Portafolio de Evidencias "Bacteriología" Lucia y Maily

PORTAFOLIO DE EVIDENCIAS: BACTERIOLOGÍA I DOCENTE: ASBLEIDE KARINA ANGARITA SANCHEZ IV SEMESTRE LUCIA LUZARDO 19171049 MAILY USECHE 19171005

GUÍA 1: NORMAS DE BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO Y PAUTAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Guía de Laboratorio: Tema:

• • • •

Fecha:

Manual de calidad Pag 1 de 9

1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO Y PAUTAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO Objetivo

Revisar las normas de bioseguridad para aplicarlas en los diferentes laboratorios.

Conocer equipos del laboratorio y su respectivo manejo y cuidado.

Aprender la importancia de la esterilización en las prácticas de laboratorio de microbiología Preparar algunos medios de cultivo Fundamento

Se busca que el estudiante reconozca la importancia del trabajo en el laboratorio de Microbiología y todo lo que implica su manejo, teniendo en cuenta Normas de Bioseguridad, control de calidad y manejo de equipos y material de vidrio.

PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD Bioseguridad. La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conocimiento, de las técnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposición del personal, del área de laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos.

Agentes Biopeligrosos: son todos aquellos agentes biológicos y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos citar: bacterias, virus, hongos, parásitos, productos recombinantes, alérgenos, priones, entre otros.

Riesgo Microbiológico: se encuentra presente cada vez que se realiza una actividad práctica en el Laboratorio, donde se requiera la manipulación de cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a provocar una infección si no son manipulados adecuadamente.

Vías de Infección Los microorganismos pueden ingresar al organismo a través de: la boca, los pulmones, la piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, entre otras. Las vías de contaminación más frecuentes en el laboratorio se dan a través de: la boca al comer, beber y fumar en el laboratorio. Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección. Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.).

La piel por inoculación accidental con una aguja u otros instrumentos punzantes o de vidrio.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 1. Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

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2. Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente cerrada.

3. Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica.

4. Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes.

5. Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura y estando físicamente cómodo.

6. Llevar un calzado apropiado, cerrado y de suela antideslizante en las áreas de laboratorio.

7. Evitar llevar a los laboratorios accesorios que podrían ser fuente de contaminación (por ejemplo joyas).

8. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos.

9. Hablar sólo lo indispensable.

10. No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse cosméticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningún área del laboratorio.

11. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.

12. Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo práctico.

13. Tener cuidado con el manejo de los mecheros.

Materiales y Equipos Item 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Ítem 01 Paso 1

Tipo MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT EQUIP

Descripción Uniforme completo: Bata, Gorro, Guantes, Tapa bocas Lápiz de cera y marcador Laminas o portaobjetos Laminillas o cubreobjetos Asas curvas y rectas Caja de fósforos o encendedor Jabón desinfectante Toallas desechables Cinta tirro Reconocimiento de equipos: incubadora, horno, autoclave, centrífuga, cuenta colonias, destilador, cámara de flujo laminar, microscopio.

MAT Reconocimiento de material de vidrio: cajas de Petri, tubos tapa rosca, entre otros.

Reactivos Descripción Reconocimiento de algunos reactivos de laboratorio y su adecuado manejo.

Procedimiento Descripción Se les dará a conocer a los estudiantes una lista de normas de bioseguridad indispensables para el buen desempeño de las futuras prácticas en el área de

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

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GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código: 2

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

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Microbiología.

Se explicará el funcionamiento de equipos de laboratorio para su buen manejo, aspectos claves y precauciones pertinentes para el uso de algunos reactivos de laboratorio.

3

Se orientará a los estudiantes en la correcta disposición de residuos sólidos y líquidos.

4

Se desarrollará una inducción en el manejo del material de vidrio y medios de cultivo, como envolver el material y como esterilizar el material y medios de cultivo.

Consulta 1. Investigar otras normas de bioseguridad 2. Averiguar sobre medidas de control de calidad de laboratorio para garantizar resultados confiables.

3. Aclarar sobre medidas preventivas y medidas correctivas, citar algunos ejemplos.

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

FORBES, BETTY. (2009). Diagnostico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Médica Panamericana.

Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiológico. Sexta edición. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2009). Brock: Biología de los microorganismos. (Doceava edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

ANEXOS No. Anexo Descripción

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

CONSULTA 1: Normas de Bioseguridad, Reconocimiento y pautas para el trabajo en el Laboratorio Lucia Luzardo 19171049, Maily Useche 191005

1. Investigar otras normas de bioseguridad Normas de Bioseguridad ● No guardar alimentos en los equipos donde se refrigeran sustancias contaminantes o químicas.1 ● Manejar a todos los implementos como si estuviesen contaminados.1 ● Utilizar de forma sistemática guantes plásticos o de látex en procedimientos en que se manipulan sustancias biológicas, se maneja instrumental o equipo contaminado en la atención de los pacientes, o en ambas situaciones, y en caso de que estos se rompan se deben cambiar de inmediato por unos nuevos.1 ● Abstenerse de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.1 ● Emplear mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que puedan generar salpicaduras, gotitas aerosoles de sangre u otros líquidos corporales.1 ● Mantener los elementos de protección personal en condiciones óptimas de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso.1 ● Manejar con estricta precaución los elementos punzocortantes y desecharlos en los recipientes indicados, a prueba de perforaciones.1 ● Evitar el cambio de los elementos punzocortantes de un recipiente a otro.1 ● Evitar el reciclaje de material contaminado, como agujas, jeringas u hojas de bisturí.1

● En caso de que se rompa material de vidrio contaminado con sangre u otro líquido corporal, recoger los trozos con escoba y recogedor (nunca con las manos) y depositarlos en el contenedor para punzocortantes.1 ● Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material irrompible y contar con cierre hermético (tapón de rosca).1 ● Manipular, transportar y enviar las muestras en recipientes seguros, con tapa y rotulación adecuada.1 ● A su vez, transportar las gradillas en recipientes herméticos, de plástico o acrílico, que retengan fugas o derrames accidentales. Además, deben ofrecer facilidad de lavado.1 ● Las personas sometidas a tratamiento con inmunodepresores no deben trabajar en áreas de riesgo biológico.1 2. Averiguar sobre medidas de control de calidad de laboratorio para garantizar resultados confiables.

Control de calidad de las muestras clínicas:

- La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.

- Al tomar una muestra clínica, es importante evitar la contaminación con microorganismos de la flora normal del área afectada.

- Debe seleccionarse el lugar anatómico correcto de donde se obtendrá la muestra, utilizar la técnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtención.

- Se debe recolectar un volumen apropiado de muestra para evitar los resultados falsos negativos.

- Se debe identificar cada muestra con el nombre del paciente y su número de identificación.

- Se debe colocar la muestra en un recipiente adecuado para su transporte, con el fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso.

- Por último, se debe evitar derramar la muestra y mantener en todo momento las medidas de bioseguridad apropiadas.2

Control de calidad de los medios de cultivo:

-Se debe mantener un registro de cada frasco de medio de cultivo, con el nombre del producto, nombre de la casa proveedora, fecha de recibo, fecha de expiración, número de lote y fecha en que se abrió el frasco.

-Cada lote preparado de medio de cultivo se debe probar antes de su uso rutinario, mediante la inoculación de microorganismos cuyo comportamiento se conoce, tanto para reacciones positivas, como negativas. Para esto pueden utilizarse cepas bacterianas control de la ATCC (American Type Culture Collection). Se debe guardar un registro de los resultados obtenidos.

-Para el agar Mueller-Hinton, empleado como medio de soporte para realizar la prueba de susceptibilidad por el método de difusión en agar (Método de Bauer and Kirby), el control de calidad debe extenderse hacia la determinación de las concentraciones de timina/timidina, la concentración de cationes, así como en medir la profundidad del agar y que ésta sea igual en todo el plato de agar.

-La concentración adecuada de timina/timidina se monitoriza utilizando la cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 y el disco de trimetoprin sulfa.

-La concentración adecuada de cationes se monitoriza utilizando la cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y el disco de gentamicina.

-Las pruebas básicas de control de calidad de los medios preparados deben incluir: medición del pH, pruebas de esterilidad, capacidad de crecimiento y reacción, aspecto, dureza y profundidad del agar.2 Control de Calidad de reactivos:

-Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio de microbiología lo constituyen los reactivos, tanto comerciales como de preparación doméstica, que son utilizados en la caracterización de microorganismos. Por ello, deben efectuarse controles diarios con las bacterias tipo y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto a almacenamiento de los reactivos, metodología de la prueba y tiempo de lectura. Es

recomendable que los reactivos comerciales sean examinados inmediatamente cuando se abre un nuevo lote o vial y llevar un registro de su funcionamiento.

-El registro de funcionamiento debe efectuarse en forma diaria o al menos cada vez que se efectúa la prueba.2 Control de calidad de las tinciones:

-La concentración de las soluciones de tinción, por efecto de la evaporación de los solventes o las variaciones introducidas en los métodos recomendados, pueden afectar los resultados de las tinciones para diferenciar microorganismos por su reacción a la tinción de Gram y la morfología, tintes para cápsulas, esporas, etc.

-El control de calidad de éstos tintes debe realizarse primero con cada nuevo lote, luego basta con un control semanal para mantener un grado de seguridad apropiado en su uso.Para facilitar el control de los tintes, se recomienda preparar placas con microorganismos aislados en el trabajo rutinario o cepas de la ATCC frescas, tomado en cuenta aquellos que pudieran ser más útiles según la tinción a evaluar.

-Para el control diario de la tinción de Gram, se recomienda el uso de una cepa ATCC de Staphylococcus aureus y de Escherichia coli.

-Es necesario llevar un registro de estos controles.2 Control de calidad de equipos:

-Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio deben estar respaldados por un programa de control de calidad y de mantenimiento preventivo y correctivo, basados en las instrucciones del fabricante y los procedimientos establecidos. Debe mantenerse un registro de todo lo realizado al respecto, con el nombre del instrumento, fecha, resultado y comentarios.

-Debe redactarse un manual de procedimientos operacionales que incluya: -Listado de los equipos con nombre, marca, modelo, número de serie, fecha de recibo y número de inventario de la institución.

-Registro del mantenimiento preventivo y correctivo, periodicidad de la inspección y fallas del instrumento.

-Debe incluirse un apartado de corrección de fallas y acciones correctivas efectuadas.

-Instrucciones de uso del instrumento, redactadas en forma clara y en el idioma de los usuarios. Incluir precauciones de seguridad, procedimientos de limpieza, cuidado del instrumento y acciones correctivas.2

Control de calidad externo:

-Es recomendable que los laboratorios de microbiología puedan participar en programas de evaluación externa. Estos programas miden la capacidad del laboratorio para evaluar una muestra desconocida y llegar a un resultado seguro.

-Estos controles de calidad externos pueden ser nacionales o internacionales. 2

3. Aclarar sobre medidas preventivas y medidas correctivas, citar algunos ejemplos.

Una medida correctiva es aquella que llevamos a cabo para eliminar la causa de un problema. Las correcciones atacan los problemas, las medidas correctivas sus causas.

Las medidas preventivas se anticipan a la causa, y pretenden eliminarla antes de su existencia. Evitan los problemas identificando los riesgos. Cualquier acción que disminuya un riesgo es una acción preventiva.2

Medida correctiva: retirar un reactivo que este vencido / arreglar un equipo que se haya dañado o esté funcionando como no debe.

Medida preventiva: realizar un inventario de los reactivos del laboratorio para evitar utilizar materiales vencidos que hagan perder tiempo y dinero. / Hacerles revisión y mantenimiento

periódico

a

todos

los

equipos

del

laboratorio. 2

REFERENCIAS 1. Chlaep.

NORMAS

DE

MICROBIOLOGÍA.

SEGURIDAD [En

EN

línea].

EL

LABORATORIO Disponible

DE en:

http://www.chlaep.org.uy/pdf/normas_de_bioseguridad.pdf [Consultado el 15 de noviembre de 2020].

2. Marco Luis Herrera y Marlen Campos. Control de la Calidad para un Laboratorio de

Microbiología.

[En

línea].

https://www.scielo.sa.cr/pdf/rmhnn/v40n1/3567.pdf noviembre de 2020].

Disponible [Consultado

el

en: 15

de

Lucia Luzardo 19171048 Maily Useche 19171048

Términos NORMAS DE BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO Y PAUTAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Definiciones

En la esfera de la desinfección y la esterilización se utilizan muchos términos diferentes. Los siguientes se encuentran entre los más comunes en el campo de la bioseguridad: Antimicrobiano – Agente que mata los microorganismos o suprime su crecimiento y proliferación.

Antiséptico – Sustancia que inhibe el crecimiento y el desarrollo de microorganismos, pero no necesariamente los mata. Los antisépticos suelen aplicarse a las superficies corporales.

Biocida – Término general para cualquier agente que mate organismos.

Descontaminación – Cualquier proceso utilizado para eliminar o matar microorganismos. También se utiliza para referirse a la eliminación o neutralización de sustancias químicas peligrosas y materiales radioactivos.

Desinfección – Medio físico o químico de matar microorganismos, pero no necesariamente esporas.

Desinfectante – Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizada para matar microorganismos, pero no necesariamente esporas. Los desinfectantes suelen aplicarse a superficies u objetos inanimados.

Esporicida – Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizadas para matar microorganismos y esporas.

Esterilización – Proceso que mata o elimina todas las clases de microorganismos y esporas.

Germicida químico – Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizada para matar microorganismos.

Microbicida – Sustancia o mezcla de sustancias químicas que mata microorganismos. Este término se utiliza a menudo en lugar de «biocida», «germicida químico» o «antimicrobiano»

Fuente: https://www.who.int/topics/medical_waste/manual_bioseguridad_laboratorio.pdf ?ua=1

GUÍA 2: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Manual de calidad

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Guía de Laboratorio: Tema:

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2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Objetivo

Desarrollar habilidades en la preparación de medios de cultivo.

Conocer los diferentes medios de cultivo de acuerdo a su clasificación y función.

Fundamento

La recuperación, mantenimiento e identificación de un microorganismo se realiza mediante su siembra en diferentes medios de cultivo, los cuales deben ser usados conociendo sus fundamentos para su aislamiento de acuerdo a sus necesidades nutricionales, atmosféricas y todas sus características de crecimiento para facilitarle su desarrollo.

Es muy importante que el estudiante empiece a conocer los diferentes medios de cultivo, su función y forma de preparación, así como los cuidados para su mantenimiento.

Materiales y Equipos Item 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tipo EQUIP MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT EQUIP

Descripción Balanza Vidrio de reloj Baja lenguas o espátula Erlenmeyer Probetas Vasos de precipitado Pipetas de 10 ml Pipeteador Estufa Reactivos Descripción Medios de cultivo deshidratados Agua destilada Cinta indicadora de pH NaOH 0.1N HCl 0.1 N

Ítem 1 2 3 4 5

Procedimiento Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

1.

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3.

4.

Fecha:

UC – BAC – MCG – GL 001

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Descripción Leer las instrucciones dadas por la casa comercial adjuntas a la etiqueta del recipiente que contiene el medio de cultivo liofilizado.

2

Realizar los cálculos correspondientes de la cantidad de medio necesario para el volumen a preparar.

3

Disolver en un vaso de precipitado la cantidad en gramos de medio más el agua destilada, homogenizar correctamente Calentar hasta ebullición y esterilizar de ser necesario.

Dejar enfriar a 50°C si es medio de cultivo sólido y servir en cajas estériles

6

Si es medio de cultivo líquido o semisólido servir en tubos tapa rosca en las cantidades requeridas según sea el caso y esterilizar

7

Guardar en refrigeración o usar según necesidades del laboratorio.

Consulta Investigue sobre los medios de cultivo preparados, cuál puede ser su uso y cómo se comportan los microorganismos que ahí se espera que crezcan.

Qué es el un indicador.

Qué es un inhibidor.

Cuál es la función de la peptona en los medios de cultivo Cómo se clasifican los medios de cultivo de acuerdo a su naturaleza. Dé cinco ejemplos de cada uno.

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

Manual de calidad

2019

Paso 1

4 5

1.

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2 de Febrero de 2019

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CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

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GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

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Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 6 de 9

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires FORBES, BETTY. (2009). Diagnóstico Microbiológico. Doceava ediciòn. Editorial Médica Panamericana.

Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiologico. Sexta ediciòn. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2009). Brock: Biología de los microorganismos. (Doceava edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

ANEXOS No. Anexo

Descripción

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

Lucia Luzardo 19171049, Maily Useche 19171005

1. Investigue sobre los medios de cultivo preparados, cuál puede ser su uso y cómo se comportan los microorganismos que ahí se espera que crezcan R: Medios de cultivos preparados en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

Pueden ser usados porque son preparados estériles que contienen sustancias necesarias para el desarrollo de los microorganismos.1

Las colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características ayuda a su identificación. En el medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos.1

2. ¿Qué es un indicador?

R: Los indicadores son sustancias químicas que varían de color según el pH del medio. Se utilizan en los medios diferenciales y permiten visualizar, por cambios de color del medio de cultivo o de las colonias, la ocurrencia de distintas reacciones bioquímicas.2

3. ¿Qué es un inhibidor?

R: Un inhibidor es un compuesto que frena el crecimiento microbiano en un medio de cultivo, además la actividad antimicrobiana se mide determinando la cantidad más pequeña que se necesita de un agente para inhibir el crecimiento de un

microorganismo, valor llamado Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), de manera que cuanto más pequeño sea este valor, mayor potencia antimicrobiana tiene el compuesto. 3

4. Cuál es la función de la peptona en los medios de cultivo?

R: las peptonas son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Las peptonas son fuente de nitrógeno y, en ausencia de hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo, cumplen la función de fuente de carbono y energía.4

5. Cómo se clasifican los medios de cultivo de acuerdo a su naturaleza. ¿Dé cinco ejemplos de cada uno?

R: Medios naturales o complejos: Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes. Ej: trozo de papa, jugo de vegetales, jugo de manzana, Leche, huevo.5 Medios sintéticos o químicamente definidos Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto se puede conocer exactamente su composición cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales. 5 Semisintéticos son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura, extracto de carne.5

REFERENCIAS 1

Ecured.

Medio

de

cultivo

(Microbiología).

[En

línea].

Disponible

en:

https://www.ecured.cu/Medio_de_cultivo_(Microbiolog%C3%ADa) [Consultado el 23 de agosto de 2020].

2Microbiologiaparahumanos.

Medios de Cultivo. [En línea]. Disponible en:

https://microbiologiaparahumanos.wordpress.com/medios-de-cultivo/

[Consultado

el 23 de agosto de 2020].

3

Diario de Leon. Inhibición de las bacterias. 2010. Consultado el 22 de agosto del

2020. Disponible en: https://www.diariodeleon.es/articulo/sociedad/inhibicion-debacterias/201002260400001086279.html 4Diaz,

Y. Peptona. Fundación Universitaria de Popayán Ciencias Naturales Ecología

Popayán.

5Universidad

Nacional del Nordeste Trabajo Práctico Nº 4 FACULTAD DE

AGROINDUSTRIAS Medios de cultivo Microbiología General- Carrera Farmacia 2006.

padlet.com/asbleka/hak81m605yre84mh

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Hecho con un cálido abrazo ASBLEIDE KARINA 24 DE AGOSTO DE 2020 00:29

Grupo 1 Uso de los medios de cultivo GRUPO 1

Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos especí cos.2 Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características

Mariangel Barrientos 19171041 Lucia Luzardo 19171049 Laura Caceres 19171021 Paola Laguado 19171027 Jose Lastra 19171016 1- Investigue sobre los medios de cultivo preparados, cuál puede ser su uso y cómo se comportan los microorganismos que ahí se espera que crezcan.

-Un medio de cultivo es una técnica de laboratorio que consta de un gel o una solución que contiene los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo no o granular antes de

siológicas de los microorganismos. 2

-Bibliográfica11-Schlegel, Métodos de cultivo y condiciones de crecimiento (1976). «6». Microbiología general. Ediciones Omega S.A. ISBN 84-282-1030-6.

2- Ecured. Medio de cultivo (Microbiología). [En línea].

Disponible en: https://www.ecured.cu/Medio_de_cultivo_(Microbiolog%C3%ADa) [Consultado el 23 de agosto de 2020].

ser preparados.1 Los medios de cultivos preparados en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se pre ere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simpli car el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

Pueden ser usados porque son preparados estériles que contienen sustancias necesarias para el desarrollo de los microorganismos.

Las colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características ayuda a su identi cación. En el medio líquido las bacterias producen modi caciones de interés para su clasi cación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona super cial, si producen pigmentos. Según los organismos que se espera que crezcan en el pueden clasi carse en: Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.2

grupo 2 Que es un indicador, que es inhibidor, funciones de la peptona en los medios de cultivo

integrantes CAMILO PEÑARANDA ANGIE PARADA JULIAN RAMIREZ YERSON MOTA ISIS ROZO ¿Que es un indicador? Un

Viviana Sanabria Maily Useche

indicador posee la cualidad de indicar (por medio de colores) si una sustancia es un ácido o base débil. Si un indicador se añade a una muestra, generalmente una disolución, sobre la que se desea

Daniela Parra

realizar el análisis, se produce un cambio químico en el que es apreciable, generalmente, un cambio de color en el indicador.1 1 Universidad Nacional del Nordeste. Trabajo Práctico N.º 4.

naturaleza?.De cinco ejemplos de cada uno.

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).

-Líquidos: contienen nutrientes a los cuales se les adicionan

FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS. Medios de cultivo, Microbiología General. Año 2006. ¿Que es un inhibidor? Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y

sustancias con la capacidad de mantener estables un pH, entre ellos podemos encontrar el caldo nutritivo y caldo peptona.

-Solidos: se obtienen agregando agar (sustancia de tipo

disminuyen su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un agente patógeno o corregir un desequilibrio metabólico, muchos medicamentos actúan como inhibidores

polisacárido que se obtiene de algas marinas) a un medio liquido determinado. Al tener un medio sólido, nos facilita obtener colonias bacterianas aisladas.

enzimáticos. También son usados como herbicidas y pesticidas.

Sin embargo, no todas las moléculas que se unen a las enzimas son inhibidores. Los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima

-Semisólidos: similares a los medios sólidos, la única diferencia es que a estos se les disminuye la cantidad de agar, lo que permite conservar cepas bacterianas y la observación y registro de

de forma covalente y modi can su estructura química a nivel de residuos esenciales de los aminoácidos necesarios para la actividad enzimática.2 2 Shapiro R, Vallee BL. Interaction of human placental ribonuclease with placental ribonuclease inhibitor.

bacterias móviles.

SEGÚN SU NATURALEZA Medios naturales o complejos: Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente se

Biochemistry. (Internet). (Citado el 24 de agosto de 2020).

Funciones de la peptona en los medios de cultivo Para uso en laboratorio, la peptona se presenta como un polvo amorfo, o bien como escamas o masas irregulares, esponjosas, de color blanco amarillento o amarillo parduzco; con olor característico que recuerda al de la carne asada; de sabor amargo (peptona

complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes. Ejemplo: trozo de papa, jugo de vegetales, jugo de manzana, Leche, huevo.

Medios sintéticos o químicamente de nidos Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto se puede

pancreática) o amargo y salado (peptona pépsica). Es muy higroscópica y por tanto se altera con facilidad en contacto con aire húmedo. 3 3 Patrick R. Murray; Ken S. Rosenthal; Microbiología Médica (6a edición). (Internet). (Citado el 24 de agosto de 2020)

conocer exactamente su composición cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.

Semisintéticos son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura, extracto de carne.

grupo 3 Como se clasifican los medios e cultivo de acuerdo a su naturaleza

Referencias 1.Universidad Nacional del Nordeste Trabajo Práctico Nº 4 FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS Medios de cultivo Microbiología General- Carrera Farmacia 2006.

2.Ecured. Medio de cultivo (Microbiología). [En línea]. Disponible en: https://www.ecured.cu/index.php?

Integrantes: Nicolle Villa Dana Villamizar Jeimy Sayago

5.¿Como se clasi can los medios de cultivo de acuerdo a su

title=Medio_de_cultivo_(Microbiolog%C3%ADa)&oldid=3531553 [Consultado el 26 de agosto de 2020].

3. Edulabc. Medio de cultivo. [En línea]. Disponible a partir de: https://edulabc.com.mx/medios-de-cultivo/ [consultado el 26 de agosto de 2020],.

※※※※※※

Forma Forma circular

Imagen

Forma irregular

Forma rizoide

Forma Filamentosa

Forma en roseta

Bordes Borde entero

Borde dentado

Borde filamentoso

Borde digitado

Borde Lacerado

Borde rizoide

Borde lobulado

Elevaciรณn Elevaciรณn convexa

Elevaciรณn pulvinadas

Elevaciรณn plana

Elevaciรณn umbilicada

Elevaciรณn crateriforme

Textura Textura Lisa

Textura escamosa

Textura rugosa

Textura plegada

Textura granular

Cromogénesis Cromogénesis amarilla

Cromogénesis fucsia

Cromogénesis Rojo

Cromogénesis bruna

Cromogénesis blanca

Características complementarias Opacas y translucidas

Gotas de agua

GUÍA 3: UBICUIDAD MICROBIANA Y MÉTODOS DE SIEMBRA

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 7 de 9

Código Guía de Laboratorio: 3 Tema: Ubicuidad microbiana y métodos de siembra Objetivo • • • •

Conocer los diferentes métodos de siembra que se utilizan en el laboratorio de microbiología.

Inocular un cultivo microbiano en diferentes medios de cultivo y observar sus características de crecimiento.

Determinar cuál método tiene mayor efectividad para el agotamiento del cultivo hasta obtener colonias aisladas.

Establecer la presencia de microorganismos en diferentes ambientes de la naturaleza, mediante la observación del crecimiento microbiano en diversos medios de cultivo.

Fundamento

Las técnicas de cultivo microbiano sirven para aislar un tipo de microorganismos específicos de una fuente natural, cuantificar el número de microorganismos que se encuentren en un material dado (rumen, leche, agua, entre otros), así como de organismos vivos como animales, plantas y el hombre; también nos ayuda a incrementar y mantener el número de poblaciones microbianas en condiciones estables.

Hay ciertos procedimientos que son indispensables para los bacteriólogos y microbiólogos, como las técnicas estándar del vaciado en placa y el estriado en placa. Estos métodos tienen la virtud de ser eficaces tanto para la identificación como para la enumeración de diferentes microorganismos presentes en diferentes muestras a analizar.

Materiales y Equipos Item 1 2 3 4 5 6

Tipo MAT MAT MAT MAT MAT EQUIP

Descripción Cultivos bacterianos Asas bacteriológicas curvas y rectas Cinta tirro Lápiz graso Mechero Incubadora

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Paso 1

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

7

EQUIP

Ítem 01

Fecha:

Manual de calidad Pag 8 de 9

Estereoscopio Reactivos

Descripción Medios de cultivo: sólidos, semisólidos y líquidos Procedimiento Descripción Rotular cada uno de los medios entregados con el grupo de trabajo, fecha, medio de cultivo y cepa que va a sembrar en el medio de cultivo y definir que método o técnica de siembra va utilizar dependiendo de si es sólido, semisólido o líquido.

2 3

Realizar cada siembra frente del mechero, previamente desinfectar el área de trabajo.

Flamear el asa de inoculación y boca de los tubos de ensayo a trabajar. Dejar enfriar el asa cerca del mechero para evitar su contaminación.

4

Tomar el cultivo a sembrar o repicar y proceda a realizarla.

5 6 7 8

Flamear nuevamente el asa y la boca del tubo de ensayo de trabajo.

Incubar a 37°C/24 – 48 horas o temperatura óptima de los microorganismos trabajados.

Realizar observación del cultivo y analizar morfologías de las diferentes colonias Tenga en cuenta los siguientes cuadros para determinar las características de las colonias: forma, borde, elevación, tamaño, color.

Ilustración 1. Forma

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 9 de 9

Ilustración 2. Elevaciòn

Ilustración 3. Forma

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 10 de 9

Ilustración 4. Borde

Consulta 1. Realice esquemas de cada una de los métodos o técnicas de siembra mencionadas anteriormente: (rejilla, masiva, zig-zag, agotamiento, punción o picadura). Indique otras recomendaciones a tener en cuenta para la correcta aplicación de la metodología.

2. En qué consiste la selección de una colonia?

3. Mencione o haga una breve reseña de quienes propusieron los métodos de siembra que hoy en día se conocen.

4. Defina: técnica aséptica, cultivo puro, condiciones anaerobias y aerobias.

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

FORBES, BETTY. (2009). Diagnostico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Médica Panamericana.

Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiológico. Sexta edición. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2009). Brock: Biología de los microorganismos. (Doceava edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

ANEXOS No. Anexo

Descripción

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

Lucia Luzardo 19171049, Maily Useche 19171005

1. Realice esquemas de cada una de los métodos o técnicas de siembra mencionadas anteriormente: (rejilla, masiva, zig-zag, agotamiento, punción o picadura). Indique otras recomendaciones a tener en cuenta para la correcta aplicación de la metodología.

En placa

Siembra masiva: Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de cultivo sólido imprimiéndo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar.1

Técnica de siembra por estría en placa (zigzag); Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente

de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos.1

Siembra en rejilla. Realice una estría que atraviese el centro del agar. Luego realice estrías en ángulo recto con respecto a la estría inicial. Voltee el agar en ángulo de 90 grados y realice estría hasta cubrir todo el agar. 2

Siembra por agotamiento: La obtención de un cultivo puro se hace mediante una técnica de aislamiento. La técnica de aislamiento más utilizada consiste en sembrar en un medio de cultivo sólido en placa de tal manera que los microorganismos generen colonias separadas ("Aislamiento por agotamiento en estrías"). Se sabe que cada colonia procede de una sola célula. Por lo tanto el cultivo descendiente de una colonia es un cultivo puro. Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Al incubar ésta, cada una de las bacterias originará una colonia. Consiste en tomar con asa o aguja de siembra el cultivo de partida y sembrarlo en agar en placa haciendo tandas de estrías sucesivas tal y como se muestra en la figura. Entre cada tanda de estrías debe esterilizarse el asa de forma que la siguiente estría se hace con los microorganismos que arrastramos de la anterior. De esta forma conseguimos que en las sucesivas estrías sea cada vez menor el número de células que arrastramos con el asa. Después de llevar la placa a incubar obtendremos una placa como la que se muestra en la foto en la que en las últimas estrías hemos conseguido colonias perfectamente aisladas unas de otras. Una vez que dispongamos de colonias aisladas es preciso cerciorarse de que cada una esta

formada por un solo tipo de microorganismo. Para ello realizaremos una nueva siembra de esta colonia por agotamiento en estrías sobre una nueva placa de Petri. 3

En tubo

Siembra por punción: Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la aguja de platino y el medio de cultivo sólido, generalmente, en tubo de ensayo.

Las manipulaciones y la observancia de las precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de cultivo. 1

Siembra por picadura: Asa recta, tomar la muestra, sembrar en agar semisólido, en el tubo de ensayo hasta que la muestra quede bien impregnada al agar. 1

2. ¿En qué consiste la selección de una colonia?

Las bacterias se seleccionan en placas con antibióticos. Las bacterias con un plásmido son resistentes a los antibióticos y cada una formará una colonia. Las colonias con el plásmido adecuado pueden cultivarse para producir grandes cultivos de bacterias idénticas que se utilizan para producir plásmido o hacer proteína. 4

3. Mencione o haga una breve reseña de quienes propusieron los métodos de siembra que hoy en día se conocen.

Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el micólogo Brefeld, quien logró aislar esporas de hongos y cultivarlas sobre medios sólidos a base de gelatina. Por su menor tamaño, este método se hacía inviable para las bacterias, por lo que se recurrió a un método basado en diluciones: Lister, en 1878 realizó diluciones secuenciales de cultivos mixtos, hasta lograr muestras en las que existía una sola célula. Pero la técnica era larga y tediosa y, además, normalmente sólo se lograban aislar células del tipo bacteriano más abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvió para confirmar la naturaleza "particulada" de los agentes de

las fermentaciones. Por aquella época Koch buscaba con ahínco métodos más sencillos de cultivo puro, indispensables para proseguir sus investigaciones sobre bacterias patógenas. Primero empleó rodajas de patata como sustrato sólido nutritivo sobre el que se podían desarrollar colonias macroscópicas de bacterias que presentaban morfología característica, que Koch interpretó como resultantes del crecimiento a partir de células individuales. Pero enseguida recurrió a compactar el típico caldo de cultivo a partir de carne (diseñado por Loeffler) añadiéndole gelatina (1881). El medio sólido así logrado era transparente, lo que permitía visualizar fácilmente los rasgos coloniales, y contenía los nutrientes adecuados para el crecimiento de una amplia gama de bacterias. Éstas eran inoculadas en la superficie del medio con un hilo de platino pasado previamente por la llama, por la técnica de siembra en estría.

5

4. Defina: técnica aséptica, cultivo puro, condiciones anaerobias y aerobias.

La Técnica Aséptica: La constituyen un conjunto de procedimientos y actividades que se realizan con el fin de disminuir al mínimo las posibilidades de contaminación microbiana durante la atención de pacientes. Los procedimientos que incluyen la Técnica Aséptica, son parte de medidas generales comprobadas efectivas que deben estar siempre presentes, al momento de realizar procedimientos invasivos durante la atención clínica.6 Cultivo puro: Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismos. Sólo después de haber obtenido un cultivo puro se puede identificar un microorganismo y/o estudiar sus características bioquímicas o de otro tipo. La obtención de un cultivo puro se hace mediante una técnica de aislamiento.7 Condiciones anaerobias: Estados del agua en la cual la concentración de oxígeno disuelto es demasiado baja para permitir la existencia de bacterias aeróbicas. 8 Condiciones aerobias: los organismos que pueden vivir o desarrollarse en presencia de oxígeno diatómico. La aerobiosis es un proceso de respiración celular,

en el que se usa el oxígeno para la oxidación del sustrato (por ejemplo, azúcares y grasas, para obtener energía).9

REFERENCIAS 1.- Wix.com. Técnicas y tipo de sembrado en placa y tubo. [En línea]. Disponible en: https://labdemicrobiologia.wixsite.com/scientist-site/t-cnicas-y-tipos-de-sembrado [Consultado el 28 de agosto de 2020].

2.- Aulavirtual. Técnica aséptica. Obtención de un cultivo puro. Técnicas de siembra.

[En

línea].

Disponible

en:

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u 2c5s2.htm#:~:text=La%20t%C3%A9cnica%20de%20aislamiento%20m%C3%A1s, por%20agotamiento%20en%20estr%C3%ADas%22).&text=Al%20incubar%20%C 3%A9sta%20%2C%20cada%20una%20de%20las%20bacterias%20originar%C3 %A1%20una%20colonia. [Consultado el 28 de agosto de 2020].

3.-

Blogpost.

Curso

de

Microbiología.

[En

línea].

Disponible

en:

http://elblogsbuts.blogspot.com/2014/10/siembra-de-medio-solido-medioliquido.html. [Consultado el 28 de agosto de 2020].

4.-

Khanacademy.

Selección

de

Colonias.

[En

línea].

Disponible

en:

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloningtutorial/a/bacterial-transformation-selection [Consultado el 28 de agosto de 2020].

5.- Iáñez, E. Curso de Microbiología General. [En línea]. Disponible en: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/01_micro.htm. [Consultado el 28 de agosto de 2020].

6.- Hostipal del niño roberto del rio. Técnica Aséptica. [En línea]. Disponible en: https://www.hrrio.cl/documentos/eLearningIIH/profesionales/tecnicaaseptica.pdf [Consultado el 28 de agosto de 2020] 7.- Aulavirtualusal. ¿Qué es un cultivo puro? [En línea]. Disponible en: http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u 2c5s2.htm#:~:text=Un%20cultivo%20puro%20es%20aquel,bioqu%C3%ADmicas% 20o% 20de% 20otro% 20tipo. & Text = La% 20obtenci% C3% B3n% 20de% 20un%

20cultivo, mediante% 20una% 20t% C3% A9cnica% 20de% 20aislamiento.

[Consultado el 28 de agosto de 2020].

8.-

Gidahatari.

Condiciones

anaeróbicas.

[En

línea].

Disponible

en:

https://gidahatari.com/wh-es/condicionesanaerobicas#:~:text=Estados%20del%20agua%20en%20la,la%20existencia%20d e%20bacterias%20aer%C3%B3bicas. [Consultado el 28 de agosto de 2020].

9.- Lagua. ¿En qué consiste las condiciones aerobias?. [En línea]. Disponible en: https://www.iagua.es/noticias/espana/barmatec/16/09/15/que-consiste-zonaaerobia [Consultado el 28 de agosto de 2020].

padlet.com/asbleka/vxgwusq9z41bhrw3

Métodos de siembra grupo A Hecho con una pizca de ingenio ASBLEIDE KARINA 19 DE AGOSTO DE 2020 11:33

PREGUNTA 2 (GRUPO 3-4) INTEGRANTES: Yeimi Sayago Velasquez 19171020 Paola Laguado Contreras 19171027 Maily Paola Useche Acevedo 19171005 Lucia Luzardo Pardo 19171049 ¿En qué consiste la selección de una colonia?

Se trata de obtener el cultivo de un solo tipo microbiano en un medio de cultivo, por ejemplo, en un tubo inclinado de agar nutritivo. Para ello, se obtiene una pequeña cantidad de masa bacteriana de una colonia separada en el aislamiento. Con ella se inocula un nuevo medio de cultivo haciendo estrías muy juntas. La incubación en condiciones adecuadas proporcionará un cultivo puro. (1) También las bacterias se seleccionan en placas con antibióticos, aquellas que cuentan con un plásmido son resistentes a los antibióticos y cada una formará una colonia. Las colonias con el plásmido adecuado pueden cultivarse para producir grandes cultivos de bacterias idénticas que se utilizan para producir plásmido o hacer proteína. (2) Referencias Bibliográ cas 1.- Sanz, S. Práctica de Microbiología. Universidad de la Rioja.

Servicio de publicaciones. España. 2011 [En línea]. Disponible en: le:///C:/Users/USUARIO/Downloads/DialnetPracticasDeMicrobiologia-100835.pdf.

2.- Khanacademy. Selección de Colonias. [En línea]. Disponible en: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dnatechnology/dna-cloning-tutorial/a/bacterial-transformationselection [Consultado el 28 de agosto de 2020].

Grupo 1 Laura Cacères Mariangel Barriento Alex Hidalgo Danna Villamizar 1. Realice esquemas de cada una de los métodos o técnicas de siembra mencionadas anteriormente: (rejilla, masiva, zig-zag, agotamiento, punción o picadura). Indique otras recomendaciones a tener en cuenta para la correcta aplicación de la metodología.

Siembra masiva: Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la super cie del medio de cultivo sólido imprimiendo un movimiento en espiral.

La siembra masiva también se puede realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la super cie de una placa de agar.

Siembra por punción: Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la aguja de platino y el medio de cultivo sólido, generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia de las precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de cultivo.

Siembra por agotamiento: Primeramente, encendemos el mechero Bunsen para crear un ambiente de esterilidad. Con cuidado, destapamos uno de los tubos con medio líquido, ameamos su cuello, ameamos el asa de siembra e introducimos esta en el tubo, para coger el inoculo.

SIEMBRA POR ESTRÍA:Se inocula la muestra sobre un extremo de

la placa con un ansa y se extiende formando estrías sobre la super cie en varios sentidos, cada célula aislada se multiplicará

https://www.historiadelamedicina.org/petri.html 2. Medios de cultivo: historia, función, tipos, preparación - Lifeder

formando una colonia independiente, cada colonia representa un cultivo puro.

[Internet]. Lifeder. 2020 [cited 2 September 2020]. Available from: https://www.lifeder.com/medios-de-cultivo/

https://ladonabacteriablog.wordpress.com/2016/11/17/practica6-tecnicas-de-siembra/ https://docplayer.es/109622542-Tecnicas-de-siembra-parahongos-y-bacterias.html

PREGUNTA 3: GRUPO 5/6 INTEGRANTES: * Isis Rozo (19171018) * Angie Parada (19171009) * Yerson Mota (19171042) * Viviana Sanabria (19171004) Mencione o haga una breve reseña de quienes propusieron los métodos de siembra que hoy en día se conocen.

JULIUS RICHARD PETRI Médico y microbiólogo, se le ocurrió enfrentar dos discos de vidrio, uno un poco más grande que el otro, y formar una caja que,

PREGUNTA 4 ( GRUPO 7 - 8)

sin que su cierre fuese hermético, permitiese entrar el oxígeno y aislar su contenido de los residuos de la atmósfera. Ideó el médico alemán un mecanismo circular -hoy convertido en todo un imprescindible en todos los laboratorios del mundo-, que adoptó su apellido y ha pasado a la historia como placa de Petri. También

-Bryant peñaranda - Nicolle villa -Julian ramirez - Daniela Parra

se le conoce como cápsula de Petri o caja de Petri.

El invento de Julius Richard Petri permite la realización del cultivo bacteriano en condiciones controladas para llevar a cabo diversos experimentos cientí cos. Las placas de Petri fabricadas con vidrio pueden limpiarse y reutilizarse después de ser expuestas a temperaturas muy altas. Con ayuda de sus colaboradores, Robert

4. De na: técnica aséptica, cultivo puro, condiciones anaerobias y aerobias.

Koch logró ciertos avances: el diseño de la placa de Petri por Julius Richard Petri , que aún se usa en la actualidad; y Walter Hesse quien sustituyó la gelatina por agar–agar para preparar los medios de cultivo sólidos, lo cual fue muy relevante, ya que la gelatina era degradada por algunos microorganismos.

Bibliografía:

sus características bioquímicas o de otro tipo - Técnica aséptica: La Técnica Aséptica la constituyen un conjunto de procedimientos y actividades que se realizan con el n de disminuir al mínimo las posibilidades de contaminación microbiana durante la atención de pacientes.

1. José L. Fresquet Febrer, Universitat de València, marzo de 2019. historia de la medicina. Disponible en:

- Cultivo puro: Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismos. Sólo después de haber obtenido un cultivo puro se puede identi car un microorganismo y/o estudiar

• Los procedimientos que incluyen la Técnica Aséptica son parte de medidas generales comprobadas efectivas que deben estar siempre presentes, al momento de realizar procedimientos

invasivos durante la atención clínica.

0de%20otro%20tipo.&text=Por%20lo%20tanto%20el%20c ultivo,colonia%20es%20un%20cultivo%20puro.

- condiciones anaerobias: La palabra anaerobio signi ca "sin oxígeno". El término tiene muchos usos en medicina.

Las bacterias anaerobias son microorganismos que son capaces de sobrevivir y multiplicarse en ambientes que no tienen oxígeno. Por ejemplo, pueden proliferar en tejido humano lesionado que no esté recibiendo un ujo de sangre rica en oxígeno. Este tipo de bacterias causan infecciones como el tétanos y la gangrena. Las infecciones anaerobias normalmente causan abscesos (acumulación de pus), y la muerte del tejido. Muchas bacterias anaerobias producen enzimas que destruyen el tejido, y a veces libera toxinas poderosas.

- condiciones aerobias: organismo que necesita oxígeno para: Sobrevivir Crecer Trabajar apropiadamente las bacterias aerobias forman parte de un tipo de organismo que necesita de un ambiente que contenga oxígeno diatómico (un gas compuesto por dos átomos de oxígeno) para poder existir y desarrollarse adecuadamente, es decir, éstas bacterias necesitan oxígeno para la respiración celular.El metabolismo aerobio de muchos organismos es una consecuencia evolutiva de la fotosíntesis, que comenzó a liberar grandes cantidades de oxígeno y que inicialmente resultó tóxico para muchos seres vivientes.

BIBLIOGRAFIA : 1. http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia /unidades/curso/UNI_02/u2c5s2.htm#:~:text=Un%20cul tivo%20puro%20es%20aquel,bioqu%C3%ADmicas%20o%2

※※※※※※

2. https://www.hrrio.cl/documentos/eLearningIIH/profesio nales/tecnicaaseptica.pdf 3. -MEDLINE PLUS. Anaerobios, aerobios. 04 agosto 2020 4. https://www.slideshare.net/SergioBermudez7/bacteriasanaerobias-y-aerobias

GUÍA 4: MICROSCOPIO OPTICO

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Guía de Laboratorio: Tema:

Manual de calidad Pag 11 de 9

4 MICROSCOPIO OPTICO Objetivo

• • • •

Conocer el funcionamiento e importancia del microscopio óptico.

Realizar frotis bacterianos para realizar observaciones al microscopio.

Fortalecer el correcto manejo del microscopio realizando observaciones hasta 100X, indicando el funcionamiento de los tornillos macrométrico y micrométrico.

Reconocer las diferentes morfologías, agrupaciones y respuestas tintoriales de las bacterias.

Fundamento

EL MICROSCOPIO Para la observación de las células, tejidos u otras muestras, es necesario el uso del microscopio, ya que en su gran mayoría las células no son visibles a simple vista porque miden micrómetros (1 micrón = milésima parte de un milímetro).

Este aparato, insustituible en cualquier investigación científica, fue ideado y construido en el siglo XVII por el holandés Antón van Leeuwenhoek (1632-1723), siendo constantemente perfeccionado por su continua utilidad, hasta llegar al poderoso microscopio electrónico que hoy se utiliza.

La construcción de este aparato está basada en un fenómeno físico que es la refracción de la luz. Consta de dos partes: una mecánica y otra óptica.

Parte mecánica Está formada por un pie o soporte, que sirve para la estabilidad del aparato; por la platina, que es una pieza movible por dos tornillos laterales, donde se coloca la preparación microscópica, que se fija mediante dos pinzas o resortes y que posee un orificio circular en el centro por donde pasa la luz que ilumina la preparación; y por el brazo o columna, que es articulado y sirve para inclinar el microscopio o para trasportarlo.

Parte óptica Consta de dos partes principales (ocular y objetivo) y de partes accesorias (condensador, diafragma, tornillo macrométrico y tornillo micrométrico).

El ocular es el lugar por donde se mira y está formado por dos lentes ubicados en el extremo superior del tubo óptico.

El objetivo es también un sistema de lentes ubicado en el extremo inferior del tubo. Cada microscopio suele tener varios objetivos con lentes de distintos aumentos, que se disponen sobre una pieza giratoria llamada revólver.

El espejo es móvil y está situado debajo de la platina, tiene una cara cóncava (que se utiliza si se trabaja con Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 12 de 9

luz artificial) y una cara plana (que se utiliza si se trabaja con luz natural). Este espejo se adapta a la luz y la refleja hacia el objeto que se observa.

El diafragma, colocado entre la platina y el espejo, gradúa la cantidad de luz que ilumina el objeto.

El condensador es un lente que concentra la luz sobre el preparado.

Los tornillos macrométricos y micrométricos sirven para acercar o alejar el tubo óptico del preparado, para su perfecto enfoque. El primero es de movimientos más rápidos, y el segundo, más sensible, es de movimientos lentos.

Identifique cada una de las partes del microscopio en el esquema:

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Código:

Manual de calidad Pag 13 de 9

Materiales y Equipos Item 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tipo BIOL MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT

Descripción Cultivos bacterianos Asas bacteriológicas Mecheros Portaobjetos o láminas Cubreobjetos o laminillas Cinta tirro Lápiz graso o marcador de vidrio Dotación personal Micropreparados de Tinción de Acido alcohol resistentes (Tinción de Zielh – Neelsen) MAT Cubeta de descarte de colorantes EQUIP Microscopios Reactivos Tinción de Gram: Cristal violeta, lugol, alcohol acetona y safranina)

10 10 1 Ítem 1

A partir de los diferentes cultivos bacterianos realizar frotis o extendidos, realizar tinción de Gram y observar al microscopio.

Procedimiento Descripción

Paso 1

Se entregará un cultivo bacteriano por equipo de trabajo, se observarán las características macroscópicas del cultivo de acuerdo a lo aprendido en la clase anterior. En cuanto a tamaño, forma, pigmentación, borde, elevación y aspecto de las colonias.

2

1.

3

2.

3.

4 5 6 7 8 9

Descripción

Preparar el frotis bacteriano, colocando una gota de solución salina sobre la lámina si el cultivo procede de un medio sólido, si es a partir de un medio líquido colocar varias asadas y emulsionar, dejar secar al aire.

Fijar el extendido o frotis, con calor si la muestra procede de un medio sólido o con metanol si procede de un medio líquido Teñir con el colorante cristal violeta, dejar actuar por 1 minuto Lavar con agua el exceso de colorante Agregar lugol, dejar actuar por 1 minuto Lavar con agua el exceso de colorante Agregar alcohol acetona, por un periodo de 10 – 30 segundos Lavar con agua, eliminar siempre el exceso de agua

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código: 10 8 9

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 14 de 9

Teñir con safranina, dejar actuar por1 minuto Lavar con agua el exceso de colorante Dejar secar al aire o con la ayuda de un papel absorbente (sin frotar). Llevar al microscopio y observar hasta el objetivo de 100X. Tener siempre en cuenta las normas del buen enfoque.

Ilustración 5. Tinción de Gram

Graficar las observaciones y clasificar de acuerdo a la tinción de Gram correspondiente

Ilustración 6. Morfología y agrupaciones microscópicas bacterianas Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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Revisado por:

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CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

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GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 15 de 9

Consulta 1. Investigue características generales sobre los cultivos bacterianos trabajados 2. Por qué es importante trabajar cultivos jóvenes para la tinción de Gram. Investigue sobre la curva de crecimiento microbiano.

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires FORBES, BETTY. (2009). Diagnóstico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Médica Panamericana.

Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiologico. Sexta edición. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2009). Brock: Biología de los microorganismos. (Doceava edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

ANEXOS No. Anexo Descripción

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

Lucia Luzardo 19171049, Maily Useche 19171005

1. Investigue características generales sobre los cultivos bacterianos trabajados

Características:

Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne.1 Las características morfológicas de las colonias obtenidas en los cultivos bacterianos pueden ser muy variadas.

Las colonias pueden ser muy pequeñas, moderadas o grandes y su aspecto puede ser seco o mucoide, brillante u opaca. Según la textura puede variar entre lisa y rugosa y, según la forma, pueden ser circulares, planas, convexas.1 Según el color pueden ser: incoloras, blancas, amarillas, rosadas, fucsias, rojas, naranja, beige, grisáceas, verdosas, marrón, negra o con brillo metálico, dependiendo de la bacteria involucrada y del medio de cultivo utilizado.1 Los bordes de las colonias pueden ser regulares o irregulares. Otras, en cambio, pueden presentar una película uniforme que se distribuye en casi la totalidad del medio denominada «swarming». Esto es característico de Proteus sp. 1 Algunos cultivos bacterianos emiten olores que son bastante característicos de la especie involucrada. Por ejemplo, un cultivo de Pseudomonas aeruginosa tiene un característico olor a frutas, mientras que el género Proteus presenta un olor característicamente putrefacto.1

2. Por qué es importante trabajar cultivos jóvenes para la tinción de Gram.

Investigue sobre la curva de crecimiento microbiano.

El laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de referencia para evaluar la calidad de los medios de cultivo, aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo y validación de métodos microbiológicos, ya que mientras más joven sea el cultivo se van a poder realizar tinciones como la tinción de Gram ya que n estos tipos de tinción es muy importante realizarlas sobre cultivos jóvenes, ya que los cultivos viejos pueden dar resultados erróneos (se pierde la positividad). 2

Para medir el crecimiento que bacteriano que tiene un cultivo se utiliza la curva de crecimiento microbiano que resulta de la representación gráfica de la determinación periódica del número de células viables por mililitro que existen en un líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo que ha crecido previamente hasta la saturación.3 ● Fase lag: Representa el tiempo necesario para reiniciar el ciclo celular después de un periodo de ayuno nutrimental.

3

● Fase exponencial O de crecimiento balanceado, representa el periodo en el que hay suficientes nutrimentos; las bacterias recuperan el ciclo celular e incrementan su número exponencialmente.

3

● Fase estacionaria Representa el periodo de crecimiento nulo. Se define operacionalmente como el momento en el que el número de células en el cultivo no varía. 3 ● Fase de muerte.

Figura 1: Curva de crecimiento bacteriano3

REFERENCIA 1. Lifeder. Cultivo de bacterias: tipos, características, métodos, requerimientos.

[En línea].

Disponible en:

https://www.lifeder.com/cultivo-de-bacterias/

[Consultado el 5 de septiembre de 2020].

2. Cuesta, A. Cultivos de Referencia Norma ISO 17025. [En línea]. Disponible en:http://www.fao.org/tempref/GI/Reserved/FTP_FaoRlc/old/prior/comagric/ codex/rla3013/pdf/aseg4.pdf 3. Infanzón, B; Rojas, A. Curva de crecimiento bacteriano en la producción de proteínas recombinantes. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Universidad Nacional de Asunción. 2016. [En línea]. Disponible en: https://www.conacyt.gov.py/sites/default/files/Transferencia_de_conocimient os_Liz_Lopez_2015.pdf

GUÍA 5: TÉCNICAS DE TINCIÓN: TINCIÓN DE GRAM

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 16 de 9

Código Guía de Laboratorio: 5 Tema: Técnicas de tinción: Tinción de Gram Objetivo •

Reconocer el fundamento de la Tinción de Gram y establecer criterios para su buen manejo.

Fundamento

La tinción de Gram, fue desarrollada por el bacteriólogo Christiam Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido, la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realizan para cualquier identificación bacteriana, dividiéndolas en Gram positivas y Gram negativas.

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de ácido teicoico, pobre en moléculas de grasa. Por el contrario las Gram negativas poseen una delgada capa de peptidoglicano en su pared, además de lipoproteínas y lipopolisacaridos. Por lo tanto, aquellas con una capa delgada de peptidoglicano (gram negativas) pierden el complejo cristal violeta – lugol por acción del alcohol acetona, permitiendo de esta forma diferenciarlas de las Gram positivas por el colorante de contraste: safranina o fuscina.

Esta tinción es el primer paso para poder identificar un cultivo bacteriano.

Ilustración 7. Tinción de Gram

Materiales y Equipos Ítem 1

Tipo BIOL

Descripción Cultivos bacterianos

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Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

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GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión:

001

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Código: 2 3 4 5 6

Manual de calidad Pag 17 de 9

MAT MAT MAT MAT EQUIP

Ítem 1 2 3 Paso 1 4.

5.

6.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fecha:

Asas bacteriológicas curvas y rectas Mechero Laminas Laminillas Microscopio Reactivos Descripción Colorantes: Cristal violeta, lugol. Safranina Alcohol acetona Aceite de inmersión Procedimiento Descripción Preparar el frotis bacteriano, colocando una gota de solución salina sobre la lámina si el cultivo procede de un medio sólido, si es a partir de un medio líquido colocar varias asadas y emulsionar, dejar secar al aire.

Fijar el extendido o frotis, con calor si la muestra procede de un medio sólido o con metanol si procede de un medio líquido Teñir con el colorante cristal violeta, dejar actuar por 1 minuto Lavar con agua el exceso de colorante Agregar lugol, dejar actuar por 1 minuto Lavar con agua el exceso de colorante Agregar alcohol acetona, por un periodo de 10 – 30 segundos Lavar con agua Reñir con safranina, dejar actuar por1 minuto Lavar con agua el exceso de colorante Dejar secar al aire o con la ayuda de un papel absorbente (sin frotar)

Ilustración 8. Tinción de Gram

12

Observar al microscopio, teniendo en cuenta recomendaciones para un buen enfoque Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

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CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

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GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código: 13

001

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Manual de calidad

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Pag 18 de 9

Graficar las observaciones y clasificar de acuerdo a la tinción de Gram correspondiente

Ilustración 9. Morfología y agrupaciones microscópicas bacterianas

Consulta 1. Cuál es la importancia de la composición de las paredes bacterianas en la respuesta tintorial.

2. Consulte sobre las diferentes tinciones para bacterias ácido alcohol resistentes, en qué consisten.

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires FORBES, BETTY. (2009). Diagnóstico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Médica Panamericana.

Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiologico. Sexta ediciòn. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2003). Brock: Biología de los microorganismos. (Décima edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

ANEXOS No. Anexo

Descripción

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

Lucia Luzardo 19171049, Maily Useche 19171005

1. Cuál es la importancia de la composición de las paredes bacterianas en la respuesta tintorial.

Tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas poseen una pared celular de peptidoglicanos que les confieren su forma característica y les provee de protección mecánica. La pared celular bacteriana rodea al protoplasto. ● La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta coloración es un criterio de clasificación importante correlacionable con otras propiedades bacterianas. Unos pocos organismos son Gram-variables. ● En contraste en las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de peptidoglicano no impide la extracción por el solvente del complejo.

2. Consulte sobre las diferentes tinciones para bacterias ácido alcohol resistentes, en qué consisten.

La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica

comúnmente

usada

en

el

diagnóstico rutinario de tuberculosis.

Esta tinción permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son. La sensibilidad de esta tinción para identificar

bacilos

ácido-alcohol

resistentes es del 74% y la especificidad del 98%. La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que permita el paso libre del

colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los รกcidos micรณlicos presentes en la pared. Al enfriar con agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar, resistiendo la acciรณn abrasiva del alcohol-รกcido, y el azul de metileno se utiliza como contratinciรณn.2

REFERENCIAS

1. Biologiaedu.

La

Pared

bacteriana.

[En

línea].

Disponible

en:

http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm#:~:text=Tanto%20las%20bacteria s%20Gram%20positivas,les%20provee%20de%20protecci%C3%B3n%20mec% C3% A1nica. & Text = La% 20pared% 20celular% 20bacteriana% 20rodea% 20al% 20protoplasto. [Consultado el 27 de septiembre de 2020].

2. Luis Esaú López-Jácome, Melissa Hernández-Durán, Claudia Adriana Colín-Castro, Silvestre Ortega-Peña,* Guillermo Cerón-González, Rafael Franco-Cendejas. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Vol. 3, Núm. 1 Enero-Marzo 2014

pp

10-18

[En

línea].

Disponible

en:

https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf [Consultado el 27 de septiembre de 2020].

padlet.com/asbleka/hak81m605yre84mh

Tinciรณn BAAR Hecho con un cรกlido abrazo ASBLEIDE KARINA 24 DE AGOSTO DE 2020 00:29

TINCION DE ZIEHL-NEELSEN INTEGRANTES: JOSE ALEXANDER LASTRA MARIANGEL BARRIENTOS

4. Enjuague con agua.

5. Inunde la preparación con Diferenciador durante 10 minutos, aplicando un cambio de Diferenciador a los 5 minutos.

6. Enjuague con agua.

7. Inunde la preparación con contra tinción (azul de metileno o verde malaquita), deje reposar durante 1 minuto.

8. Enjuague bien con agua, seque suavemente con papel secante o seque usando calor suave.

9. Mire utilizando microscopia de inmersión en aceite.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Los bacilos ácido-alcohol resistentes se tiñen de rojo, otros organismos se tiñen de azul o de verde dependiendo de la contra tinción empleada.

Tinción de Zielhl-Neelsen (ácido-alcohol resistentes) INTEGRANTES: Angie Parada - Isis Rozo PRINCIPIO La tinción se utiliza para teñir micobacterias y otros microorganismos ácidos resistentes se tiñen con carbolfucsina básica resistente a la descoloracion con soluciones de ácidoalcohol Se realiza contra tinción del fondo con azul de metileno Los microorganismos aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro.

Para que un organismo se denomine ácido-alcohol resistente, debe resistir la decoloración por ácido-alcohol. Se usa entonces una contratinción para destacar el organismo teñido.

MÉTODO CLÁSICO 1. Prepare una extensión delgada y uniforme y deje secar al aire.

2. Fije al calor y deje enfriar.

3. Inunde la preparación con Carbol Fucsina ZN y caliente suavemente (no hierva). Deje que repose durante 10 minutos aplicando calor de nuevo Después de 5 minutos.

TINCION DE ZIEHL-NEELSEN INTEGRANTES: - NICOLLE ANDREA VILLA - BRYANT CAMILO PEÑARANDA La tinción de Ziehl- Neelsen se trata de un procedimiento de tinción diferencial que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Esta técnica permite distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistentes).

FUNDAMENTO: Esta técnica se basa en la pared celular de estos microorganismos que formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas, por lo tanto pueden retener los colorantes con mayor facilidad.

Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir mediante tinción de Gram, debido al alto contenido de ácidos micólicos de la pared celular.

En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante básico, que tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de textura cerosa a temperatura ambiente.

La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que la cera se derrite y las moléculas de colorante se mueven con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular.

PROCEDIMIENTO: 1. Preparar un frotis bacteriano: Prepare una extensión delgada y uniforme y deje secar al aire.

2. Secado del frotis: Fije al calor y deje enfriar.

3. Cubrir la mancha y calentar la marcha: Inunde la preparación con Carbol Fucsina ZN y caliente suavemente (no hierva). Deje que repose durante 10 minutos aplicando calor de nuevo después de 5 minutos.

4. Lavar la mancha: Enjuague con agua.

5. Cubrir el frotis con alcohol-acido: Inunde la preparación con Diferenciador durante 10 minutos, aplicando un cambio de Diferenciador a los 5 minutos.

6. Lavar la mancha: Enjuague con agua.

7. Cubrir el frotis con colorante: Inunde la preparación con contra-tinción (azul de metileno o verde malaquita), deje reposar durante 1 minuto.

8. Lavar la mancha y drenar: Enjuague bien con agua, seque suavemente con papel secante o seque usando calor suave.

9. Examinar el frotis en el microscopio: Mire utilizando microscopia de inmersión en aceite.

10. Interpretar los resultados: los microorganismos que se tiñan de un color rojizo se consideran ácido alcohol resistente positivos (AAR+). Al contrario, si los microorganismos se tiñen de azul o verde, dependiendo del colorante utilizado como contra-colorante, se consideran ácido alcohol resistente negativos (AAR-).

REFERENCIAS: 1. Katherine Briceño. Tinción de Ziehl-Neelsen: Fundamento, Reactivos y Técnica. Lifeder.com. 30 septiembre, 2020. disponible en: https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/ 2. PROLABS DIAGNOSTICS. TINCIONES ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES PARA MYCOBACTERIAS. 30 Septiembre, 2020. disponible en: https://www.pro-lab.com/wpcontent/uploads/2016/11/Stains_TB_Spanish.pdf

Tinción ácido-alcohol resistentes Integrantes: - Jeny Paola Laguado - Jeimy Estefanny Sayago COLORACIÓN ACIDO ALCOHOL RESISTENTE Técnica de tinción diferencial para diagnóstico de bacterias contienen ácidos grasos denominadas Bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR (Micobacterias).

Tipo de muestra: esputo Técnica: microscópica Condiciones especiales: Ayuno; preferiblemente tomar la muestra en las primeras horas de la mañana Valores normales: Negativo En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, implica el uso de distintos colorantes con la nalidad de crear contraste entre las estructuras que se desean observar, diferenciar y posteriormente identi car. sirve para identi ca ciertos tipos de microorganismos. Algunos de estos microorganismos son micobacterias (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis), nocardias (por ejemplo, Nocardia sp.) y algunos parásitos unicelulares (por ejemplo, Cryptosporidium parvum). Muchas de las bacterias pueden clasi carse a través de una técnica común llamada tinción de Gram.

Técnica 1. Realizar un frotis bacteriano de la cepa de mycobacterium phlei y jar la extensión con calor.

2. Añadir el primer colorante: Carbofucsina.

3. Se pasa por el mechero varias veces, durante cinco minutos, sin permitir que hierva el colorante.

4. Decantar y lavar con agua destilada el exceso de colorante.

5. Decolorar con alcohol/ácido hasta que la muestra tenga un color rosado.

6. Lavar con agua destilada.

7. Teñir con el colorante azul de metileno durante un minuto.

8. Lavar con agua destilada hasta retirar el exceso de colorante.

9. Secar la extensión al aire.

10. Observar al microscopio óptico y anotar los resultados

BIBLIOGRAFÍA Vázquez, C., Martín, A., de Silóniz, M. I., & Serrano, S. (2011).

Técnicas básicas de Microbiología. Observación de bacterias.

Reduca (Biología), 3(5https://www.pro-lab.com/wp content/uploads/2016/11/Stains_TB_Spanish.pdf Calderón, H., & León, M. C. (1982). Estudio comparativo de métodos de homogenización para investigar microorganismos acido-alcohol-resistentes. Rev. costarric. cienc. Méd, 3(1), 2534.https://www.binasss.sa.cr/revistas/rccm/v3n1/art4.pdf

mueven con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular.

El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células que no fueron teñidas porque su pared no era lo su cientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del decolorante ácido es capaz de eliminar el colorante ácido. Las células que resisten esta decoloración se llaman ácido-resistentes.

Colorante secundario: Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con otro colorante llamado colorante secundario. Generalmente se utiliza el azul de metileno o el verde de malaquita. Este tiñe el material de fondo y, en consecuencia, crea contraste a las estructuras que fueron teñidas en el primer paso. Solo las células decoloradas absorben el segundo colorante (contra-tinción) y toman su color, mientras que las células ácido-resistentes conservan el color rojo.

Reactivos Colorante primario Se usa carbol fucsina al 0,3 % ( ltrado). Este colorante se prepara a partir de una mezcla de alcoholes: fenol en etanol (90 %) o metanol (95 %), y en esta mezcla se disuelven 3 gramos de fucsina básica.

Solución decolorante En este paso se pueden emplear soluciones de ácido alcohol al 3 % o ácido sulfúrico al 25 %.

Tinción Ácido Alcohol Resistentes Integrantes:

Colorante secundario (contra-colorante) El colorante más empleado para realizar el contraste en las muestras suele ser el azul de metileno al 0,3 %. Sin embargo, también se pueden emplear otros, como el verde malaquita al 0,5 %.

Danna Villamizar C. Laura Cáceres C. __________________________ Fundamento: Es una técnica de coloración para identi car microorganismos alcohol-ácido resistentes. Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el uso de distintos colorantes con la nalidad de crear contraste entre las estructuras que se desean observar, diferenciar y posteriormente identi car.

Clasi cación: Esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de estos microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas. Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los colorantes con mayor facilidad.

Se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante básico. Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de textura cerosa a temperatura ambiente.

La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que la cera se derrite y las moléculas de colorante se

Tinción ácido-alcohol resistentes INTEGRANTES: Daniela Parra Julian Ramirez

Tinción de Ziehl-Neelsen Se utiliza para teñir micobacterias y otros microorganismos acido resistentes El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de estos microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas.

A diferencia de la técnica de Ziehl-Neelsen —que ja el colorante a través del calor—, en la técnica de Kinyoun este paso no es necesario, ya que la solución de fucsina fenicada que se prepara para esta técnica contiene alta concentración de fenol.

Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los colorantes con mayor facilidad. Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir mediante tinción de Gram, debido al alto contenido de ácidos micólicos de la pared celular.

En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante básico. Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de textura cerosa a temperatura ambiente.

colorante penetra, se queda jo a pesar del lavado con el alcoholácido.

La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que la cera se derrite y las moléculas de colorante se mueven con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular.

El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células que no fueron teñidas porque su pared no era lo su cientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del decolorante ácido es capaz de eliminar el colorante ácido. Las células que resisten esta decoloración se llaman ácido-resistentes.

Interpretar los resultados Teóricamente, los microorganismos que se tiñan de un color rojizo se consideran ácido alcohol resistente positivos (AAR+).

Al contrario, si los microorganismos se tiñen de azul o verde, dependiendo del colorante utilizado como contra-colorante, se consideran ácido alcohol resistente negativos (AAR-) TINCIÓN KINYOUN La tinción Kinyoun es una técnica de coloración utilizada para teñir bacterias y parásitos ácido alcohol resistentes. Nació de la modi cación de la coloración de Ziehl-Neelsen; ambas técnicas se interpretan de la misma manera pero se diferencian en dos elementos: en la preparación del reactivo principal y en que la técnica de Kinyoun no utiliza calor.

Por esta razón también es conocida como Ziehl-Neelsen modi cada en frío o tinción en frío de Kinyoun. Esta indicada para la coloración de Micobacterium tuberculosis, Micobacterium leprae, micobacterias atípicas, Nocardias sp, Criptosporidium parvum, Criptosporidium meleagridis, Criptosporidium felis, Criptosporidium muris y Cyclosporas cayetanensis.

El reactivo principal de la tinción es la carbolfucsina o fucsina fenicada, que tiene la propiedad de unirse a los ácidos carbólicos existentes dentro de la pared celular cérea, rica en lípidos (ácidos micólicos) de las micobacterias y ciertos parásitos.

Esa unión no es contrarrestada por el decolorante ácido; por ello, los microorganismos se de nen como ácido alcohol resistentes.

El fenol disuelve el material lipídico de la pared celular, lo que permite la entrada del colorante carbolfucsina. Después de que el

De esta manera los microorganismos ácido alcohol resistentes toman el característico color rojo, mientras que todo lo que no es ácido alcohol resistente se decolora y se tiñe de azul.

Referencias bibliográficas 1. Briceño K. Tinción de Ziehl-Neelsen: Fundamento, Reactivos y Técnica - Lifeder [Internet]. Lifeder. 2020 [cited 28 September 2020]. Available from: https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/ 2. Gil Marielsa. Tinción de Kinyoun: fundamento y técnicas Lifeder [Internet]. Lifeder. 2020 [cited 28 September 2020].

Available from: https://www.lifeder.com/tincion-de-kinyoun/

Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen Es una tinción diferencial ideada por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo. Su nalidad es la de identi car mycobacterias (fuertemente ácidoalcohol resistentes), nocardias (débilmente AAR), actinomices (débilmente AAR) o parásitos como cryptosporidium.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasi cados según la tinción de Gram , la técnica más común en la microbiología actual. Sin embargo pueden ser teñidas con algunas tinciones combinadas con calor, como la de Ziehl-Neelsen. Una vez teñidas tienen la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol/ácido, el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias.

Técnica Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes: ácido periódico 58% carbol fucsina de Ziehl culina (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado: 1) 0,5 g fucsina básica 2) 50 cc agua destilada 3) 5 cc etanol absoluto 4) 28,5 g cristales de fenol derretidos 5) hematoxilina 6) alcohol ácido 1%: 7) alcohol de 35º 8) ácido clorhídrico Técnica

TINCION Ziehl-Neelsen INTEGRANTES: viviana sanabria yerson mota La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identi cación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) Fundamento Debido a la composición de la «pared» bacteriana no es fácil teñir diversos microorganismos como el mycobacterium. Por tanto hay que forzarlo con calor.

Además, al tratarse de una tinción diferencial, es necesario el uso de más de un colorante para poner de mani esto la a nidad por ciertos colorantes de determinados microorganismos o estructuras de los mismos. Esta a nidad puede de nirse como la «fuerza» con la que queda retenido el colorante, que no se elimina con ácido-alcohol.

procedimiento

1. Realizar un frotis bacteriano de la cepa y jar la extensión con calor.

2. Añadir el primer colorante: Carbofucsina.

3. Se pasa por el mechero varias veces, durante cinco minutos, sin permitir que hierva el colorante.

4. Decantar y lavar con agua destilada el exceso de colorante.

5. Decolorar con alcohol/ácido hasta que la muestra tenga un color rosado.

6. Lavar con agua destilada.

7. Teñir con el colorante azul de metileno durante un minuto.

8. Lavar con agua destilada hasta retirar el exceso de colorante.

9. Secar la extensión al aire.

10. Observar al microscopio óptico y anotar los resultados.

Resultados En la teoría si el microorganismo aparece de color rosa es AAR+ o ácido alcohol resistente positivo. En cambio, si el microorganismo aparece de color azul, en el microscopio óptico, es AAR- o ácido alcohol resistente negativo.

No tengo fotos ni dibujos, porque no conseguimos visualizar la mycobacteria. Ésta debería haber aparecido de color rosa,

indicando su positividad frente a la alcohol resistencia.

a

Lucía Luzardo 19171049 Maily Useche 19171005

Cristian Orozco Luis Jaimes METODOS Tinciones Tinción de ácido-alcohol resistencia (técnica de Kinyoun modi cada) Fundamento: envuelta Las bacterias ácido alcohol resistentes son bacterias Gram positivas que resisten la decoloración con decolorantes enérgicos, como las soluciones de etanol en ácido clorhídrico (de donde deriva la denominación). Ácidos micólicos: Esta resistencia se debe a ácidos grasos especí cos de la pared (ácidos micólicos). Los ácidos se encuentran esteri cando hidroxilos de glúcidos de diferente tamaño.

Hidrofobia: El resultado es la formación de una pared lipídica (hidrófoba). En consecuencia la pared di culta la difusión de moléculas hidrofílicas (nutrientes y colorantes) a través de su envuelta celular

Grumos en los cultivos: El aspecto de los cultivos sobre medios sólidos es característico: se forman grumos (en la imagen a la izquierda cultivo de Mycobacterium smegmatis y a la derecha de E. coli).

Grumos al microscopio: Si las bacterias AAR no se extienden con fruición, quedan agrupadas di cultando la de nición de su forma (en ambas imágenes cultivos de M. smegmatis).

Crecimiento lento: La impermeabilidad a moléculas hidrofílicas determina un crecimiento (lento) característico (formación de grumos) y la di cultad de tinción por colorantes convencionales, pero como las endosporas, una vez teñidas son difíciles de decolorar.

Alteración de la envuelta con calor o con fenol: Solo se tiñen bien forzando la tinción (con calor como en la endospora o con una solución muy concentrada de colorante (fuchina) en fenol).

Alcohol-clorhídrico: El Alcohol-clorhídrico no las decolora, por lo que se observan de color rojo. Cualquier otra célula (excepto de algunas Nocardia, o endosporas) es decolorada, por lo que admite la tinción por un segundo colorante (azul de metileno) .

Azul de metileno: Modalidades: Puede hacerse según dos técnicas: tinción de Ziehl-Neelsen o tinción de Kinyoun Material necesario: Cultivos de Mycobacterium smegmatis o de M. phlei. Fuchina básica (fuchina (1 g), fenol (5 g), etanol (15 ml) y agua destilada 100 ml). Etanol-HCl : HCI 12N (3 ml), agua destilada 100 ml.

Método: tinción de Kinyoun modi cada): Teñir con fuchina durante 2 minutos. Lavar con agua Decolorar con etanol-HCI . Lavar con agua Teñir con azul de metileno durante 1 minuto. Lavar con agua.

Observar con objetivo de inmersión Resultado: Las bacterias ácido-alcohol resistente se ven de color violeta y las no acido-alcohol resistentes de color azul. (en la imagen M. smegmatis).

Bibliografía 1. hipertextos del area de la biologia. [Online]. [cited 2020 septiembre 29. Available from: http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm#:~:text=Tanto %20las%20bacterias%20Gram%20positivas,les%20provee%20de% 20protecci%C3%B3n%20mec%C3%A1nica.&text=La%20pared%20 celular%20bacteriana%20rodea%20al%20protoplasto.

2. Martín. CVA. revista educa. [Online].; 2010 [cited 2020 septiembre 29. Available from: http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/download/81 9/834.

3. [Online]. [cited 2020 septiembre 29. Available from: https://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-iii/pb-iii-3acido_alcohol.htm.

Maynel Dariana Higuera- Maria Fernanda Rangel TINCIÓN ACIDO ALCOHOL RESISTENTE es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor, las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasi cados según la tinción de Gram, la cual es la técnica más común en la microbiología contemporánea, sin embargo puede ser teñido con algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teñida tiene la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol- ácido, el cual es el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias, de donde viene el nombre Alcohol-ácido resistente.

La alta concentración de ácido micólico en la pared celular es la causante, como las bacterias del género Mycobacterium, de la baja absorción y alta retención de la tinción (fucsina). La forma más común para poder identi car este tipo de bacterias es a través de la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen, donde la bacteria queda teñida en rojo y se agrega una tinción de contraste de nombre azul de metileno la cual permite apreciar de mejor forma la bacteria. referencias: (1) S. Raisman., D. J. (2005, septiembre). La Pared bacteriana. http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm (2). Madison B (2001). "Application of stains in clinical microbiology". Biotech Histochem 76 (3): 119-25.

Daniela Rojas- Karen Gamboa La tinción Kinyoun :es una técnica de coloración utilizada para teñir bacterias y parásitos ácido alcohol resistentes. Nació de la modi cación de la coloración de Ziehl-Neelsen; ambas técnicas se interpretan de la misma manera pero se diferencian en dos elementos: en la preparación del reactivo principal y en que la técnica de Kinyoun no utiliza calor.

Por esta razón también es conocida como Ziehl-Neelsen modi cada en frío o tinción en frío de Kinyoun. Está indicada para la coloración de Micobacterium tuberculosis, Micobacterium leprae, micobacterias atípicas, Nocardias sp, Criptosporidium parvum, Criptosporidium meleagridis, Criptosporidium felis, Criptosporidium muris y Cyclosporas cayetanensis.

Referencias.

1. Química Clínica Aplicada. (2016). BK Kinyoun Kit. Disponible en: cromakit.es https://www.lifeder.com/tincion-de-kinyoun/

bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasi cados según la tinción de Gram, la cual es la técnica más común en la microbiología contemporánea, sin embargo puede ser teñido con algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teñida tiene la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol- ácido, el cual es el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias, de donde viene el nombre Alcohol-ácido resistente.

Las bacterias ácido alcohol resistentes son bacterias Gram positivas que resisten la decoloración con decolorantes enérgicos, como las soluciones de etanol en ácido clorhídrico (de donde deriva la denominación).

MATERIAL NECESARIO: Cultivos de Mycobacterium smegmatis o de M. phlei. Fuchina básica (fuchina (1 g), fenol (5 g), etanol (15 ml) y agua destilada 100 ml).

Etanol-HCl : HCI 12N (3 ml), agua destilada 100 ml.

MÉTODO: tinción de Kinyoun modi cada) | Teñir con fuchina durante 2 minutos. Lavar con agua.

Decolorar con etanol-HCI. Lavar con agua.

Teñir con azul de metileno durante 1 minuto. Lavar con agua. Se observa con objetivo de inmersión.

RESULTADOS: Las bacterias ácido-alcohol resistente se ven de color violeta y las no acido-alcohol resistentes de color azul. (en la imagen M. smegmatis) BIBLIOGRAFÍA: 1. Métodos Tinciones [Internet]. Ugr.es. 2020 [cited 30 September 2020]. Recuperado de: https://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-iii/pb-iii-3acido_alcohol.htm 2. Ácido-alcohol resistencia [Internet]. Es.wikipedia.org. 2020 [cited 30 September 2020]. Recuperado de: https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cidoalcohol_resistencia#:~:text=%C3%81cido%2Dalcohol%20resisten cia%20es%20la,del%20fenol%20y%20el%20calor.

Marlin Dávila (19171032) Jazmin García (19171034) FUNDAMENTO: Ácido-alcohol resistencia es la propiedad física de algunas

teñida en rojo y se agrega una tinción de contraste de nombre azul de metileno la cual permite apreciar de mejor forma la bacteria.

La tinción de Ziehl-Neelsen en una técnica de coloración para identi car microorganismos alcohol-ácido resistentes (AAR). El nombre de este procedimiento de microbiología hace referencia a sus autores: el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen.

Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el uso de distintos colorantes con la nalidad de crear contraste entre las estructuras que se desean observar, diferenciar y posteriormente identi car. La tinción de Ziehl-Neelsen sirve para identi ca ciertos tipos de microorganismos.

Tinción de Ziehl-Neelsen Algunos de estos microorganismos son micobacterias (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis), nocardias (por ejemplo, Nocardia sp.) y algunos parásitos unicelulares (por ejemplo, Cryptosporidium parvum). Muchas de las bacterias pueden clasi carse a través de una técnica común llamada tinción de Gram.

No obstante, algunos grupos bacterianos requieren otros métodos para poder identi carlos. Técnicas como la tinción de ZiehlNeelsen requieren combinaciones de colorantes con calor para jar el primero a la pared celular. https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/

Kelly Sandoval - Eduardo Ramirez Ácido-alcohol resistencia es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasi cados según la tinción de Gram, la cual es la técnica más común en la microbiología contemporánea, sin embargo, puede ser teñido con algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teñida tiene la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol- ácido, el cual es el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias, de donde viene el nombre Alcohol-ácido resistente.

La alta concentración de ácido micólico en la pared celular es la causante, como las bacterias del género Mycobacterium, de la baja absorción y alta retención de la tinción (fucsina). La forma más común para poder identi car este tipo de bacterias es a través de la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen, donde la bacteria queda

integrantes: Maryuri Jaimes-Nicolle Contreras

Tinción de Ziehl-Neelsen La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identi cación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) , como M. tuberculosis o el Phylum Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo.

- Sheehan, Dezna; Hrapchak, Barbara (1980). Theory and practice of Histotechnology (2 Ed. edición). The C.V. Mosby Company.

- ARP, ed. (1992). Métodos Histotecnológicos. Instituto de patología de las Fuerzas Armadas de los EEUU (AFIP). https://www.franrzmn.com/tincion-diferencial-de-ziehlneelsen/

FUNDAMENTO

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les con eren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidi cación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste. Debido a esto, está que esta muy in uenciado con la enfermedad de tuberculosis.

Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes - Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes.

- Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.

- Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras fecales.

PROCEDIMIENTO

1 Realizar un frotis bacteriano de la cepa de mycobacterium phlei y jar la extensión con calor.

2 Añadir el primer colorante: Carbofucsina.

3 Se pasa por el mechero varias veces, durante cinco minutos, sin permitir que hierva el colorante.

4 Decantar y lavar con agua destilada el exceso de colorante.

5 Decolorar con alcohol/ácido hasta que la muestra tenga un color rosado.

6 Lavar con agua destilada.

7 Teñir con el colorante azul de metileno durante un minuto.

8 Lavar con agua destilada hasta retirar el exceso de colorante.

9 Secar la extensión al aire.

10 Observar al microscopio óptico y anotar los resultados.

BIBLIOGRAFIA

Dariana Carrillo-Yosimar Tapiero Tincion de Ziehl-Neelsen La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identi cación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) , como M. tuberculosis o el Phylum Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo. Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les con eren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcoholácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidi cación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste. Debido a esto, está que esta muy in uenciado con la enfermedad de tuberculosis.

Referencias: LANIADO-LABORIN, Rafael y CABRALES-VARGAS, Noemí. «A positive sputum smear test is not always indicative of pulmonary TB: Another reason to order routine cultures.» Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. [en línea]. 2005, vol. 18, no. 4 [citado 8 de

noviembre 2007], pp. 286-289. Disponible: [2]. ISSN 0187-7585

identi ca ciertos tipos de microorganismos.

Fundamento: El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de estos microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas.

Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los colorantes con mayor facilidad. Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir mediante tinción de Gram, debido al alto contenido de ácidos micólicos de la pared celular.

Gisselle Galvis-Jhony Mise En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante básico. Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de textura cerosa a temperatura ambiente.

La tinción de Ziehl-Neelsen en una técnica de coloración para identi car microorganismos alcohol-ácido resistentes (AAR). El nombre de este procedimiento de microbiología hace referencia a sus autores: el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen.

Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el uso de distintos colorantes con la nalidad de crear contraste entre las estructuras que se desean observar, diferenciar y posteriormente identi car. La tinción de Ziehl-Neelsen sirve para

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GUÍA 6: TÉCNICAS DE TINCIÓN: ESPORAS Y CÁPSULA

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Código Guía de Laboratorio: 6 Tema: Técnicas de tinción: Esporas y cápsula Objetivo • • • •

Observar las endosporas y su disposición en las formas vegetativas.

Comparar las distintas morfologías y disposiciones que adoptan las endosporas en las diferentes especies bacterianas empleadas.

Entender el fundamento de las tinciones negativas Observar la morfología de las cápsulas Fundamento

Algunos géneros bacterianos, entre los que se destacan Clostridium sp y Bacillus sp, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables ya sea por agotamiento de nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, entre otras. Al terminar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva célula vegetativa.

Ilustración 10. Formación de endosporas bacterianas

Algunas bacterias producen exopolimeros que se acumulan alrededor de la superficie de la envoltura celular Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

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que se denomina generalmente cápsula. La mayoría de estos exopolimeros son de naturaleza polisacarídica o proteica. La cápsula no es una estructura indispensable para la bacteria y su producción se ve influenciada por la existencia de genes específicos y por factores ambientales

Materiales y Equipos Item 1

Tipo BIOL

Descripción Cultivos bacterianos: especies del género Bacillus sp y Klebsiella pneumoniae en medios enriquecidos con glucosa y sacarosa MAT Asas bacteriológicas curvas MAT Laminas y laminillas MAT Lápiz graso MAT Mechero EQUIP Microscopio Reactivos Descripción Colorante verde de malaquita 5% Colorante safranina 0.5% Tinta china Aceite de inmersión

2 3 4 5 6 Ítem 1 2 3 4

Procedimiento Descripción

Paso TINCIÒN DE ESPORAS 1 Preparar los frotis bacterianos según clases anteriores 2 Teñir con verde de malaquita, calentar pasando la llama del mechero debajo de la lámina evitando que hierva o seque el colorante, sólo debe humear durante 5 minutos. (5 o 6 vapores) 3 Lavar con abundante agua el exceso de colorante 4 Teñir con safranina durante 1 minuto 5 Lavar con abundante agua el exceso de colorante 6 Secar la preparación y observarla en el microscopio.

7 Anotar la disposición y la morfología de las endosporas.

Ilustración 9. Morfologìa de Bacilos esporulados Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

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2019

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TINCION DE CAPSULA 1 Seleccionar láminas limpias y secas 2 3

Preparar los frotis bacterianos según clases anteriores sin dejar secar el extendido Agregar una gota de tinta china y mezclar bien

4

Colocar el cubreobjetos evitando formar burbujas de aire

5 6 7

Presionar y secar con la ayuda de toallas absorbentes los sobrantes del colorantes Observar al microscopio, teniendo en cuenta cerrar un poco el diafragma Reconocer la cápsula y graficar

Ilustración 11. Bacterias encapsuladas

Ilustración 12. Morfología bacteriana

Consulta 1. Qué son las estructuras teñidas con verde de malaquita que aparecen en el medio circundante.

2. Porqué es necesario cultivar los microorganismos formadores de cápsula en medios de cultivo enriquecidos de azúcares.

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Medica Panamericana. Buenos Aires.

FORBES, BETTY. (2009). Diagnostico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Medica Panamericana. Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiológico. Sexta edición. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2003). Brock: Biología de los microorganismos. (Décima edición) Editorial Pearson – Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

Lucia Luzardo 19171049, Maily Useche 19171005

1. Qué son las estructuras teñidas con verde de malaquita que aparecen en el medio circundante.

Respuesta 1:

Las estructuras que se observan teñidas de color verde son endosporas bacterianas y lo de color rojo coloreado con la safranina es la célula como tal, estas estructuras por carecer de paredes celulares no se tiñen con colorantes regulares y son teñidos con verde de malaquita, que al calentarse penetra hasta llegar a teñir las endosporas. El verde de malaquita se utiliza como tinción de esporas bacterianas. También se utiliza como contratinción con colorantes rojos. (1)

2. Porqué es necesario cultivar los microorganismos formadores de cápsula en medios de cultivo enriquecidos de azúcares.

Respuesta 2:

La cápsula bacteriana es la capa con borde definido formada por una serie de polímeros orgánicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular. Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes, incluyendo polialcoholes y aminoazúcares, es aquí en dónde radica la importancia de cultivar a estos microorganismos en medios ricos en azucares ya que al estar el medio de cultivo enriquecido con azúcares le permitirá a los microorganismos desarrollarse en el medio de cultivo, junto con sus cápsulas. (2)

REFERENCIAS

1. Ugr. Tinción de esporas. [En línea]. Disponible en: http://www.ugr.es/~pomif/pombac/pb-iii/pb-iii-3-esporas.htm [Consultado el 3 de octubre de 2020].

2. P. Tauro, K.K. Kapoor, K. S. (1986) An Introduction to Microbiology, New Age Publishers, ISBN 0852268785.

GUÍA 7: METODOLOGÍA PARA EL AISLAMIENTO MICROBIANO: CULTIVO AXÉNICO.

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2019

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Prentice Hall, Madrid.

Guía de Laboratorio: Tema:

• •

7

METODOLOGÍA PARA EL AISLAMIENTO MICROBIANO: CULTIVO AXÉNICO.

Objetivos Aislar microorganismos de diferentes ambientes.

Determinar cuál es el cultivo predominante y cuáles son los posibles contaminantes.

Fundamento

Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos que podrían contaminar y alterar los resultados de los análisis; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio.

Por otra parte, se deben tener en cuenta las necesidades de los microorganismos para brindárselos en los medios artificiales y en su periodo de incubación, como nutrientes, pH, temperatura, aireación, tiempo de crecimiento entre otras.

La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto.

Materiales y Equipos Item 1

Tipo MAT

Descripción Cajas de Petri con medios de cultivo como: Agar nutritivo, Agar Base Sangre.

EQUIP Incubadora EQUIP Microscopio EQUIP Estereoscopio Reactivos Colorantes para la tinción de Gram, alcohol acetona.

Procedimiento

2 3 4 1

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Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

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Paso 1

Descripción Por equipos de trabajo se entregará el material, que consiste en 2 cajas de Petri una con Agar Nutritivo y la otra con Agar Base Sangre.

2 Exponer por 15 minutos las cajas de Petri a diferentes ambientes establecidos con anterioridad por el docente.

3 Transcurrido el tiempo de exposición, tapar en el sitio las cajas y rotular adecuadamente.

4 Incubar a 37°C por un periodo de 24 a 48 horas 5 Realizar observaciones macroscópicas y microscópicas de los aislamientos, describir y registrar resultados.

6 Interpretar cuál es el cultivo predominante y cuáles son los posibles contaminantes de los aislamientos.

Consulta 1. Qué es un cultivo axénico y cuál es su importancia.

2. Relacione los aislamientos con posibles microorganismos que reúnan características observadas tanto macroscópica como microscópicamente.

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

FORBES, BETTY. (2009). Diagnostico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiológico. Sexta edición. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2003). Brock: Biología de los microorganismos. (Décima edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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1. Qué es un cultivo axénico y cuál es su importancia.

Un cultivo axénico está formado por una única especie, cepa o variedad de organismo, y por lo tanto está desprovisto de otros organismos contaminantes. Los cultivos axénicos son muy extraños en la naturaleza. En los medios naturales como el suelo, agua, o en el cuerpo humano, existen cultivos mixtos que consisten en muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en un laboratorio.1 Su importancia es que permite facilitar el estudio de ciertos microorganismos.

Sin embargo, presenta dificultades al no considerar los cambios fisiológicos y morfológicos que pueden tener estos organismos al no encontrarse en su cultivo natural.1

REFERENCIA 1. Bioquimicamicro. CULTIVO

AXENICO (PURO). [En línea]. Disponible http://bioquimicamicro.blogspot.com/2014/03/cultivo-axenicopurointroduccion.html [Consultado el 11 de octubre de 2020].

en:

GUÍA 8: CRECIMIENTO MICROBIANO. RECUENTO DE BACTERIAS. TÉCNICA DE VERTIDO EN PLACA, SIEMBRA POR SUPERFICIE.

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• • •

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Guía de Laboratorio Tema:

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8 CRECIMIENTO MICROBIANO. RECUENTO DE BACTERIAS. TÉCNICA DE VERTIDO EN PLACA, SIEMBRA POR SUPERFICIE.

Objetivos Reconocer la importancia de los métodos de siembra que permiten el recuento de los diferentes grupos microbianos.

Realizar adecuadamente la técnica de cuenta en placa para diversos grupos microbianos de importancia.

Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la calidad de las muestras analizadas.

Diferenciar los métodos de siembra y su finalidad.

Fundamento Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en una muestra, la técnica comúnmente utilizada es la de recuento en placa. Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno o no, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante; por ejemplo, las bacterias mesófilas aerobias que son un indicador general de la población que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de las muestras como por ejemplo alimentos que permiten predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento.

La técnica básica es la misma, pero cambian las condiciones de incubación, medios de cultivo y algunos otros detalles de acuerdo al grupo indicador que se desee aislar. Si se modifican las condiciones de incubación o se somete la muestra a algún tratamiento previo, el método puede aplicarse también a la detección de otros grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada selección de medios de cultivo. El método permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores.

La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que se desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia (UFC).

Las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones necesarias de la muestra, antes de ponerla en una caja de Petri estéril y luego agregar el medio de cultivo apropiado para lo que se desee aislar, además se deben ofrecer todas las condiciones ambientales apropiadas para su recuperación.

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Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

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Materiales y Equipos Item 1 2 3 4 5 6

Tipo MAT MAT MAT MAT EQUIP EQUIP

Descripción Cajas de Petri desechables o de vidrio estériles Pipetas de 10ml estériles Pipetas de 1ml estériles Pipeteadores Incubadora Balanza Reactivos Agar Nutritivo (AN) o Agar Standar Plate Count (ASPC) a una temperatura aproximada de 50°C Frascos tapa rosca con 90 ml de agua peptona Tubos tapa rosca con 9 ml de agua peptona Procedimiento Descripción Con antelación se definirá la muestra a analizar por grupo o equipo de trabajo. Se debe recolectar en su recipiente original o en las mejores condiciones de asepsia o higiene, en recipientes estériles para no alterar la calidad de la misma.

Desinfectar área de trabajo, rotular con marcador de vidrio, tanto tubos con diluciones respectivas como las cajas de Petri.

Se entregará por grupo de trabajo, un frasco tapa rosca con 90ml de agua peptona donde se agregarán 10 gramos o 10 mililitros de la muestra. Para preparar así la dilución 10-1. Se debe agitar u homogenizar por un periodo de 5 minutos.

1 2 3 Paso 1

2 3

A partir de la dilución anterior (10-1 ), tomar con pipeta estéril 1 ml para servir en un

4

tubo tapa rosca y de esta manera preparar la dilución 10-2 . Se repetirá este procedimiento hasta preparar las diluciones que se estimen convenientes de acuerdo a la naturaleza de la muestra.

A partir de las diluciones realizadas sembrar o servir 1ml por duplicado en cajas de Petri estériles, para luego agregar el agar nutritivo o (ASPC) para el análisis de Aerobios Mesófilos, homogenizar suavemente con movimientos de vaivén por un periodo de 1 minuto.

Dejar en la superficie del mesón hasta que solidifiquen. Sellar con cinta tirro.

Incubar a 37°C/24 – 48 horas Realizar lectura, teniendo en cuenta la formación de colonias y las indicaciones dadas en clase. Si las cajas de Petri de algunas diluciones presentan muchas colonias, considerarlas incontables y tener en cuenta aquellas diluciones donde se puedan contar colonias en un rango de 30 – 300.

5

6 7 8

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 26 de 9

Consulta 1. Qué propiedades tiene el Agar Nutritivo o el Agar Standar Plate Count que permite el recuento de este grupo indicador.

2. A qué tipo de muestras no se recomienda realizarle este análisis y por qué?

3. Indague sobre la normatividad microbiológica de la muestra que analizo e indique que condiciones de calidad posee de acuerdo a éste analito (Aerobios Mesófilos).

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

FORBES, BETTY. (2009). Diagnostico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiológico. Sexta edición. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2003). Brock: Biología de los microorganismos. (Décima edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

Guía de Laboratorio: Tema:

• • • • • •

9 METABOLISMO BACTERIANO “IDENTIFICACIÓN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS” Objetivo

Reconocer morfológicamente las bacterias Gram. negativas en medios diferenciales y selectivos.

Diferenciar el crecimiento macroscópico de las colonias aisladas en los diferentes medios de cultivo.

Adquirir destreza en aislamiento realizado a partir diferentes cepas de microorganismos para realizar la coloración de Gram. y bioquímicas.

Fundamentar las pruebas bioquímicas.

Identificar por medio de pruebas bioquímicas u otros métodos los géneros de Enterobacterias.

Tener conocimientos teóricos de la acción patogénica de las Enterobacterias

Fundamento Según Murray et al (2008), la familia Enterobacteriaceae es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos Gram negativos de importancia clínica. Se han descrito 40 géneros con más de 150 especies, estos géneros se han descrito según sus propiedades bioquímicas, estructura antigénica e hibridación y secuenciación de los ácidos nucleicos. A pesar de la complejidad de esta familia, menos de 20 especies son las responsables de más del 95% de las infecciones (p. 323) Son microorganismos ubicuos, se encuentran en forma universal en el suelo, agua y vegetación y también en la flora intestinal normal de muchos animales incluyendo al ser humano. Producen una gran cantidad de enfermedades en el ser humano; entre ellas septicemias, infecciones del aparato urinario, Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

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Consulta 8: Crecimiento Microbiano. Recuento de Bacterias. Técnica de vertido en placa. Siembra por superficie Maily Useche 19171005, Lucia Luzardo 19171049.

1. ¿Qué propiedades tiene el Agar Nutritivo o el Agar Standar Plate Count que permite el recuento de este grupo indicador?

El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativamente altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas.Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante.1 Plate Count Agar (Standard Methods Agar) no contiene suplementos selectivos y es relativamente rico en nutrientes, por lo que es ideal para la enumeración de organismos viables, ya sea siguiendo un método de vertido en placa o un método de placa de superficie que se puede acoplar con un plato en espiral. Plate Count Agar (agar de métodos estándar) también se conoce como agar de levadura de glucosa con triptona.2 2. ¿A qué tipo de muestras no se recomienda realizarle este análisis y por qué?

Este tipo de agar maneja muestras como: a) Productos destinados al consumo humano y la alimentación animal b) Muestras ambientales de área de producción y manipulación de alimentos para consumo humano y alimentación animal El agar Plate Count se utiliza para la enumeración de bacterias en agua, aguas residuales, alimentos y productos lácteos en un entorno de laboratorio. El agar Plate Count no está diseñado para su uso en el diagnóstico de enfermedades u otras afecciones en humanos.2

Bacterias aéreas mesófilas La palabra mesófilos significa que son afines a temperatura media (30-37°C) y la palabra aerobia que son dependientes de oxígeno.

Son todas aquellas bacterias aerobias, mesófilas capaces de crecer en agar nutritivo. Se investigan por el método de recuento en placa con siembra en profundidad, que se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo sólido (Agar para recuento en placa o PCA), donde se ha sembrado un volumen conocido de la solución madre o sus diluciones (1 ml) , incubadas a 37° C durante 24 hs.

Se deberán contar todas las colonias desarrolladas en cada placa. Si se ha sembrado más de una dilución se seleccionará la que proporcione entre 30 y 300 colonias, descartando las demás. El recuento no se efectuará en placas que contengan menos de 30 colonias, excepto en aquellas sembradas con solución sin diluir.3 3. Indague sobre la normatividad microbiológica de la muestra que analizo e indique que condiciones de calidad posee de acuerdo a éste analito (Aerobios Mesófilos).

Dependiendo del aislamiento y las normativas de sus ministerios de salud se establecen ciertos parámetros para el recuento de colonias en este caso de los microorganismos aerobios mesófilos presentes en los alimentos, como se evidencian en estos dos documentos: 4 NORMA

SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO [Internet]. Digesa.minsa.gob.pe. 2020 [Consultado el 21 de octubre del 2020]. Disponible de: http://www.digesa.minsa.gob.pe/norma_consulta/Proy_RM615-2003.pdf 5 ANEXO

PARAMETROS MICROBIOLOGICOS [Internet].

Mcp.bolsamercantil.com.co. 2020 [Consultado el 21 octubre de 2020]. Disponible de: https://mcp.bolsamercantil.com.co/ArchivosPublicados//PDF/PubId=4381_ANEXO %20MICROBIOLOGICO.pdf

REFERENCIAS 1. Britania.

Agar nutritivo.

[En línea].

Disponible en: https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2 8446b169d8.pdf [Consultado el 21 de octubre de 2020].

2.

Neogen. Agar para recuento en placa. [En línea]. Disponible en: https://www.neogen.com/solutions/microbiology/plate-count-agar-standardmethods/#:~:text=Plate%20Count%20Agar%20(Standard%20Methods%20Agar)

20is% 20used% 20for% 20the, o% 20other% 20conditions% 20in% 20humans [Consultado el 21 de octubre de 2020].

3. Monografias. Bacterias Mesófilas Aerobias. [En línea]. Disponible en: https://www.monografias.com/docs/Bacterias-Mes%C3%B3filas-AerobiasF3RXZZGPC8G2Z#:~:text=Las%20bacterias%20mes%C3%B3filas%3A%20son %20aquellas,Salmonella% 20a% 20el% 20 Staphylococcus% 20aureus.

[Consultado el 21 de octubre de 2020].

4. NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO [Internet]. Digesa.minsa.gob.pe. 2020 [Consultado el 21 de octubre del 2020].

Disponible de: http://www.digesa.minsa.gob.pe/norma_consulta/Proy_RM615-2003.pdf 5. ANEXO PARAMETROS MICROBIOLOGICOS [Internet].

Mcp.bolsamercantil.com.co. 2020 [Consultado el 21 octubre de 2020]. Disponible de: https://mcp.bolsamercantil.com.co/ArchivosPublicados//PDF/PubId=4381_ANEX O%20MICROBIOLOGICO.pdf

GUÍA 9: METABOLISMO BACTERIANO “IDENTIFICACIÓN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS”

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

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2019

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Consulta 1. Qué propiedades tiene el Agar Nutritivo o el Agar Standar Plate Count que permite el recuento de este grupo indicador.

2. A qué tipo de muestras no se recomienda realizarle este análisis y por qué?

3. Indague sobre la normatividad microbiológica de la muestra que analizo e indique que condiciones de calidad posee de acuerdo a éste analito (Aerobios Mesófilos).

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

FORBES, BETTY. (2009). Diagnostico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiológico. Sexta edición. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2003). Brock: Biología de los microorganismos. (Décima edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

Guía de Laboratorio: Tema:

• • • • • •

9 METABOLISMO BACTERIANO “IDENTIFICACIÓN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS” Objetivo

Reconocer morfológicamente las bacterias Gram. negativas en medios diferenciales y selectivos.

Diferenciar el crecimiento macroscópico de las colonias aisladas en los diferentes medios de cultivo.

Adquirir destreza en aislamiento realizado a partir diferentes cepas de microorganismos para realizar la coloración de Gram. y bioquímicas.

Fundamentar las pruebas bioquímicas.

Identificar por medio de pruebas bioquímicas u otros métodos los géneros de Enterobacterias.

Tener conocimientos teóricos de la acción patogénica de las Enterobacterias

Fundamento Según Murray et al (2008), la familia Enterobacteriaceae es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos Gram negativos de importancia clínica. Se han descrito 40 géneros con más de 150 especies, estos géneros se han descrito según sus propiedades bioquímicas, estructura antigénica e hibridación y secuenciación de los ácidos nucleicos. A pesar de la complejidad de esta familia, menos de 20 especies son las responsables de más del 95% de las infecciones (p. 323) Son microorganismos ubicuos, se encuentran en forma universal en el suelo, agua y vegetación y también en la flora intestinal normal de muchos animales incluyendo al ser humano. Producen una gran cantidad de enfermedades en el ser humano; entre ellas septicemias, infecciones del aparato urinario, Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

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infecciones intestinales, entre otras.

Materiales y Equipos Item 1

Tipo BIOL

Descripción Cultivos bacterianos: especies de la Familia Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae que se encuentren en el cepario.

MAT Asas bacteriológicas redondas y rectas MAT Láminas MAT Laminillas MAT Mecheros EQUIP Microscopios Reactivos Descripción Colorante cristal violeta Colorante safranina 0.5% Lugol Alcohol acetona Aceite de inmersión Bioquímicas: Tirillas de oxidasa, agar citrato, agar TSI, agar LIA, Agar SIM, agar Motility, agar OF, caldo Rojo de Metilo – Voges Proskauer, caldo malonato con fenilalanina, Caldo Urea, Caldo Nitratos, Peróxido de hidrógeno (catalasa), entre otras.

2 3 4 5 6 Ítem 1 2 3 4 5 6

Agar TSI

Agar LIA

Elaborado por:

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Agar Citrato

Agar Urea

7 Agares selectivos y diferenciales para bacterias Gram negativas: Mac Conkey, hecktoeen, EMB, XLD, entre otros.

Agar Mac Conkey,

Agar Hektoeen,

Agar XLD

Procedimiento Paso 1

Descripción Preparar los frotis bacterianos según clases anteriores, realice tinción de Gram

2

a. Siembre en las diferentes pruebas bioquímicas asignadas b. Incube a 37°C/24 horas c. Revele e interprete.

3

Realice Prueba de Catalasa: sobre una lámina suspenda una asada del cultivo a identificar, deje caer una gota de peróxido de hidrogeno y observe inmediatamente. La formación de burbujas se interpreta como una reacción positiva.

4

Siembre en los diferentes medios de cultivo selectivos y diferenciales asignados e interprete su crecimiento.

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

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GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

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Consulta 1. Realice una tabla comparativa de cada uno de los géneros de las Enterobacterias donde incluya pruebas bioquímicas, infecciones que causan y aspectos epidemiológicos relevantes.

2. En un cuadro mencione cada una de las pruebas bioquímicas realizadas a las Enterobacterias; con el fundamento o principio de la prueba, medios y reactivos utilizados, procedimiento y controles.

Guía de laboratorio

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Tema:

METABOLISMO BACTERIANO “IDENTIFICACIÓN BACTERIAS GRAM POSITIVAS” Objetivos

• •

Diferenciar grupos bacterianos, tanto Gram negativos como Gram positivos.

Reconocer las principales especies de los géneros Streptococcus sp y Staphylococcus sp, que son muy importantes en el área clínica e industrial.

Fundamento El metabolismo bacteriano ya sea por la vía fermentativa o por la vía oxidativas es un parámetro importante en la diferenciación de sus géneros y especies.

Se analizarán algunas bacterias Gram positivas, sembrándolas en pruebas bioquímicas y en otros medios de cultivos selectivos para ellas. Se trabajará con cultivos de diferentes especies del género Streptococcus sp y Staphylococcus sp, por su gran importancia tanto en la parte clínica como industrial.

El género Streptococcus sp, comprende un grupo biológico grande y diverso de cocos Gram positivos que proliferan en pares o cadenas. Son anaerobios facultativos con metabolismo fermentativo generalmente homoláctica y no producen gas, son catalasa negativos y esta característica sirve para diferenciarlos de los Staphylococcus sp. Varias de sus especies causan enfermedades humanas importantes, tales como faringitis estreptocócica, fiebre escarlatina, infecciones del tracto urinario y endocarditis bacteriana. Se dividen en cinco grupos, citando en cada grupo algunas especies de mayor importancia clínica: Estreptococos del Grupo A: Streptococcus pyogenes; Estreptococos del Grupo B: Streptococcus agalactiae y Streptococcus faecalis; Estreptococos del Grupo C: Streptococcus equi; Enterococos y Estreptococos del Grupo D: Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium; Estreptococos del Grupo G: Son cepas de Streptococcus que contienen el antígeno del grupo G no tienen designación de especie También se analizarán cepas de Staphylococcus sp en agar sangre para diferenciarlas de los Streptococcus sp.

Materiales y Equipos Item Tipo Descripción Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

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Consulta bacteriología guía 9 METABOLISMO BACTERIANO "IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS" LUCIA LUZARDO PARDO 19171049 MAILY PAOLA USECHE ACEVEDO 19171005 1. Realice una tabla comparativa de cada uno de los géneros de las Enterobacterias donde incluya pruebas bioquímicas, infecciones que causan y aspectos epidemiológicos relevantes.

Géneros

Pruebas bioquímicas

Cedecea

Infecciones

● Pruebas de Infecciones respiratorias, Voges de tejidos blandos, Proskauer. abscesos y bacteriemias. ● Arginina ● dihidrolasa y ornitina ● descarboxilasa

Citrobacter

● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

Enterobacter

Infección del tracto urinario ● Fermentan la glucosa, ● Reducen nitratos y y del tracto respiratorio. nitritos ● son citocromooxidasa negativos y catalasa

Urea (hidrólisis), Lactosa (fermentación), Manitol (fermentación), Lisina descarboxilasa, Ornitina descarboxilasa, Arginina dihidrolasa, ONPG, Citrato de Simmons, Rojo de metilo, Voges-Proskauer.

Aspectos epidemiológicos Actualmente son considerados como patógenos oportunistas pero muy infrecuentes.

Infecciones urinarias, Es una bacteria meningitis neonatal y capaz de desarrollar abscesos cerebrales. multirresistencia.

Destruyen las microvellosidades, formando lesiones muy características denominadas de adherencia y eliminación.

Las enterobacterias son las más frecuentemente relacionadas con las infecciones cuya gravedad depende principalmente de la capacidad patológica o de la

virulencia de la especie en cuestión y de las características del hospedador.

Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera de la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación.

Escherichia

● Catalasa positivos. ● Oxidasa negativos. ● Reducen nitratos nitritos. ● Citrato.

Tatumella

●

Infección del tracto urinario, y enfermedad a gastrointestinal que varía entre una simple diarrea hasta una disentería.

Es responsable de la gran mayoría de enfermedades en humanos.

Da positiva en la prueba de fenilalanina. ● Da negativas las pruebas de indol, Voges Proskauer, citrato.

Los informes clínicos asocian este agente con infecciones traqueobronquiales pulmonares (neumonitis, bronquitis asmática, faringitis).

La información científica sobre las especies de Tatumella es escasa, al igual que las infecciones humanas confirmadas.

Yokenella

Es catalasa-positiva débil, oxidasa-negativa, nitrato reductasa-positiva y fermenta la glucosa produciendo gas.

Se ha aislado en sangre de personas con sepsis y se ha registrado que puede causar osteomielitis

Probablemente causa, aunque de forma excepcional, enfermedad en humanos.

Yersinia

Metabolismo fermentativo, es nitrato reductasa positiva, catalasa positiva y oxidasa negativa. Sus pruebas del IMViC son positivas para el rojo de metilo y el Voges Proskauer.

Produce en el ser humano la peste pulmonar, la peste bubónica y también la peste septicémica.

Yersinia pestis es un agente infeccioso que ha sido directamente responsable de más muertes humanas

Es un cocobacilo de tinción bipolar similar a otras Enterobacterias.

Klebsiella

Kluyvera

Raoultella

Serratia

que cualquier otra enfermedad infecciosa.

Está ampliamente distribuido en la naturaleza, es huésped habitual saprófito del hombre y de los animales y la especie K. Forma parte de la microbiota normal del intestino humano y de la cavidad oral.

Es así que las heces son la fuente más significativa de las infecciones. ● Indol positivas y Voges Bacteria que puede causar No se han descrito Proskauer negativas. infecciones oportunistas en factores específicos de virulencia, pero, a ● Citrato de Simmons. pacientes semejanza de otras ● Ornitina descarboxilasa. inmunodeprimidos . enterobacterias. ● Malonato.

Posee el ● Lactosa. lipopolisacárido de la pared y antígenos de superficie que le confieren poder patógeno.

Las especies del Infecciones del tracto ● IND: indol, género Raoultella ● ODC: ornitina urinario y heridas. son poco frecuentes descarboxilasa, en muestras ● VP: Voges Proskauer, clínicas. ● MAL: malonato, ● ONPG: onitrofenilgalactopiranós ido, 10°C y 44°C: desarrollo a esas temperaturas, ● MEL: D-melizitosa, ● SOR: Lsorbosa, ● HIS: histamina ● IND: indol, ● ODC: ornitina descarboxilasa, ● VP: Voges Proskauer, ● MAL: malonato, ● ONPG: onitrofenilgalactopiranós ido, 10°C y 44°C: desarrollo a esas temperaturas, ● MEL: D-melizitosa, SOR: Lsorbosa, ● HIS: histamina

Infecciones del tracto urinario, septicemia, e infecciones de tejidos blandos, infecciones en vías respiratorias.

● Glucosa (gas). ● VPa

Puede conjuntivitis,

provocar Reconocida como queratitis e agente responsable

● ONPG ● Citrato

infecciones en heridas, riñones y vías urinarias, así como infecciones respiratorias, meningitis y endocarditis.

de infecciones nosocomiales y de pacientes de la comunidad.

Pantoea

● Movilidad ● ONPG

Es un patógeno oportunista en pacientes inmunodeprimidos , que causa infecciones de heridas, sangre e infecciones del tracto urinario.

Algunas especies muestran una capacidad de detección de quórum que podría impulsar la expresión de diferentes genes, controlando así ciertas actividades fisiológicas

Salmonella

● ● ● ● ● ● ● ●

Infección bacteriana La salmonelosis se frecuente que afecta el clasifica como una aparato intestinal. enfermedad de origen alimentario porque los alimentos contaminados, principalmente los de origen animal, constituyen el modo predominante de transmisión.

Cronobacter

● ● ● ●

Dulcitol ONPG Malonato Gelatina Sorbitol KCN Tartrato Mucato

Catalasa, Reducción de nitratos, Utilización de citrato, Producción de acetoína (VogesProskauer), ● Esculina y arginina.

Este microorganismo se ha relacionado con brotes de meningitis o enteritis, en especial en los lactantes.

En los escasos brotes relatados, se observó una mortalidad del 20% al 50% de los lactantes que contrajeron la enfermedad.

Los lactantes sobrevivientes presentaron complicaciones duraderas severas

incluyendo trastornos neurológicos.

Las consecuencias ligadas a la morbilidad en adultos parecería ser significativamente más leve.

Referencias del cuadro: 1. La asociación argentina de microbiologÍa. Bacterias de Importancia Clínica. [En línea].

Disponible en: https://www.aam.org.ar/descargaarchivos/Parte21Enterobacterias.pdf [Consultado el 26 de octubre de 2020].

2. En un cuadro mencione cada una de las pruebas bioquímicasrealizadas en las enterobacterias, con el fundamento o principio de la prueba, medios y reactivos utilizados, procedimiento y controles.

Prueba Citrato

Fundamento o Principio Esta prueba nos permite comprobar la capacidad de la bacteria de utilizar el citrato como fuente exclusiva de carbono. La degradación del citrato conlleva a la alcalinización del medio y el viraje del indicador azul de bromotimol de verde a azul prusia.

Microrganismos positivos • Salmonella • Arizona • Citrobacter • Enterobacter • Klebsiella • Serratia licuefaciensis •Pseudomonas cepacia

Medios y Reactivos El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la fórmula de Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de flauta).

Procedimiento Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario y se siembra en forma de estría única en el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar Indicador: Azul de citrato. El tubo se incuba a Bromotimol.

35 °C durante 24 a 48 Sustrato principal: citrato horas. de sodio.

Sustrato secundario: fosfato dipotásico, cloruro de sodio, sulfato de magnesio y fosfato monoamónico.

Resultados Citrato positivo: La bacteria consume el citrato como fuente exclusiva de carbono Ej.: Klebsiella pneumoniae citritasa Citrato negativo: La bacteria no consume el citrato como fuente de carbono.

Ej.: Escherichia coli

La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si hay desarrollo visible en la estría de siembra. Esto es valido porque para que el desarrollo sea visible, el microorganismo debió haber ingresado en la fase logarítmica de crecimiento, lo que solo es posible si ha asimilado carbono y nitrógeno.

Microrganismos negativos • • • • • • •

Edwarsiella Yersinia enterocolítica Escherichia coli Shigella Yersinia pseudotuberculosis Otras especies de Moraxella Proteus morganii

Prueba Ureasa

Fundamento o Principio Es una diamida del ácido carbónico. Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinización y aumento de pH del medio.

Medios y Reactivos Los dos medios utilizados con mayor frecuencia son el caldo urea de Stuart y el agar urea de Christensen.

Indicador: Rojo fenol Sustrato principal: Ureasa

Procedimiento El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por probar.

La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en estría con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24 horas.

Resultados Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 o 2 horas; las especies menos activas pueden requerir 3 días o más. Las reacciones son las siguientes: 1. Caldo de Stuart: Un color rojo en todo el medio indica alcalinización e hidrolisis de la urea.

2.

Agar de Christensen: Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el medio.

Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo solo en el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo.

3. Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original.

Microrganismos positivos • Klebsiella •Proteus (rápido)

Microrganismos negativos • Escherichia coli • Providencia

Prueba Voges-Proskauer

Fundamento o Principio

Voges-Proskauer, estos investigadores fueron los primeros en observar la reacción de color rojo producida en medios de cultivo adecuados después del tratamiento con hidróxido de potasio. Luego se descubrió que el producto activo del medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil metil carbinol, producto de la vía del butilenglicol. El ácido pirúvico, se metaboliza da como resultado la producción de acetona (acetil metil carbinol). Los microorganismos del grupo KlebsiellaEnterobacterHafnia-Serratia producen acetoina como producto metabólico final principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades pequeñas de ácidos mixtos.

En presencia de oxígeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la acetona se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de color rojo.

Microrganismos positivos • Klebsiella pneuminiae • Yersinia enterocolítica

Medios y Reactivos

Procedimiento

Resultados

El medio de cultivo utilizado es el caldo de rojo de metilo de Voges-Proskauer.

(MR/VP)

Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por probar. Incubar 24 horas a 35 °C. Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio. Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosférico y dejar el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.

Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o más después del agregado de los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación de la acetona. La prueba no debe leerse más allá de una hora después de dejar los tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo falso.

 

a-naftol al 5% KOH

Microrganismos negativos • Escherichia coli • K. ozaenae

Prueba Rojo de Metilo

Fundamento o Principio El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho más bajo que el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de ácido del sustrato de hidratos de carbono que se utilice. La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la producción de ácido, que requiere que los microorganismos positivos produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) de la glucosa.

Microrganismos positivos • Escherichia coli • Especies de Yersinia

Medios y Reactivos

Procedimiento

Resultados

El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metiloVoges-Proskauer (MR/VP) según la fórmula de Clark y Lubs.

1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas).

2.

Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de metilo directamente al caldo.

Positivo: El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica la suficiente producción de ácido como para disminuir el pH a 4,4.



Reactivo de rojo de metilo.

Negativo: Como otros microorganismos pueden producir pequeñas cantidades de ácido del sustrato probado, puede observarse un color naranja, intermedio entre amarillo y rojo.

Esto no indica una prueba positiva.

Microrganismos negativos • Enterobacter aerógenes • Enterobacter cloacae • Klebsiella

Prueba SIM: Sulfuro indol movilidad

Fundamento o Principio Es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. La prueba del indol se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del pdimetilaminobenzaldehido.

En la práctica se utilizan medios combinados, como el medio de sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol omitina (MIO) o el medio indol nitrato.

Medios y Reactivos Caldo triptofano (triptofano al 1%)

Procedimiento Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por • Peptona o digerido probar e incubar a 35 °C pancreatico de caseina durante 18 a 24 horas. (tripticasa) 2 g Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 • Cloruro de sodio 0,5 g gotas del reactivo haciendo que se • Agua destila da 100 ml deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza el Reactivo de Kovac reactivo de Ehrlich, este • Alcohol amilico o paso debe ser SIM: Determinar si un organismo es isoamilico puro 150 ml precedido por el móvil o inmóvil, si es capaz de liberar agregado de 1 mL de ácido sulfhídrico por acción enzimática • p- xilol.

Esto no es de los aminoácidos que contienen dimetilaminobenzaldehido necesario con el azufre produciendo una reacción 10 g reactivo de Kovac. visible de color negro y por último la capacidad de desdoblar el indol de la • HCI concentrado 50 ml molécula de triptófano.

Reactivo de Ehrlich • pdimetilaminobenzaldehido 2g

Resultados Ácido sulfhídrico: Positivo: ennegrecimiento del medio Negativo: Sin ennegrecimiento

Indol: Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio Negativo: No se produce color /Color naranja en la superficie del medio indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser precursor de la formación de indol.

• Alcohol etílico 190 ml PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfato ferroso.

• HCI concentrado 40 ml La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba completa. Si el cultivo de 24 hrs es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.

Movilidad: Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y

PRODUCCIÓN DE INDOL El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético. La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono.

se difunden en el medio provocando turbiedad.

Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.

Prueba MIO: MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA

Fundamento o Principio Se utiliza para la identificación de enterobacterias sobre la base de movilidad, la producción de ornitina descarboxilasa e indol.

1. Descarboxilación de ornitina 2. Producción de indol 3. Movilidad

Medios y Reactivos Composición del medio: • Extracto de levadura • Peptona • L-Ornitina • Dextrosa • Agar • Agua •Indicador de pH: púrpura de bromocresol Descarboxilación de ornitina: • Ácido: amarillo pH 5.2 mide la capacidad enzimática de • Alcalino: Púrpura pH 6.8 un organismo para descarboxilar • Medio no inoculado: un aminoácido para formar una Púrpura intenso brillante amina, con la consiguiente pH 6.0 alcalinidad.

Producción de indol: El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético.

Microrganismos positivos • Especies de Enterobacter • Proteus mirabilis • Proteus morganii • Yersinia enterocolitica

Procedimiento Inoculación: picadura en forma vertical Tiempo: 28-48 hrs Temperatura 35 -37°C

Resultados Ornitina descarboxilasa Positivo: color púrpura del medio Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser púrpura al final Indol: Positivo: anillo rojo en la superficie del medio Negativa: No se Produce color / Color naranja en la superficie del medio, indica desarrollo de escatol Movilidad:

Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad.

Negativa: crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.

Microrganismos negativos • Especies de Klebsiella • Enterobacter aglomerans • Proteus vulgaris • Proteus rettgeri • Yersinia pestis • Yersinia pseudotuberculosis

Prueba TSI: Triple azúcar Hierro

Fundamento o Principio Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico.

El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol. A 6 horas de la incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo tendrán un color amarillo (fermentador de glucosa) Si el fondo permanece rojo, no hay variación de pH (no fermentador de glucosa) Si el color rojo es más intenso que el original, hay alcalinización (no es miembro de la familia enterobacteriaceae) Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa.

Después de 18-24 hrs, el medio permanece amarillo, reacción ácida sobre ácido (A/A). Fermentador de lactosa. La producción de gas romperá el agar o lo empujará hacia arriba. Reacción A/A más gas.

Si no utiliza la lactosa, hará uso de proteínas o aminoácidos. El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxígeno es abundante. 1824 hrs de incubación: zona inclinada roja fondo del agar amarillo (metabolismo anaerobio de glucosa inicial). Reacción alcalina sobre ácido K/A. Las bacterias que fermentan glucosa también pueden formar productos alcalinos a partir de la utilización de la peptona, sobre la zona inclinada. Reacción K/K.

Medios y Reactivos Agar hierro de klinger (AHK)

Procedimiento Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano.

Composición: Temperatura: 35Estracto de carne 37°C Tiempo 18Extracto de levadura 24 hrs Peptona Proteasa Lactosa Dextrosa Sulfato ferroso Cloruro de Na Tiosulfato de Na Agar Agua destilada Indicador: Rojo fenol Ácido: amarillo Alcalino: Rojo Medio no inoculado: naranja rojizo, pH 7.4

Resultados K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad ácida).

Característico de bacterias no fermentadores de lactosa como Shigella.

A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ profundidad ácida).

Característicos de E. coli y grupo KlebsiellaEnterobacter.

K/K: No fermentación de glucosa y lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad alcalina).

Característico de bacterias no fermentadoras como Pseudomas aeruginosa

Prueba LIA: Agar Lisina Hierro

Fundamento o Principio Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina con la consiguiente alcalinidad.

Medios y Reactivos Procedimiento Base de Inoculación: por descarboxilasa de picadura y estría, inóculo Moller liviano. Temperatura: 3537°C Tiempo 18-24 hrs Composición: Peptona Extracto de carne Piridoxal L-lisina Citrato de amonio Tiosulfato de sodio Glucosa Agua destilada Agar Indicador de pH: Purpura de bromocresol

Resultados • K/K: Azul de Prusia/azul de Prusia.

Desaminación oxidativa/descarboxilación.

• K/A: azul desaminación.

de

Prusia/lila.

No

• Producción de H2S: Enegrecimiento del medio • Producción de gas: burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las paraedes del tubo.

Ácido: Amarillo pH 5.2 Alcalino: Púrpura pH 6.8 Medio no inoculado: Purpura intenso brillante pH 6.0 COLOR: LILA INDICADOR: PÚRPURA DE BROMOCRESOL SUSTRATOS PRINCIPALES: LISINA Y GLUCOSA

REFERENCIAS: Toda la información fue tomada de: Gurrola, S. Pruebas bioquímicas utilizadas para identificación de enterobacterias. Slideshare. (Internet) 10 de abril del 2014. (Cansultado el 25 de octubre del 2020). Disponible en: https://es.slideshare.net/SusanaGG/pruebas-bioqumicas

GUÍA 10: METABOLISMO BACTERIANO “IDENTIFICACIÓN BACTERIAS GRAM POSITIVAS”

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 29 de 9

Consulta 1. Realice una tabla comparativa de cada uno de los géneros de las Enterobacterias donde incluya pruebas bioquímicas, infecciones que causan y aspectos epidemiológicos relevantes.

2. En un cuadro mencione cada una de las pruebas bioquímicas realizadas a las Enterobacterias; con el fundamento o principio de la prueba, medios y reactivos utilizados, procedimiento y controles.

Guía de laboratorio

10

Tema:

METABOLISMO BACTERIANO “IDENTIFICACIÓN BACTERIAS GRAM POSITIVAS” Objetivos

• •

Diferenciar grupos bacterianos, tanto Gram negativos como Gram positivos.

Reconocer las principales especies de los géneros Streptococcus sp y Staphylococcus sp, que son muy importantes en el área clínica e industrial.

Fundamento El metabolismo bacteriano ya sea por la vía fermentativa o por la vía oxidativas es un parámetro importante en la diferenciación de sus géneros y especies.

Se analizarán algunas bacterias Gram positivas, sembrándolas en pruebas bioquímicas y en otros medios de cultivos selectivos para ellas. Se trabajará con cultivos de diferentes especies del género Streptococcus sp y Staphylococcus sp, por su gran importancia tanto en la parte clínica como industrial.

El género Streptococcus sp, comprende un grupo biológico grande y diverso de cocos Gram positivos que proliferan en pares o cadenas. Son anaerobios facultativos con metabolismo fermentativo generalmente homoláctica y no producen gas, son catalasa negativos y esta característica sirve para diferenciarlos de los Staphylococcus sp. Varias de sus especies causan enfermedades humanas importantes, tales como faringitis estreptocócica, fiebre escarlatina, infecciones del tracto urinario y endocarditis bacteriana. Se dividen en cinco grupos, citando en cada grupo algunas especies de mayor importancia clínica: Estreptococos del Grupo A: Streptococcus pyogenes; Estreptococos del Grupo B: Streptococcus agalactiae y Streptococcus faecalis; Estreptococos del Grupo C: Streptococcus equi; Enterococos y Estreptococos del Grupo D: Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium; Estreptococos del Grupo G: Son cepas de Streptococcus que contienen el antígeno del grupo G no tienen designación de especie También se analizarán cepas de Staphylococcus sp en agar sangre para diferenciarlas de los Streptococcus sp.

Materiales y Equipos Item Tipo Descripción Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código: 1 2 3 4 5 6 Ítem 1 2 3 4 5 6

Paso 1 2

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 30 de 9

BIOL

Cultivos bacterianos: especies de Streptococcus, Staphylococcus que se encuentren en el cepario.

MAT Asas bacteriológicas redondas y rectas MAT Láminas MAT Laminillas MAT Mecheros EQUIP Microscopios Reactivos Descripción Colorante cristal violeta Colorante safranina 0.5% Lugol Alcohol acetona Aceite de inmersión Bioquímicas: Caldo Urea, Caldo Nitratos, Peróxido de hidrógeno (catalasa), oxidasa, caldo glucosa con campana durham y caldo lactosado con campana durham, Agar DNasa, tubos con 0.5ml de plasma. HCl al 1N, sensidiscos de Novobiocina de 5µg, Agar Muller Hinton.

Procedimiento Descripción Preparar los frotis bacterianos según clases anteriores, realice tinción de Gram a. Siembre en las diferentes pruebas bioquímicas asignadas b. Incube a 37°C/24 horas c. Revele e interprete.

Ilustración 13. Pruebas bioquímicas: Coagulasa, Ureasa, Dnasa

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 31 de 9

Ilustración 14. Antibiograma

3 Realice Prueba de Catalasa: sobre una lámina suspenda una asada del cultivo a identificar, deje caer una gota de peróxido de hidrogeno y observe inmediatamente. La formación de burbujas se interpreta como una reacción positiva.

4

Siembre en agar sangre para observar hemólisis a. Siembre con escobillón estéril o con asa redonda por agotamiento sobre la caja de petri que contiene agar sangre las cepas en estudio. b. Incube a 35+/-2°C por 24-48horas c. Observe la producción según sea el caso de (β - hemólisis) zona clara alrededor de la colonia como consecuencia de la lisis completa de los eritrocitos. Otros producen una zona de hemólisis parcial con una coloración verdosa (α – hemólisis), mientras que otras especies son no hemolíticas y no producen hemólisis (γ – hemólisis) en agar sangre. d. Compare la actividad hemolítica de los diferentes cultivos asignados.

5

Siembre en agar Baird Parker: a. Tome una asada del cultivo y siémbrela sobre agar Baird Parker agotando el cultivo. b. Incube a 35+/-2°C por 24-48horas.

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

GUIA DE LABORATORIODE BACTERIOLOGÍA I Unidad de Formación Versión: Código:

001

Fecha:

2019

UC – BAC – MCG – GL 001

Manual de calidad Pag 32 de 9

Observe el crecimiento e identifique la actividad de las enzimas lipasas y lecitinasas si están presentes en el cultivo asignado.

Consulta 1. Qué son las hemolisinas, explique su composición y mecanismos de acción.

2. Investigue de las siguientes especies generalidades del cultivo y sobre las enfermedades que producen (cuadro clínico y tratamiento): a. Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Enterococus faecalis Streptococcus equi; Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium; Estreptococos del Grupo G. b. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus.

3. Investigue sobre los medios de cultivo y las pruebas bioquímicas utilizados.

Bibliografía TORTORA, GERARD. J. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

FORBES, BETTY. (2009). Diagnostico Microbiológico. Doceava edición. Editorial Médica Panamericana.

Buenos Aires.

KONEMAN ET AL. (2008). Diagnostico Microbiológico. Sexta edición. Editorial Mac GrawHill. México.

MADIGAN ET AL. (2003). Brock: Biología de los microorganismos. (Décima edición) Editorial Pearson – Prentice Hall, Madrid.

Elaborado por:

Elaborado por: Azula Sanguino Fecha

2 de Febrero de 2019

Fecha

Revisado por:

Aprobado por:

CARMELITA MENDOZA PEREZ

CLAUDIA MONTEJO

Fecha

Consulta Bacteriología 10 “METABOLISMO BACTERIANO: IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS” Lucia Luzardo Pardo Maily Useche Acevedo 1. Qué son las hemolisinas, explique su composición y mecanismos de acción.

LAS HEMOLISINAS Las Hemolisinas son anticuerpos del suero que cuando actúan con el complemento tienen el poder de Usar o destruir los glóbulos rojos, o alterar su membrana permitiendo la salida de la hemoglobina. La mayoría de ellas son proteínas o lípidos. Son un factor de virulencia de Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Streptococcus pyogenes y otro gran número de bacterias patógenas.

COMPOSICIÓN La hemolisina está constituida por siete subunidades y el gen que la codifica posee siete promotores.

Estas siete subunidades se insertan en la membrana plasmática de las células blanco y, al juntarse, forman un canal iónico por donde se escapan los metabolitos del interior celular.

La hemolisina es una citotoxina dependiente de calcio (Ca+2) extracelular que actúa sobre la membrana plasmática de las células del torrente sanguíneo. Los poros que crea en la membrana también son hidrofílicos y causan la entrada de agua en el interior celular, lo que puede ocasionar la lisis.

Las hemolisinas son productos proteicos típicos de las bacterias de tipo gramnegativas y todas comparten dos características:

1- La presencia de un péptido muy pequeño (nonapéptido) conformado por repetidos de los aminoácidos glicina y ácido aspártico. Los nonapéptidos de la hemolisina se ubican cerca de la porción C-terminal de la estructura primaria de la proteína.

2- Todas las hemolisinas son secretadas por la bacteria al medio extracelular a través de un transportador de tipo ABC (del inglés ATP-Binding Cassette).

Habitualmente se detecta la producción de hemolisinas en las cepas bacterianas a través de un crecimiento en medio agar sangre. En la prueba, se observa un halo hemolítico, producto de la ruptura de los glóbulos rojos cerca de las colonias bacterias.

MECANISMOS DE ACCIÓN Mecanismo Una forma en que la hemolisina lisa los eritrocitos es formando poros en las bicapas de fosfolípidos. Otras hemolisinas lisan los eritrocitos hidrolizando los fosfolípidos en la bicapa.

Formación de poros Muchas hemolisinas son toxinas formadoras de poros (PFT), que pueden causar la lisis de eritrocitos, leucocitos y plaquetas al producir poros en la membrana

citoplasmática. La hemolisina normalmente es secretada por las bacterias de forma soluble en agua. Estos monómeros se difunden a las células objetivo y se unen a ellas mediante receptores específicos. Una vez hecho esto, se oligomerizan, creando complejos heptámeros en forma de anillo. Las hemolisinas pueden ser secretadas por muchos tipos diferentes de bacterias como Staphylococcus aureus, Escherichia coli o Vibrio parahemolyticus, entre otros patógenos.

2. Investigue de las siguientes especies generalidades del cultivo y sobre las enfermedades que producen (cuadro clínico y tratamiento):

a. Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Enterococus faecalis Streptococcus equi; Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium; Estreptococos del Grupo G. Agente Streptococcus pyogenes

Cultivo Cultivo en una placa de agar sangre enriquecida, a las 24 horas de incubación las colonias aparecen en forma de cúpula, de color grisaceo.

Cuadro Clínico Faringitis, Escarlatina, Pioderma, Erisipela, Celulitis, Fascitis necrosante, Síndrome del shock tóxico estreptocócico, Fiebre reumática, Glomerulonefritis aguda.

Tratamiento S. pyogenes es altamente sensible a penicilina. En los pacientes alérgicos a esta puede usarse eritromicina o una cefalosporina oral, pero este tratamiento suele ser ineficaz contra infecciones mixtas con staphylococcus aureus, en donde el tratamiento puede incluir oxacilina o vancomicina.

Streptococcus agalactiae

Colonias β-hemoliticas de Streptococcus agalactiae en agar sangre después de 18 h de incubación a 36°C

Es la principal causa de sepsis neonatal; sin medidas de prevención, su incidencia es de, aproximadamente, 3 casos por mil nacidos vivos (entre el 1 y el 2% de los recién nacidos colonizados por el EGB). En éste, la infección suele manifestarse, en las primeras horas de vida, bajo la forma de neumonía, sepsis o meningitis, con una mortalidad próxima al 10% (0,2-0,5 casos por mil nacidos vivos).

La penicilina G es el antibiótico de elección para el tratamiento de las infecciones por este microorganismo.

También se utiliza habitualmente la combinación de penicilina más un aminoglucósido, generalmente la gentamicina, en el tratamiento de las infecciones graves, dada la sinergia que estos antibióticos presentan in vitro.

Colonias de Streptococcus agalactiae en Granada medium, incubación anaerobia 48h 36°C

Enterococcus faecalis

Agar sangre donde crecen a las 24h colonias de Enterococcus faecalis.

Tienen un tamaño entre 0.5 y 1 mm, a menudo opacas y blancas, que suelen ser α hemolíticas o no hemolíticas, aunque en algunos casos aparecen como β hemolíticas.

E. faecalis puede causar endocarditis, infecciones de vejiga, próstata, epidídimo; las infecciones de sistema nervioso son menos comunes.

Cuando no se puede usar un aminoglucósido, la combinación de penicilina o ampicilina con ceftriaxona es una alternativa eficaz para el tratamiento de endocarditis por E. faecalis

Streptococcus equi

Colonias pequeñas gris blanquecinas e incoloras, se cultiva normalmente en agar sangre.

La bacteriemia por S.equi se produce en asociación con procesos patológicos de base aneurisma aórtico o en el contexto de infecciones de otros órganos, artritis, neumonía, meningitis

Enterococcus faecium

Agar sangre donde crecen a las 24h colonias de Enterococcus faecium.

Tienen un tamaño entre 0.5 y 1 mm, a menudo opacas y blancas

Puede ser comensal (inócuo, organismo coexistente) en el intestino humano, pero podría ser patógeno, causando enfermedades como meningitis neonatal.

La terapia antimicrobiana tradicional incluye como antibióticos de primera elección a los β-lactámicos, principalmente la penicilina G (PEN), con muy buena respuesta clínica. Otros grupos de antimicrobianos utilizados son las sulfas potenciadas, como la trimetroprimasulfametoxazol (TMS), y los macrólidos, como la eritromicina.

Linezolid o daptomicina son utilizados para tratar las infecciones EVR. Las estreptograminas, así como la quinupristina/dalfopristina, pueden ser usados para el E. faecium

Estreptococos del Grupo G

Colonias blancas, pequeñas, con hemólisis Beta, pueden dividirse en dos grupos morfológicos según el tamaño de su colonia: las colonias grandes son similares a las de S. pyogenes (≥ 0,5 mm de diámetro)

En humanos se han aislado en infecciones faríngeas y cutáneas similares a las del grupo A. También se han descritos casos aislados de infección puerperal, sepsis, endocarditis y neumonía.

Son sensibles a la penicilina, pero se han descrito cepas tolerantes.

b. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus.

Agente

Cultivo

Cuadro Clínico

Staphylococcus

Desde el punto de vista

saprophyticus.

nutricional es no exigente,

Es

causa

Tratamiento

frecuente

de

Muchas

infecciones del tracto urinario en

resistentes

cepas a

la

son

penicilina.

por lo tanto, crece tanto en mujeres jóvenes, 17 a 27 años- y

Además, son resistentes a

medios de cultivo pobres,

uretritis en varones. Durante el

Novobiocina

como el agar simple, como

coito puede haber un arrastre de

en medios ricos, como el

bacterias de la vagina al tejido

agar sangre ovina.

urinario; por lo que después del coito es muy recomendable orinar.

Staphylococcus epidermidis

Cultivo en el medio

S. epidermidis, es una causa

El

antimicrobiano

agar manitol salado en el

común de infección relacionada

elección

que se observan colonias

con catéter intravascular, la cual

empírico

de S. aureus (amarillas

es consecuencia directa de la

dispone del antibiograma del

con halo amarillo) y de S.

formación de biopelículas.

microorganismo)

en

el

de

tratamiento

(cuando

no

se

es

la

epidermidis (blancas sin

vancomicina (debido a la alta

halo).

tasa

de

resistencias

meticilina),

que

a

puede

asociarse a rifampicina o a un aminoglucósido

como

la

gentamicina.

Staphylococcus

Cultivo de estafilococos

Enfermedades, que van desde

En un inicio, el tratamiento

aureus

en agar-sal-manitol que

infecciones cutáneas y de las

de elección contra infecciones

muestra

colonias

S.aureus amarilla/dorada).

de mucosas relativamente benignas,

(sección

graves

por

este

tales como foliculitis, forunculosis

microorganismo era penicilina.

o

Pero debido a que el 80% de S.

conjuntivitis,

hasta

enfermedades de riesgo vital,

aureus

como

penicilina,

las

penicilinas

resistentes

a

penicilasas

profundos,

celulitis,

abscesos osteomielitis,

es

resistente

meningitis, sepsis, endocarditis o

(oxacilina,

neumonía.

dicloxacilina y meticilina) son

a

nafcilina,

los fármacos de elección.

3. Investigue sobre los medios de cultivo y las pruebas bioquímicas utilizados.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS GENERO STAPHYLOCOCCUS PRUEBA DE LA CATALASA

La enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno. De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares

PRUEBA DE LA COAGULASA

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos

que

permite

la

conversión

del

fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus.

PRESENCIA DE (DNAsa)

Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es capaz de clivar los enlaces fosfodiéster internos de la molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo el cual se combina con

DNA

altamente

polimerizado.

Cuan-do

la

combinación no ocurre, por acción de la enzima DNAsa, se produce una decoloración del medio.

SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA

Separar

S.

saprophyticus

(resistente

a

la

novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa negativos.

GENERO STREPTOCOCCUS SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA

Streptococcus

pyogenes

es

sensible

a

bajas

concentraciones de Bacitracina (discos conteniendo 0,04U). También existe un 5% de cepas de Str. agalactiae que son sensibles a la Bacitracina.

HIDROLISIS DEL PYR

Separar Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los demás estreptococos, S.pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa.

PRUEBA DE CAMP

Se basa en que los estreptococos del grupo B producen

un

factor

llamado

CAMP

(factor

de

monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por un estafilococo productor de ßlisina ESTREPTOCOCOS

Se basa en la capacidad de los estreptococos del

ALFA Y GAMMA

grupo D de crecer en un medio de cultivo que contiene

HEMOLITICOS

un 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina, la cual se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro. La concentración de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del grupo Viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis.

PRUEBA DE

Se basa en la capacidad de los enterococos de

TOLERANCIA A LA

crecer en una concentración de 6,5% de NaCl. Se trata

SAL (Caldo salado)

de un medio de cultivo líquido que contiene además de NaCl, glucosa y un indicador de pH: púrpura de bromocresol.

SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA

Se basa en la sensibilidad de S.pneumoniae a una concentración menor o igual a 5µg/ml de hidroxicuprina (optoquina).

El Agar Sangre

Es un medio de aislamiento especialmente diseñado para facilitar el crecimiento de microorganismos exigentes, bacterias Gram+ y todas las especies encontradas en mustras de origen clínico.

Agar Baird Parker

Medio altamente nutritivo, en el cual la peptona de caseína y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el extracto de levadura aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el crecimiento de los estafilococos. El agar es el agente solidificante.

Referencias

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Coagulasa.

[En

línea].

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https://decs.bvsalud.org/es/ths/resource/?id=3058&filter=ths_exact_term &q=Coagulasa [Consultado el 31 de octubre de 2020].

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Prueba

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https://fiestadelosmicroorganismos.wordpress.com/2017/02/26/practica18-siembra-en-agarsangre/#:~:text=El%20agar%20sangre%20es%20un,en%20mustras

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