PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Negli ultimi anni è emerso chiaramente come, nelle malattie prioniche ereditarie (malattie incurabili del SNC causate da mutazioni nel gene che codifica la proteina prionica -PrP), la neurodegenerazione sia preceduta da disfunzioni sinaptiche, causate da un effetto negativo della PrP “misfolded”. Ci proponiamo di chiarire i meccanismi attraverso i quali la PrP difettiva altera la normale attività sinaptica, con l’obiettivo di elaborare strategie efficaci per il trattamento precoce della patologia. Contesto e motivazioni: Il presente progetto si basa sulla nostra recente dimostrazione che la PrP mutata viene trattenuta nel reticolo endoplasmatico dove interagisce con la subunità Alpha2Delta-1 dei canali del calcio voltaggio dipendenti (VGCC), compromettendo pertanto l’inserzione del canale sulla superficie cellulare (Senatore et al., Neuron, 2012). Ci proponiamo di definire i meccanismi tramite cui il difetto nel traffico del canale è all’origine della neurodegenerazione e se questo processo può essere funzionalmente recuperato. Disegno sperimentale. Utilizzeremo una serie di tecniche e diversi modelli transgenici di malattia da prioni per verificare l’ipotesi che il “misfolding” di PrP porti a difetti sinaptici e, infine, a morte neuronale. Più in particolare, si verificherà se la mancata inserzione di VGCC nella membrana plasmatica attivi meccanismi compensatori che provocano a loro volta un aumentato rilascio basale di glutammato. Investigheremo quindi se la PrP mutata alteri anche la corretta localizzazione e la funzione dei recettori NMDA, favorendo fenomeni di eccitossicità. Caratterizzeremo infine l’interazione tra PrP e subunità Alpha2Delta-1, con la prospettiva di individuare strategie che, inibendo l’associazione tra le due proteine, forniscano potenziali strategie innovative per l’intervento terapeutico. Risultati attesi. Ci aspettiamo di definire se le anomalie nel traffico di proteine alla sinapsi possa essere all’origine di fenomeni eccitotossici. Questa informazione è essenziale per identificare nuovi bersagli molecolari e per elaborare strategie terapeutiche, che possano eventualmente utilizzare strumenti farmacologici già disponibili in clinica.
(1) Dipartimento di Bioscienze, Università di Milano, Via Celoria 26, Milano. Tel. +39.02.50314893, Fax +39.02.50314895, E-mail: martino.bolognesi@unimi.it (2) CNR Istituto di Biofisica, Palermo, Italia (3) Dipartimento Fisica, Università di Palermo, Italia (4) Dipartimento Biologia e Biotecnologie Charles Darwin, Università di Roma La Sapienza, Roma, Italia
La neuroserpina umana (NS) appartiene alla famiglia delle serpine (serine protease inhibitor). NS è una proteina glicosilata espressa principalmente nei neuroni ed inibisce specificamente il tissue plasminogen activator (tPA). Sei mutanti di NS inducono un accumulo di NS polimerica responsabile della FENIB, una malattia neurodegenerativa, caratterizzata da demenza ad esordio precoce, epilessia e morte neuronale. UNIMI unità: Per studiare l’inibizione del tPA, un complesso stabile NS:tPA è stato ricostituito in soluzione usando mutanti inattivi del tPA. Da un’analisi cromatografica è emerso che le mutazioni non hanno influenzato la stabilità del complesso; due diversi complessi stabili sono stati isolati. In parallelo abbiamo anche isolato la forma latente di NS. La cristallizzazione di tutti questi campioni è attualmente in corso. Inoltre, studiamo il meccanismo di polimerizzazione utilizzando due diversi approcci. A) Per individuare i residui coinvolti nella polimerizzazione, oligomeri di NS sono in fase di analisi mediante crosslinking e spettrometria di massa. B) Per chiarire l’architettura globale dei polimeri la cristallografia e la crio-microscopia elettronica saranno combinate. A questo scopo, anticorpi specifici in grado di riconoscere NS monomerica e polimerica sono utilizzati. La cristallizzazione di complessi NS:anticorpo è in corso. IBF Unità: Studiamo il meccanismo di polimerizzazione NS in vitro. Da studi di scattering e cromatografia, abbiamo individuato diversi processi coinvolti (attivazione, dimerizzazione, allungamento, frammentazione, inattivazione) e il loro ruolo nella formazione di polimeri (Noto et al 2012 PLoS ONE). Abbiamo affrontato gli aspetti molecolari delle conformazioni funzionali e disfunzionali di NS. (I) un fingerprint spettroscopico dei diversi conformeri di NS sono stati individuati spettroscopicamente; i risultati preliminari di EPR e site-directed spin labelling indicano differenze nella loro dinamica e struttura, (ii) la struttura dei polimeri NS dipende dalle condizioni chimico-fisiche (Santangelo et al 2012 Proteine.), (iii) simulazioni di dinamica molecolare dimostrano l’esistenza di domini meccanicamente coerenti le cui perturbazioni locali influenzano le dinamiche globali di NS. UNIRO unità: Ci siamo concentrati sulla biologia cellulare delle varianti polimerogeniche di NS da due punti di vista: a) il ruolo che la N-glicosilazione svolge sulla stabilità di NS all’interno del reticolo endoplasmatico. I nostri risultati dimostrano che l’N-glicosilazione è importante per evitare la polimerizzazione e che può promuovere la degradazione di NS mutata. b) Abbiamo sviluppato un nuovo modello cellulare per lo studio della tossicità di NS polimerica, mediante trasfezione di NS wild type e delle varianti patologiche in cellule staminali neurali di corteccia murina. Tale modello possiede le principali caratteristiche della demenza FENIB: la formazione e l’accumulo di NS polimerica all’interno del reticolo endoplasmatico.
ABSTRACT N. 136 Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Responsabile
MATTEOLI MICHELA GGP12115
Totale € Num Centri: 2
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2011
Forloni Gianluigi (1), Tagliavini Fabrizio (2), Artuso Vladimiro (3), Redealli Veronica (2), Lucca Ugo (1), Tettamanti Mauro (1), Albanese Yasmin (1), Roiter Ignazio (3) (1) Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri”, Via La Masa 19, 20156 Milano, Italy Tel.02.39014462; Fax 0239001916 (2) Fondazione IRCCS - Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano, Italy (3) Dipartmento di Medicina Interna, Unità Operativa di Medicina, Oderzo ASL 9 Treviso ASL 9 Treviso, Italy
L’insonnia fatale familiare (FFI) è una malattia genetica neurodegenerativa caratterizzata da disturbo del sonno, iperattivazione del sistema autonomico e anomalie motorie. FFI appartiene al gruppo delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) dette anche malattie da prioni. Le TSE sono malattie neurodegenerative trasmissibili caratterizzate da un fenotipo molto eterogeneo, i casi genetici sono associati a mutazioni sul gene che codifica per la proteina prion. FFI è una malattia autosomica dominante associata alla mutazione da acido aspartico ad asparagina sul codone 178 del gene prion in combinazione con la presenza di metionina sul codone polimorfico 129 (D178/M129). La malattia è devastante e normalmente porta a morte in meno di due anni, non ci sono ad oggi trattamenti efficaci. In questo progetto ci proponiamo di effettuare un trattamento preclinico con doxiciclina (DOXY) in soggetti a rischio genetico di sviluppare FFI. La potenziale efficacia della DOXY nelle TSE deriva da numerosi studi sperimentali e da due studi clinici osservazionali che in Italia e in Germania hanno dimostrato effetti positivi con questo farmaco nelle TSE e un’ottima tollerabilità. Sono stati genotipizzati 85 soggetti appartenenti ad una famiglia con membri affetti da FFI, alcuni di questi sono risultati portatori della mutazione D178/M129. Poiché la penetranza della malattia è elevata e la possibilità di cura alla comparsa dei sintomi è piuttosto remota, un trattamento preventivo con DOXY è stato proposto ai soggetti portatori della mutazione nati tra il 1958 e il 1969. Sulla base dell’ana-
374.800 Durata (anni): 3
237.200
INSONNIA FATALE FAMILIARE: TRATTAMENTO PREVENTIVO CON DOXICICLINA IN SOGGETTI A RISCHIO GENETICO DI MALATTIA
Progetti di Ricerca Telethon - Malattie Neurologiche Telethon grant N.
GGP10208
Totale € Num Centri: 3
ABSTRACT N. 135 Responsabile
FORLONI GIANLUIGI
Telethon grant N.
Anno d’inizio: 2013
LA PROTEINA PRIONICA MUTATA IMPEDISCE L’INSERZIONE DI CANALI PER IL CALCIO VOLTAGGIO-DIPENDENTI NELLA MEMBRANA PRESINAPTICA: ANALISI DEI MECCANISMI DI NEUROTOSSICITÀ E POTENZIALI STRATEGIE TERAPEUTICHE Matteoli Michela (1,2), Senatore Assunta (3), Morini Raffaella (1,2), Ghirardini Elsa (1,2), Verderio Claudia (4), Restelli Elena (3), Pozzoli Manuela (3), Bertani Ilaria (3), Chiesa Roberto (3) (1) Dip Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, via Vanvitelli 32, Università di Milano, Tel. 02.50317097, Fax 02.7490574, E-mail: michela.matteoli@unimi.it (2) IRCCS Humanitas, Rozzano (3) Dulbecco Telethon Institute and Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Milano (4) CNR Istituto di Neuroscienze, Milano
Obiettivi generali e specifici
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