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Farmacología Molecular y Farmacovigilancia molecular

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GENERANDO COMPETENCIAS

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INDICE NUEVAS TERAPIAS ONCOLÓGICAS CONTRA BLANCOS MOLECULARES ................................................... 3 SUS APLICACIONES EN TUMORES SÓLIDOS DEL ADULTO ......................................................................................... 3 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................ 3 BIOLOGÍA MOLECULAR Y NUEVAS TERAPIAS ....................................................................................................... 4 ANTICUERPOS MONOCLONALES EN ONCOLOGÍA ................................................................................................. 5 FÁRMACOS QUE ATACAN LA SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR .................................................................................... 7 ANTICUERPOS MONOCLONALES Y FÁRMACOS ORALES........................................................................................... 8 IMPACTO EN LOS COSTOS ASISTENCIALES ......................................................................................................... 10 PERSPECTIVAS ............................................................................................................................................ 11 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................................ 13 BLANCOS TERAPÉUTICOS PARA LA DIABETES ...................................................................................... 14 CONCLUSIONES .......................................................................................................................................... 19 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................................................... 19 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................................... 21 NEUROPÉPTIDOS ........................................................................................................................................ 22 OTROS COMPUESTOS................................................................................................................................... 25 AVANCES EN EL TRATAMIENTO ANTIDEPRESIVO BASADO EN INVESTIGACIÓN FARMACOGENÓMICA ............................... 27 CONCLUSIONES .......................................................................................................................................... 28 BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................................ 29 GALECTINAS .............................................................................................................................................. 30 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................................... 30 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................... 32 LAS CÉLULAS Y LOS REACTIVOS ....................................................................................................................... 32 INMUNOTINCIÓN DE TEJIDOS......................................................................................................................... 33 DETERMINACIÓN DE LA UNIÓN A LA SUPERFICIE CELULAR GALECTINA ..................................................................... 33 ENSAYOS DE MUERTE DE CÉLULAS T ................................................................................................................ 34 PÉRDIDA DE CÉLULAS DE TIMOCITOS ............................................................................................................... 34 IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA GALECTINA-3-VINCULANTES ........................................................................ 35 RESULTADOS.............................................................................................................................................. 37 LA GALECTINA-3 MUERTES CÉLULAS T Y TIMOCITOS ........................................................................................... 40 DISCUSIÓN ................................................................................................................................................ 54 NUEVOS BLANCOS MOLECULARES PARA EL TRATAMIENTO DE LA ULCERA PÉPTICA .................................................. 59 FISIOLOGÍA DE LA SECRECIÓN ÁCIDA................................................................................................................ 59 JUSTIFICACIÓN DE LA BÚSQUEDA DE NUEVOS BLOQUEANTES ÁCIDOS ..................................................................... 60 FARMACOLOGÍA DE LA GASTRINA ................................................................................................................... 60 EFECTOS CLÍNICOS DE LOS ARG ..................................................................................................................... 61 RECEPTORES Y REGULACIÓN DE LA LIBERACIÓN DE HISTAMINA.............................................................................. 63 RECEPTORES Y REGULACIÓN DE LA SECRECIÓN ÁCIDA.......................................................................................... 63 FARMACOLOGÍA Y FARMACOVIGILANCIA MOLECULAR ....................................................................... 65 PROGRAMA DE ACTUALIZACIÓN PROFESIONAL .................................................................................... 65 CUESTIONARIO VII ..................................................................................................................................... 65

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NUEVAS TERAPIAS ONCOLÓGICAS CONTRA BLANCOS MOLECULARES SUS APLICACIONES EN TUMORES SÓLIDOS DEL ADULTO INTRODUCCIÓN Las nuevas terapias sistémicas del cáncer son resultado de décadas de inversión en investigación básica (descubridora de la denominada ―Nueva Biología‖ y generadora del Proyecto Genoma Humano) y clínica (aportante de numerosos ensayos piloto y ensayos controlados de eficacia y seguridad).

La interacción bidireccional entre la clínica y el laboratorio abrió un panorama completamente nuevo, con un universo creciente de ―nuevos blancos moleculares‖ posibles de ser manipulados farmacológicamente. Los mecanismos de regulación de la señalización celular, de generación de nueva vasculatura (angiogénesis), de control del ciclo celular, entre otros, quedaron más abiertamente expuestos en su nivel molecular.

El laborioso proceso de identificación de adecuadas drogas para cada uno de estos ―blancos moleculares‖ se halla plenamente en marcha. La selecta minoría de fármacos que accede a la aprobación (anticuerpos monoclonales, drogas moduladoras de la señalización intracelular, y otras) exhibe nuevos beneficios y a la vez, plantea incertidumbre por su potencial de resultados a largo plazo, en la búsqueda de su lugar en la panoplia de terapias disponibles.

Ante el nuevo escenario que plantean estos nuevos agentes y su impacto en los sistemas de salud, la posición más recomendable para médicos, pacientes, terceros pagadores, regulatorios y laboratorios farmacéuticos es un análisis crítico de la evidencia científica de alta calidad, y un balance entre beneficios, riesgos, costos y alternativas. Se abre un campo de diálogo y reflexión ―basada en la evidencia‖.

El presente artículo se limita al análisis de fármacos utilizados en los denominados ―tumores sólidos del adulto‖ (cánceres de mama, ovario, útero, pulmón, aparato digestivo, génito-urinario y otros), sin incursionar en el área de las neoplasias malignas hematológicas (leucemias, linfomas, mieloma y otras).

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BIOLOGÍA MOLECULAR Y NUEVAS TERAPIAS Uno de los resultados prácticos del enorme impulso dado a la investigación en Biología Molecular y en Genética Humana es el desarrollo de una amplia categoría de nuevos fármacos, denominados ―terapias contra nuevos blancos moleculares‖, o ―terapias dirigidas‖ (como traducción de targeted therapies). Se trata de un grupo heterogéneo de nuevas moléculas, diseñadas para interferir con diversos mecanismos críticos para la supervivencia, proliferación y funcionamiento de la célula tumoral, de modo de lograr un ataque relativamente selectivo sobre las células malignas, en contraposición a la toxicidad relativamente generalizada e indiscriminada de la quimioterapia antineoplásica convencional.

La elucidación del genoma humano por dos consorcios de investigadores (uno público y otro privado) en el año 2001, abrió el camino para desarrollar un ―mapa‖, no solamente de los genes humanos (genoma) sino también de las proteínas (proteasoma), muchas de las cuales conforman las cascadas moleculares utilizadas para decodificar, transmitir y amplificar las señales a nivel celular, regulando el metabolismo, la proliferación, migración y diferenciación celular, entre otros procesos clave.

De este modo, el proceso de descubrimiento identificó nuevos blancos susceptibles de ser atacados o modulados – siempre y cuando se desarrollen fármacos adecuados para tal función. En otras palabras, el descubrimiento de nuevos mecanismos de regulación de la vida y función celular (tanto de las células malignas como de las normales) ofrece la posibilidad de nuevos blancos terapéuticos, y por vía reversa, la definición molecularmente precisa del blanco de un fármaco puede brindar mejor conocimiento de los procesos regulatorios celulares, en un camino bidireccional de generación de nuevos conocimientos y nuevas terapias. Los nuevos fármacos aprobados o en desarrollo se agrupan en diversas categorías:

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anticuerpos monoclonales, drogas moduladoras de la señalización intracelular, inhibidores de la angiogénesis, moduladores del ciclo celular, inhibidores de mecanismos de ―descarte‖ de proteínas, inductores de diferenciación celular, inmunomoduladores, vacunas terapéuticas.

Adicionalmente, algunos fármacos biotecnológicos fueron desarrollados con el objetivo de mitigar la toxicidad de la quimio- y de la radioterapia: factores estimulantes de colonias, eritropoyetina y derivados, palifermin para prevenir la mucositis post-trasplante autólogo de médula ósea, etc.

La selecta minoría de moléculas que alcanza aprobación regulatoria exhibe nuevos beneficios y a la vez, plantea incertidumbre por su potencial de resultados a largo plazo, en la búsqueda de su lugar en la panoplia de terapias disponibles.

ANTICUERPOS MONOCLONALES EN ONCOLOGÍA Los anticuerpos monoclonales son medicamentos biológicos, de estructura química compleja, obtenidos mediante métodos de ingeniería genética (moléculas recombinantes). Exhiben la estructura de una proteína del sistema inmunológico: la inmunoglobulina G. Estos anticuerpos, entonces, son capaces de reconocer una molécula ―blanco‖, en forma muy selectiva.

La perspectiva histórica nos remonta a los trabajos pioneros de Kohler y Milstein en los años 70(4). Estos investigadores lograron fusionar células de mieloma (una neoplasia maligna hiperproductora de inmunoglobulinas) con otras células inmunocompetentes, de modo de dar origen a una verdadera ―fábrica‖ de inmunoglobulinas dirigidas muy selectivamente contra un determinante antigénico o epitope, de composición constante, ya que se originaban de un único clon celular, ―inmortalizado‖ en cultivo celular (de allí la expresión monoclonales).

Se denomina epitope a una secuencia aminoacídica o sector molecular reconocido por una inmunoglobulina, y contra el cual reacciona, ligándose y poniendo posteriormente en marcha diversos mecanismos de ataque y destrucción. Cabe destacar que, por conveniencia técnica, los investigadores trabajaron con células de ratón, de modo que los anticuerpos producidos tenían

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la secuencia de aminoácidos o ―estructura primaria‖ típica de una inmunoglobulina de esta especie. Este punto será analizado más adelante, al momento de explicar las reacciones adversas y limitaciones.

En una conferencia magistral en los años 80, en la Facultad de Medicina de la UBA, el Dr. César Milstein desplegó el vasto panorama de aplicaciones de esta novedosa herramienta: en el diagnóstico preciso de estructuras moleculares y celulares (como reactivos de diagnóstico en laboratorio clínico y de patología) en la terapia de diversas enfermedades (debido a su capacidad de atacar selectivamente un sector de una molécula compleja).

En la actualidad, la expresión ―anticuerpo monoclonal‖ ha sido incorporada al lenguaje cotidiano en el ámbito biomédico, de investigación, de producción en planta farmacéutica, y al arsenal terapéutico. El generoso gesto de desprendimiento del Dr. Milstein y sus colegas, quienes declinaron patentar su hallazgo, permitió la explosiva difusión de aplicaciones de este descubrimiento.

A continuación, se presenta un historial o secuencia cronológica de la aprobación inicial de anticuerpos monoclonales selectos para su uso en cáncer.

(Tabla 1) Si bien la aprobación regulatoria de un medicamento por parte de la FDA conlleva una gran importancia, los requerimientos de las diversas agencias regulatorias exhiben algunas diferencias que pudieran introducir retrasos en la incorporación de fármacos en otros países.

En el caso de Argentina, en un contexto regulatorio dado por el Decreto presidencial 150/92, existen mecanismos y plazos de revisión de los expedientes para su aprobación por la ANMAT. Por lo tanto, es factible que algunos anticuerpos monoclonales se hallen aprobados en Europa y EEUU pero que aún no se encuentren autorizados para su comercialización, sea porque el laboratorio no presentó la documentación, o porque ésta se halla en revisión en la ANMAT.(5)

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FÁRMACOS QUE ATACAN LA SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR Los fármacos incluidos en este grupo son mayormente moléculas relativamente pequeñas capaces de reconocer un sector de otra molécula ―blanco‖ y ligarse al mismo. De este modo, operan como factores de interferencia de elevada especificidad, con la capacidad de bloquear diversas ―cascadas‖ de señalización intracelular (también denominadas ―de transducción de señal‖), necesarias para la proliferación, migración, formación de nuevos vasos nutricios, y supervivencia de la célula maligna.

Estas acciones son facilitadas por su relativa liposolubilidad y penetración al interior celular, con la conveniencia de la administración oral. En contraste, los anticuerpos monoclonales son grandes moléculas, que deben ser infundidas por vía intravenosa (o en el caso de otras patologías crónicas, algunos anticuerpos también son administrables por vía subcutánea), exhiben estructura molecular compleja y relativamente antigénica, y tienen marcada dificultad en el acceso a determinados sectores del organismo (por ej, el sistema nervioso central).

En síntesis, los nuevos blancos, sistemas de señalización molecular de la célula maligna, pueden ser atacados desde el exterior celular mediante anticuerpos contra un receptor a un factor proliferativo, o bien desde el interior, mediante los fármacos orales descriptos.

Varios de estos nuevos fármacos han sido aprobados para el tratamiento de una diversidad de patologías malignas, no necesariamente frecuentes. El primero en ser autorizado para su comercialización, el imatinib (Glivec, de Novartis) está aprobado en la terapia de leucemia mieloide crónica y del raro sarcoma del estroma gastrointestinal. Las empresas farmacéuticas emplearon una doble estrategia con estos fármacos, en el sentido de buscar desarrollos para terapia de enfermedades malignas frecuentes (cánceres de mama y de pulmón, por ej), y por otra parte, seguir el derrotero marcado por el presunto mecanismo de acción del fármaco, lo cual implicó en varios casos el desarrollo de nuevas terapias para enfermedades ―huérfanas‖ (esto goza de incentivos regulatorios, de patente y fiscales en los EEUU).

El segundo fármaco oral gefitinib (Iressa, de Astra Zeneca) fue inicialmente aprobado para la terapia del cáncer de pulmón en su forma más común (denominada ―no a pequeñas células‖, que abarca más del 80% de los casos nuevos), luego del fracaso de la primera línea de quimioterapia. Esto sucedió mediante un mecanismo de ―aprobación acelerada‖ y prioritaria. Sin embargo, los estudios a largo plazo (completados varios años después del lanzamiento al mercado) mostraron que el fármaco no extendía la supervivencia, y su uso fue limitado. Llamativamente, un fármaco con similar mecanismo de acción erlotinib; (Tarceva, de Genentech-Roche) resultó discretamente activo en el

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control sintomático de pacientes con cáncer de pulmón recaído o metastásico, en cuyo tratamiento había fracasado la quimioterapia. Sin embargo, la tasa de respuesta clínica objetiva (reducción del tamaño de la enfermedad medible) fue de solamente un dígito en el ensayo clínico que llevó a la aprobación.

El mismo fármaco fue posteriormente aprobado para su uso en combinación con gemcitabina (quimioterapia) en otro cáncer frecuente (cáncer pancreático), si bien nuevamente la ventaja en supervivencia fue muy modesta.

A partir de lo expuesto precedentemente, surge que estos nuevos fármacos orales exhiben diversas ventajas y limitaciones, a saber: Ventajas Selectividad (esperable, en principio, en base a su novel mecanismo de acción).

Menor toxicidad (al menos, diferente de la clásica toxicidad de la quimioterapia).

Comodidad posológica (a partir de su administración por vía oral).

Desventajas Tratamiento prolongado, de duración máxima no definida. Los ensayos clínicos establecieron un esquema de tratamiento continuo, ―hasta toxicidad intolerable o progresión de la enfermedad‖.

Nuevas toxicidades: erupción cutánea que puede ser severa, tendinosa, articular, retención hidrosalina y raramente (en el caso del gefitinib, al menos), enfermedad intersticial pulmonar que ha sido reportada fatal en 0.1% (norteamericanos) y hasta 3% de los casos (japoneses).

Elevado costo mensual ANTICUERPOS MONOCLONALES Y FÁRMACOS ORALES Un blanco molecular en la superficie celular, a su vez acoplado a una secuencia de enzimas intracelulares de transducción de señal, puede ser atacado desde el exterior con diversos fármacos, y también desde el interior celular (si se dispone de moléculas pequeñas que ingresen a la célula). Para establecer la comparación entre estos dos abordajes, tomemos como ejemplo el ataque al receptor al factor de crecimiento epidérmico y su cascada de señalización.

Si continuamos con las terapias dirigidas contra la familia del factor de crecimiento epidérmico o EGF (que incluye, entre otros, los receptores denominados HER 1 y HER 2), veremos que es posible el ataque

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farmacológico con anticuerpos monoclonales (en la superficie celular) o con inhibidores de la señalización celular, que actúan en la cascada de amplificación y transducción de señal, en el citoplasma. (Tabla 2) A modo de resumen: los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas (IgG1) dirigidas contra la familia del receptor a EGF, son moléculas de alto PM, que requieren administración en infusión intravenosa periódica (mayormente semanal), son efectivos en combinación con quimioterapia (cetuximab + irinotecan en 2ª línea en colorrectal; trastuzumab + paclitaxel o docetaxel en 1ª línea en mama avanzada/metastásica), y presentan toxicidad vinculada a la infusión y rash cutáneo acneiforme.

En contraste, los inhibidores de tirosina-quinasa del EGF-R aprobados (gefitinib y erlotinib) son ―moléculas pequeñas‖, cuyo blanco molecular se ubica en el sector citoplásmico del receptor anclado en la membrana celular. Son drogas activas por vía oral, aptas para el uso continuado, con potencial de toxicidad cutánea y pulmonar severas, sin demostración de actividad aditiva con quimioterapia. Su uso en cáncer de pulmón a células no-pequeñas se restringe a la segunda línea o posterior.

Aprobación de fármacos orales contra blancos moleculares La aprobación regulatoria, que da acceso a la comercialización, se realiza con un lenguaje que acota el marco de uso a una serie de situaciones médicas (indicaciones) para las cuales el medicamento ha sido evaluado y exhibe resultados satisfactorios.

Todas las indicaciones aprobadas por la agencia regulatoria son incorporadas al prospecto (denominado ―label‖ en inglés). Por lo tanto, un fármaco tiene una aprobación inicial, que permite su ingreso al mercado, y aprobaciones adicionales o secundarias (―aprobación suplementaria‖), a medida que la agencia regulatoria acepte nueva evidencia clínica.

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En algunos casos se ha llegado a facilitar, promover, o en algunos casos, inducir, la prescripción ―por fuera‖ de las indicaciones aprobadas. A este uso se lo denomina ―off label‖, y si bien no es ilegal, queda claro que tal uso no se halla sustentado por evidencia científica suficiente y representa una situación de alta vulnerabilidad e incertidumbre respecto de los resultados esperables (Tabla 3).

Una somera consideración de la tabla precedente revela un patrón de aprobaciones de nuevos fármacos dirigidos contra blancos moleculares en las células malignas. Se trata de moléculas originales (―nueva entidad molecular‖, en el lenguaje regulatorio), introducidas al mercado en rápida secuencia en los últimos años.

Brevemente, el fármaco considerado con mayores probabilidades de aprobación por la FDA en un futuro cercano es el axitinib, un inhibidor oral de la señalización intracelular mediada por receptores a VEGF. El axitinib es razonablemente tolerado, y mostró actividad en ensayos clínicos en cáncer renal metastásico y en carcinoma anaplásico de tiroides (una patología para la cual hace décadas que no se desarrolla una nueva terapia).

IMPACTO EN LOS COSTOS ASISTENCIALES Los ejemplos precedentes bastan para señalar que la actual atmósfera de aprobaciones aceleradas de nuevos fármacos impuesta por la FDA, resulta frecuente que sean autorizados para la venta diversos agentes farmacológicos cuyo beneficio clínico (supervivencia) aún no ha sido evaluado. En otras palabras, la FDA pone actualmente el acento en la seguridad y en el novedoso mecanismo de acción y ―espera lo mejor‖. Entretanto, el producto está en el mercado, y diversas sociedades médicas lo definen como ―el nuevo estándar‖, por lo que la presión para su adopción generalizada precede a la demostración plena y satisfactoria de eficacia.

Un factor que ha incidido en la disminución de precios de los medicamentos – desde la óptica del mercado– es la aparición de ―genéricos‖ o de ―similares‖ (copias) –cuando no se han realizado los estudios de bioequivalencia en humanos, como sucede mayormente en la Argentina–. Teniendo en cuenta que el primer fármaco oral dirigido contra nuevos blancos moleculares (imatinib) fue aprobado en el año 2001, con gran visibilidad (nada menos que una presentación en la Casa Blanca), es importante señalar que hasta la fecha, no ha habido aprobación regulatoria de genéricos ni ―similares‖ de los productos motivo de esta revisión.

Tomando como base unas 60.000 muertes por año, y aplicando fórmulas de corrección internacionalmente aceptadas, y en ausencia de estadísticas adecuadas que releven datos de incidencia y prevalencia en nuestro país, puede estimarse (conservadoramente) que habría entre 120.000 y 150.000 MODULO VII

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casos nuevos de cáncer anualmente en la Argentina (excluyendo los carcinomas basocelular y espinocelular de la piel).

Si se extrapolasen cálculos de prevalencia en base a modelos poblacionales europeos y a estimaciones realizadas sobre datos poblacionales y de consumo en el instituto nacional argentino responsable de cobertura de salud de jubilados y pensionados, PAMI (INSSJP: Instituto Nacional de Servicios Sociales para Jubilados y Pensionados.) en los años 90 (proyectados hasta la actualidad), el número total de pacientes con cáncer, o prevalencia en la Argentina se hallaría entre 400.000 y 700.000.(6, 7) En base a la aplicación de factores de corrección convencionales, podría estimarse tentativamente para Argentina una incidencia de 15.000 casos nuevos de cáncer de mama anuales, 9.000 a 10.000 cánceres de pulmón, y entre 10.000 y 15.000 cánceres de colon.

Aún teniendo en cuenta que no todos los pacientes requieren una terapia sistémica, resulta evidente que la repercusión de cambios en los estándares terapéuticos y en el patrón prescriptivo de productos para enfermedades oncológicas comunes del adulto será muy importante en todos los sistemas de salud.

PERSPECTIVAS La prevalencia del cáncer depende fuertemente de la edad (y del mismo modo, la tasa de mortalidad anualizada), de modo que fenómenos tales como el envejecimiento de la población llevan aparejado un incremento de la prevalencia de este tipo de patologías. El interés de los laboratorios farmacéuticos y empresas de biotecnología es alto en el área de Oncología.

Una estimación conservadora ubica en más de 30 el número de fármacos orales dirigidos contra nuevos blancos moleculares, actualmente en evaluación clínica en la terapia del cáncer, con varios de ellos en fase III (es decir, con la posibilidad de presentar el expediente para aprobación entre 2009 y 2011).

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La combinación de tres tendencias claramente identificadas apunta hacia un escenario de costos crecientes y de consumo en ascenso de estos fármacos en Oncología. Estas tendencias son: 1. El auge de las estrategias de desarrollo de fármacos basados en el concepto de una cronificación de la enfermedad, con la consiguiente cronificación del tratamiento, en el mismo estilo observado para la terapia para la infección por el VIH, diabetes, hipertensión, hipercolesterolemia, etc.

2. El reconocimiento de la necesidad de estrategias terapéuticas de combinación de fármacos (anticuerpos monoclonales, quimioterapia, hormonas, inmunoterapia, terapias dirigidas contra nuevos blancos moleculares), ante la comprensión de una elevada complejidad genética y molecular de las diversas enfermedades malignas. Combinando los dos primeros puntos, surge que la perspectiva es de tratamientos prolongados, cronificados, con múltiples agentes terapéuticos.

3. El endurecimiento de las pautas regulatorias para la evaluación y aprobación de genéricos de los anticuerpos monoclonales y otros agentes biológicos.

Basadas en la complejidad de los temas involucrados, las agencias regulatorias FDA y EMEA han publicado regulaciones muy restrictivas y demandantes para la aprobación de genéricos de nuevas terapias moleculares. De hecho, no se ha aprobado ningún genérico de esta categoría de uso en Oncología o en Onco-hematología. Este fenómeno, que parece firmemente establecido, impide una competencia por precios al establecer altas barreras no-arancelarias de ingreso para candidatos a genéricos.

4. La relativamente rápida proliferación de nuevas terapias de alto costo, eficacia modesta, y duración de tratamiento indefinida, asociada con la falta de estudios comparativos entre los nuevos fármacos aprobados para una misma patología, genera una situación de confusión entre médicos, pacientes, terceros pagadores y sociedad. Los nuevos fármacos son aprobados en ensayos breves, contra placebo, y se carece de datos a largo plazo, de información sobre su desempeño en ―el mundo real‖ y de elementos para elaborar un cuidadoso análisis costo-efectividad. Esta situación de ―semipenumbra‖ dificulta la toma de decisiones.

5. El desarrollo de nuevas moléculas dirigidas contra blancos terapéuticos bien definidos en la célula maligna no siempre tuvo como requerimiento la demostración de la presencia del blanco molecular a atacar, previo al inicio de la terapia. Esto sí sucedió en el caso del imatinib, tanto en LMC como en GIST (blancos moleculares: bcr/abl y c-kit, respectivamente). El requerimiento de esta documentación de presencia del blanco molecular es un mínimo requisito para la decisión racional de cobertura en estos casos.

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En resumen, el concepto de patología crónica, sumado al de la ―alta complejidad‖ que determina una terapia combinada, más la dificultad en la aprobación de genéricos, subraya la relevancia creciente de este tema y enfatiza la necesidad de estrategias de gestión inteligentes, efectivas y prácticas para abordar este desafío. No hay soluciones fáciles, pero un prerequisito es la toma de conciencia sobre la magnitud del problema, y la decisión, por parte de la sociedad civil de cada uno de nuestros países y de sus gobiernos, de declarar el cáncer ―un problema nacional‖7 y desarrollar políticas y gestiones efectivas.

BIBLIOGRAFÍA 1- Dirección de Estadísticas de Salud. Ministerio de Salud de la Nación.

Accedido: agosto 5, 2008. http://www.deis.gov.ar/publicaciones/Archivos/Serie12nro6.pdf.

2- ht tp: / /www.abc.com.py/2006-11-03/ar ticulos/289496/el-cancer-es-lasegundacausa- de-mortalidad-en-nuestro-pais 3- ht tp: / /www.presidencia.gub.uy/_Web/noticias/2007/07/2007072403.htm 4- Köhler G, Howe SC, Milstein C. Fusion between immunoglobulin-secreting and nonsecreting myeloma cell lines. Eur J Immunol. 1976 Apr;6(4):292–295.

5- Listado de los anticuerpos monoclonales aprobados por la agencia regulatoria argentina (ANMAT) para la terapia antineoplásica, recientemente actualizado. :http://www.anmat.gov. ar/medicamentos/anticuerpos_29-08-08.pdf Accedido: setiembre 1, 2008.

6- Terragno NA (coordinador); Touloupas C, Bisang J, Politi P, Vassallo C, Limeres M. Evaluación del Subcomponente Medicamentos. Auditoría del INSSJP. Programa Naciones Unidas para el Desarrollo. Banco Mundial. Proyecto PNUD-015 Arg. Buenos Aires, 1997.

7- ht tp: / /www.abc.com.py/2008-08-15/ problemanacional

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BLANCOS TERAPÉUTICOS PARA LA DIABETES La DM está relacionada con varios trastornos metabólicos que generan una serie de patologías, por eso el punto de partida para comprender el comportamiento de esta enfermedad es necesario conocer algunos factores hormonales y la relación genética de la enfermedad.

La Leptina es una hormona que restringe la secreción de insulina en el páncreas y promueve el catabolismo de glucosa en los tejidos periféricos como el hígado, el músculo esquelético y el tejido adiposo. Pero uno de los efectos de la diabetes es la disminución de esta hormona, produciendo una restricción en el transporte a través de la barrera hematoencefálica, evitando la metabolización de la glucosa y causando la hiperglicemia. Se han realizado experimentos utilizando la terapia génica en células del hipotálamo (donde se produce la leptina principalmente) en ratones, donde han demostrado la reposición de la leptina in vivo, según la investigación por Kalra (2009), la restitución de la homeóstasis energética por el suministro de bioactivos de leptina superaron la insuficiencia de esta hormona por largos períodos de tiempo. Entre los diversos vectores virales utilizados para transferir genes se han utilizado el adenovirus recombinante (rADV) y el virus adenoasociado recombinante (rAAV). Sin embargo, se han presentado algunas dificultades al momento de transferir el material genético, en este caso el rADV al transferir el gen va a tener poca integración con el genoma del hospedero, porque un alto nivel de expresión del transgen sólo se va ha dar de forma transitoria y rápida provocando una reacción inmune fuerte a la proteína viral.

La replicación deficiente del rAAV no produce una reacción inmune, lo cual puede transferir genes de forma segura al hospedero, después de la integración en el genoma del huésped se da la expresión del transgen durante la vida útil de la célula. Todo esto expondría una ventaja ideal para el tratamiento de la diabetes para establecer el control de la glucemia, sin alterar o perturbar mínimamente las interacciones homeostáticas y fisiológicas con la transferencia del gen de la leptina.

En investigaciones recientes, la terapia génica de la leptina está destinada para sustituir el tratamiento médico de la inyección de insulina. Esta terapia con leptina ha demostrado la reducción de la hiperglicemia y la hiperfagia en ratones diabéticos con insuficiencia de insulina. En estos ratones se les indujo la deficiencia de insulina con un fármaco llamado estreptozotocina (STZ) y luego se utilizó el rAAV que introdujo el gen de la leptina (rAAV-lep). En los ratones inducidos con la deficiencia de insulina murieron a la semana 6.

En cambio a los ratones que fueron tratados con el gen de la leptina (rAAVlep), evitó la muerte prematura de los ratones tratados con STZ porque se elevaron los niveles de leptina en el hipotálamo. En general los buenos resultados en esta investigación fueron demostrados porque en los ratones MODULO VII

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hubo una marcada reducción de la hiperfagia, se normalizaron los niveles sanguíneos de glucosa y hubo en retorno parcial en la funcionalidad de las células-ß de los islotes según Kojima et al. (2009). Estos resultados sugieren una nueva alternativa en el tratamiento de la diabetes mellitus, en este caso la leptina sería un sustituto de la insulina para el tratamiento en pacientes diabéticos, ya que permitiría reducir los niveles glucosa en la sangre en ausencia de la insulina.

Won et al. (2009) toma en cuenta la regulación génica de la glucosa, donde se han buscado alternativas de terapia génica. Se plantea que la expresión de los genes es modulada por la glucosa y por ende afecta la variación de la glicemia en el torrente sanguíneo. Cuando los niveles de glucosa son muy elevados y las células-ß están expuestas a estos incrementos de la glicemia, tendrá un efecto citotóxico, conocida particularmente como glucotoxicidad, comprometiendo la supervivencia celular y la expresión génica de estas células. El tratamiento convencional de la diabetes mellitus tipo 1 (DM1) se realiza por inyecciones de insulina a diferentes regímenes, pero el control glicémico no va hacer tan preciso como la proporcionada por la dinámica natural de la insulina por factores fisiológicos inherentes a esta hormona polipeptídica, por eso la terapia génica encaminada a solucionar estos problemas de desequilibrio de la glicemia es crear células-ß artificiales transgénicas para producir insulina por medio de la transferencia del gen de la proinsulina, gen transferido por un vector viral (adenovirus), cuando sean implantadas (solamente estudios realizados en ratones) estas células van a ser capaces de secretar insulina de células autólogas más potentes para revertir este desequilibrio metabólico no logrado por las células-ß originales. Sin embargo, aunque la expresión de la insulina transgénica es sensible a la glucosa, ninguno de los ensayos con terapia génica para inducir la producción de insulina hasta la fecha ha sido capaz de imitar completamente el funcionamiento normal de las células- ß con respecto a la estricta regulación de la insulina en las condiciones fisiológicas naturales.

Hasta el momento, las investigaciones de la terapia génica para el tratamiento de la diabetes se han utilizado vectores virales, dando la percepción que serían los únicos vectores utilizados en cualquier terapia génica. Cabe aclarar que los vectores virales son los que mejor transfieren el material genético a la célula huésped, pero en la siguiente investigación realizada por Hou et al.

(2011) se construyó un plásmido no viral liberado por vía intramuscular, que transfieren el gen que codifica la proinsulina (PI), la regeneración pancreática (Reg) y la proteína III (pReg/PI). Esta investigación fue probada en ratones inducidos con STZ para inducir la deficiencia de insulina. Los resultados en esta investigación mostraron que la liberación intramuscular de pReg/PI reduce significativamente los niveles de hiperglucemia, aumentando el contenido de insulina sanguínea en los ratones tratados, también mostró una restauración en

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el balance de citoquinas TH1/TH2 y linfocitos T, recordemos que la DM1 se caracteriza por presentar autoinmunidad en las células-ß, con cuadros de inflamación en el tejido pancreático y por ende destrucción celular aminorando la producción de insulina, al restaurar el balance de las citocinas y los linfocitos T habrá una tolerancia a la autoinmunidad, regenerando estas células y la secreción de insulina. El tratamiento retrasó la aparición de DM1.

Sin duda uno de los problemas más significativos en los tratamientos médicos de la diabetes es la respuesta autoinmune del paciente cuando se implantan células-ß, que acarrean una destrucción de estas células, agravando los cuadros clínicos de la enfermedad. La terapia génica también se está encaminado hacia las células-ß para inducir la tolerancia inmune a través de la modificación genética de células autólogas (Obtenido de los propios tejidos del paciente) por medio de vectores retrovirales, según en estudios realizados por Zhang et al. (2010) la terapia génica en células-ß aminoran la fusión del antígeno-Ig con las proteínas de las células-ß transducidas, mostrando una tolerancia a las citoquinas TH1 y TH2, por de cortes histológicos con tinción de la columna, en la parte lumbar, mostraron una disminución en la infiltración de células mononucleares del sistema nervioso central y de anticuerpos en general. Esto sugiere que al utilizar un pretratamiento en las células-ß autólogas no se presentarán reacciones autoinmunes en el paciente después del trasplante de dichas células, restituyendo las funciones pancreáticas en cuanto al suministro de insulina para controlar los niveles de glicemia en la sangre.

Uno de los tratamientos más utilizados para aminorar las patologías producidas en la DM1 es el implante de células-ß en pacientes que padecen esta enfermedad, para inducir la secreción de novo de insulina a largo plazo. Sin embargo, las complicaciones de este procedimiento están enmarcadas por respuestas inmunológicas, citotoxicidad y apoptosis en las células-ß. En respuesta se está desarrollando la modificación genética de las células-ß por medio de la terapia génica como estrategia para mejorar el trasplante de estas células secretoras. Los vectores virales y liposomas han sido los más utilizados para la transfección del material genético deseado a estas células-ß, pero representan una serie de problemas de bioseguridad y dificultades técnicas.

Según Kang y Bae (2007) el uso de vectores virales con frecuencia ha planteado problemas de toxicidad, mutagénesis, carcinogénesis y respuestas antivirales; con las limitaciones técnicas contamos con una capacidad de carga limitada de genes y la producción de vectores de difícil purificación. El transporte liposomal de genes a menudo da como resultado ineficaces expresiones génicas. En respuesta a esta serie de dificultades se están desarrollando los vectores funcionales poliméricos (vectores no víricos) para transferir genes en las células-ß para inducir la secreción de la insulina, el transporte polimérico de genes tienen un perfil favorable de seguridad, como

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bajas respuestas inmunes y no inducen a la oncogénesis. Las buenas características de estos vectores poliméricos radican en la facilidad en la producción, control de calidad fiable, buen almacenamiento y la capacidad casi ilimitada de carga de plásmidos de DNA, realizando la transfección en las células-ß antes de la implantación en los pacientes, garantizando la prolongación del período de expresión génica para la producción de insulina.

Debido a que el DNA es una molécula con carga negativa neta y de alto peso molecular, no puede penetrar en las células por sí misma. Además es susceptible al ataque de enzimas, requiriendo un vector para su liberación. El estado actual en el desarrollo de vectores no virales para terapia génica está dirigido hacia la preparación y evaluación de materiales alternativos que puedan dar lugar a altos valores de transfección y proporcionando apropiadas respuestas celulares. Los derivados acrílicos de la pirrolidina y de la morfolina forman complejos electrostáticos con ADN dando lugar a la formación de nano partículas entre 50-200 nm, que poseen una buena biocompatibilidad (Polímeros sensibles a estímulos. Nuevos vectores poliméricos para terapia génica, 2011), en la investigación anterior se utilizó derivados de sulfonilurea como medio de transfección de plásmidos de DNA, formando un complejo de transfección de PLLSU/pDNA. El silenciamiento de receptores de membrana en células-ß como el Fas (CD95), y su ligando FasL han sido considerados un elemento clave en la patogénesis de la diabetes, porque sería un factor de apoptosis en estas células. Según Jeong et al. (2010) el silenciamiento del Fas con siRNA (RNA pequeño de interferencia, en inglés) transportada por un vector polimérico (PEI) e inyectada por vía intravenosa en ratones que fueron inducidos a la diabetes.

Estos ratones tratados mostraron una reducción de la diabetes por 40 días, lo que sugiere que la deficiencia en la secreción de insulina en el páncreas se atenúa. Se concluye que el silenciamiento en los receptores de membrana Fas (CD95) y el ligando FasL son blancos terapéuticos viables para el tratamiento de la DM1.

Según Samuel et al. (2010) las complicaciones en la diabetes que sufren los pacientes están acompañadas de enfermedades coronarias, enfermedad arterial periférica y accidentes cerebrovasculares, todas ellas relacionadas con la alteración de la angiogénesis. Recordemos que la angiogénesis es el proceso fisiológico que consiste en la formación de vasos sanguíneos nuevos a partir de los vasos preexistentes. Varios estudios han vinculado la diabetes con la angiogénesis, impidiendo la mediación en la degradación de la membrana basal en los vasos sanguíneos, alterando el delicado equilibrio de factores de crecimiento angiogénicos y citoquinas que regulan la estabilidad vascular, problemas en la transducción de señal y en gran medida a la diabetes mediada por el estrés oxidativo. La evidencia sugiere que las especies reactivas al oxígeno (ROS) y el estrés oxidativo es el principal contribuyente de

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la disfunción vascular en el miocardio que compromete negativamente la recuperación de estas condiciones. La reversión de la diabetes y por ende de las demás complicaciones fisiológicas fue evaluada en ratones diabéticos por la administración intramiocárdica de un vector viral del adenovirus thioredoxin-1 (Ad.Trx1) para codificar la tiorredoxina. La tiorredoxina (TRX) es una proteína antioxidante que redujo el estrés oxidativo en células del miocardio, demostrado por una sobre expresión de TRX en este tejido a través de análisis de Western Blot y pruebas inmunohistoquímicas. Esta investigación demostró que el miocardio infartado puede ser rescatado del deterioro de la angiogénesis relacionada con la diabetes y reducir el trastorno funcional del miocardio con terapia génica de TRX1.

La DM genera baja cicatrización de heridas en los pacientes de edad avanzada. Según las investigaciones realizadas por Lu et al. 2009 en ratones, relacionan los factores que causan la baja cicatrización con la expresión reducida del factor 1a de transcripción inducible por hipoxia (HIF-1a). La terapia génica con fue desarrollada con el plásmido gWIZ-CA5, siendo transferidas por medio de electroporación en células HEK-293T, luego inyectadas por vía intradérmica. Los resultados mostraron que el mRNA del HIF-1a, o sea la transcripción del gen que codifica para el HIF-1a fueron inhibidos, las heridas en los tejidos evaluados en los ratones se redujeron significativamente, con una rápida cicatrización. La expresión de mRNA que codifica para el HIF-1a, producen las citoquinas angiogénicas, el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), la angiopoyetina 1 y 2 (ANGPT1, ANGPT2), factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B) y el factor de crecimiento placentario (PlGF) que también están relacionadas con la alteración de las heridas en los ratones. Estos factores contribuyen a respuestas inflamatorias anormales. En general estos resultados ponen en manifiesto la utilización de la terapia génica en el tratamiento indirecto de la diabetes, como la actividad sinérgica de múltiples factores angiogénicos juega un papel crítico en la respuesta vascular en una herida.

Un punto de partida importante es el estudio genético de la enfermedad, permitiendo establecer unas bases sólidas para comprender la patogenia de la enfermedad, sus diferentes formas en que pueden afectar al paciente que padece de diabetes. Otro punto que cabe resaltar es el estudio de distintas metodologías para realizar una terapia génica, en este caso la utilización de los vectores virales son los más difundidos, hay que tener en cuenta que en diversas investigaciones se utilizan controles positivos para medir la eficiencia de transfección del gen por vectores virales. De acuerdo a investigaciones realizadas por Han et al. (2008) comparan la transducción de dos vectores virales adeno-asociados, AAV-1 y AAV-2 en ratones, los cuales el AAV-1 se reportaron mayores incrementos de expresión génica que en el AAV2 en la regulación de las citoquinas TH1 y TH2.

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CONCLUSIONES Los avances más significativos en la terapia génica en diabetes encontramos la inducción en la regulación de factores hormonales como en la leptina que estimula la metabolización de la glucosa en pacientes con insuficiencia de insulina, la regulación génica de la glucosa, la transgénesis de las células-ß autólogas para la producción de insulina de novo, o el tratamiento de problemas autoinmunes asociadas a la enfermedad en especial a la diabetes mellitus tipo 1 cuando se trasplantan células de los islotes pancreáticos.

Los desarrollos más relevantes incluyen la utilización de los vectores virales como el adenovirus y los adeno-asociados, sin embargo pueden presentar reacciones inmunes a causa de los mecanismos de replicación viral. En respuesta a esto se están desarrollando vectores poliméricos los cuales tienen la capacidad de transportar y transducir material génico suficiente para generar en las células diana los efectos deseados para la reparación de cualquier complicación fisiológica.

Los resultados obtenidos experimentalmente en modelos biológicos como en los ratones han sido efectivos, observándose la disminución parcial o total en las patologías producidas por la diabetes, no han sido aplicados en pacientes humanos. En perspectiva con el apoyo de estas investigaciones se podrán desarrollar nuevos estudios para aplicar la terapia génica como tratamiento de la diabetes en pacientes humanos.

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El futuro de la farmacoterapia antidepresiva

César González Caro1 1 Psiquiatra. Profesor asociado del Departamento de Psiquiatría de la Universidad del Valle, Cali. Ha sido speaker de los siguientes laboratorios farmacéuticos: Pfizer, Eli Lilly Interamerica Inc., Janssen-Cilag, Abbott, Glaxo Smith Kline, Tecnofarma, Tecnoquímicas, Wyeth Inc., Bussié, Organon, BristolMyers Squibb. E mail:cesar.gonzalez@imbanaco.com.co

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INTRODUCCIÓN La depresión es una entidad clínica ampliamente extendida y ocupa un lugar importante entre las causas de discapacidad en el mundo. Las personas afectadas tienen riesgos superiores de padecer otras enfermedades, generan grandes costos de salud y presentan una elevada tasa de mortalidad (1-3). Las entidades psiquiátricas son responsables del 1% de las tasas de mortalidad, pero representan aproximadamente el 11% de las cargas totales de salud alrededor del mundo. Se calcula, además, que la depresión será la segunda causa de discapacidad a escala mundial en el año 2020 (4).

Aunque actualmente se dispone de terapias somáticas (fármacos, terapia electronvulsiva y estimulación magnética transcraneal, entre otras) y de diversos tipos de psicoterapias para el alivio de este sufrimiento, el recurso farmacológico es el más ampliamente usado; en ocasiones llega a ser la única intervención en pacientes afectados por esta enfermedad. Sin embargo, desde las primeras sustancias antidepresivas descubiertas en la década de los sesenta hasta el importante número de ellas disponibles en el momento, no existen diferencias significativas en cuanto a su eficacia (5-9) y aún no logran mejorar las tasas de respuesta y remisión que se consideran inaceptablemente bajas (10).

Por otra parte, se carece de estudios que muestren los resultados de la utilización de estos medicamentos a largo plazo, y tampoco podemos aseverar que los instrumentos y los parámetros utilizados en los estudios clínicos para evaluar estos resultados sean los más indicados. El número de medicamentos ha aumentado en los últimos años, pero su mecanismo de acción —basado principalmente en el proceso de recaptación de monoaminas— ha tenido pocas y relativas variaciones en este aspecto y todavía persisten algunas dificultades y limitaciones: demora en el inicio de su acción terapéutica, efectos colaterales, interacción medicamentosa y, aun una situación más compleja, se desconoce su exacto mecanismo de acción.

Buscando mejorar la efectividad de los medicamentos existentes se han planteado diversas estrategias; por ejemplo, modificar la estructura química de la sustancias (búsqueda de enántiomeros), cambiar la forma de liberación o combinar dos moléculas con diferente acción farmacológica en la misma presentación (11). En el en primer caso se dispone, desde comienzos de la presente década, del enántiomero del Citalopran, el S-Citalopran, que generó inicialmente estudios que mostraron ventajas importantes en términos de comienzo de acción y eficacia (12), aunque luego otros mostraron que esta diferencia no es tan significativa (13).

La segunda posibilidad —modificar la forma de la liberación, por ejemplo una presentación de Mirta zapina que facilita su absorción oral y que es

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bioequivalente a su presentación original— carece de evidencia sobre una mayor efectividad y rapidez en su inicio de acción (14). El último mecanismo utiliza una combinación de Fluoxetina y Olanzapina disponible actualmente en Estados Unidos y que busca potenciar el efecto de un fármaco con la adición de otro. Al tiempo que se esperan resultados prometedores en pacientes con depresión resistente (15).

Las consideraciones anteriores muestran que estas alternativas no son suficientes para las necesidades de los clínicos. El avance de las neurociencias al tratar de comprender y dilucidar los mecanismos que subyacen a esta enfermedad obliga, a la vez, a desarrollar sustancias basadas en nuevos blancos de acción y, en consecuencia, permite la aparición de nuevas posibilidades para la inmensa población afectada. Este texto se centrará, precisamente, en estos aspectos, así como también en la pregunta de hacia dónde apuntan los nuevos antidepresivos. Finalmente, puntualizará las futuras direcciones en este campo.

Nuevos ‗blancos‘ para el desarrollo de farmacoterapia antidepresiva NEUROPÉPTIDOS Los neuropéptidos son aminoácidos de cadena corta que ejercen su función como neurotransmisores y neuromoduladores; están localizados en las regiones cerebrales que median las conductas emocionales y la respuesta al estrés (16). Se constituyen en ‗blancos‘ terapéuticos atractivos para el desarrollo de nuevos medicamentos antidepresivos y ansiolíticos. De estos neuropéptidos, las takininas (sustancia P y neurokinina A), el factor liberador de corticotropina (CRF, por sus iniciales en inglés), la vasopresina y el neuropéptido Y han sido estudiados extensamente y han recibido atención recientemente. Veamos: Sustancia P: desde su descubrimiento en 1930, la sustancia P es uno de los neuropéptidos más estudiados. Pertenece a la familia de las takininas y median sus acciones biológicas a través de un receptor de takinina denominado NKl. Durante muchas décadas de investigación se especuló mucho sobre los papeles fisiológicos de esta sustancia y su importancia en inflamación, dolor, función respiratoria y gastrointestinal, respuesta al estrés y emésis. Sólo hasta el desarrollo de antagonistas selectivos del receptor NK1 en la pasada década se pudieron comprobar algunas hipótesis. Hay evidencia preclínica que soporta un papel importante del sistema sustancia P-receptor NK1 en conductas relacionadas con el estrés y ha guiado al desarrollo de antagonistas del receptor NK1.

La eficacia antidepresiva del primer antagonista de NK 1 desarrollado clínicamente, el compuesto denominado MK0869 Aprepitant, fue probado en un principio en pacientes con depresión mayor y elevados grados de ansiedad MODULO VII

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(17). Sin embargo, fue retirado de estudios clínicos de fase III porque no fue más efectivo que el placebo en el tratamiento de depresión (18). Los antagonistas del receptor NK1 son, generalmente, bien tolerados y pueden producir menos náuseas y menos disfunción sexual que los medicamentos actualmente disponibles. Otro miembro de la familia de las taquikininas, la neurokinina A, que actúa a través de receptores NK2, está también bajo investigación por su potencial papel el tratamiento de la depresión y los trastornos de ansiedad (19).

Factor liberador de corticotropina (CRF): el factor liberador de corticotropina activa varios subtipos de receptores y coordina efectos endocrinos, inmunes, autonómicos y conductuales del estrés. La hiperactividad de esta sustancia está bien documentada en depresión y en algunos problemas de ansiedad, como en el trastorno postestrés postraumático. El CRF es sintetizado y liberado en muchas regiones del cerebro que modulan la memoria, el miedo, la ingesta de alimentos y el afecto, incluyendo la corteza frontal, la amígdala y el hipocampo (20).

El CRF es la señal que inicia la respuesta hormonal al estrés, pero la activación directa de circuitos que involucran esta sustancia puede producir muchos de los síntomas y signos prevalentes en depresión (ansiedad, insomnio, cambios psicomotores, anorexia, etc.). Hay pruebas abundantes que sugieren que el CRF es hipersecretado en depresión y que ejerce su acción por medio del receptor CRF1. Sobre la base de estas observaciones se han desarrollado drogas que bloquean este receptor y que teóricamente pueden producir un efecto antidepresivo o ansiolítico (21).

Las sustancias de este tipo generaron expectativas positivas en una etapa inicial. La denominada R121919 fue empleada en un estudio clínico con 24 pacientes, y éstos mostraron mejorías significativas relacionadas con la dosis (22) sin alterar el funcionamiento del eje hipotálamo-pituitario-adrenal.

Posteriormente fueron suspendidos los ensayos debido a la probable hepatotoxicidad del producto (23).

La otra sustancia, denominada NBI34031, alcanzó estudios de fase I, pero fueron temporalmente suspendidos. El más novel compuesto (el CP-154,526) antagonista no péptido de receptores CRF-R1 y su análogo, la Antalarmina, que presentan efectos antidepresivos y ansiolíticos en modelos animales, ya se han comenzado a experimentar en humanos, pero los resultados aún no han sido publicados (24-25).

Más adelante serán necesarios otros estudios doble-ciegos y controlados para establecer la eficacia de estos compuestos en el tratamiento de trastornos de ansiedad y del estado de ánimo.

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Vasopresina: aunque se consideró primariamente como un modulador de la presión sanguínea y del balance hídrico, la vasopresina está implicada en conductas relacionadas con ansiedad, y esto se ha visto especialmente en animales expuestos a repetidos estímulos estresantes. Se ha demostrado también en seres humanos que hay concentraciones elevadas de vasopresina cuando padecen depresión (26). La vasopresina también potencia los efectos del CRF en la pituitaria para producir liberación de ACTH. Se han identificado tres tipos de receptores de vasopresina. Dos de los receptores V1a y V1b (también llamado V3) determinan un patrón de expresión neuroanatómica que sugiere que la vasopresina puede incidir en la modulación de la conducta. Hay receptores V1a presentes en la corteza, el tabique lateral, los núcleos supraquiasmáticos, la amígdala y el hipotálamo; los receptores V 1b, por su parte, se encuentran en la corteza, los ganglios basales, la amígdala, el hipocampo y el núcleo supraóptico. Ambos receptores son candidatos de interés para el desarrollo de nuevos fármacos. Recientes resultados mostraron que un antagonista de receptores V1b de vasopresina (SSR149415) es efectivo en modelos animales de ansiedad y depresión, posiblemente por acciones que ocurren en estructuras límbicas (27).

Neuropéptido Y: el neuropéptido Y (NPY) pertenece a una familia de péptidos que en los mamíferos incluye el polipéptido pancreático y el péptido YY. El NPY Se expresa en numerosas áreas del cerebro, incluyendo el locus coeruleus, el hipotálamo, la amígdala, el hipocampo, el núcleo accumbens y la neocorteza.

Además, antagoniza las consecuencias conductuales que produce el estrés en el cerebro. Esto se ha comprobado en estudios del comportamiento en modelos animales genéticamente modificados. Las acciones del NPY son mediadas a través de receptores heterogéneos o acoplados a la proteína G, entre los cuales los receptores Y1, Y2 y Y5 son los más importantes.

Las acciones antiestrés del NPY son potenciadas por agonistas del receptor Y1 y bloqueadas por antagonistas de Y1. El bloqueo de receptores Y2 produce efectos antiestrés indistinguibles de los producidos por el agonismo Y1.

Otro papel crucial de estos elementos se ha demostrado en la regulación de la ingesta de alimentos, ritmos circadianos, cognición y actividad convulsiva.

Algunos estudios han demostrado un enlace entre concentraciones bajas de NPY y un riesgo elevado de trastornos de ansiedad y depresión. Por esta razón se constituyen en un potencial blanco para el desarrollo de tratamientos farmacológicos en trastornos relacionados con el estrés, incluyendo, además, depresión y ansiedad. Actualmente el desarrollo de antagonistas de receptores Y2 parece ofrecer la más promisoria estrategia (28-29).

Galanina: este neuropéptido se ha encontrado como neuromodulador inhibitorio de noradrenalina y serotonina, así como de otros neurotransmisores en modelos animales. Su distribución varía con las diferentes especies animales, y MODULO VII

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se han identificado, al menos, tres subtipos de receptores de galanina acoplados a la proteína G. Los estudios preclínicos apuntan a la posible utilidad del uso de antagonistas de galanina, especialmente en trastornos de ansiedad, como el estrés postraumático y el trastorno de pánico, donde existe una hiperactividad del sistema noradrenérgico.

A la inversa —normalizando la deficiente neurotransmisión de monoaminas en los trastornos ansiosos y depresivos— la galinina podría ser un potencial blanco para la acción de los ligandos a los receptores de galanina. Esto podría minimizar o aumentar la efectividad de los antidepresivos, pero se requiere aún mucha investigación para determinar si estas sustancias ejercen acción antidepresiva o antiestrés en modelos preclínicos (28).

OTROS COMPUESTOS Inhibidores de síntesis y antagonistas de receptores de glucocorticoides: se acepta que un mecanismo esencial de la acción de los fármacos antidepresivos es la normalización de la hiperactividad del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA). Las concentraciones elevadas de cortisol pueden ser reducidas bloqueando la síntesis de éste al usar, por ejemplo, una sustancia denominada metirapona o, también con aminoglutetimida y ketoconozal, pero estos dos últimos son menos específicos y presentan muchos efectos adversos, así como gran interacción medicamentosa (30).

En cuanto a los antagonistas específicos de receptores de glucocorticoides no hay mucha información por la carencia de éstos. Hay datos clínicos preliminares con mifepristona (RU486), que ha sido evaluada en pacientes con depresión psicótica. Un pequeño estudio doble ciego y controlado con placebo sugiere que es eficaz, pero son necesarios ensayos más extensos (31).

Melatonina: un enfoque alternativo al desarrollo de drogas antidepresivas se visualiza en los agonistas de los receptores de melatonina. Los ritmos circadianos normales están alterados en ciertos grupos de pacientes deprimidos, por ejemplo en aquellos que padecen depresión estacional. Estos agonistas de melatonina pueden poseer actividades cronobióticas y antidepresivas. Un compuesto denominado Agomelatine, que también tiene propiedades antagónicas al receptor 5-HT2C, ha demostrado efectos cronobióticos y antidepresivos en modelos animales de depresión y, por lo tanto, se investiga actualmente para el tratamiento de depresión mayor (32).

Sistemas serotoninérgicos: el sistema serotoninérgico está bien establecido como un ‗blanco‘ para el desarrollo de sustancias, debido a la eficiciencia demostrada de los inhibidores de recaptación de serotonina y de otros fármacos que tienen que ver con este neurotransmisor.

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Se han identificado hasta la fecha un gran número de receptores, y los desarrollos apuntan a acciones más selectivas en subtipos más específicos, lo cual dará como resultado acciones antidepresivas más selectivas. Como ejemplo podemos mencionar los fármacos femoxetina, cericlamina y litoxetina.

Como antagonistas de 5-HT1Aestán el tandospirona y flesinoxan, y como agonista de 5-HT1A y antagonista de 5-HT2, la fibanserina (33-34).

Agentes que actúan sobre las vías intracelulares de señalización dependientes de AMPc: en la depresión hay una aparente alteración de las vías intracelulares de señalización del sistema AMPc. Así, algunos fármacos dirigidos a vías intracelulares específicas podrían servir como antidepresivos y, al actuar directamente sobre estos ‗blancos‘, producirían efectos más rápidos que los fármacos que actúan extracelularmente.

Los nuevos agentes terapéuticos se dirigirían a modificar ya sea la traducción de las señales intracelulares —por ejemplo, mediante el aumento de la producción o la duración del AMPc o la afectación de proteincinasas (isoenzimas selectivas de inhibidores de PKC), fosfodiesteras y fosfatasas (inhibidores de fosfatas MAPkinase)— o bien los factores de trascripción o tróficos, mediante el aumento de la expresión del CREB, de fosforilación de CREB, de expresión de BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro), de también inhibidores de GSK-3, reguladores por lo alto de B-catenin y reguladores por lo alto de Bcl-2 (35).

La fosfodiesterasa 4, enzima que degrada el AMPc puede ser un ‗blanco‘ terapéutico en la cascada de AMPc. En efecto, la regulación que ejerce esta enzima puede ser importante en la fisiopatología y terapéutica de la depresión (36). El Rolipram (inhibidor específico de la fosfodiesterasa 4) ha sido probado en ensayos clínicos, pero su uso se ha limitado enormemente por los efectos secundarios.

Antagonistas de los receptores de glutamato: ya que hay evidencias sobre la participación de los sistemas glutamatérgicos cerebrales en la fisiopatología de la depresión y en el mecanismo de acción de los medicamentos convencionales, se ha probado la administración parenteral de ketamina, un antagonista del receptor NMDA en pacientes con depresión. Este fármaco produce una significativa mejoría de los síntomas, lo que sugiere un efecto antidepresivo potencial de los fármacos que modulan el receptor NMDA (37). El dimebón, un agente antihistamínico con una fuerte acción NMDA y anticolinesterasa, mejora la función cognitiva y la depresión en pacientes con enfermedad de Alzheimer (38). También se ha logrado en animales un efecto antidepresivo con antagonistas de los receptores metabotrópicos de glutamato, como el MPEP, un antagonista selectivo de mGlu5, descubierto recientemente (39).

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AVANCES EN EL TRATAMIENTO ANTIDEPRESIVO BASADO EN INVESTIGACIÓN FARMACOGENÓMICA La biología molecular se constituye en una herramienta para poder comprender los difíciles y complejos mecanismos cerebrales de la enfermedad mental y, de esta forma, cambiar las estrategias de investigación. El desarrollo de nuevos y mejores modelos animales podrá identificar determinantes genéticos del estado de ánimo normal y anormal y descubrirá nuevos ‗blancos‘ y marcadores biológicos, para progresar en el conocimiento de la fisiopatología de los trastornos afectivos.

La genómica funcional (conocimiento de genes individuales y su interacción con otros genes) tendrá un profundo impacto en la medicina, particularmente en la investigación de la psiquiatría; además, requerirá el concurso de diferentes profesionales, como biólogos, químicos, físicos, genetistas, ingenieros y, por supuesto, profesionales de salud mental.

La detección de polimorfismos de nucleótidos simples, el descubrimiento de patrones de expresión genética en relación con la localización anatómica y el análisis de proteínas, serán, entre otras, las técnicas empleadas en el futuro, pero la que probablemente genera más interés es la de poder identificar la función y los patrones de expresión de las proteínas codificadas por los genes.

El patrón cuantitativo y cualitativo de biosíntesis de proteínas, denominado proteinómica, se correlacionará con la causalidad, el curso y el tratamiento de las enfermedades, y para ello será necesario también el concurso de la genómica.

Se dispone actualmente de microarreglos de ADN que permiten analizar miles de genes a la vez y, de esta manera, detectar patrones de expresión genética, polimorfismos, genotipo del individuo, su fenotipo y su respuesta al tratamiento.

Se podría pensar en un futuro en una ―medicación personalizada‖ con grandes probabilidades de eficacia, pues entenderíamos la pobre efectividad de ciertos medicamentos en algunos pacientes y podríamos garantizar así un tratamiento exitoso (40-44).

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CONCLUSIONES Los antidepresivos existentes están lejos de constituirse en los medicamentos ideales para tratar una afección tan prevalente y tan extendida de manera universal como lo es la depresión. A pesar de los grandes avances en la neurociencia ocurridos en años recientes, el mecanismo de acción de los nuevos agentes no difiere demasiado de los que se han utilizado anteriormente.

Continúa sin esclarecerse completamente la neurobiología de las alteraciones afectivas, así como los mecanismos de acción terapéutica de los antidepresivos disponibles. El retraso de su acción benéfica, la pobre efectividad en algunos pacientes y la falta de remisión total de los síntomas motivan, entre otras cosas, el desarrollo de nuevos fármacos basados en el conocimiento preciso de las interrelaciones entre los sistemas nervioso, inmunitario y endocrino, con sus correspondientes cascadas de señales intracelulares y las consecuencias en la expresión genética y en la función proteica.

En un futuro se espera, con la ayuda de la psicogenómica y la proteinómica, conocer la expresión de los genes y las proteínas de un individuo en un momento determinado y en áreas cerebrales particulares. En consecuencia, sería posible diseñar tratamientos individualizados con herramientas que podrían predecir los resultados futuros según el genotipo del individuo y que ayudarían al clínico a tomar decisiones con mayor eficiencia y menor costo.

Un grupo de trabajo del Instituto Nacional de Salud Mental de Estados Unidos (45) identifica cuatro áreas prioritarias en relación con este tema y recomienda su aplicación: 1. Desarrollo de mejores modelos animales para el estudio de trastornos del ánimo.

2. Identificación de los determinantes genéticos de los trastornos afectivos.

3. Desarrollo de nuevos agentes con nuevos mecanismos de acción e identificación de marcadores biológicos en trastornos afectivos en humanos.

4. Reunión de neurocientíficos de diversas especialidades en el campo y aumento de la investigación básica de las enfermedades.

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GALECTINAS

La galectina-3 y galectina-1 Bind Distintos receptores de la glicoproteína de superficie celular para inducir la muerte celular T 1 Brianna N. Stillman * , Daniel K. Hsu † , Mabel Pang * C. Fred Brewer ‡ , Pauline Johnson § , Fu-Tong Liu † y Linda G. Baum 2 , *

INTRODUCCIÓN La muerte celular programada de linfocitos es crítico para el desarrollo normal inmune, regulación inmune, y la prevención de lymphomagenesis ( 1 ).

Teniendo en cuenta las funciones críticas de la muerte celular en el sistema inmune, varias familias de proteínas endógenas participan en este proceso. En general, las proteínas que regulan la muerte celular y la supervivencia se pueden clasificar en dos grupos principales: aquellos que funcionan dentro de la célula, tales como Bcl-2 miembros de la familia ( 2 ) y los que la función fuera de la célula, tales como miembros de la familia de TNF ( 3 ).

Las galectinas son una familia de proteínas de mamíferos que positivamente y negativamente regular la muerte celular ( 4 , 5 , 6 ). Las galectinas son únicas en que los diferentes miembros de la familia, incluida la galectina-1, -2, -3, -7, 8, -9 y -12, puede regular la muerte celular, ya sea dentro o fuera de la célula ( 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ). Como galectinas son proteínas de unión a carbohidratos, galectinas que actúan extracelularmente para inducir la muerte de las células que lo hagan por glicoproteínas de unión específica en una manera dependiente de sacárido. Por ejemplo, la galectina-1, que mata a los timocitos humanos y células T periféricas activadas ( 14 , 15 ), se une CD7, CD43, y CD45 en las células T ( 16 ). Todos los tres glicoproteínas están implicados en la regulación de la susceptibilidad a la galectina-1, y las modificaciones de oligosacáridos específicos de CD43 y CD45 de control de la galectina-1 de unión y la susceptibilidad a la muerte de células T ( 17 , 18 ).

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Aunque la galectina-1 regula la muerte de células T sólo a través de la ruta extracelular, y la galectina-7 actúa sólo intracelularmente para promover la apoptosis de las células epiteliales ( 10 , 19 ), la galectina-3 regula la muerte celular a partir de tanto fuera como dentro de la célula ( 9 , 20 ) . Por otra parte, la galectina-3 es el único miembro de la familia tanto con la actividad pro-y antiapoptóticas ( 5 ). Citoplasmática galectina-3 antagoniza la apoptosis mediante la asociación con la membrana mitocondrial para mantener la integridad de la membrana mitocondrial y antagonizar la liberación de citocromo c ( 9 , 21 , 22 ). Por el contrario, la galectina-3 extracelular induce directamente la muerte de células T ( 20 ).

La galectina-1 y galectina-3 son los miembros más expresión ubicua de la familia galectina. En algunos tejidos, sólo la galectina-1 o galectina-3 se expresa; galectina-1 se expresa en los miocitos esqueléticos y cardíacos, hepatocitos, y células del estroma de la próstata, mientras que la galectina-3 se expresa en las células epiteliales de los tractos digestivo y respiratorio ( 23 ).

En muchas células inmunes y tejidos, la galectina-1 y galectina-3 se coexpresan, éstas incluyen las células T, células B, células NK, macrófagos, células dendríticas, células endoteliales y fibroblastos, con altos niveles de ambas galectinas en timo y los ganglios linfáticos ( 5 , 24 , 25 , 26 ).

Tanto la galectina-1 y galectina-3 puede unirse a las células T y activar la muerte de células T ( 14 , 20 ), sin embargo, estos dos lectinas probable reconocen conjuntos discretos de ligandos de oligosacáridos expresados en cadenas principales de la glicoproteína distintos que llevan estos ligandos.

Aunque tanto la galectina-1 y galectina-3 reconoce el disacárido galactosa-β1, 4 - N -acetilglucosamina como un ligando sacárido mínimo, los dos galectinas difieren en especificidades finas para ligandos de oligosacáridos modificados, debido a las diferencias estructurales en el dominio de reconocimiento de carbohidratos (27, 28, 29 , 30 , 31 ).

Como timocitos y células T se encontrarán con la galectina-1 y galectina-3 en los tejidos normales y se inflama, es fundamental para identificar similitudes y diferencias entre la galectina-1 y vías de muerte celular T galectina-3, para entender las distintas funciones de las galectinas in vivo y los efectos de la administración de las galectinas exógenos como agentes inmunosupresores.

Por ejemplo, mientras que tanto la galectina-3 y la galectina-1 son inmunosupresora en modelos de enfermedad autoinmune, la administración de galectina-3 resulta en la supresión de citoquinas de tipo Th2, mientras que la administración de galectina-1 resulta en la supresión de citoquinas de tipo Th1 ( 4 , 32 , 33 ). La comprensión de los mecanismos que regulan la susceptibilidad de las poblaciones de células T a los diferentes galectinas permitirá una modulación precisa de las respuestas de células T, específicas por galectinas.

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MATERIALES Y MÉTODOS LAS CÉLULAS Y LOS REACTIVOS Líneas de células T humanas MOLT-4, Jurkat E6-1, J45.01 (American Type Culture Collection), CEM, CEM.DKO (Ref. 34 , un regalo del doctor B. Ardman, Centro Médico de Nueva Inglaterra, Boston, MA ), Jurkat A-11, y el derivado de CD29-deficientes (Ref. 35 ; un regalo del Dr. Y. Shimizu, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN) se mantuvieron en RPMI completo (RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies) suplementado con glutamina 2 mM, 10% de SFB y 10 mM HEPES) en 5% de CO 2 a 37 ° C. J45.01 células reconstituidas con CD45RABC murino se ha descrito anteriormente ( 36 ). Murino líneas de células T BW5147 y CD45 - / - derivado (Ref. 17 , un regalo del doctor K. Bottomly, la Universidad de Yale, New Haven, CT) se mantuvieron en DMEM modificado por Iscove (Invitrogen Life Technologies) suplementado con 10% de SFB y 0,1% de 2-ME en 10% de CO 2 a 37 ° C.

Los siguientes anticuerpos monoclonales se obtienen de los proveedores indicados: CD43 (DFT1), CD45 (leucocitos común Ag), CD4-PE (MT310), CD8aloficocianina (DK25), y el ratón IgG1-y Abs control de IgG2a-negativos de DakoCytomation CD45; (F10-89-4) y CD29-FITC (TDM29) de Southern Biotechnology Associates; CD7 (M-T701), CD71 (M-A712), y anti-ratón CD45 (30F11) de BD Pharmingen; CD29 (4B7R) desde Serotech; anti-galectina-3 (Mac-2; M3/38) de Boehringer Mannheim. Reactivos de detección secundarias se obtuvieron del proveedor indicado: de cabra anti-IgG de ratón-FITC (DakoCytomation); estreptavidina (SA) 3 -FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories); SA-HRP y conejo anti-IgG de ratón-HRP (Zymed Laboratories); de cabra anti-IgG de conejo-HRP (Bio-Rad); Alexa Fluor 568 cabra anti-IgG de ratón y SA-verde Oregon (Molecular Probes).

Recombinante humana galectina-1 y galectina-3 se prepararon como se describe anteriormente ( 37 , 38 ). Sueros policlonales de conejo anti-galectina1 y anti-galectina-3 se han descrito previamente ( 39 , 40 ).

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INMUNOTINCIÓN DE TEJIDOS Cinco micrómetro secciones de parafina amígdala humana o timo sobre portaobjetos de vidrio se calentaron a 60 ° C durante 30 min, desparafinaron con xileno y etanol, se enjuaga con dH 2 O, y se fijaron con 3% de H 2 O 2 durante 5 min. Los portaobjetos se bloquearon con 20% de suero de cabra en PBS durante 20 min antes de la adición de dilución 1/1000 de anti-suero de la galectina-1, anti-galectina-3 suero, o suero de conejo no inmune en 2% de suero de cabra / PBS. Para la inmunohistoquímica, Ab primario unido se detectó con el ratón anti-IgG de conejo-HRP diluido 1/1000 en PBS y se desarrolló con 3-amino-9-etilcarbazol (Biomedia) durante 10 min a 37 ° C. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina durante 1-2 min, se lavaron con PBS, y se montaron con Faramount (DakoCytomation). Para los estudios de inmunofluorescencia, la galectina-1 y galectina-3 se detectaron con anticuerpo de conejo anti-galectina-1 y el ratón monoclonales anti-galectina-3 Abs policlonales, seguido de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-Texas Red y de cabra anti-IgG de ratón-FITC. Los cultivos primarios de células epiteliales del timo humanos se cultivaron y las células fueron teñidas con anti-galectina-1 y anti-galectina-3 antisueros policlonales y Ab unido detectado con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-FITC como se ha descrito previamente ( 39 ). Las imágenes se recogieron en un microscopio Olympus AX70 para inmunohistoquímica, un Axioskop 2 plus microscopio de fluorescencia, o un IX70 microscopio confocal Olympus, y analizados mediante punto 4.0.4 versión avanzada del software (instrumentos de diagnóstico) o software Fluoview 2.0 (Olympus).

DETERMINACIÓN DE LA UNIÓN A LA SUPERFICIE CELULAR GALECTINA La unión de biotina a las células T o timocitos galectina-1 o galectina-3 se realizó tal como se describe ( 18 ). Brevemente, 5 × 10 5 células se incubaron durante 30 min a 4 ° C con concentraciones crecientes de las concentraciones de la galectina-1 o galectina-3 para construir las curvas de unión, y la galectina biotinilados que dieron ~ 50% de unión máxima (5,5 mM galectina-1 y 0,67 mM galectina-3) se utilizaron para los ensayos de unión a la inhibición con 0,1 M βlactosa. Los ensayos de unión se realizaron a 4 ° C para minimizar la muerte celular. Para los estudios de unión a la competencia galectin-3/galectin-1, las células fueron incubadas con 10 mM biotinilado galectina-1 en presencia de 10 mM sin marcar la galectina-3. Las células se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron con 3 g de SA-FITC y 0,6 g de 7-aminoactinomicina D (Molecular Probes) para detectar las células de unión y muertos galectina, respectivamente. Los datos de citometría de flujo se adquirieron usando un BD Biosciences-BD LSR Me Analítica citómetro de flujo y se analizaron con el programa informático CellQuest (BD Biosciences).

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ENSAYOS DE MUERTE DE CÉLULAS T Ensayos de muerte de células T se realizaron como se ha descrito previamente ( 37 ). Brevemente, 2 × 10 5 células se incubaron en 200 l de RPMI completo con la concentración indicada definitiva de la galectina-1, galectina-3, tanto la galectina-1 y galectina-3, o control de tampón con o sin 0,1 M β-lactosa para 4 horas a 37 ° C. La galectina fue disociado con 0,1 M β-lactosa y la muerte celular detectada por el marcaje con anexina V GFP y yoduro de propidio (PI; Molecular Probes). Para la detección de células que contienen ADN subdiploides, células permeabilizadas fijas se tiñeron con PI y contenido de ADN se determinó como se describió previamente ( 15 , 37 ). Todos los ensayos de muerte se realizaron por triplicado y los datos fueron adquiridos usando un BD Biosciences-BD LSR Me Analítica citómetro de flujo y se analizaron con el programa informático CellQuest (BD Biosciences). El porcentaje de muerte celular de las líneas de células T se determinó como: ((porcentaje anexina V - , PI - células en la muestra de control-tratado) - (ciento anexina V - , PI - células en la muestra tratada con la galectina)) / (porcentaje anexina V - , PI - células de la muestra de control con tratamiento). El porcentaje de pérdida de células de líneas de células T se determinó como se describe a continuación para los timocitos.

PÉRDIDA DE CÉLULAS DE TIMOCITOS Timocitos humanos se aislaron a partir de muestras quirúrgicas como se describe y se cultivaron durante la noche en medio libre de suero (AT-IMDM) que consiste en IMDM (Omega Scientific) suplementado con 1,100 g / ml de BSA previamente sin lípidos (Sigma-Aldrich), 85 g / ml de transferrina ( SigmaAldrich), 2 mM de glutamina, y 25 U/25 mg / ml de penicilina / estreptomicina ( 15 ). El día siguiente, 10 6 células en 200 l se incubaron con la concentración indicada de galectina-1, galectina-3, o control de tampón (TDT o PBS / glicerol) en AT-IMDM durante 3-5 horas a 37 ° C. La galectina fue disociado con 0,1 M β-lactosa y las células se lavaron con PBS antes de la tinción con CD4-PE-y CD8 aloficocianina durante 45 min a 4 ° C. Las células se analizaron en un BD Biosciences citómetro de flujo FACScan usando el software CellQuest. Como hemos encontrado previamente que existe una alta línea de base de unión de anexina V unión a timocitos aislados de esta manera, los timocitos se evaluaron para la viabilidad basado en adelante frente a dispersión lateral y ausencia de 7-aminoactinomicina D permeabilidad, como hemos descrito previamente ( 17 , 37 ). La pérdida de timocitos viables de cada población se determinó como: la pérdida de células por ciento = 100 × ((número de células de control tratadas viables) - (número de células viables galectina-tratados)) / (número de células de control tratadas viables).

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Aislamiento de proteínas galectina-3 se unen mediante cromatografía de afinidad La galectina-3 fue conjugado con bromuro de cianógeno-Sepharose 4B activada (Sigma-Aldrich). Proteínas de la superficie celular en 3 × 10 8 células fueron etiquetados con sulfo-NHS-biotina (Pierce), preparaciones de membranas de plasma se aislaron y se solubiliza en 0,1% de Tween 20, y el extracto se aplicó a la columna de la galectina-3 como se describe anteriormente ( 16 ).

Después de lavar exhaustivamente con PBS, 0,1% de Triton X-100, azida de sodio 0,02% (tampón de lavado), las proteínas unidas se eluyeron con 0,1 M βlactosa en tampón de lavado (tampón de elución). Se recogieron las fracciones, resueltos mediante la reducción de 10% de SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se detectaron con SA-HRP. Las proteínas se visualizaron por ECL (Amersham).

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA GALECTINA-3-VINCULANTES Las glicoproteínas se eluyeron de la columna de afinidad de la galectina-3 se concentraron en una membrana YM-3 Centricon (Millipore) y se resolvieron por electroforesis en 10% SDS-PAGE. Las proteínas separadas se visualizaron por tinción con azul brillante (Sigma-Aldrich) y las partes pertinentes del gel fueron extirpados para el análisis de secuencia de polipéptido. El análisis de secuencia se realizó en el Centro Microquímica Harvard (Cambridge, MA) por microcapillary de fase inversa HPLC nanoelectrospray tándem de espectrometría de masas en un espectrómetro de masas de iones cuádruple trampa (Thermo Electron) Finnigan LCQ Deca XP Plus. Para confirmar la identidad de las glicoproteínas en la muestra eluida de la columna de la galectina-3, se utilizaron Abs candidatos para la inmunoprecipitación o inmunotransferencia. Para la inmunoprecipitación con anti-CD29, marcado con biotina glicoproteínas de células T eluidas de la columna de la galectina-3, o proteínas de la membrana marcadas con biotina totales como un control, se inmunoprecipitaron con anti-CD29, separadas por 10% SDS-PAGE y electrotransferencia sobre membrana de nitrocelulosa (Hybond C-extra, Amersham). La membrana se bloqueó con 5% de leche descremada en PBS, se sondeó con SA-HRP, y se lavó extensamente con 0,1% de Tween 20 en PBS. Las proteínas se visualizaron por ECL.

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Alternativamente, las proteínas de membrana o total de proteínas de la membrana eluidas específicamente de la columna de la galectina-3 se resolvieron por SDS-PAGE, electrotransferencia, y se sondaron con anti-CD43, anti-CD45, o Abs anti-CD71 primarias seguidas de conejo conjugado con HRP anti- IgG de ratón. Bound Ab se detectó mediante ECL.

Caracterización de la localización del receptor tras el tratamiento con galectina3 Un total de 10 7 células CEM se incubaron con 5 mM galectina-3 en PBS con 10% de glicerol, o PBS / glicerol solo, durante 2 horas a 37 ° C con 5% de CO 2 . Las células se enfriaron a 4 ° C, y enlazado a la galectina-3 disocian con hielo-frío 0,1 M β-lactosa. Las células se tiñeron con anexina V-biotina (Molecular Probes) durante 30 min en hielo y se fijaron con paraformaldehído al 2% durante 30 min en hielo. La reacción se inactivó con 0,2 M de glicina durante 5 min, seguido por la tinción con el ratón anti-CD45 humano de leucocitos Ag o de ratón anti-CD71 humano común, durante 1 h en hielo.

Después del lavado, unido anexina V se detectó con SA-verde Oregon, y Ab unido se detectó con Texas Red-conjugado de cabra anti-IgG de ratón durante 1 hora a 4 ° C. Las células se lavaron y se montaron en portaobjetos de vidrio de microscopio usando Prolong medios de montaje anti-fade (Molecular Probes).

Control de las células teñidas y de un solo manchado isotipo se utilizan para controlar la tinción inespecífica y la compensación entre los canales fluorescentes, respectivamente. Células fluorescentemente marcadas se analizaron mediante el objetivo × 100 en un CLSM microscopio confocal de barrido con láser Leica. Las células fueron analizadas por doble excitación de Oregon verde y Alexa Fluor 568 (rojo) sondas fluorescentes. Imágenes fluorescentes de emisión dual se recogieron en canales separados en rodajas ópticos de 0,5 m. Las imágenes fueron procesadas utilizando Leica Confocal Software. Áreas de fluorescencia superposición de color rojo y verde se representan con una señal amarilla. La agrupación se define como la agregación del receptor en uno, dos, o tres grandes manchas en la superficie celular. Clustering se analizó en grupos de imágenes que contienen células 3080. Un total de 90 PBS / glicerol-tratada y 90 células galectina-3-tratados con tiñeron con anti-CD45, y 140 PBS / glicerol-tratada y 240 células galectina-3tratados con tiñeron con anti-CD71 fueron analizados.

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RESULTADOS La galectina-1 y galectina-3 se expresan en el tejido linfoide humano. Tanto la galectina-1 y galectina-3 se expresan en tejidos linfoides tales como timo y los ganglios linfáticos, por lo que las células T podrían encontrar uno o ambos galectina-1 y galectina-3 en diferentes sitios anatómicos ( 4 , 5 ).

Para demostrar la co-expresión de la galectina-1 y galectina-3 en el tejido linfoide, secciones de timo humano y la amígdala se marcaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-humano de la galectina-1 o de conejo anti-humano de la galectina-3. Como se muestra en la figura. 1, galectina-3 se detectó en todo el timo, en las regiones capsulares, corticales, y medulares; galectina-3 se detectó timocitos circundantes y intracelular galectina-3 era abundante en las células epiteliales en las regiones tanto corticales y medulares como se determina por la morfología y localización anatómica (fig. 1 C ).

Se observó un patrón similar para la galectina-1 inmunoreactividad (Fig. 1 ⇓ B ), como se ha descrito previamente ( 39 ). Como la galectina-1 y galectina-3 se puede localizar tanto intracelularmente y extracelularmente, se confirmó que las células epiteliales del timo secretan los dos galectinas sobre la superficie celular. Los cultivos primarios de células epiteliales del timo humanos se fijaron y se tiñeron las células intactas con el antisuero policlonal de conejo utilizado para inmunohistoquímica.

Células epiteliales del timo humanos primarios demostraron tinción de la superficie celular robusto con anti-galectina-1, como hemos observado anteriormente (39), y también con anti-galectina-3, mientras que el control no mostró antisuero inmunofluorescencia no específica significativa (fig. 1). Por lo tanto, las células epiteliales del timo expresar y exteriorizar tanto la galectina-1 y galectina-3, lo que indica que los timocitos en desarrollo se verían expuestos tanto a la galectina-1 y galectina-3 en el timo.

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FIGURA 1.

La galectina-1 y galectina-3 se expresan en el timo humano. Consecutivos secciones 0.5-micras de timo humano se incubaron con suero no inmune de conejo ( A ), o antisuero policlonal de conejo para la galectina-1 ( B ), o galectina-3 ( C ).Bound Ab se detectó por cabra conjugado con HRP anti-IgG de conejo. La tinción positiva se indica por el producto de reacción marrón. Las secciones se counterstained con hematoxilina (azul). Magnificación, x 50. El mismo antisuero policlonal de conejo se utiliza para teñir cultivos primarios de fijo, células epiteliales del timo humanos nonpermeabilized, que se muestran debajo de las respectivas secciones de timo teñidas. Bound Ab se detectó por cabra conjugado con FITC anti-IgG de conejo y células imágenes de microscopía de fluorescencia. Magnificación, × 100.

En la amígdala humana, se observó un patrón más complejo de la expresión de galectina-1 y galectina-3. Aunque tanto la galectina-1 y galectina-3 se expresaron en algunos tipos de células, tales como células dendríticas foliculares (Fig. 2 ⇓ , A , B , D , y E ), las células endoteliales expresan abundantes galectina-1, mientras que la galectina-3 fue no es detectable en las células endoteliales (Fig. 2 ⇓ , C y F ). Para examinar con más precisión colocalización de los estudios de inmunofluorescencia galectina-1 y galectina-3, doble la etiqueta se llevaron a cabo (fig. 2 ⇓ , G-I ). La galectina-1 (rojo) y la galectina-3 (verde) fueron ambas expresadas por las células dendríticas dentro del folículo de los ganglios linfáticos, como se demuestra por la colocalización de las señales de color verde y rojo. Sin embargo, otras áreas demostraron la expresión de sólo la galectina-1 o galectina-3. En las regiones extrafollicular, galectina-3 se expresó en el estroma que rodea los vasos pequeños, mientras que se detectó la galectina-1, pero no la galectina-3, en las células endoteliales.Por lo tanto, las células T en los ganglios linfáticos podrían encontrar ya sea la galectina-3 o la galectina-1, o ambas galectinas, dependiendo de la localización anatómica de la célula T dentro del nodo.

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FIGURA 2.

La galectina-1 y galectina-3 se expresan en los ganglios linfáticos humanos.Consecutivos secciones 0.5 micras de ganglio linfático humano se tiñeron con antisuero policlonal de conejo a la galectina-1 ( A -C) o la galectina3 ( D-F ). La galectina-1 ( A y B ) y la galectina-3 ( D y E ) se expresan por las células dendríticas en la zona folicular. La galectina-1 ( C ), pero no la galectina-3 ( F ), se expresa por las células endoteliales que revisten la microvasculatura. No se observó tinción con control de isotipo Ab (datos no mostrados). Para la microscopía de fluorescencia, las secciones de ganglio linfático humano se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo galectina-1 anti-humano ( T ) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano de la galectina-3 ( H ) Abs. Bound Ab se detectó con Texas Red-conjugado de cabra anti-conejo IgG ( T ) y FITC-conjugado de cabra anti-IgG de ratón ( H ). Nota colocalización en las células dendríticas foliculares representados en la expresión de color amarillo, y discreta en regiones fuera del folículo representado en rojo y verde ( I ). Magnificación, × 400, a excepción de una y D , × 50.

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LA GALECTINA-3 MUERTES CÉLULAS T Y TIMOCITOS Al igual que la galectina-1, galectina-3 se ha informado para matar líneas de células T, aunque el mecanismo de la muerte galectina-3-inducida no se entiende bien ( 20 ). Se comparó la capacidad de la galectina-3 y la galectina-1 para activar la muerte de células T. Para demostrar que la galectina-3 de unión a las células T es dependiente de hidratos de carbono, biotinilado galectina-3 se fijó a las células T en presencia o ausencia de lactosa (fig. 3 A La galectina3 muertes células T y timocitos.

Al igual que la galectina-1, galectina-3 se ha informado para matar líneas de células T, aunque el mecanismo de la muerte galectina-3-inducida no se entiende bien ( 20 ). Se comparó la capacidad de la galectina-3 y la galectina-1 para activar la muerte de células T. Para demostrar que la galectina-3 de unión a las células T es dependiente de hidratos de carbono, biotinilado galectina-3 se fijó a las células T en presencia o ausencia de lactosa (fig. 3 A ). La unión de la galectina-3, como la unión de la galectina-1, fue inhibida por la lactosa, lo que demuestra que la galectina-3 se une a ligandos de glicanos en la superficie de células T. FIGURA 3.

La galectina-3 se une a e induce la muerte de las células T de una manera dependiente de hidratos de carbono.

A , La unión de biotina de la galectina-1 y galectina-3 a las células Jurkat E6-1 T se detectó por SA-FITC. Las líneas grises y negro representan la unión en presencia o ausencia de 0,1 M β-lactosa, respectivamente.

B, células Jurkat E6-1 T se trataron con 5 mM galectina-3 (derecho) o PBS / glicerol ( izquierda ) como un control de tampón y anexina V vinculante y captación de PI determinaron como se describe en Materiales y Métodos .

Las células T Jurkat y MOLT-4 se trataron con concentraciones crecientes de la galectina-3, PBS / glicerol como un control de tampón, o 20 mu M galectina-1 como un control positivo para la muerte, y el porcentaje de muerte celular se determinó como se describe en Materiales y Métodos. Los valores son media ± SE de tres experimentos.

C, las células T CEM se trataron con 5 mM galectina-3 o 20 mM galectina-1 en la presencia o ausencia de 0,1 M β-lactosa. Los valores son la media ± SD de tres muestras de una, representativos de tres experimentos independientes.

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Para examinar la potencia de la galectina-3 en el desencadenamiento de la muerte de células T, aumento de las concentraciones de la galectina-3 se añadieron a líneas de células T y la muerte celular se determinó mediante el

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marcaje con anexina V y PI. Como control positivo, las células fueron tratadas con 20 mM galectina-1. La galectina-3 inducida por la muerte significativa de líneas de células T como se demuestra por la anexina V vinculante y captación de PI (Fig. 3 ⇑ B ). También se observó un aumento en la fracción de células con ADN subdiploides en muestras de galectina-3-tratados en comparación con el control, como se ha descrito previamente ( 20 ), y la pérdida de células viables se determinó por dispersión lateral frente hacia adelante (datos no mostrados). Por otra parte, se observó la muerte de células T galectina-3inducida en concentraciones más bajas en comparación con la galectina-1. Un total de 1-5 mM muerte significativa la galectina-3 inducida por células T (Fig. 3 ⇑ B ), mientras que 5 mM galectina-1 inducida por la muerte celular insignificante (datos no mostrados) y niveles comparables de la muerte celular requeridos 20 mM galectina-1 . Lactosa abrogada tanto la galectina-3-y la muerte celular galectina-1-inducida, lo que demuestra que la galectina-3, al igual que la galectina-1, induce la muerte de las células T de una manera dependiente de hidratos de carbono (Fig. 3 C ).

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FIGURA 4.

La galectina-3 y la galectina-1 muerte distintos subconjuntos de timocitos.

Timocitos humanos fueron tratados con galectina-3 o control de tampón durante 4 h ( A ) o de control de la galectina-1, galectina-3, o tampón durante 3 h ( B ), antes de la tinción con CD4-PE-y CD8 aloficocianina. Las células viables en el DN y DP subconjuntos de timocitos fueron analizados, y el porcentaje de pérdida de células de los subconjuntos DN y DP se determinó como se describe en Materiales y Métodos . Los datos mostrados son la media ± SD de tres muestras de una, representativos de tres experimentos independientes.

Aunque la galectina-3 se expresa en timo humano, la susceptibilidad de los timocitos humanos a la muerte galectina-3-inducida es desconocido. Añadimos la galectina-3 o la galectina-1 y el total de timocitos humanos y analizamos la pérdida de células viables de diferentes subconjuntos de timocitos. Como se muestra en la figura. 4, la pérdida de la galectina-3 inducida de ambos CD4CD8 timocitos doble negativos (DN) y doble positiva (DP), con pérdida insignificante de CD4 o CD8 timocitos sola-positivos (datos no presentados). El aumento de las concentraciones de la galectina-3 dio lugar a una mayor pérdida de células, tanto en DN y subconjuntos DP. Sin embargo, los timocitos DN eran más susceptibles a la galectina-3, como se muestra en la figura. 4 ⇓ Una . El tratamiento con 5 mM galectina-3 resultó en un ~ 25% de pérdida de timocitos DN viables y el tratamiento con 20 mM galectina-3 resultó en una pérdida de> 60% de los timocitos DN. En contraste, se observó una pérdida de <10% de células de timocitos DP tratados con 5 mM galectina-3, y la pérdida máxima de timocitos DP con 20 mM galectina-3 fue <30%. La selectividad relativa de la galectina-3 para los timocitos DN es muy diferente de los efectos de la galectina-1 en subpoblaciones de timocitos. Como hemos demostrado anteriormente ( 21 ), los timocitos DN y DP humanos eran susceptibles a la galectina-1 (Fig. 4 B ). Por lo tanto, mientras que los timocitos encontrarían tanto la galectina-3 y la galectina-1 en el estroma tímico, las dos galectinas pueden tener efectos distintos en diferentes subconjuntos tímicas in vivo.

Aunque la galectina-3 y la galectina-1 tenían efectos distintos en diferentes subconjuntos de timocitos, no estaba claro si la susceptibilidad diferencial a los dos galectinas resultado de diferencias en el reconocimiento de la superficie celular del receptor, las diferencias en las vías intracelulares, o ambos. Para examinar si las vías de muerte intracelulares difieren entre galectina-3 y la galectina-1, las células T se trataron con concentraciones crecientes de solo o en combinación con 10 o 20 mM galectina-1 (Fig. 5 galectina-3).

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FIGURA 5.

La galectina-1 y la muerte galectina-3 son ni aditivos ni sinérgico. MOLT-4 ( A ) o CEM ( B ) líneas de células T se trataron con las concentraciones indicadas de la galectina-3 con o sin 10 mM o 20 galectina-1 para 4 h y el porcentaje de muerte celular se determinó como se describe en Materiales y Métodos . Los datos mostrados son la media ± SD de tres muestras de un representante de cinco experimentos independientes.

Como se ha descrito anteriormente, 10 mu M niveles variables galectina-1 inducida por la muerte de células T, mientras que 20 mM galectina-1 inducida consistentemente la muerte de células T significativa. Como se observa en la figura. 3 B , el tratamiento con 1-5 mM galectina-3 dio lugar a niveles significativos de la muerte de células T, con la muerte celular máxima observada a los 5 mM galectina-3. Es importante destacar, no se observaron efectos aditivos o sinérgicos de la galectina-1 y galectina-3. En ningún caso la adición de cualquiera de galectina-1 o galectina-3 aumentar el nivel de muerte de las células T por encima de la observada para la galectina ya sea solo.

Estos resultados sugieren que la muerte intracelular provocada por la galectina3 y la galectina-1 se cruzan en algún momento. Así, razonó que la susceptibilidad diferencial a la galectina-3 vs galectina-1 probablemente sería

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determinada por la unión a diferentes conjuntos de receptores de la glicoproteína de superficie celular.

La galectina-3 y la galectina-1 se unen a los distintos complementos de los receptores de la glucoproteína Aunque tanto la galectina-3 y la galectina-1 se unen a las células T en una manera dependiente de hidratos de carbono (Fig. 3 ⇑ A ), los ligandos sacáridos preferentemente reconocidos por los dos galectinas se expresan en numerosas glicoproteínas de la superficie de células T. Como la galectina-3 y la galectina-1 tienen características estructurales muy distintas, con la galectina-3 (que es principalmente un monómero en solución) que forma un pentámero, unido por N terminales flexibles, cuando los dominios C-terminales de unión a ligandos se unen a sacáridos agrupados , y la galectina-1 que forma un homodímero no covalente rígida ( 28 , 41 , 42 ), la galectina-3 y la galectina-1 puede reconocer en cadenas principales de sacáridos similares glicoproteína distintos. Para investigar si la galectina-3 y la galectina-1 se unen a diferentes receptores de la glicoproteína, nos preguntamos si la galectina-3-1 y galectina competir por la unión a los receptores en la superficie de células T. Galectina-1 biotinilado (10 mM) se une a las células T en la ausencia o presencia de concentraciones crecientes de la galectina-3 no marcado a 4 º C, y unido a la galectina-1 detecta con SA-FITC. La galectina-3 sólo inhibió parcialmente la galectina-1 de unión a la superficie de la célula T; inhibición máxima de la galectina-1 de unión por galectina-3 fue del 50% (fig. 6 ⇓ ). Estos resultados indicaron que la galectina-3 y la galectina-1 reconocen preferentemente repertorios de distintos receptores de la glicoproteína de superficie de células T.

FIGURA 6.

La galectina-3 inhibe parcialmente la unión de la galectina-1 a la superficie de la célula T. Las células T se incubaron con 10 mM biotina galectina-1 en la presencia o ausencia de 10 mM sin marcar la galectina-3. Galectina unido se detectó por SA-FITC y se cuantificó por citometría de flujo. La línea punteada gris, línea gris sólida, y la línea de negro representan la unión de biotina BSA,

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biotina galectina-1 en presencia de una concentración igual de galectina-3, y la biotina sola galectina-1, respectivamente.

Para aislar glicoproteínas específicas de células T que se unen la galectina-3, se realizó cromatografía de afinidad galectina-3, como lo hemos hecho anteriormente para aislar la galectina-1 receptores (16). Proteínas de la superficie celular fueron marcadas con biotina, y extractos de membrana de células se aplicaron a una columna de afinidad de la galectina-3. Después de un lavado extenso, las glicoproteínas unidas se eluyeron con lactosa, y el eluato se analizó por transferencia con SA-HRP para detectar las proteínas de la superficie celular. Como se muestra en la figura. 7 ⇓ , varias de las principales bandas de proteínas se visualizaron en el eluato lactosa. El patrón de bandas de proteínas eluidas de la columna de afinidad de la galectina-3 difiere del patrón que había observado previamente para glicoproteínas de células T unidas a una columna de afinidad de la galectina-1 ( 16 ), lo que indica que el conjunto de T glicoproteínas de la superficie celular que se unen preferentemente a los galectina-3 es diferente del conjunto de receptores unidos por galectina-1.

FIGURA 7.

Identificación de las glicoproteínas de células T obligados por la galectina-3. La galectina-3 proteínas de unión se aislaron a partir de células MOLT-4 y Jurkat E6-1 proteínas de membrana con biotina mediante cromatografía de afinidad galectina-3 y detectados por SA-HRP ( panel de la izquierda ). CD45, CD29, CD43, y CD71 ( a la izquierda a la derecha ) a partir de células MOLT-4 total de proteínas de la membrana (T) o de eluato galectina-3 (E) se detectaron por transferencia Western con mAb específicos (CD45, CD43, y CD71) o mediante inmunoprecipitación (CD29), seguido de secante con SA-HRP.

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Para identificar la galectina-3 receptores de la glicoproteína específica de células T, se obtuvo información de la secuencia de péptidos de las proteínas eluidas de la columna de la galectina-3. Varios glicoproteínas de membrana de células T se identificaron en el eluato; aquellos previamente implicado en la apoptosis o la unión a la galectina-1 o galectina-3 se presentan en la Tabla I ⇓ .

Estos incluyen los galectina-3 receptores previamente identificados proteína Mac-2-unión, CD29, y CD98 ( 5 , 43 , 44 ), así como los receptores CD43 y CD45 (galectina-1 16 ). Este enfoque también identificó varias proteínas de la galectina-3 se unen nuevos, incluyendo CD71 y la cadena TCRβ. En particular, CD7, un TCR importante para la galectina-1 ( 7 ), no se identificó en el material eluido de la columna de la galectina-3. Para examinar receptores de la glicoproteína de células T que podrían participar en la muerte galectina-3inducida, nos centramos en CD29, CD43, CD45, y CD71, todos los cuales han sido previamente implicadas en la muerte de células T ( 20 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 ). Se confirmó la presencia de estos cuatro glicoproteínas en el eluato de la matriz de la galectina-3 afinidad por inmunoprecipitación o transferencia Western. Como se muestra en la figura. 7 ⇑ , CD29, CD43, CD45 y CD71 glicoproteínas eran cuatro de las bandas predominantes aislados de la columna de afinidad de la galectina-3

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CD45, pero no CD29 ni CD43, contribuye a la muerte de células T galectina-3inducida Aunque la identificación de glicoproteínas de la superficie de células T que la galectina-3 enlazado fue un paso crítico en la definición de las glicoproteínas implicados en la muerte galectina-3-mediada, es importante tener en cuenta que las glicoproteínas de células T modificadas con los glicanos apropiados pueden se unen a la galectina-3, sin embargo, no ser necesario para la muerte de células T. Esta ha sido previamente demostrada para la galectina-1, mientras que la galectina-1 se une a CD2 y CD3, ninguna de estas glicoproteínas se requieren para activar la muerte de células T galectina-1 inducida por (7,14).

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FIGURA 8.

Identificación de las glicoproteínas de células T que participan en la muerte de células T galectina-3-inducida. Una , líneas de células T parentales y derivados que carecen de CD29, CD43, CD45 o fueron tratados con galectina-3 (línea sólida) o tampón de control (línea de puntos) para 4 h y la muerte celular determinada por la anexina V vinculante. B , Reconstitución de expresión CD45RABC murino en CD45 - células Jurkat 45,01 restaurado susceptibilidad a la muerte galectina-3. Panel superior , la expresión CD45 en las células transfectadas con el vector solo (45,0 vector) o con murino CD45RABC (línea de puntos, control de isotipo, línea continua, anti-CD45, clon 30-F11). Las células Jurkat que expresan CD45RABC eran susceptibles a la muerte galectina-3, que se muestra por la unión de anexina V (línea, control de memoria intermedia de puntos; línea continua, la galectina-3) y por la pérdida de células (□, control de memoria intermedia; ▪, galectina-3). Las células transfectadas con el vector solo (45,0 vector) se mantuvieron resistentes a la galectina-3. C , Hut78, una línea de células T que carecen CD7, se trató con galectina-1 o galectina-3 y la muerte celular determinada por la anexina V vinculante. La galectina-3, pero no la galectina-1, la muerte inducida de células T Hut78. Las líneas de puntos y negro representan la anexina V unión a las células tratadas con tampón de control y la galectina, respectivamente. Los datos mostrados son de un representante de tres experimentos independientes.

Para determinar las funciones de CD29, CD43, y CD45 en la muerte de células T galectina-3-inducida, hemos examinado un panel de líneas celulares con pares de células que expresan o que carecen de la glicoproteína indicado. Las células se trataron con 5 mM galectina-3 y la muerte celular se determinó por anexina V. Como se muestra en la figura. 8 A , CD29 nulas las células Jurkat fueron susceptibles a la muerte galectina-3-inducida. Del mismo modo, CD43 nulos células CEM eran susceptibles a la muerte galectina-3-inducida (Fig. 8 A ). Por lo tanto, se requieren ni CD29 ni CD43 para la muerte celular T galectina3 inducida.

Sin embargo, CD45 parece participar en la muerte celular galectina-3-inducida.

Esto está en contraste con la galectina-1, que puede matar CD45 nulos líneas de células T (17). Células Jurkat E6-1 eran susceptibles a la muerte galectina3-inducida, mientras que el CD45 nula derivado J45.01 era resistente a la galectina-3; Además de la galectina-3 a las células J45.01 dio lugar a un cambio insignificante en la anexina V vinculante ( la figura. 8 ⇑ Una ). Por otra parte, la reconstitución de la expresión en las células CD45RABC J45.01 rindió las células susceptibles a la galectina-3, mientras que las células transfectadas con el vector J45.01 solamente, permanecieron resistentes a la galectina-3, lo que indica que CD45 tiene un papel crítico en la galectina-3-T inducida la muerte celular (Fig. 8 ⇑ B ). Del mismo modo, se encontró que la muerte inducida por galectina-3 de células murinas BW5147 que expresan CD45 (17), mientras que CD45 -/- células BW5147 eran resistentes a la galectina-3 muerte (datos no mostrados).

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Para examinar el papel de CD71 en la muerte celular galectina-3, se intentó reducir la expresión de CD71 en las células T CEM Jurkat E6-1 y por pequeños ARN de interferencia. Aunque hemos sido capaces de disminuir la expresión de CD71 en células Jurkat E6-1 por ~ 50%, tal como se detecta por la intensidad media de fluorescencia de CD71 tinción, se observó ninguna diferencia en la muerte celular inducida por galectina-3 en células interferentes pequeños ARNtratado comparado con las células transfectadas de control (datos no mostrados). El hecho de que la transferrina es un factor de supervivencia para muchos tipos de células (50) puede explicar por qué no fuimos capaces de reducir la expresión de CD71 por> 50%, y la reducción parcial en la expresión de CD71 que se podría lograr puede no haber sido suficiente para afectar a las células T susceptibilidad a la galectina-3.

1-galectina gatillo muerte galectina-3 y a través de diferentes receptores de superficie celular Nuestro laboratorio demostró previamente un requisito para CD7 en la muerte galectina-1 inducida por células (7), y el trabajo anterior utilizando Abs bloquea sugerido un papel para CD7 en la muerte de células T galectina-3-inducido (20). Sin embargo, no detectamos CD7 entre las glicoproteínas de membrana de células T que se unen específicamente a la galectina-3 (Tabla I ). Para abordar específicamente el papel de CD7 en la muerte de galectina-3 células, se examinó el efecto de la galectina-3 en CD7 nulas las células T Hut78.

Células HUT78 son resistentes a la muerte galectina-1-inducida, mientras que la expresión de CD7 en las células HUT78 rindió las células susceptibles a la galectina-1 (7). Como se muestra en la figura. 8 ⇑ C , mientras que las células HUT78 fueron resistentes a la muerte celular inducida por galectina-1, se observó la muerte significativa de las células HUT78 después de la adición de la galectina-3. Estos datos demuestran que la galectina-3 y la galectina-1 inducen la muerte de las células T a través de la unión a diferentes glicoproteínas de la superficie celular; galectina-1 muerte de las células T requiere CD7, mientras que la galectina-3 muerte de las células T no, y CD45 no se requiere para la galectina- 1 muerte inducida, mientras que CD45 parece ser necesario para la muerte galectina-3-inducida (Fig. 8).

La galectina-3 induce la agrupación de CD71, pero no CD45, en la superficie de células T Nuestro laboratorio ha demostrado anteriormente que los resultados de la galectina-1 de unión en la agrupación de CD45 y colocalización de CD45 con fosfatidilserina en vesículas apoptóticas durante la muerte de células T galectina-1 inducida por (16). Como se muestra arriba, la galectina-3, al igual que la galectina-1, se une a CD45, y CD45 pueden contribuir a la muerte celular inducida por galectina-3 (Figs. 7 y 8). Sin embargo, como la galectina-3 y la galectina-1 tiene características estructurales distintas 5, 27, 28), los dos

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galectinas pueden tener diferentes efectos sobre la localización de glicoproteína después de la unión. Por lo tanto, se determinó el efecto de la unión de la galectina-3 en la localización de CD45 en la superficie de las células T CEM. Antes del tratamiento galectina-3, CD45 se distribuye de manera difusa en la superficie de células T, como se ha demostrado por inmunofluorescencia (no se muestran datos). Después de la galectina-3 vinculante, CD45 se mantuvo difusamente distribuida sobre la superficie de células T (Fig. 9 A ). Para confirmar que las células T expuestas a la galectina3 fueron sometidos a la muerte celular, las células también se marcaron con anexina V. Como se muestra en la figura. 9 ⇓ A , anexina V vinculante se concentró en parches en vesículas apoptóticas de las células que mueren, como se observó durante la galectina-1 muerte de las células T ( 6). Sin embargo, a diferencia de la galectina-1, la galectina-3 no indujo redistribución de CD45 a vesículas apoptóticas en las células que mueren.

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La FIGURA 9.

La galectina-3 induce la agrupación de CD71, pero no CD45, en la superficie de células T. A , imágenes microscópicas confocales de CD45 o CD71 (rojo) y anexina V (verde) después del tratamiento con galectina-3 de las células T CEM durante 2 h. Superposición de CD45 ( superior ) o CD71 ( inferior ) con la anexina V se representa en amarillo en los paneles de la derecha . La galectina-3 inducida por la exposición de fosfatidilserina focal (centro). La galectina-3 no induce CD45 clustering ( arriba a la izquierda ), pero indujo agrupación de CD71 en la superficie de la célula T ( parte inferior izquierda ).

Las células tratadas con tampón de control demostraron una distribución uniforme de ambos CD45 y CD71 y sin anexina V vinculante (datos no mostrados). B , el porcentaje de células que demuestra la agrupación de CD45 o CD71 en la superficie de la galectina-3 o células de control tratados con tampón. Los valores son medias ± SD de imágenes recogidas a partir de un representante de tres experimentos independientes (CD45, n = 90 células; CD71, n = 240 células).

Como CD71 también obligado a la galectina-3, se determinó la distribución de la superficie celular de CD71 después del tratamiento con la galectina-3. Antes de la galectina-3 de unión, y en las células tratadas con tampón de control, CD71 se distribuyó uniformemente sobre la superficie de las células T CEM. Sin embargo, como se muestra en la figura. 9 ⇑ A , la unión de la galectina-3 resultó en CD71 localización en grupos distintos en la superficie de células T. Aproximadamente el 60% de las células CEM galectina-3-tratados demostró agrupación de CD71, mientras que no se observó ninguna agrupación de CD45 después de la galectina-3 tratamiento (Fig. 9 ⇑ B ). De las células con CD71 en clúster, 90% también obligado anexina V. Por otra parte, numerosas células CD71 había agrupado colocalized con anexina V en vesículas de membrana.

Es importante destacar que ninguna de las células que retuvieron distribución uniforme de CD71 unido a la anexina V, lo que sugiere que la redistribución de CD71 está implicado en la muerte galectina-3.

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DISCUSIÓN La galectina-3 y la galectina-1 se unen ambos a las células T para inducir la muerte celular de una manera dependiente de hidratos de carbono. A primera vista, puede parecer que la galectina-3 y la galectina-1 tienen funciones redundantes, lo que sugiere que una galectina podría sustituir a la otra. De hecho, varias otras galectinas, incluyendo la galectina-2, -7, y -9, también matan a las células T ( 8 , 10 , 13 ). Sin embargo, los datos presentados aquí indican que la galectina-3 y la galectina-1 eliminar las células T mediante la unión a diferentes glicoproteínas de la superficie celular para iniciar la muerte celular. Del mismo modo, lo poco que se sabe acerca de T vías de muerte celular mediada por galectina apoya la hipótesis de que diferentes galectinas no utilizan idénticos mecanismos para eliminar las células T. Por ejemplo, durante la muerte celular galectina-1, endonucleasa G se transloca desde la mitocondria al núcleo sin la liberación de citocromo c ( 51 ). En contraste, durante la muerte de células T galectina-2-inducida se produce una pérdida de potencial de membrana mitocondrial y liberación de citocromo c ( 8 ). In vivo, la galectinas diferentes pueden actuar en diferentes momentos en el desarrollo, en diferentes sitios anatómicos, o en poblaciones de células diferentes, para regular la muerte celular. A medida que los patrones de expresión de células y tejidos de muchas galectinas se superponen, tenemos que entender los diferentes mecanismos utilizados por distintas galectinas para regular la muerte celular T. Se han descrito numerosos ejemplos de similitudes y diferencias en las funciones de la galectina-3 y la galectina-1. Aunque tanto la galectina-3 y la galectina-1 participan en el empalme de ARN en el núcleo ( 52 ), sólo intracelular galectina-3 previene la apoptosis desencadenada por una variedad de agentes, mediante la localización de la mitocondria y la prevención de citocromo c de liberación ( 22 , 53 ). Aunque tanto la galectina-3 y la galectina-1 puede interactuar con los mediada por Fas vía de la muerte, extracelulares galectina-1 aumenta la muerte inducida por Fas ( 54 ), mientras que la galectina-3 intracelular dirige la vía de la muerte desencadenada por la unión de Fas ( 55 ). Aunque tanto la galectina-3 y la galectina-1 puede mediar en la unión de patógenos a las células huésped, sólo la galectina-1 promueve la unión del VIH-1 a las células diana, mientras que la galectina-3 inhibe la unión del HIV galectina-1-facilitada (56, 57). Aunque tanto la galectina-3 y la galectina-1 se unen a las células T para activar la muerte de células T, se muestra aquí que las galectinas difieren con respecto a los receptores de superficie celular, receptor de localización después de la unión, y los requisitos para los receptores específicos para desencadenar la muerte de células T. Aunque la administración de tanto la galectina-3 y la galectina-1 eran inmunosupresor en varios modelos animales de enfermedad inflamatoria, y tanto la galectina-3 y la galectina-1 influencia del umbral de la señalización del

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TCR ( 58 , 59 ), la galectina-1 tratamiento reduce de tipo Th1 la producción de citoquinas (5 , 32 , 60 ), mientras que el tratamiento galectina-3 reduce la producción de citoquinas de tipo Th2 (33, 61).

Por otra parte, los ratones galectina-3 y la galectina-1 knockout tienen distintos fenotipos. La galectina-3 ratones deficientes han atenuado el reclutamiento de neutrófilos, mientras que los ratones galectina-1-deficientes han aumentado el reclutamiento de neutrófilos en comparación con los ratones de tipo salvaje en un modelo de inflamación peritoneal (JC Paulson, Consorcio para Glicómica funcionales: <www.teleimpac.com/ glicómica / publicdata / phenotyping.jsp.> y Ref.. 62), consistente con las observaciones que la galectina-1 antagoniza la adhesión de neutrófilos al endotelio, mientras que la galectina-3 promueve la adhesión de neutrófilos al endotelio ( 63 , 64 ). Por lo tanto, existe una amplia evidencia de que la galectina-3 y la galectina-1 se superponen, pero distintas funciones en la regulación inmune.

Nuestros datos demuestran claramente que la galectina-3 y la galectina-1 requieren receptores de la glicoproteína de superficie diferentes para activar la muerte de células T. La galectina-1 se une a y requiere CD7 expresión para activar la muerte de células T (7), pero la galectina-3 no se une ni CD7 requiere CD7 para activar la muerte de células T. Además, las principales glicoproteínas de células T reconocidos por la galectina-3 difieren de los reconocidos por la galectina-1. Como conjuntos distintos galectina-3 y la galectina-1 se unen de ligandos de oligosacáridos ( 29, 30, 31), estos ligandos se pueden mostrar diferencialmente en glicoproteínas de células T específicas. Tanto la galectina1 y galectina-3 se unen CD29, CD43, y CD45, pero sólo la galectina-3 se une CD71, y sólo la galectina-1 se une CD7 y CD2 ( 7 , 16 , 65 ). No sólo la galectina-3 y la galectina-1 se unen complementa distinta de los receptores de glicoproteína, la galectina-3 y la galectina-1 también inducen distintos patrones de agrupamiento de estos receptores en la superficie de células T. Aunque tanto la galectina-3 y la galectina-1 se unen CD45, CD45 agrupamiento se produce después de la galectina-1 de unión ( 16 ), mientras que no se observó CD45 agrupación durante la muerte celular galectina-3-inducida. Sin embargo, la galectina-3 indujeron agrupación de CD71 en las células que mueren (Fig. 9 ⇑ ), y se observó ninguna muerte de las células que no lo hicieron racimo CD71 después de la unión de galectina-3. Por lo tanto, la agrupación CD71 puede estar implicada en la vía de la muerte galectina-3. Curiosamente, tanto DN y timocitos DP subconjuntos expresa CD45 y CD71, pero se observó susceptibilidad diferencial a la galectina-3 entre estos dos subgrupos (Fig. 4).

Los factores adicionales, tales como las diferencias en la glicosilación entre estos subconjuntos de timocitos ( 4 ), pueden determinar la susceptibilidad relativa de las células a la galectina-3. Por ejemplo, diferentes isoformas de CD45 son diferencialmente glicosiladas, y específicos de isoformas de CD45 pueden ser modificados por glicosiltransferasas expresadas en diferentes MODULO VII

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subconjuntos de timocitos ( 17 , 18 ), mientras que el presente trabajo sólo se determinó que el CD45RABC isoforma era suficiente para hacer que las células Jurkat susceptibles a la galectina -3 estudios en curso en nuestro laboratorio están examinando el papel de los diferentes isoformas de CD45 y CD45 glicosilación diferencial en la regulación de la sensibilidad celular a la galectina3.

Los ligandos de oligosacáridos precisas que regulan la muerte celular T galectina-3-inducida permanecen indefinidos. Sin embargo, nuestra observación de que la galectina-3 BW5147 mata las células T indica que la galectina-3 y la galectina-1 también tienen requisitos diferentes para la glicosilación superficie celular. Células BW5147 carecen de expresión de la base 2 de N -acetilglucosaminiltransferasa (C2GnT) que se requiere para la muerte galectina-1 de células ( 17 ). Como las células BW5147 murieron en respuesta a la galectina-3, los glicanos específicos realizados por C2GnT no son necesarios para la muerte celular galectina-3. Las diferencias en el reconocimiento de o la necesidad de ligandos de oligosacáridos específicos pueden reflejar diferencias en los dominios de reconocimiento de hidratos de carbono de los dos galectinas o pueden resultar de diferencias estructurales entre la galectina-3 y la galectina-1 que dictan cómo los diferentes galectinas pueden interactuar con ligandos de glicanos en la célula superficie.

La galectina-3 y la galectina-1 tienen varias características estructurales que pueden contribuir al reconocimiento del receptor diferencial y la agrupación de las glicoproteínas de la superficie celular. La galectina-1 es un homodímero no covalente rígido, con una K d en el rango micromolar bajo (42). Hemos demostrado que se requiere la forma dimérica de la galectina-1 para la muerte celular, y el homodímero rígida puede ser crítico para la galectina-1 patrón de agrupamiento de los receptores de la unión al receptor y homogénea en la superficie de células T ( 16 ). Por el contrario, la galectina-3, que es un monómero en solución, forma pentámeros a través de los dominios Nterminales flexibles después de la unión a ligandos sacáridos en una superficie inmovilizada, tales como la superficie de una célula T, y forma heterogéneos complejos reticulados de glicoconjugados multivalentes (41).

Las diferencias estructurales entre flexibles pentamérica galectina-3 vs cuenta la galectina-1 probablemente dimérica rígida para los efectos distintos sobre la agrupación de receptores, así como las diferentes cantidades de los dos galectinas necesarias para matar a las células. Aunque se requiere 20 mM galectina-1 para 50% de muerte de las células T MOLT-4 y Jurkat, 1-5 mM galectina-3 era suficiente para inducir la muerte celular 50%. La forma pentamérica de la galectina-3 pueden permitir la unión y la reticulación de un mayor número de receptores de superficie de células T. Por otra parte, como las interacciones carbohidrato-proteína son de baja afinidad pero alta avidez, pentamérica galectina-3 puede tener un mayor tiempo medio de ocupación de

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ligandos sacáridos unidos a un esqueleto del polipéptido, en comparación con la galectina-1. Todos estos factores pueden contribuir a la concentración más baja de la galectina-3 necesaria para disparar la muerte de células T en comparación con la galectina-1. Estos resultados implican que, en el tejido con la expresión tanto de la galectina-3 y la galectina-1, galectina-3 efectos pueden predominar en los sitios donde las concentraciones de los dos galectinas son equivalentes.

Como se muestra en la Tabla I, varias glicoproteínas de células T se eluyeron de la columna de afinidad galectina-3. Las funciones precisas de estas glicoproteínas en la muerte celular galectina-3-inducida siguen siendo desconocidas. Cuatro glicoproteínas que se unía la galectina-3, CD29, CD43, CD45, y CD71, han sido implicados en la apoptosis de células T. Específicamente, Ab entrecruzamiento de CD43, CD45, o CD71, o CD29 de reticulación por la Yersinia proteína invasina todas inducir la apoptosis de células T (45, 46, 47, 48, 49). Sin embargo, mientras que CD29 Abs comandos apoptosis de las células T galectina-3-inducido (20), nuestros datos indican que la expresión de CD29 no es absoluto necesario para la muerte celular (Fig. 8).

Del mismo modo, mientras que CD43 contribuye a la muerte celular galectina-1 inducida (J. Hernández y LG Baum, datos no publicados), CD43 expresión no era necesario para la muerte celular galectina-3-inducida (Fig. 8). Como también hemos observado que la galectina-3 mata a las células murinas BW5147 que no expresan el complejo TCR, esto implica que la cadena TCRβ que fue aislado en la galectina-3 matriz de afinidad (Tabla I ⇑ ) tampoco se requiere para la galectina-3 -la muerte celular inducida. En su lugar, nuestros datos sugieren que CD45 está implicado en la activación de la muerte celular galectina-3-mediada, como las células que carecen de expresión CD45 no fueron susceptibles a la galectina-3, y la restauración de la expresión CD45 restauran la susceptibilidad a la galectina-3 (Fig. 8 ⇑ ) . Por otra parte, se observó agrupación galectina-3-inducida de CD71 (Fig. 9 ⇑ ), lo que sugiere que la galectina-3 de unión a CD71 también está implicado en el envío de una señal de muerte. Es necesario seguir trabajando para aclarar las funciones precisas de CD45 y CD71 en la muerte de galectina-3 inducida.

Identificación de la galectina-3 TCR y la caracterización de la agrupación de receptores no sólo tiene implicaciones importantes para la vía de la muerte galectina-3, sino que también sugiere un mecanismo por el que la galectina-3 puede restringir el TCR contratación en la sinapsis inmunológica (58). Como también aislaron TCRβ de la columna de la galectina-3 afinidad (Tabla I ⇑ ), la interacción de la galectina-3 con TCRβ puede contribuir a establecer el umbral para la respuesta a Ag TCR. Del mismo modo, como la localización de CD71 al anillo periférico de la sinapsis inmunológica se produce durante la activación de células T (66), la galectina-3 agrupamiento de CD71, CD71 prevención de reclutamiento a la sinapsis, también puede contribuir al efecto inhibidor de la MODULO VII

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galectina-3 en TCR de señalización. Alternativamente, la galectina-3 puede formar un enrejado que los enlaces cruzados y restringe el movimiento de muchos receptores diferentes, incluyendo CD29, CD43, CD45, CD71 y TCRβ, para antagonizar la formación de la sinapsis inmunológica.

Aunque receptores de la glicoproteína aguas arriba para la galectina-3 y la galectina-1 son distintos, los mecanismos de aguas abajo de la muerte celular pueden ser comunes, como hemos observado que la muerte de células T inducida por galectina-3 y la galectina-1 no era ni aditivo ni sinérgico (Fig. 4 ⇑ ).

Esto está en contraste con el aditivo o los efectos sinérgicos de la galectina-1 en la muerte celular inducida por Fas CD3 o reticulación (15, 54).

Características comunes de las funciones intracelulares galectina-3 y la galectina-1, siguientes eventos ascendentes distintos no es inusual. Se informaron hallazgos similares para la inducción de estallido respiratorio de neutrófilos por la galectina-3 y la galectina-1. Aunque ambas galectinas inducen la actividad de la NADPH oxidasa de los neutrófilos cebados con una cinética similar, la galectina-1 y galectina-3 subconjuntos distintos de receptores enlazados sobre los neutrófilos para desencadenar una explosión respiratoria (67). ¿Por qué la galectina-1 y galectina-3 tanto en destruir las células T? Tanto la galectina-1 y galectina-3 se expresa abundantemente en varios tejidos, incluyendo el timo y los ganglios linfáticos (4, 24, 39, 57, 68, 69). Aunque un reciente informe señaló que la cantidad de proteína galectina-3 en el total del tejido de los ganglios linfáticos es mucho menor que la cantidad de la galectina1 (57), esta cuantificación no distingue la expresión de distintos tipos de células. Por ejemplo, la fig. 2 demuestra que, como hemos descrito anteriormente, la galectina-1 se expresa abundantemente por las células endoteliales así como otras células en el ganglio linfático (68), mientras que la galectina-3 no se expresa por las células endoteliales. Sin embargo, en la vecindad de las células dendríticas foliculares, células T se encontrarán con abundante galectina-3 y la galectina-1.

Por otra parte, mientras que secretada, galectinas típicamente concentrarse en la superficie de la célula y la matriz locales, el aumento de la concentración local de un galectina por encima de la detectada en homogeneizados de tejido (70). Sin embargo, mientras que las células T se encontrarán con ambas galectinas en varios sitios de tejido, ahora hemos demostrado que la galectina3 y la galectina-1 reconocen diferentes ligandos de oligosacáridos y T glicoproteínas de superficie celular. Por lo tanto, las distinciones sutiles en la expresión del receptor, estequiometría, o glicosilación, así como las diferencias entre las estructuras multiméricas galectina-1 y galectina-3 y los patrones específicos de la célula de expresión, pueden permitir una mayor selectividad en la inducción de la muerte celular en las poblaciones de células T específicas por galectina-1 y galectina-3.

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Nuevos Blancos Moleculares Para el Tratamiento de la Ulcera Péptica

Autor : Lehman FS, Hildebrand P y Beglinger C Titulo original: [New Molecular Targets for Treatment of Peptic Ulcer Disease] Cita : Drugs 63(17):1785-1797, 2003

Si bien se están investigando nuevas sustancias para el tratamiento de las úlceras pépticas, los inhibidores de la bomba de potasio y los antagonistas de los receptores H2 de histamina continúan siendo las drogas de elección.

La presencia de ácido gástrico es uno de los principales factores predisponentes de úlcera péptica. Los inhibidores de la bomba de protones (IBP) y los antagonistas de los receptores H2 de histamina (ARH) son las drogas más usadas en la actualidad, pero su administración a largo plazo puede asociarse con diversos problemas, incluidas la hiperplasia de células tipo enterocromafines (TEC) y la reducción de la eficacia (en el caso de los ARH).

El objetivo de esta revisión fue resumir los conceptos actuales sobre secreción ácida gástrica, y presentar los nuevos compuestos antisecretores antagonistas de la gastrina (AG) y del péptido liberador de gastrina (PLG), así como ligandos de los receptores H3 (LRH3).

FISIOLOGÍA DE LA SECRECIÓN ÁCIDA La secreción ácida gástrica facilita la digestión de proteínas y la absorción de hierro, y evita el sobrecrecimiento bacteriano en el estómago y la primera porción del intestino delgado. Los principales estímulos a la secreción son la acetilcolina, la histamina, y la gastrina. Estas sustancias interactúan con receptores acoplados a dos vías principales de transducción de señales. El efecto estimulador de la histamina se ejerce a través de aumento de la actividad de adenilatociclasa, mientras que el efecto de la acetilcolina y la gastrina es mediado por aumento del calcio citosólico. La gastrina es capaz de inducir secreción de histamina en las células TEC. La vía final común en la secreción ácida es la activación de la bomba H+/K+-ATPasa gástrica.

Los mecanismos reguladores periféricos (neurales, hormonales, paracrinos y autocrinos) son capaces de estimular o inhibir la secreción gástrica, actuando en forma directa en las células parietales. Las neuronas colinérgicas causan estimulación directa de las células parietales por acetilcolina (a través de

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receptores muscarínicos) e indirecta por estimulación de la gastrina y disminución de la secreción de somatostatina.

La úlcera péptica Los pacientes con úlceras duodenales tienen varias anomalías en la secreción ácida. Generalmente secretan mayores cantidades de ácido en ayunas, y tienen una respuesta exagerada ante los alimentos. También presentan mayor capacidad de secretar ácido con máxima estimulación con histamina o pentagastrina. La capacidad secretoria ácida se relaciona con el número de células parietales. Estos pacientes tienen además mayor sensibilidad a la gastrina exógena y un patrón de secreción diferente en respuesta a bombesina.

A diferencia de lo anterior, sólo en una minoría de pacientes con úlcera gástrica hay secreción gástrica aumentada.

JUSTIFICACIÓN DE LA BÚSQUEDA DE NUEVOS BLOQUEANTES ÁCIDOS En la mayoría de los pacientes con úlcera péptica se usan IBP o ARH, pero su uso a largo plazo se asocia con cuatro complicaciones: recidiva de las úlceras aun estando en terapia de mantenimiento con ARH; ambas drogas pueden producir hipergastrinemia que estimulará el crecimiento de las células TEC; estudios en animales sugieren que la inhibición de la H+/K+-ATPasa por omeprazol puede promover la degeneración de células parietales con posterior aumento de esta población; los IBP no son tan eficaces en pacientes H. pylori negativos. Todo esto justifica la búsqueda de terapias alternativas.

Antagonistas del receptor de gastrina (ARG) FARMACOLOGÍA DE LA GASTRINA La principal acción fisiológica de la gastrina es la estimulación de la secreción ácida. La gastrina es producida por las células G antrales. Las proteínas inducen aumento del ARNm de gastrina. Esta es un ligando periférico que actúa en los receptores de colecistoquinina (CCK) 2. Los principales efectos de la gastrina son estimular la producción de ácido directamente en las células parietales, estimular la secreción ácida aumentando la liberación de histamina de las células TEC, y estimular la liberación de somatostatina de las células D. Esta sustancia también afecta la motilidad gástrica y tiene efectos tróficos en varias de las células de la mucosa oxíntica.

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EFECTOS CLÍNICOS DE LOS ARG Proglumide: Es un ARG no selectivo, con menor efecto antisecretorio y antiulceroso que los ARH. L-365260: Es un potente antagonista no péptido, altamente selectivo, de los receptores CCK-2. Inhibe la secreción ácida estimulada por pentagastrina, y mayores dosis podrían inhibir la inducida por histamina, betanecol, y peptona.

En comparación con la cimetidina, es menos potente en la prevención del daño producido por aspirina, pero igual de efectivo en la prevención de úlceras inducidas por cisteamina. No tiene efecto en la secreción ácida basal y tiene escasa biodisponibilidad y vida media corta, por lo que no sería útil en pacientes con enfermedades asociadas con la secreción de ácido.

YM-022: Es un antagonista potente y selectivo de los receptores CCK-2. Inhibe la secreción ácida pero no tiene efecto sobre la producción de ácido inducida por histamina y betanecol, lo que indica su selectividad. Además inhibe la formación de lesiones de la mucosa duodenal y gástrica inducidas por varios factores. Es igual de efectivo que la famotidina y más potente que el omeprazol en la prevención de lesiones inducidas por indometacina, pero menos efectivo que la famotidina e igual de potente que el omeprazol en las lesiones inducidas por mepirizol.

RP-73870: Es un antagonista potente y selectivo del receptor CCK-2. Inhibe no sólo la secreción basal ácida, sino también la inducida por pentagastrina (pero no por histamina). Es activo en el modelo de daño inducido por aspirina, así como en la prevención de las úlceras inducidas por mercaptamina. Es igual de efectivo que el omeprazol y la famotidina en la prevención de úlceras inducidas por mercaptamina.

S-0509: Antagonista potente y selectivo de receptores CCK-2, con efectos antisecretorios y cicatrizantes. Inhibe la secreción ácida basal y disminuye la producción ácida estimulada por pentagastrina y peptona, y posiblemente por carbacol (pero no por histamina). Tiene actividad antiulcerosa potente, previene la formación de úlceras inducidas por mepirizol y promueve la cicatrización de úlceras duodenales preexistentes.

Espiroglumide (CR-2194): Inhibe la secreción ácida estimulada por pentagastrina, por lo que parece ser un antagonista específico. Reduce la acidez intragástrica en el período preprandial y posprandial.

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Itriglumide (CR-2945): Es un antagonista de los receptores CCK-2 con mayor biodisponibilidad que L-365260, e iguales efectos antiulcerosos y antisecretores que esta sustancia, ranitidina y omeprazol. Inhibe la secreción gástrica estimulada por pentagastrina pero no por histamina o carbacol. Es igual de efectivo que la ranitidina en la prevención de úlceras inducidas por indometacina y etanol.

Potencial terapéutico de los ARG Todos parecen tener efectos antisecretores y antiulcerosos. La gastrina podría actuar como factor de crecimiento en varios tejidos y al bloquear este efecto se podría interferir en la cicatrización de la úlcera. Además de reducir la secreción ácida, los ARG podrían tener efecto en el tracto gastrointestinal, ya que se vio que los ratones carentes de receptores CCK-2 tienen vaciamiento gástrico acelerado.

PLG. Farmacología de los péptidos tipo bombesina El péptido de las ranas bombesina, así como su contrapartida en los mamíferos, PLG, se ligan con gran afinidad al mismo subtipo de receptor. Estos péptidos no circulan, sino que actúan de manera neurocrina o paracrina. Su administración exógena libera la mayoría de las hormonas gastrointestinales, incluidas gastrina y somatostatina.

Efectos clínicos de antagonistas de los receptores de PLG Uno de ellos, el BIM-26226, demostró inhibir por completo la secreción de ácido y gastrina. Inhibe la acidez intragástrica basal y posprandial y suprime la producción ácida estimulada por alimentos, lo que indica que es un regulador fisiológico de la secreción ácida gástrica. No tienen efecto sobre los niveles plasmáticos de gastrina en respuesta a los alimentos, ni interfieren con la expresión de ARNm de gastrina o somatostatina en la mucosa gástrica. Se cree que los PLG podrían actuar a nivel de ganglios intramurales del nervio vago, regulando la liberación de acetilcolina, que a su vez estimularía las células parietales. Aún se desconoce si este tipo de drogas pueden o no ser útiles, porque como los péptidos tienen muchos efectos biológicos tendrán también muchos efectos colaterales.

LRH3 Farmacología de los receptores histaminérgicos gástricos H2 La histamina tiene un papel central en la estimulación de la secreción ácida.

Esta sustancia es la principal estimulante de las células parietales. La liberación de histamina se produciría a nivel de las células TEC, y el efecto estimulador se ejercería a través de los receptores H2. Además actuaría con otros secretagogos. Los ARH tienen eficacia limitada ya que se vio recidiva de

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las úlceras aún bajo tratamiento con ARH, hay pacientes con úlceras duodenales que no cicatrizan luego de 12 semanas de tratamiento, y se vio pérdida del efecto luego de 28 días de tratamiento. Por todo esto se empezaron a investigar los LRH3 como drogas antisecretoras.

Receptores en el cerebro Se vio inhibición por retroalimentación de la síntesis y liberación de histamina a nivel de las neuronas histaminérgicas en la corteza cerebral a través de un subtipo del receptor H3.

Química de los LRH3 Los primeros antagonistas de los receptores H3 (burinamide, impromidine) eran no selectivos. Más tarde se desarrollaron otros selectivos, como R-a metilhistamina (agonista) y tioperamide (antagonista).

Distribución de receptores H3 Se los ha encontrado en terminales nerviosas perivasculares y ganglios entéricos, así como en células TEC.

RECEPTORES Y REGULACIÓN DE LA LIBERACIÓN DE HISTAMINA Los receptores H3 de las células TEC podrían actuar como autorreceptores que inhibirían la síntesis y liberación de histamina, igual que lo que ocurre en el cerebro. Se vio que el tioperamide aumenta la liberación basal de histamina, y su efecto se puede evitar con R-a -metilhistamina. También modularían la secreción de histamina estimulada por gastrina.

RECEPTORES Y REGULACIÓN DE LA SECRECIÓN ÁCIDA Se vio que la estimulación de receptores H3 inhibe la secreción ácida estimulada por gastrina, bombesina, 2-desoxiglucosa y alimentos, pero no por histamina. El tioperamide aumenta el efecto inhibidor de 2-desoxiglucosa y pentagastrina. Se desconoce a qué nivel ejercen su acción (central o periférico). En las ratas se vio un efecto estimulante de los receptores H3 en la secreción ácida, posiblemente eliminando la acción inhibidora de la somatostatina.

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Receptores H3 y gastroprotección Se demostró que la R-a -metilhistamina protege la mucosa gástrica de lesiones inducidas por etanol, ácido, aspirina y estrés. Los receptores H3 parecen estar involucrados activamente en el mantenimiento de la integridad de la mucosa gástrica, posiblemente por inhibición de la secreción ácida basal.

¿Los nuevos ligandos de receptores tienen algún papel clínico?

Es poco probable que en un futuro cercano los IBP o los ARH sean reemplazados por las sustancias aquí mencionadas, por las siguientes razones: hasta el momento no se han realizado estudios que comparen la efectividad de IBP y los nuevos compuestos, aunque teniendo en cuenta el mecanismo de acción de estos últimos se podría afirmar que tendrán una eficacia comparable; muchos de estos compuestos son de acción breve, tienen pobre biodisponibilidad, y no se han ensayado en humanos; si bien se publicaron casos aislados de carcinoides en personas que recibieron tratamiento prolongado con drogas inhibidoras de la secreción ácida, en general no existe tal asociación; los efectos de los ligandos de los receptores H3 en la secreción ácida gástrica no están bien caracterizados, y no se sabe con certeza si predominan los efectos inhibidores o estimuladores de la secreción ácida.

Un grupo de pacientes que podrían beneficiarse con el uso de ARG son aquellos con síndrome de Zollinger-Ellison. También serían útiles en sujetos con alteraciones de la motilidad (retardo del vaciamiento gástrico).

Ref: INET, SAMET, FARMACO, GASTRO Resumen objetivo elaborado por el Comité de Redacción Científica de SIIC en base al artículo original completo publicado por la fuente editorial. Sociedad Iberoamericana de Información Científica (SIIC) 2002

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FARMACOLOGÍA Y FARMACOVIGILANCIA MOLECULAR PROGRAMA DE ACTUALIZACIÓN PROFESIONAL

Desarrolle el siguiente cuestionario y entréguelo a nuestras coordinadoras académicas o envíelo a nuestras oficinas de enlace académico a nivel nacional.

CUESTIONARIO VII

1.- Redacte un breve informe sobre sus conclusiones y apreciaciones respecto a las nuevas terapias enfocadas en la farmacogenética y la farmacogénomica.

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