4) ACLARACIÓN: Se realiza con xilol o tolueno. Este permite remover el alcohol y además es importante aplicarlo ya que es soluble en parafina. En este paso se pierden los lípidos, por lo tanto se usan otras técnicas para teñirlos. 5) INCLUSIÓN (en parafina líquida): Se coloca la muestra en parafina líquida y se deja reposar hasta que la misma endurezca. El mismo proceso (pero al revés) lo vemos en la vida cotidiana en las velas que están compuestas, justamente, por parafina y que por acción de la llama, esta se derrite. Volviendo a la inclusión, repetimos que este paso se vería impedido si la muestra previamente no se deshidrata y aclara. Uno de los efectos adversos de realizar estos dos pasos previos, es la pérdida de los lípidos de la muestra. 6) CORTE: una vez que la parafina endurece, obtenemos lo que se conoce como "taco". Este mismo va a ser pasado por una máquina, llamada micrótomo, que va a cortar con una cuchilla al taco en finas láminas de unos 5 a 15 um - micrómetros. Este aparato lo podemos asemejar, si uno quiere, con una cortadora de fiambres. 7) MONTAJE: la muestra se coloca en un portaobjetos donde se le aplica un medio de montaje, como la albúmina, que sirve de adhesivo. 8) DESPARAFINIZACION: se vuelve a pasar la muestra por xilol o tolueno para remover la parafina. 9) COLORACIÓN O TINCIÓN: Luego de la desparafinización se debe rehidratar la muestra con soluciones decrecientes de alcohol, ya que si no, los colorantes serían en vano, ya que son hidrosolubles. Luego de estos dos pasos, se tiñe la muestra con hematoxilina, paso seguido se utiliza la eosina. A pesar de que este ultimo colorante también es hidrosoluble, resulta mucho más soluble en alcohol, por lo tanto se deshidrata nuevamente la muestra antes de colorearla con eosina. 10) MONTAJE FINAL: se utiliza un cubreobjetos. Ente el portaobjetos y el cubreobjetos se coloca una gota de bálsamos de Canadá o betún de Judea para que queden bien adheridos. Algo que llama la atención del procedimiento anterior, es la no conservación de los lípidos. ¿Cómo hacer para conservarlos? Para ello se deben utilizar cortes por congelamiento del tejido, fijado en formalina y utilizar colorantes que se disuelvan en las grasas.
2. Técnica histológica para microscopía electrónica. La preparación de una muestra para microscopía electrónica es igual al de la microscopía óptica, con la diferencia de que ciertos pasos, son de alguna manera "reforzados" por la necesidad de métodos más refinados. En el paso de "fijación" se debe utilizar el mejor fijador que se pueda conseguir; primero se fija con glutaldheido (preserva las proteínas al establecer enlaces cruzados entre ellas), seguida por un enjuague en buffer y la fijación con tetroxido de osmio (preserva lípidos).El tetroxido de osmio es un metal pesado, lo cual mejora la formación ulterior de la imagen en el MET. El paso de deshidratación es igual y luego el tejido se sumerge con una resina epoxi que luego se polimeriza (plástico). Luego se corta con un micrótomo de cuchilla de diamante que permite cortes muchos más finos, a comparación de micrótomos comunes para microscopía óptica.
3. Tinción H&E En microscopía óptica, es de suma importancia teñir las muestras con diversos colorantes. La mayoría de las muestras que vas a utilizar durante toda tu cursada, básicamente, están teñidas con hematoxilina y eosina, dos colorantes diferentes, y que funcionan de manera diferentes. Antes de saber qué tiñen, tenemos que entender cómo lo hacen. Para eso vamos a repasar conceptos básicos que se han visto en Química del CBC.
a. Concepto de ácidos y bases Un ácido es una sustancia capaz de ceder protones (H+); y una base, es aquella sustancia capaz de aceptar protones (H+). Entonces podemos decir que si el acido dona protones, tendría una carga neta negativa, y las bases tendría una positiva ya que aceptan ese par. El valor de acidez o alcalinidad (basicidad) está determinado a través de una escala: la escala de pH. El valor de pH es igual al logaritmo negativo de la concentración de ion hidronio y el de pOH al de la concentración del ion hidroxilo en disolución acuosa.
pH = -log [H+] pOH = -log [OH-] Esta misma oscila entre 0, que será el más acido, y 14, el más básico. Cuando se combinan un ácido y una base, tiene lugar una reacción de neutralización, en la que se formarán agua y sal. Pag 16 Nuevo Espacio Ciencias Medicas