEL

FRENCH POODLE

34,62

COCKER SPANIEL

SCHNAUZER SHITZU

22,1

38,62

32,45

41,78

SCHNAUZER

36,83

SHITZU

La rutina SIMPER para los caninos agrupados por género indica que la concentración de PCR es la variable que mejor explica la disimilitud entre los dos grupos, pero sólo contribuye con un 37,37%. La disimilitud dentro de los grupos de machos y hembras es mejor explicada por el recuento de Leucocitos.

La interacción entre los factores raza, edad y género fue analizada con la rutina PERMANOVA de Primer 6. Éste análisis corresponde a un análisis de varianza multivariado con permutaciones y permite identificar el efecto individual y conjunto de los factores sobre la variación encontrada entre las muestras. El resultado indica que ni la edad (p=0,754), ni el género (p=0,456) ni la raza (p=0,308) tienen efectos

significativos

sobre

las

variables

hematológicas

y

serológicas

consideradas para el grupo de pacientes clínicamente sanos. La interacción de los tres factores tampoco tiene efecto significativo (p=0,921).

Para ver la agrupación de los pacientes según todas las variables hematológicas y serológicas consideradas, se realizó un análisis de coordenadas principales (PCO), el cual retuvo el 63,9% de la variación total en los dos primeros ejes (Figura 13). Los mayores valores de PCR se encontraron en algunos de los

44

pacientes con el mayor recuento de Linfocitos; sin embargo el recuento de linfocitos y de eosinófilos son variables que no están bien representadas en el plano del PCO. Las direcciones opuestas que siguen cada uno de los vectores que representan a las variables serológicas y hematológicas muestran la escasa correlación entre ellas.

Figura 13. Análisis de Coordenadas Principales (PCO) que muestra la distribución de los caninos según los valores obtenidos en cada variable serológica y hematológica descrita 7.2 Meta-análisis Se revisaron en total 66 artículos y 5 tesis (3 de pregrado, 2 doctorales) procedentes de las siguientes bases de datos: Scielo, ProQuest, Science, Doaj, OARE, Highwire Press, Agbios, Citebase, Medicina y Ciencias de la Vida, BULB, CINDOC, ERIC, Google Book Search, Highwire, Internet Invisible, Pub Med y

45

Research Gate. Los artículos y tesis se encontraron en español, inglés y portugués.

Se descartaron los artículos que no presentaran la técnica utilizada para la medición de la concentración de la PCR, datos numéricos de los resultados obtenidos, tamaño de la muestra, criterios para determinar la condición “clínicamente sana” o discusión de los resultados obtenidos.

Además de la búsqueda abierta se utilizó una metodología de búsqueda ascendente, la cual se refiere a la consulta de artículos que fueron citados en otros artículos. Algunos de los documentos se encuentran disponibles con acceso libre y en otros casos se solicitó el archivo original directamente al autor principal.

Los artículos incluidos en el meta-análisis consideran la determinación de la concentración de PCR con fines comparativos entre animales sanos y con alguna patología, en el seguimiento de procesos post-quirúrgicos y de tratamientos farmacológicos, evaluación de respuesta de la PCR frente a traumas o alteraciones

fisiológicas

inducidas,

identificación

de

valores

pronósticos

relacionados con riesgo de mortalidad, comparación entre técnicas cuantitativas y semi-cuantitativas para la medición de PCR y, en muchos casos, la determinación de un valor o rango de referencia característico de la condición “clínicamente sana”.

Existe un gran número de publicaciones que presentan resultados sobre la investigación en la concentración de PCR en caninos, y parte de la motivación de éstos estudios es el uso de la PCR como marcador de interpretación diagnóstica en procesos inflamatorios de diferente origen, y también orientados por el uso del perro como un modelo para la respuesta de fase aguda en humanos (KjelgaardHansen, 2004).

De los artículos y las tesis tenidas en cuenta para el meta-análisis, 15 artículos y 2 tesis reportan rangos de referencia para caninos clínicamente sanos (condición

46

determinada por anamnesis, examen físico, cuadro hematológico y bioquímica sanguínea completa) de diferentes razas, edades y pesos corporales, utilizando diversos métodos de detección de PCR como ELISA, inmunofluorometría, inmunoturbidimetría y aglutinación en látex. Así mismo, se reportan en algunos artículos el valor del promedio, la desviación estándar o la mediana de las concentraciones de la PCR (Tabla 10). Por medio de una gráfica de dispersión se compararon los rangos de referencia para las concentraciones séricas de PCR, determinado por diversas técnicas implementadas por los autores en cada estudio revisado, donde utilizaban un tamaño de muestra muy variado, encontrando en algunos casos resultados similares a los del presente trabajo (figura 14).

Tabla 10. Valores de Proteína C Reactiva para caninos clínicamente sanos determinados en los estudios revisados N

RANGO

DE

TÉCNICA

150

0,6-30

150

REFERENCIA

7,2

4,5

ELISA

Yamamoto et al., 1994

2,2-17,2

8,2

5,1

Látex

Yamamoto et al., 1994

70

1,5-16

7,9

3,4

ELISA

Kuribayashi et al., 2003

74

1,8-18,9

8,3

4

ELISA

Kuribayashi et al., 2003

59

0,4-15,9

0,41

0,34

Inmunoturbidimetría

10

9,0-31

19,84

8,19

ELISA

Fransson et al., 2007

20

-

2,77

0,45

ELISA

Merlo et al., 2007

6

-

3,33

0,88

Inmunoturbidimetría Ranganath y Senthil, 2007

6

-

4

2,03

Inmunoturbidimetría Ranganath y Senthil, 2007

15

0,6-8,8

2,72

0,7

ELISA

Veiga et al., 2008

30

0,5-8,8

5,6

1,98

ELISA

Medeiros et al., 2009

30

5-192

48

27,9

Látex

Medeiros et al., 2009

10

0,15-12

0,97a

-

ELISA

Tecles et al., 2009

10

2,2-4,4

3,37

0,68

Kjelgaard-Hansen et al., 2004

Inmunoturbidimetría Crossley et al., 2010

47

85

4,0-87

14

19

ELISA

Kenyon et al., 2011

6

6,3-45,5

15,8

1,04

ELISA

Lazarov et al., 2011

8

0,8-14

7,6

2,01

ELISA

Ulutas et al., 2011

20

0-18,2

4a

-

Inmunoturbidimetría Wong et al., 2011

41

0-10,7

0,1a

-

Inmunoturbidimetría Wong et al., 2011

5

-

5,3

0,8

ELISA

Seo et al., 2012

13

-

1,79

1,39

ELISA

Da˛browski et al., 2013

10

-

14,48

4,93

ELISA

Enginler et al., 2014

N: tamaño de la muestra.

promedio. DE: desviación estándar. a: valor de la

mediana

Figura 14. Gráfico de dispersión de los rangos “normales” establecidos en los diversos estudios revisados. La línea punteada representa el rango obtenido en el presente estudio (20,95 mg/L)

48

Es interesante observar que en modo independiente al tamaño de la muestra, la mayoría de los estudios encontrados, incluyendo el presente, reportan amplitudes de rango similares para la concentración de la proteína. Sin embargo, en el grupo de estudios con rangos superiores a 40 mg/L destaca el de Medeiros et al., (2009) que utilizó el mismo grupo de perros (n=30) para comparar el resultado obtenido con dos técnicas: ELISA y aglutinación en látex, obteniendo resultados muy contrastantes y llamando la atención sobre la técnica que se utilice en la detección.

Al respecto, y al revisar diferentes investigaciones, que con objetivos diversos han estimado la concentración de PCR en caninos, una de las primeras diferencias que sobresale es la técnica empleada para la medición de la proteína.

Medeiros et al. (2009) compararon las técnicas ELISA y de aglutinación en látex obteniendo correlación significativa entre los resultados obtenidos con cada una (R2=0,62). En ésta comparación es importante resaltar que si bien los valores se encuentran correlacionados, las escalas varían en forma drástica; al revisar los resultados presentados por los autores puede observarse que un valor de concentración de PCR de casi 200 mg/L obtenido con la técnica de aglutinación en látex corresponde a un valor de 7 mg/L usando ELISA. Es entonces importante que el médico veterinario que desee dar una interpretación clínica o diagnóstica a un determinado valor o rango de concentración de PCR, sea cuidadoso en la revisión de la técnica utilizada para determinar el valor que está usando como referencia.

Kjelgaard-Hansen (2004) comparó los resultados obtenidos entre ensayos realizados con la técnica de ELISA (Enzime linked inmunossorbent assay), y los coeficientes de variación (≈23%) indican un grado de imprecisión en la prueba que puede resultar inaceptable en análisis con fines diagnósticos, sin embargo la técnica permite diferenciar las concentraciones de la proteína en pacientes con diferentes patologías, así como en el monitoreo de cambios dinámicos que

49

suceden en pacientes sometidos al tratamiento de enfermedades. El mismo autor realizó una evaluación de control de calidad interno de la medición de PCR usando la técnica de inmunoturbidimetría (Kjelgaard-Hansen et al., 2004); los coeficientes de variación obtenidos fueron inferiores a los presentados en las comparaciones de múltiples ensayos usando ELISA, estableciendo a la inmunoturbidimetría como una técnica útil y confiable en estimaciones puntuales y monitoreos.

Plickert et al. (2011) realizaron una evaluación del desempeño de la inmunocromatografía de flujo lateral en la estimación de la concentración de PCR, tomando como referencia los resultados obtenidos usando ELISA. Los autores encontraron un 98,6% de concordancia entre las dos pruebas y resaltan las elevadas sensibilidad y especificidad de la inmunocromatografía. En éste caso es importante tener en cuenta que la inmunocromatrografía permite una estimación cualitativa de la concentración de PCR, indicando como positivas las concentraciones por encima de 5 mg/L; debe de considerarse entonces que la técnica no sería útil si se desea tomar un rango de referencia establecido con otra técnica y que además se encuentre en una escala continua.

Klenner et al. (2010) compararon tres ensayos inmunoturbidimétricos, usados comúnmente en humanos, para la determinación de la concentración de PCR en caninos sanos y con diferentes enfermedades. Además de comparaciones entre los ensayos basados en inmunoturbidimetría, los autores compararon cada ensayo con la técnica de ELISA evaluando la precisión de cada ensayo y su capacidad de discernir entre los pacientes sanos y los de cada grupo de patologías consideradas. Los resultados de la comparación entre técnicas inmunoturbidimétricas mostraron una elevada linealidad entre ensayos, así como similitud significativa con los resultados obtenidos por ELISA. Los coeficientes de variación de los ensayos inmunoturbidimétricos fueron mayores en las muestras de pacientes con neoplasias, enfermedades inflamatorias y otras, siendo más homogéneos los valores de PCR para los caninos clínicamente sanos. Éste

50

resultado es particularmente interesante si se considera que el grupo de pacientes sanos incluía 11 razas diferentes, entre grandes y pequeñas, y machos y hembras entre los cuales no se detectaron diferencias significativas en la concentración de PCR. Ésta homogeneidad permitió a los autores establecer límites superiores de referencia para el grupo de caninos sanos, indicando que la concentración de PCR máxima está entre 6,8 y 9,9 mg/L. Sin embargo, la variación presentada por las técnicas en los resultados para grupos con alguna enfermedad, dificulta el establecimiento confiable de límites superiores de referencia en la concentración de PCR. Con el objetivo de identificar la influencia de la técnica sobre los valores de PCR que hasta el momento algunos autores reportan como característicos de pacientes clínicamente sanos, se extrajeron los datos originales de aquellas publicaciones donde se encuentran disponibles y se compararon con los obtenidos en éste trabajo usando inmunoturbidimetría.

Se encontraron datos obtenidos con ELISA principalmente (5 artículos), inmunofluorometría (1 artículo) y se incorporaron al análisis los resultados de la inmunoturbidimetría aplicada en el presente estudio. Se hizo un análisis descriptivo de los datos por técnica y se construyeron los intervalos de confianza para la concentración promedio de PCR en cada grupo (Tabla 11).

51

Tabla 11. Estadística descriptiva e intervalos de confianza para la concentración de PCR en pacientes clínicamente sanos determinada con diferentes técnicas ELISA1-5 INMUNOFLUOROMETRÍA5 Número de datos

INMUNOTURBIDIMETRÍA6

52

14

46

Media

3,72

4,13

4,53

Mediana

2,21

3,09

2,54

4,44

2,24

4,77

19,74

5

22,74

2,61

1,30

2,23

Rango

23,60

6,98

20,25

Mínimo

0,10

1,87

0,70

Máximo

23,70

8,85

20,95

Límite inferior

4,96

5,42

5,95

Límite superior

2,49

2,83

3,12

Desviación estándar Varianza Coeficiente de asimetría

Intervalo de Confianza 95%

1 Kjelgaard-Hansen et al., 2 Bathen-Nothen, 2008; 3 Otabe et al., 2000; 4 Plickert et al., 2011; 5 Tvarijonaviciute et al., 2011; 6 Presente estudio Las medidas de dispersión (asimetría, desviación estándar, varianza y rango) fueron

mayores

en

los

grupos

de

datos

provenientes

de

ELISA

e

inmunoturbidimetría, lo cual puede explicarse parcialmente por el tamaño de la muestra en cada conjunto, y también por las características de los pacientes, ya que la muestra analizada con inmunofluorometría sólo considera individuos de raza Beagle, y los grupos de ELISA e inmunoturbidimetría tienen representadas las razas Beagle, Schnauzer, Shitzu, French Poodle, entre otras. Los valores máximos y mínimos, que además de determinar el rango, determinan los límites superior e inferior para la referencia que un veterinario considere como

52

característica de la condición “clínicamente sana”, varían según la heterogeneidad de la muestra analizada y la aplicabilidad de los límites estará restringida a aquellos factores representados; así por ejemplo, el valor máximo y mínimo de PCR obtenido con inmunofluorometría tiene una interpretación restringida a la raza Beagle y tal vez sea sólo comparable con intervalos obtenidos con la misma técnica, ya que al observar los resultados de ELISA para la misma raza el rango se amplía.

Por medio del diagrama de caja se observó que los valores de la concentración de la PCR determinadas por las diferentes técnicas desarrolladas en los estudios que presentaban los valores de PCR para cada individuo, tienen una distribución asimétrica respecto al valor de la mediana para la técnica de ELISA e inmunoturbidimetría, más que para la técnica de inmunofluorometría, debido a la heterogeneidad de la muestra en cada conjunto de datos (figura 15).

Figura 15. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR por técnica utilizada en los artículos con valores individuales en caninos clínicamente sanos 53

Al realizar la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para los valores de PCR en las técnicas comparadas, se determinó el valor del estadístico H= 4,828 y valor de p= 0,08946. Como el valor de p es mayor a 0,05 puede decirse con un 95% de confianza

que

no

hay

diferencias

estadísticamente

significativas

en

la

concentración promedio de PCR entre las técnicas utilizadas en los artículos con valores individuales en caninos clínicamente sanos.

Haciendo uso de la prueba Mann-Whitney se hicieron comparaciones pareadas de los promedios entre las técnicas utilizadas, donde todos los valores resultantes de p fueron mayores a 0,05 confirmando la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre estas técnicas (tabla 12).

Tabla 12. Valores de p obtenidos en la prueba de Mann-Whitney para comparaciones pareadas de PCR entre las técnicas utilizadas. Valores menores a 0,05 indican diferencias significativas entre grupos Técnicas para PCR

ELISA

ELISA IF

IF

IT

0,072

0,118 0,2245

IT IF: inmunofluorometría. IT: inmunoturbidimetría Es frecuente encontrar publicaciones sobre la concentración de PCR en pacientes caninos clínicamente sanos de raza Beagle y, en otros casos sólo se indica que los individuos eran de “diferentes razas”. Con el fin de identificar el efecto de la raza sobre las concentraciones séricas de la PCR, se agruparon los datos disponibles en las publicaciones, junto con los obtenidos en el presente estudio y se compararon con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. El resultado indica que no hay diferencias estadísticamente significativas en la mediana de la concentración de PCR entre razas (p=0,0499), pero al realizar comparaciones

54

pareadas con la prueba Mann Whitney, sí se observan diferencias significativas al involucrar el grupo “diferentes razas” (tabla 13).

Tabla 13. Valores de p obtenidos en la prueba de Mann-Whitney para comparaciones pareadas de PCR entre las razas incluidas en los artículos del meta-análisis. Valores menores a 0,05 indican diferencias significativas entre grupos

Razas Cocker Spaniel

Cocker

French

Spaniel

Poodle

Diferentes

Schnauzer

Shitzu

Beagle

0,735

0,3246

0,9178

0,03178

0,8173

0,1316

0,3874

0,1198

0,1661

0,4704

0,04843

0,289

0,006136

0,5588

French Poodle Schnauzer Shitzu Beagle

razas

0,01094

Diferentes razas

El grupo de raza Beagle tiene un comportamiento similar al de las razas French Poodle y Schnauzer consideradas en éste estudio, aun cuando el tamaño de la muestra fue mayor una vez recopilados los datos de diferentes publicaciones (figura 16).

55

Figura 16. Diagrama de caja para la distribución de los valores de la concentración de la PCR en las razas incluidas en los artículos del metaanálisis. Los números en la parte superior de las barras indican el tamaño de la muestra en cada raza Se realizó el análisis de los datos provenientes de pacientes enfermos para determinar el aumento de las concentraciones de la PCR en las diversas patologías según el estudio realizado, utilizando diferentes técnicas de laboratorio, identificando mayor valor promedio para PCR en enfermedades de etiología infecciosa

como

la

erliquiosis

y piómetra:

452,6

mg/L

y 212,9

mg/L

respectivamente, y menor valor promedio en traumas inducidos, obesidad y tumores benignos (tabla 14).

56

Tabla 14. Valores de la concentración sérica de PCR por grupos de patologías

MUESTRA

PROMEDIO

ERROR ESTÁNDAR DE LA MEDIA

TÉCNICA

PATOLOGÍA

6,1a

-

ELISA

Tumor benigno

86,1a

-

ELISA

REFERENCIA

Neoplasias 60 10 10 Infecciosas 15 2 2 47

4,29 8,2

1,54 5,21

TIA TIA

18 173,4 452,6 200,28

20 22,5 228,1 93,51

ELISA ELISA ELISA ELISA

8

53,51

66,24

ELISA

16 47 53 30 75 32 6

56,1 2,17 207,7 235,5 107,5 17,4

12,7 92,5 79,8 49,52 1,09

ELISA ELISA ELISA ELISA TIA TIA ELISA

29

60,41

48,02

TIA

14

76,52

49,79

TIA

14 20 18 15

38,33 6,4 32,44 14,9

5,5 1,2 6,27 25

ELISA ELISA ELISA ELISA

10

14,48

4,93

ELISA

31

212,9

17,3

86

4,9

15

13,67

Tumor malignometastasis Neoplasia benigna Neoplasia maligna

Tecles et al., 2009 Tecles et al., 2009 Crossley et al., 2010 Crossley et al., 2010 Rikihisa et al., 1994 Hayashi et al., 2001 Shimada et al., 2002 Fransson et al., 2004

TIA

Erliquiosis Infección S. Aureus Erliquiosis Piómetra Hiperplasia Endometrial Quistica Pancreatitis Valvulopatia crónica Piómetra SIRSS Hemoparásitos Abdomen agudo Pancreatitis Espirocerca lupi benigno Espirocerca lupi maligno Demodicosis Cistitis bacteriana Piómetra Piómetra Hiperplasia Endometrial Quistica Piómetra

-

ELISA

Leishmania

Silvestrin et al., 2014

8,93

ELISA

Leishmania T. bajo

57

Fransson et al., 2004 Holm et al., 2004 Rush et al., 2006 Fransson et al., 2007 Fransson et al., 2007 Koster et al., 2009 Galezowski et al., 2010 Lazarov et al 2011 Mukorera et al., 2011 Mukorera et al., 2011 Ulutas et al., 2011 Seo et al., 2012 Dabroswki et al., 2013 Enginler et al., 2014 Enginler et al., 2014 Jitpean et al., 2014 Peña et al

15 15

26,93 56,47

28,44 45,81

ELISA ELISA

11

29,33

33,4

-

23

45,5

52,5

-

0,76 58

0,1 20

ELISA ELISA

7-131a 3 4,5 1,1-8 26,08-29,03 20,8-24,22 10,43-11,74

0,77 0,56 50% 14% 20% 16%

ELISA

Leishmania T. medio Peña et al Leishmania T. alto Peña et al Dirofilariosis sin microfilarias Carretón et al Dirofilariosis con microfilarias

Metabólicas y endocrinas 7 59 Traumáticas 6 6

30

Obesidad Ejercicio extremo

Veiga et al., 2008 Kenyon et al., 2011

Daño mucosa gastrica Otabe et al., 2000

TIA

OVH

Ranganath et al., 2007

ELISA

OVH

Saavedra et al., 2009

a: mediana b: coeficiente de variación c: rango TIA: inmunoturbidimetría 7.3 Discusión de resultados Las razas incluidas en el estudio se escogieron por ser de tamaño y características similares, además de ser las más comunes a nivel local. No se incluyeron pacientes cachorros por tener una débil respuesta de fase aguda, según Hayashi et al., (2001) ni pacientes geriátricos, ya que según Mundo (2008) en estos caninos se produce un desequilibrio del sistema inmune, endocrino y nervioso, dando como resultado el incremento de citoquinas pro-inflamatorias, aumentando la concentración sérica de proteínas de fase aguda. Teniendo en cuenta la cantidad de animales descartados por anamnesis, examen físico o leucograma alterado y a pesar de que el número de la muestra establecido era de 44 caninos, se incluyeron 46 en el estudio debido a que las 2 muestras sobrantes tenían ausencia de alteración en el leucograma.

Se realizó el leucograma para cada uno de los individuos con el fin de evidenciar procesos inflamatorios e/o infecciosos a partir del aumento en el conteo de las

58

células blancas, principalmente de los neutrófilos, de acuerdo con Nakemura et al., (2008) quien determinó que a mayor niveles de células blancas en un proceso patológico, se evidenciará mayor concentración de PCR. Se admitieron pacientes que tuvieron eosinofilia o un grado de linfocitosis leve, siempre y cuando el conteo general de leucocitos y neutrófilos estuviera dentro de los rangos normales, ya que en pacientes con procesos inflamatorios e/o infecciosos en curso se alterarán principalmente los neutrófilos, aumentando su concentración sanguínea (López, 2008). Así mismo, se aceptaron pacientes que tuvieran leucograma de estrés debido a la manipulación en el examen y la toma de la muestra de sangre: leucocitosis, neutrofilia sin desviación a la izquierda, linfopenia y eosinopenia (Aguilera et al., 2003).

Se han utilizado varios métodos para la determinación de la concentración sérica de la PCR en diferentes estudios donde se incluyen animales clínicamente sanos y animales con diversas enfermedades (neoplasias, hemoparásitos, endocrinas, infecciosas, entre otras). Entre los métodos que se han desarrollado se incluyen: ELISA, (ej, Eckersall et al., (1989); Yamamoto et al., (1992)), aglutinación en látex, (ej, Kjelgaard-Hensen et al., (2008)), inmunoturbidimetría, (ej, Wong et al., (2011)), inmunodifusón, (ej, Yamamoto et al., (1992)), inmunofluorimetría, (ej, Parra et al., (2006)) e inmunocromatografía, (ej, McGrotty et al., (2004)). A nivel local solo están disponibles comercialmente los métodos de aglutinación en látex y de inmunoturbidimetría para la determinación de PCR humana. Se escogió el método de inmunoturbidimetría ya que es una técnica cuantitativa con mejor límite inferior de detección (1 mg/L) respecto al método de aglutinación en látex (6 mg/L). La aplicación en clínica humana del método no fue una limitación para el estudio, ya que Kjelgaard-Hansen et al., (2003) señalan que las concentraciones de la PCR en caninos pueden ser determinadas por medio de éste inmunoensayo turbidimétrico. A pesar de que los reactivos utilizados para la determinación de la concentración sérica de PCR detectan un límite inferior de 1 mg/L, se obtuvo un resultado de 0,7 mg/L debido a que la máquina lectora de PCR (Analyzer A15 de

59

BioSystems) aumenta la sensibilidad de los reactivos y es capaz de detectar valores inferiores a 1 mg/L. Una vez analizados los datos de la PCR agrupados por raza, edad y género, se observó que no había homogeneidad en la varianza, y la distribución era asimétrica (no normal), por lo cual se utilizó una prueba no paramétrica para su comparación, evidenciando que no hay diferencias significativas en la mediana de la concentración sérica de la PCR entre las razas, los grupos de edad y el género por tener un valor de p > 0,05. Este resultado está acorde con lo concluido por Yamamoto et al., (1994) quienes determinaron que no había diferencias significativas en la concentración de la PCR entre un grupo de caninos sanos, de diferentes razas y edades mantenidos en sus propios hogares, en comparación con la concentración de un grupo de caninos Beagle sanos de diversas edades mantenidos en jaulas, y por Kuribayashi et al., (2003) quienes compararon las concentraciones de PCR entre caninos machos y hembras con edad de 3 meses a 6 años, de raza Beagle, concluyendo que no existían diferencias significativas entre la raza y edad de los caninos incluidos en el estudio. El mismo resultado se evidenció cuando se hicieron comparaciones pareadas entre individuos por raza y entre individuos por grupos de edad.

Por medio de la rutina SIMPER se evidenció que la PCR fue el factor que más varió entre los individuos agrupados por raza, grupo de edad y género, en comparación con las células diferenciales del leucograma. Sin embargo, el porcentaje de variabilidad no supero el 50%, mostrando que tiene una contribución similar a la de las demás variables hematológicas y por ende respalda la condición clínicamente sana de éstos pacientes seleccionados. El análisis de coordenadas principales muestra que la concentración sérica de PCR es una variable no correlacionada con las variables del leucograma y que puede aportar información distinta y complementaria sobre el estado del paciente.

60

Uno de los caninos incluidos en el estudio que tenía la concentración sérica de PCR entre las más altos (20,3 mg/L) pero los valores del leucograma dentro de los rangos de referencia, presentó diarrea, disquesia, depresión y anorexia a los 5 días después del examen físico, esto se puede atribuir a que las concentraciones de la PCR se alteran más rápido que el conteo de células blancas, acordando con lo descrito por Nakamura et al., (2008) quienes compararon diferentes biomarcadores de inflamación, entre los cuales se encontraban la relación de la PCR con el conteo de las células blancas en pacientes con diversas enfermedades, concluyendo que las concentraciones de PCR sufren cambios séricos en sus niveles mucho más rápidos que los observados en las células blancas. Sin embargo, Veiga et al., (2008) concluyen que a pesar de que la PCR es más sensible que el conteo de células blancas, pacientes con obesidad producen una disminución de las concentraciones de la PCR en comparación con las células diferenciales del leucograma, perdiendo su característica de sensibilidad.

Kjelgaard-Hansen et al., (2004) y Raila et al., (2011) afirman que las diferencias entre los valores de referencia de la PCR para caninos clínicamente sanos encontrados en varios estudios, se debe a la variedad de técnicas disponibles haciendo que la PCR sea dependiente de la técnica utilizada, debido a que los limites inferiores de detección de cada prueba son distintos, lo cual podría alterar los rangos de referencia. En la comparación de las técnicas utilizadas en artículos escogidos para el meta-análisis con la técnica utilizada en el presente estudio, se observa que no hay diferencias significativas en la determinación de la concentración de la PCR al tener un valor de p>0,05. Sin embargo, se evidenció que la varianza de las pruebas comparadas es muy heterogénea, haciendo que la respuesta de la determinación de la concentración sea diferente en caninos clínicamente sanos o en aquellos que presenten alguna enfermedad.

En base a las alteraciones de la PCR frente a diversas enfermedades, aumentando sus concentraciones de hasta 100 veces su valor normal, esta

61

proteĂ­na de fase aguda serĂ­a de gran ayuda en el monitoreo de respuestas tempranas a tratamientos, de acuerdo con Seo et al., (2012) y con KjelgaardHansen et al., (2004), adicionando este Ăşltimo que la PCR es un indicador estable, que mantiene sus concentraciones elevadas mientras que el proceso inflamatorio siga en curso pero disminuye sus concentraciones frente a la efectividad del tratamiento aplicado.

62

8. IMPACTO Con la determinación de los niveles séricos de referencia para pacientes clínicamente sanos de la PCR la prueba será una ayuda paraclínica para médicos veterinarios profesionales, practicantes y estudiantes de medicina veterinaria para hacer el monitoreo de caninos sanos, así como el seguimiento de tratamientos. El aumento de las concentraciones séricas de la PCR tiene su pico más alto entre las 12 – 24 horas de iniciado el proceso inflamatorio y/o infeccioso, y disminuye sus concentraciones séricas después de haber implementado un tratamiento efectivo para la patología en curso, aunque mantiene sus concentraciones fuera del rango de referencia para caninos clínicamente sanos mientras que el proceso patológico siga presente. Esto permite realizar una mejor prevención

de nuevas

enfermedades que puedan afectar a los caninos, asegurar que el tratamiento aplicado sea el correcto y mantenerlo mientras el paciente siga presentando la afección. La toma de la muestra de sangre y el procesamiento para la detección de la concentración de la PCR, hacen que sea una prueba práctica y económica que se puede implementar como ayuda paraclínica de rutina, con el fin de ofrecer un indicio de la gravedad de la patología en base al grado de elevación de la proteína. Este estudio se dará a conocer por medio de la publicación de un artículo en el que se evidencie el desarrollo del estudio, y por medio de la exposición en seminarios.

63

9. CONCLUSIONES



Por medio de la detección de los niveles séricos de la PCR a través del método de inmunoturbidimetría, se determinó que la concentración de referencia para caninos clínicamente sanos es de 0,7-20,95 mg/L.



El valor de la concentración sérica de la PCR en animales clínicamente sanos es independiente de la raza, el género y la edad.



La técnica utilizada para la medición de los niveles séricos de la PCR no afecta el resultado.



La eosinofilia se evidencia en procesos alérgicos y parasitarios, pero por no tener acción directa sobre procesos inflamatorios y/o infecciosos, no altera las concentraciones de la PCR.



La neutrofilia no es factor patognomónico de procesos inflamatorios y/o infecciosos. Sin embargo, la presencia de estos procesos alterará el conteo de neutrófilos circulantes afectando la concentración de la PCR.



La importancia de la PCR radica en la tendencia de sus concentraciones frente a un proceso patológico, al ser un biomarcador estable que disminuye sus niveles frente a la terapéutica adecuada, pero que se mantiene fuera del rango de referencia para caninos clínicamente sanos si el proceso patológico sigue presente.

64

10. RECOMENDACIONES



Realizar estudios para determinar la causa de la variación de la PCR en razas Cocker Spaniel y Shitzu respecto a las demás razas.



Realizar estudios para la determinación de la concentración de la PCR en pacientes cachorros y geriátricos clínicamente sanos, y compararlos con los valores establecidos para pacientes adultos.



Realizar estudios para la determinación de la concentración de la PCR en pacientes de raza grande para determinar variaciones con pacientes de raza pequeña.



Realizar estudios para determinar los cambios de la concentración de la PCR en días alternos durante 1 semana para caninos clínicamente sanos.

65

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12. ANEXOS

Anexo 1. Consentimiento informado para la toma de la muestra de sangre del canino incluido en el estudio

CONSENTIMIENTO INFORMADO Nombre: _______________________________________

Especie:

canina

Raza: ______________________________________ Género: M ___ H___ Edad: ______________ Propietario:

Fecha Nacimiento: _______________________

______________________________________________________

C.c o Nit: ___________________ Teléfono o celular: _____________________

Doy mi autorización al estudiante Juan Carlos López Ballesteros, estudiante de Medicina Veterinaria de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos, habiendo recibido y entendido la explicación del estudio que está desarrollando, para que realice la toma de la muestra de sangre de mi mascota.

Firma: ____________________________________ C.c: ______________________________________

77

Anexo 2. Formato de historia clínica (parte 1) para caninos incluidos en el estudio HISTORIA CLÍNICA Nombre: ________________ Especie: canina Raza: _____________________ Género: M __ H__

Edad: ________

Fecha Nacimiento: ______________

Propietario: _______________________________________________________ C.c o Nit: __________________ Teléfono o celular: ______________________ ANTECEDENTES: DIAGNÓSTICOS ANTERIORES

TIEMPO

TRATAMIENTOS FARMACOLÓGICOS ANTERIORES Medicamento

Dosis

Intervalo

ESTADO REPRODUCTIVO HEMBRA

MACHO

Entera

Entero

Esterilizada

Castrado

Último celo No. De partos

78

Duración

Anexo 3. Formato de historia clínica (parte 2) para caninos incluidos en el estudio PESO: ________ EXAMEN CLÍNICO Actitud:

Temperamento:

Temperatura:

Apetito:

FR:

FC:

TLLC:

Mucosas:

Heces:

Orina:

Dieta:

Vacunas:

EXAMEN GENERAL Normal

Anormal

Normal

Cavidad oral

Sistema respiratorio

Nariz

Sistema digestivo

Ojos

Sistema urinario

Oídos

Genitales

Gánglios linfáticos

Aparato locomotor

Tegumento

Sistema nervioso

Anormal

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

_________________________________ Firma de quien realiza el examen clínico

79

Anexo 4. Características de los pacientes caninos incluidos en el estudio PACIENTE

RAZA

GÉNERO

EDAD meses

Benjamin

Cocker Spaniel

Macho

72

Benji

Cocker Spaniel

Macho

18

Bugger

Shitzu

Macho

48

Bum

Shitzu

Macho

12

Campanita

Shitzu

Hembra

30

Doggy

Schnauzer

Macho

36

Donald

Shitzu

Macho

48

Doqui

French Poodle

Macho

60

Dulce María

French Poodle

Hembra

72

Esmeralda

Cocker Spaniel

Hembra

24

Hashi

Schnauzer

Macho

36

Kiara

Schnauzer

Hembra

13

Kira

French Poodle

Hembra

66

Lacito

Schnauzer

Hembra

60

Lucas

Cocker Spaniel

Macho

36

Lula

Shitzu

Hembra

54

Luna

Schnauzer

Hembra

24

Luna

French Poodle

Hembra

36

Luna

French Poodle

Hembra

42

Lupe

Shitzu

Hembra

36

Lupita

French Poodle

Hembra

60

Mateo

French Poodle

Macho

24

Mateo

Schnauzer

Macho

24

Matias

Cocker Spaniel

Macho

12

Milo

Schnauzer

Macho

60

Moly

Schnauzer

Hembra

13

80

Nano

Schnauzer

Macho

30

Nena

French Poodle

Hembra

36

Nena

Shitzu

Hembra

24

Nico

Shitzu

Macho

24

Nina

Schnauzer

Hembra

36

Sacha

Cocker Spaniel

Hembra

18

Sacha

Shitzu

Hembra

24

Sacha

Schnauzer

Hembra

18

Sahori

Cocker Spaniel

Hembra

12

Samy

French Poodle

Macho

13

Sasha

Cocker Spaniel

Hembra

36

Simon

Cocker Spaniel

Macho

16

Sysy

Cocker Spaniel

Hembra

18

Shitzu

Hembra

36

French Poodle

Macho

13

Tequila

Schnauzer

Hembra

13

Timon

French Poodle

Macho

36

Titan

Shitzu

Macho

48

Tomas

French Poodle

Macho

18

Tomas

Cocker Spaniel

Macho

18

Tacha Teo

81

Anexo 5. Imágenes Imagen 9. Reactivo para PCR

Imagen 10. Posicionamiento de tubos

Fuente: López, 2014

Fuente: López, 2014

Imagen 11. Procesamiento de PCR

Imagen 12. Frotis sanguíneo

Fuente: López, 2014

Fuente: López, 2014

Imagen 13. Tinción de Wrigth

Imagen 14. Cámara de Neubauer

Fuente: López, 2014

Fuente: López, 2014

82