1.
PODSTAWOWE ZAGADNIENIA KALIBRACYJNE
1.1. Jakie pojęcia analityczne są związane z kalibracją analityczną? 1
1.2. Jaka jest istota kalibracji analitycznej? 3
1.3. W jaki sposób sygnał analityczny informuje o rodzaju i ilości analitu w próbce? 4
1.4. Czym różni się kalibracja analityczna od kalibracji instrumentalnej? 5
1.5. Jaka jest definicja kalibracji analitycznej? 6
1.6. Jak należy rozumieć pojęcie funkcji kalibracyjnej? 6
1.7. Czym jest wzorzec kalibracyjny i jakie są jego rodzaje? 7
1.8. Jaka jest rola wzorca w procesie kalibracji analitycznej? 8
1.9. Czym są procedura i metoda kalibracyjna? 10
1.10. Czy istnieją metody analityczne niewymagające kalibracji? 11
2.1. Co jest miarą jakości metody analitycznej?
2.2. Jakie są rodzaje i źródła błędów analitycznych? 14
2.3. Czym jest efekt niekontrolowany? 16
2.4. W jaki sposób można wpływać na efekty niekontrolowane? 18
2.5. Jakie są konsekwencje eliminacji i kompensacji efektów? 19
2.6. W jaki sposób można ocenić wiarygodność metody analitycznej?
2.7. W jaki sposób wyznacza się precyzję wyniku analitycznego?
2.8. Na czym polega specyfika pojęcia dokładności wyniku analitycznego?
2.9. W jaki sposób można wyznaczyć i zweryfikować dokładność wyniku analitycznego?
3. SPECYFIKA
3.1. Na czym polega kalibracja w analizie jakościowej?
3.2. Jakie są informacje pomiarowe w analizie jakościowej?
3.3. Jakie są rodzaje wzorców w analizie jakościowej?
3.4. Czym jest analiza sensoryczna?
3.5. Jakie są podstawowe problemy kalibracyjne w analizie jakościowej?
3.6. Jakie jest znaczenie analizy jakościowej w chemii sądowej?
4. METODY KALIBRACYJNE W ANALIZIE JAKOŚCIOWEJ
4.1. Jakie metody kalibracyjne stosuje się w analizie jakościowej?
4.2. Na czym polega metoda wzorca zewnętrznego?
4.3. Na czym polega metoda próbki porównawczej?
4.4. Na czym polega metoda profilu porównawczego?
4.5. Na czym polega metoda dyskryminacyjna?
4.6. Na czym polega metoda wzorca wewnętrznego?
4.7. Na czym polega metoda pośrednia?
4.8. Na czym polega metoda dodatku wzorca?
4.9. W jaki sposób wybrać odpowiednią metodę kalibracyjną w analizie ilościowej?
5. SPECYFIKA KALIBRACJI W ANALIZIE ILOŚCIOWEJ
5.1. Jakie są podstawowe cechy kalibracyjne analizy ilościowej?
5.2. Na czym polega kalibracja w analizie ilościowej?
5.3. Jakie są cechy funkcji modelowej w analizie ilościowej?
5.4. Jaką drogą można wyznaczyć wynik analityczny w analizie ilościowej? 61
5.5. Jakie są podstawowe problemy kalibracyjne w analizie ilościowej?
5.6. Na czym polega znaczenie efektu preparatywnego w analizie ilościowej?
5.7. Na czym polega znaczenie efektu interferencyjnego w analizie ilościowej?
62
64
66
5.8. Na czym polega znaczenie efektu specjacyjnego w analizie ilościowej? 69
6. ROLA I ZNACZENIE WYKRESU KALIBRACYJNEGO
6.1. Czym jest wykres kalibracyjny?
71
6.2. W jaki sposób konstruuje się wykres kalibracyjny? 72
6.3. Jak wykryć odbiegający punkt pomiarowy wykresu kalibracyjnego? 74
6.4. Czy wykres kalibracyjny powinien być koniecznie liniowy?
6.5. W jaki sposób ocenić dopasowanie wykresu kalibracyjnego do punktów pomiarowych?
6.6. Od czego zależy precyzja położenia wykresu kalibracyjnego?
6.7. Czy położenie wykresu kalibracyjnego ma związek z czułością metody analitycznej?
6.8. Jakie jest znaczenie czułości metody analitycznej?
7. METODY KALIBRACYJNE W ANALIZIE ILOŚCIOWEJ
7.1. Jakie metody kalibracyjne stosuje się w analizie ilościowej?
7.2. Na czym polega metoda wzorca zewnętrznego?
76
77
79
80
81
83
84
7.3. Na czym polega metoda rozcieńczeń?
7.4. Na czym polega metoda wzorca wewnętrznego?
87
89
7.5. Na czym polega metoda pośrednia? 92
7.6. Na czym polega metoda dodatków wzorca? 94
7.7. Jak wybrać odpowiednią metodę kalibracyjną w analizie ilościowej? 97
8. INNE METODY KALIBRACYJNE W ANALIZIE ILOŚCIOWEJ
8.1. W jaki sposób można połączyć metody rozcieńczeń i dodatków wzorca?
8.2. W jaki sposób można połączyć metody wzorca wewnętrznego i dodatków wzorca?
101
103
8.3. W jaki sposób można połączyć metody pośrednią i dodatków wzorca? 105
8.4. Na czym polega kalibracja w analizie miareczkowej? 107
8.5. Na czym polega kalibracja w analizie grawimetrycznej? 110
8.6. Na czym polega kalibracja matematyczna w analizie ilościowej? 112
9. DODATKOWE ZASTOSOWANIA METOD KALIBRACYJNYCH
9.1. W jaki sposób można szybko wykryć efekt interferencyjny? 115
9.2. W jaki sposób można wykryć i zbadać efekt interferencyjny metodą zintegrowaną?
9.3. W jaki sposób można zwiększyć dokładność analizy próbek o podobnym składzie? 120
9.4. W jaki sposób można skompensować i ocenić addytywny efekt interferencyjny?
9.5. W jaki sposób można skompensować i ocenić efekt preparatywny?
9.6. W jaki sposób można odróżnić efekt interferencyjny od efektu preparatywnego?
10. KALIBRACJA
124
126
10.1. Czym jest analiza przepływowa? 129
10.2. Na czym polega wstrzykowa technika przepływowa (FIA)? 130
10.3. W jaki sposób można zastosować technikę FIA do kalibracji metodą wzorca zewnętrznego? 132
10.4. W jaki sposób można zastosować technikę FIA do kalibracji metodą dodatków wzorca? 135
10.5. W jaki sposób można zastosować technikę FIA do kalibracji metodą rozcieńczeń?
136
10.6. W jaki sposób można zastosować technikę FIA do miareczkowania? 137
10.7. Czy można skonstruować układ FIA do kalibracji różnymi metodami?
3.4
Czym jest analiza sensoryczna?
Specyficznym rodzajem analizy chemicznej jest analiza sensoryczna (organoleptyczna). W podręcznikach analitycznych zwykle pomija się lub umniejsza jej rolę analityczną, a o aspektach kalibracyjnych z nią związanych nie mówi się w ogóle. Stąd wymaga ona osobnej uwagi.
Analiza sensoryczna ma znaczenie głównie w analizie jakościowej i polega na tym, że rodzaj określonych elementów materii ocenia się za pomocą zmysłów: wzroku, węchu, słuchu, smaku lub dotyku. Za działanie zmysłów odpowiadają receptory zmysłowe, które są połączone drogami nerwowymi z tymi ośrodkami mózgu, które tworzą – mówiąc ogólnie – tzw. pamięć sensoryczną. Trafiające tam informacje są rejestrowane i przechowywane, a także w razie potrzeby odpowiednio interpretowane, kategoryzowane i przetwarzane na sygnały w postaci wrażeń zmysłowych. Mózg kojarzy te sygnały z odpowiednimi bodźcami, zapamiętuje i utrwala ten związek, a w odpowiednim momencie przypomina o nim. Przywołany obraz elementu materii (analitu) związany z określonym wrażeniem zmysłowym (a ściślej mówiąc –z określonym „położeniem” tego wrażenia na „widmie” wrażeń związanych z innymi elementami materii) pełni rolę wzorca biologicznego.
Mózg odgrywa więc w analizie sensorycznej rolę wysokiej klasy instrumentu, który umożliwia wykonanie pełnej procedury analitycznej: od przyjęcia wprowadzonej próbki, aż po detekcję i przetworzenie sygnału energetycznego (bodźca) na sygnał pomiarowy (wrażenie zmysłowe). Co więcej, zawiera w sobie pewnego rodzaju układ kalibracyjny, pozwalający na utworzenie funkcji modelowej za pomocą wzorca biologicznego i użycie tej funkcji do określenia rodzaju analitu. Działanie to jest schematycznie przedstawione na rysunku 3.4.
Element materii (analit)
RYS. 3.4
Narząd zmysłu
Receptor
MÓZG
Pamięć zmysłowa przechowywanie odtwarzanie kategoryzacja
Schemat biologicznego (sensorycznego) instrumentu analitycznego [2]
Wrażenie zmysłowe (sygnał pomiarowy)
Choć wyniki analizy sensorycznej są stosunkowo mało precyzyjne i dokładne, to dzięki swojej prostocie i szybkości analiza tego typu ma duże znaczenie między innymi w takich obszarach, jak badanie produktów żywnościowych, kosmetyków i środków czystości, zanieczyszczeń środowiska itp. W tych dziedzinach stała się
wyspecjalizowanym podejściem naukowym, dysponującym charakterystycznymi procedurami i technikami analitycznymi [16], które niekiedy pozwalają na uzyskiwanie tą drogą nawet półilościowych wyników analitycznych.
Szczególnie duże znaczenie w analizie chemicznej mają badania sensoryczne wykonywane za pomocą zmysłu węchu (olfaktometrii), ponieważ zapach jest wrażeniem zmysłowym pochodzącym bezpośrednio od określonych związków chemicznych. Przebieg badań olfaktometrycznych reguluje dedykowana norma [17].
Ważnym działem olfaktometrii jest odorometria dotycząca badania odorantów, czyli związków chemicznych wywołujących w naszym otoczeniu zapachy (odory) o dużej uciążliwości dla naszych zmysłów.
Warto zauważyć, że analiza sensoryczna jest wykorzystywana również w osmologii – dziedzinie kryminalistyki zajmującej się zabezpieczaniem, przechowywaniem i badaniem śladów zapachowych. Ostatni etap analizy jest wykonywany za pomocą specjalnie wyszkolonych psów, których zadaniem jest ustalenie zgodności zapachowej materiału dowodowego ujawnionego na miejscu zdarzenia z materiałem porównawczym pobranym od osoby podejrzanej o popełnienie przestępstwa. Analiza sensoryczna jest zatem pełnoprawnym działem analizy chemicznej, charakteryzującym się własnymi procedurami i specyficznym procesem kalibracji analitycznej.
3.5
Jakie są podstawowe problemy kalibracyjne w analizie jakościowej?
Podstawowym problemem utrudniającymi lub nawet uniemożliwiającymi dokładną identyfikację analitu jest występowanie efektów niekontrolowanych. Mogą one ujawnić się w różnej formie i na każdym etapie postępowania analitycznego z zastosowaniem zarówno kalibracji chemicznej, jak i matematycznej i biologicznej. Szczególne znaczenie mają w kalibracji chemicznej, ze względu na powszechne wykorzystanie tego typu kalibracji w analizie jakościowej i występowanie w tym przypadku wyjątkowo dużej liczby możliwych źródeł tych efektów.
Przykładem powstania efektu preparatywnego jest niewłaściwy dobór wzorca do analizowanej próbki, wyrażający się różnicą ich składu chemicznego, a w przypadku analizy próbek stałych – również odmiennymi właściwościami fizycznymi lub fizykochemicznymi. O niezgodności próbki i wzorca można mówić także wtedy, gdy ilość analitu we wzorcu jest zbyt mała lub zbyt duża w stosunku do ilości analitu w próbce, bo wówczas identyfikację może utrudniać duża różnica intensywności sygnałów otrzymanych dla próbki i wzorca. Różnice te
5.3
Jakie są cechy funkcji modelowej w analizie ilościowej?
Funkcja modelowa przyjmuje w dużym stopniu w sposób naturalny postać funkcji rzeczywistej, choć oczywiście wszelkie odstępstwa od warunków, w jakich powstała funkcja rzeczywista powodują, że obie funkcje odbiegają w pewnym stopniu od siebie pod względem kształtu i położenia (patrz rys. 5.2). Na postać funkcji rzeczywistej ma wpływ wiele czynników występujących podczas analizy, m.in.: cechy badanego układu analitycznego (rodzaj próbki, analitu, instrumentu pomiarowego itd.), sposób przygotowania próbki do pomiaru, obecność odczynników towarzyszących analitowi (w tym interferentów) w próbce, występowanie różnego rodzaju efektów niekontrolowanych. Funkcja modelowa może często przyjmować tak złożony kształt i położenie, jakie są przedstawione na rysunku 5.3: może być nieliniowa, w pewnym zakresie liniowa, na ogół rosnąca i z reguły przyjmująca wartość zerową dla zerowej ilości analitu.
zakres dynamiczny
zakres roboczy
Y , u ł a n g y s ć ś o n w y s n e t n I
RYS. 5.3
zakres liniowy
Y = G(c)
LOQ
Ilośćanalitu, c
Funkcja modelowa w analizie ilościowej; LOQ – granica oznaczalności
Na kształt funkcji modelowej w analizie ilościowej składa się kilka charakterystycznych, umownych zakresów: zakres dynamiczny – pełny zakres funkcji (zależny głównie od zdolności detekcyjnej instrumentu pomiarowego); zakres roboczy – część zakresu dynamicznego o niewielkiej nieliniowości, najbardziej dogodna do wykonywania oznaczeń; zakres liniowy – część liniowa zakresu roboczego.
5.4. Jaką drogą można wyznaczyć wynik analityczny w analizie ilościowej?
Dolną granicą zakresu roboczego (niezależnie od stopnia jego nieliniowości) jest tzw. granica oznaczalności analitu (LOQ, ang. limit of quantification), czyli taka ilość analitu, dla której mierzony sygnał jest znacząco większy (najczęściej przyjmuje się, że ok. 10-krotnie) od szumu pomiarowego.
W pewnych przypadkach funkcja modelowa może być malejąca, a także liniowa albo nieliniowa w pełnym zakresie roboczym lub nawet dynamicznym. Z kalibracyjnego punktu widzenia wykluczona jest oczywiście taka sytuacja, w której sformułowana funkcja modelowa przyjmuje wartość stałą.
5.4
Jaką drogą można wyznaczyć wynik analityczny w analizie ilościowej?
Kalibracja w analizie ilościowej, w szczególności z udziałem wzorców chemicznych, charakteryzuje się większą różnorodnością wzajemnego traktowania próbki i wzorców na etapie ich przygotowywania do pomiaru niż metody analizy jakościowej. W rezultacie istnieją również różne możliwości formułowania funkcji modelowej i transformacji wyników pomiarowych do wyniku analitycznego za pomocą tej funkcji.
Charakter etapu transformacyjnego zależy w dużej mierze od sposobu realizacji poprzedzających go etapów kalibracyjnych. Zależność tę można ogólnie opisać następująco:
jeżeli próbkę i wzorce sporządza się osobno w stosunku do siebie (strategia rozłączna) i funkcję modelową formułuje się za pomocą wyników pomiarowych otrzymanych dla samych wzorców, to wynik analityczny wyznacza się za pomocą funkcji modelowej na drodze interpolacyjnej;
jeżeli próbkę i wzorce łączy się ze sobą (strategia łączna) i funkcję modelową formułuje się za pomocą wyników pomiarowych otrzymanych dla próbki połączonej z wzorcami, to wynik analityczny wyznacza się za pomocą funkcji modelowej na drodze ekstrapolacyjnej;
jeżeli wzorzec, łączony lub niełączony z próbką, doprowadza się do z góry określonego stanu, to wynik analityczny wyznacza się po osiągnięciu tego stanu na podstawie odpowiadającego mu pojedynczego sygnału (bez względu na położenie i kształt funkcji modelowej), czyli na drodze indykatywnej.
W jaki sposób można skompensować i ocenić efekt preparatywny?
Jednym z powszechnie stosowanych sposobów kompensacji efektu preparatywnego jest tzw. metoda (test) odzysku (w domyśle – odzysku analitu z próbki). W rozdziale 5.6 przedstawiono ideę tego podejścia kalibracyjnego, a w praktyce postępowanie zgodne z tą metodą jest następujące:
• analizowaną próbkę przed przygotowaniem jej do pomiaru dzieli się na dwie porcje o stężeniu analitu c0 i równej objętości, a następnie do jednej z nich dodaje się roztwór wzorcowy o znanym stężeniu cSt analitu, a drugą uzupełnia rozcieńczalnikiem o objętości roztworu wzorcowego (czyli zgodnie z metodą dodatków wzorca);
• roztwory próbki i próbki z wzorcem poddaje się koniecznym operacjom preparatywnym i mierzy się intensywność sygnałów, odpowiednio Yx i Y1, w warunkach charakterystycznych dla analitu (rys. 9.5);
• konstruuje się wykres kalibracyjny za pomocą roztworów wzorcowych zawierających sam analit (czyli zgodnie z metodą wzorca zewnętrznego);
• otrzymane sygnały odnosi się w sposób interpolacyjny do wykresu kalibracyjnego i wyznacza różnicę stężeń ∆cx między wartościami stężeń wskazanymi przez oba sygnały.
RYS. 9.5
Zasada metody odzysku: cSt – stężenie analitu dodanego do próbki przed jej przetworzeniem, Yx, Y1 – sygnały otrzymane odpowiednio dla roztworów próbki i próbki z dodatkiem wzorca po ich przetworzeniu, Δcx – obliczone stężenie analitu po przetworzeniu próbki, linia ciągła –wykres kalibracyjny
Wykonane pomiary pozwalają na porównanie wartości stężenia Δcx z dodanym stężeniem cSt analitu. Iloraz obu wartości wyrażony w procentach jest przyjmowany za współczynnik odzysku RV:
= Δcx cSt ·100%
Jeżeli więc Δcx = cSt, to RV = 100%, co oznacza pełny odzysk analitu z próbki, czyli inaczej mówiąc, brak jakiekolwiek utraty analitu. Jeżeli natomiast analit został w pewnym stopniu utracony, czyli Δcx < cSt, to jego odzysk wyraża wartość RV < 100%, a stopień utraty analitu wartość 100% – RV.
Od strony formalnej metoda odzysku jest jeszcze jednym sposobem wykorzystania połączonych metod wzorca zewnętrznego i dodatków wzorca. Kluczowym elementem tego podejścia jest zastosowanie metody dodatków wzorca przed przygotowaniem próbki do pomiaru, czyli przed tymi operacjami laboratoryjnymi, które są potencjalnie odpowiedzialne za utratę analitu. Dzięki temu możliwe staje się wykrycie i kompensacja efektu preparatywnego powstałego w wyniku tych operacji (patrz rys. 5.6).
Można zauważyć, że istnieje bardzo prosty matematyczny związek między współczynnikiem odzysku RV a błędem względnym RE wyniku analitycznego –czyli miarą dokładności tego wyniku:
Wynika stąd, że metoda odzysku może służyć do oceny dokładności wyniku analitycznego. Na tej podstawie wydano oficjalną rekomendację, aby badanie odzysku analitu z próbki stanowiło część każdego postępowania walidacyjnego, a wyznaczany tą drogą współczynnik odzysku był traktowany jako miara dokładności wyniku analitycznego [12].
Ograniczeniem metody jest możliwość jej wykorzystania tylko w takich przypadkach, gdy stan próbki przed jej przetworzeniem pozwala na dodanie do niej analitu i próbka z dodatkiem może być w pełni zhomogenizowana. Ważne jest również, aby dodany analit miał takie same lub przynajmniej podobne właściwości do tych, jakie na etapie preparatywnym wykazuje analit natywny.
Dodatkowo, metoda odzysku musi spełniać następujące warunki:
• efekt preparatywny powinien być proporcjonalny, bo tylko efekt o takim charakterze może być skompensowany metodą dodatków wzorca;
• efekt preparatywny nie może występować razem z efektem interferencyjnym, ponieważ metoda odzysku jest wtedy zdolna do skompensowania obu efektów