Microscopía Electrónica
Como bien dijimos, hay que aumentar la apertura numérica. La apertura numérica es el producto entre el índice de refracción del medio (se define como el medio en el que se encuentra la lente, por lo general el medio es el aire cuyo índice de refracción corresponde a 1) y entre la mitad del ángulo de aceptación máxima que puede entrar o salir de la lente. Si tenemos una apertura numérica grande, las lentes podrán captar más luz y por lo tanto dar una imágen más brillante y de calidad. Por otro lado, hay que mantener una longitud de onda preferentemente baja. La longitud de onda, siendo algo breves, es la distancia que recorre una onda en un determinado intervalo de tiempo. En la fórmula está representada por la letra griega lambda. El valor numérico de esta longitud de onda, corresponderá a la de la luz blanca, ya que es la que utilizaremos en clase. Si quisiéramos disminuir esta longitud de onda, existen filtros que se colocan para disminuirla y así obtener una mejor imágen. El mejor filtro es el azul.
2. Microscopía Electrónica
Microscopía electrónica de barrido (MEB) – Sangre, se observa la superficie externa de sus componentes.
Como se dijo anteriormente, durante la cursada no van a poder manipular microscopios electrónicos, pero si es importante conocer qué imágenes nos permiten visualizar ya que las encontraremos en muchos libros. En principio debemos saber que un microscopio electrónico tiene un mayor poder de resolución, y por lo tanto un menor límite de resolución en comparación con el microscopio óptico. Esto nos indica que tendremos una mejor capacidad de ver dos puntos como separados. Pero, ¿cómo lo hace? Esto es posible ya que los microscopios electrónicos no utilizan luz como los ópticos, sino que utiliza un haz de electrones que pueden algunos o bien "barrer" u otros "atravesar" la muestra. Según lo que queramos ver y estudiar, existen dos tipos de M.E: de barrido (MEB) y de transmisión (MET). La diferencia entre ambos se vale básicamente del modo en que los electrones atraviesan la muestra. Si el haz barre, será un MEB y si atraviesa la muestra, será un MET. Las imágenes que reproduce un microscopio electrónico son en blanco y negro, aunque por computadora se puede manipular y colorear las muestras. Estas imágenes pueden mostrar el relieve del tejido - MEB -, o bien mostrar la estructura interna de las células, incluso de sus organelas - MET-. La imágen se proyecta en una pantalla o bien, es capturada en una placa fotográfica. Las porciones de la muestra que fueron atravesadas por el haz de electrones aparecen más claras, y las partes que absorbieron electrones debido a su gran densidad aparecerán oscuras.
III. Técnica Histológica Para poder visualizar al microscopio óptico una muestra, previamente se siguen una serie de pasos que permiten preparar esa muestra para su eventual estudio. Estos pasos comienzan desde la toma de la misma hasta su montaje en el portaobjetos. La siguiente seguidilla de pasos de preparación de la muestra a analizar, corresponde específicamente a la llamada "técnica de rutina” utilizada para microscopía óptica y para tinción con hematoxilina y eosina. Paciencia, ya ahondaremos en eso.
1. Técnica histológica de rutina con hematoxilina y eosina. Serie de pasos: Microscopía electrónica de transmisión (MET) – Una mitocondria, se exponen sus componentes internos.
Imagen manipulada, se le han agregado colores digitalmente. MEB – Espermatozoides.
1)OBTENCION DE LA MUESTRA: la misma se puede tomar tanto de un organismo vivo como uno no vivo. Si es vivo, al proceso de toma se lo llamará "biopsia", y si no es vivo, se lo llamará "necropsia". Otros tipos de obtención de la muestra se da a través de raspajes como los extendidos vaginales teñidos con la técnica de Papanicolau o los frotis sanguineos teñidos con Giemsa. 2) FIJACIÓN: Mediante la utilización de fijadores químicos (glutaldheido, formaldehido - formalina) o físicos (congelación o desecación), tiene como objetivo detener los procesos celulares dinámicos mediante la insolubilización de los componentes estructurales de la célula y la formación de enlaces cruzados entre moléculas proteicas. Además, la fijación inactiva ciertas enzimas cuya función es la degradación de la célula muerta. Los contra de la fijación, es que la formalina es un mal fijador de lípidos, por lo tanto las membranas celulares (compuesta principalmente de este componente) no serán fijadas. 3) DESHIDRATACIÓN: Este paso, y el siguiente, puede ser, como no, incluido en el paso de "inclusión (en parafina)". El proceso de deshidratación se lleva a cabo pasando la muestra por soluciones crecientes de alcohol, la cuales van del 60% al 100%. Esto se realiza, básicamente, para quitarle el agua a la muestra. Las células contienen una gran cantidad de agua, que debe ser removida. Decimos que el paso de deshidrataciónpodría ser incluido en el de inclusión (de hecho, hay cátedras que aceptan
esta denominación), ya que la causa de por qué hacemos este paso y el siguiente, el de la aclaración, es para poder incluir correctamente en parafina la muestra.