Aplicación de espectrometría de masas dirigida en proteómica ascendente para la investigación en biología de sistemas
Nathan P. Manes y Aleksandra Nita-Lazar
Definición de espectrofotometría de masas
La Espectrometría de masas es una técnica analítica que permite estudiar compuestos de naturaleza diversa: orgánica, inorgánica o biológica (incluyendo biopolímeros y macromoléculas naturales o artificiales) y obtener información cualitativa o cuantitativa. Mediante el análisis por Espectrometría de masas es posible obtener información de la masa molecular del compuesto analizado así como obtener información estructural del mismo, o simplemente detectar su presencia y/o cuantificar su concentración.
Es una técnica analítica que utiliza la relación masa a carga (m/z) para identificar compuestos. El método identifica un compuesto mediante la determinación de su peso molecular y analizando su abundancia isotópica. Un espectrómetro de masas ioniza la muestra en iones gaseosos y luego identifica los iones por sus relaciones masa a carga y abundancia relativa.
Historia de la espectrofotometría de masas
La espectrometría de masas tuvo su origen en los experimentos desarrollados por Joseph John Thomson en el año 1897 al construir el primer espectrómetro de masas, llamado parábola espectrográfica. Thomson observó que al aplicar descargas eléctricas sobre un gas se producían iones y que éstos podían adoptar distintas trayectorias parabólicas de acuerdo con su masa cuando atravesaban un campo electromagnético. Años después uno de sus estudiantes, Francis William Aston, diseñó varios espectrómetros de masas en los que los iones eran separados en función de su masa y detectados según sus diferentes velocidades.
A principios del año 1920, Arthur Jeffrey Dempster, desarrolló un analizador de masas de sector magnético que permitió detectar los iones generados mediante impacto electrónico sobre un colector eléctrico. Este diseño fue adaptado y mejorado por varios científicos como Josef Mattauch, Richard Herzog, Kenneth Bainbridge, Alfred Nier, entre otros, durante los años 1930.
Entre 1930 y 1940 Alfred Nier incorporó la tecnología de vacío y la electrónica para mejorar los primeros espectrómetros de masas, lo que permitió que a finales de los años 40 se comercializarán los primeros espectrómetros de masas.
Componentes técnicos de cualquier espectrómetro de masas
Entre los componentes básicos de un espectrofotómetro de masas cabe destacar:
● Sistema de introducción de muestras
● Sistema de vacío
● Fuente de ionización
● Analizador de masas
● Sistema detector de iones
Joseph John Thomson
Representación gráfica de los métodos de ionización suave para proteínas y péptidos
Cromatografía Líquida (LC) con espectrometría de masas (MS)
LC-MS es una técnica analítica que implica la separación física de compuestos objetivo o analitos seguida de su detección basada en masas. Aunque relativamente nuevo , su sensibilidad, selectividad y precisión la han convertido en una técnica de elección para detectar cantidades de microgramos o incluso nanogramos de una variedad de analitos que van desde metabolitos de fármacos, pesticidas y adulterantes de alimentos, hasta extractos de productos naturales.
LC provoca una separación física de los analitos en una muestra líquida o una solución de una muestra sólida. Se inyectan unos pocos microlitros de solución de muestra en una corriente fluida de un disolvente, llamada fase móvil. Mientras que el volumen de inyección óptimo depende de las condiciones experimentales, es posible inyectar desde 0,1 µL hasta 100 µL de la muestra con precisión utilizando un muestreador automático.
La fase móvil se bombea continuamente a través de una columna de un tubo de acero inoxidable generalmente llena de partículas de sílice recubiertas con otro líquido, la fase estacionaria. Cuando la mezcla de la solución de muestra y la fase móvil llega a la columna, sus componentes interactúan diferencialmente con la fase estacionaria que permanece en la columna dependiendo de su composición química o propiedades físicas. Basado en el mecanismo de interacción entre el analito y la fase estacionaria, las separaciones LC se han clasificado en diferentes modos, como :
● Cromatografía de partición
● Cromatografía de intercambio iónico
● Cromatografía de exclusión por tamaño
● Cromatografía de afinidad
Detección de LC
La fase móvil que sale de la columna el eluyente pasa a través de un detector que "responde" a una determinada propiedad física o química, como el índice de refracción o la absorción de luz, de los analitos que contiene. Esta respuesta se captura como una señal o un "pico" cuya intensidad área del pico o altura del pico corresponde a la cantidad del componente presente en la muestra. El momento en el que el detector "ve" el analito es su RT La identidad de un compuesto en una muestra se puede confirmar comparando su RT con el RT de un compuesto conocido.
Uso de MS para detección de LC
Mientras que el sistema LC funciona a presiones ambientales, el espectrómetro de masas funciona al vacío y los dos se acoplan a través de una interfaz. El eluyente de la columna fluye hacia la interfase, el solvente se evapora aplicando calor y las moléculas de analito se vaporizan y ionizan . Este es un paso crucial ya que el espectrómetro de masas sólo es capaz de detectar y medir los iones de la fase gaseosa.
Los iones del analito se introducen en el espectrómetro de masas donde están sujetos a campos eléctricos y / o campos magnéticos. Las trayectorias de vuelo de los entre
Trazado de datos LC-MS
La abundancia de los iones medidos durante el análisis de una muestra por LC-MS se representa como un cromatograma de iones totales TIC. Este gráfico muestra la intensidad de los picos de los iones del analito frente a su RT Además, cada punto del cromatograma está asociado con un espectro de masas. El espectro de masas representa las abundancias de iones frente a los valores m / z medidos.
Análisis de resultados
Se utilizaron dos herramientas para la identificación de péptidos como tándem MS y SEQUEST, en el artículo específicamente se utilizó para identificar los péptidos que contienen d-Asp en el suero humano.
Los autores emplearon dos métodos para detectar e identificar los péptidos que contienen d-ASp:
● Empleando diastereómeros
Consiste en hidrolizar los péptidos, derivatizar los aminoácidos a diastereoisómeros y separarlos por RP-HPLC.
● Método de LC-MS/MS
Consiste en separar los péptidos por una columna C18 y analizarlos por espectrometría de masas con un sistema de trampa iónica.
En los resultados se encontraron dos péptidos que contienen d-Asp, ambos derivados de la cadena β del fibrinógeno, sus secuencias son:
QGVNDNEEGFFSAR y QGVNDNEEGFFSA, estos péptidos con d-Asp encontrados en las muestras de los donantes de 20 y 40 años tenían las mismas masas. Los autores del artículo para la identificación de proteínas o modificaciones postraduccionales presentes en la muestra del estudio utilizaron dos programas.
Proteome Discoverer 1.0: Un programa que identifica la secuencia de péptidos a partir de secuencias en bases de datos de proteínas.
SEQUEST: Compara los espectros de masa en tándem observados con los espectros teóricos generados a partir
Gráfico de salida de ejemplo del análisis LC-MS Crédito: Daniel Norena-Caro, reproducido bajo Creative Commons CC0 1 0 Dedicación de dominio público universal licencia
de una base de datos de proteínas y asigna un puntaje en relación cruzada a cada coincidencia.
Dos ejemplos de aplicaciones en proteómica
La EM tiene una alta relevancia en la proteogenómica cuando se trata de la anotación de secuencias codificantes. Se aproxima que el 18% del proteoma humano se clasifica como “desaparecido” ya que no hay ninguna evidencia experimental que sostenga la existencia de las proteínas faltantes. Para resolver y afrontar esta situación, el Proyecto Proteoma Humano agregando la proteómica dirigida y otras tecnologías de gran renombre las cuales han identificado con gran seguridad cientos de proteínas que antes no observábamos. Una de las estrategias que han sido utilizadas, es desarrollar ensayos LC-SRM las cuales usan estándares de péptidos sintetizados y tiempo después, usan estos ensayos LC-SRM para analizar muestras biológicas, estas son seleccionadas porque expresan altos niveles del transcrito correspondiente. Gracias a la gran sensibilidad y especificidad de la EM dirigida, estos esfuerzos a menudo han tenido éxito.
Un ejemplo de ello podría ser la utilización LC-MS y LC-SRM para identificar y cuantificar pequeños polipéptidos codificados en marco de lectura abierto dentro de células cancerosas humanas.
La proteómica dirigida se ha utilizado junto con otras tecnologías para la estimación de la abundancia absoluta del proteoma.
En ocasiones la transcripción y la abundancia de proteínas que contiene el proteoma están significativamente correlacionadas y, para resolver esta cuestión se ha utilizado proteómica dirigida junto con transcriptómica para estimular la abundancia de proteínas a partir de la abundancia de transcripción. La estimación de la abundancia de proteínas utilizando proteómica dirigida integrada con transcriptómica global necesita que aquellas proteínas objetivo oscilan en abundancia en muchos órdenes de magnitud. Últimamente, la LD-MS dirigida se ha convertido en una tecnología que tiene la capacidad de investigar y reconocer toda la proteómica y en la actualidad se han analizado casi en su totalidad los proteomas de cuatro especies: Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pyogenes , Saccharomyces cerevisiae y Homo sapiens. Se realizó una segunda investigación de todo el proteoma humano, en el cual se utilizaron 18,081 proteínas recombinantes para desarrollar con éxitos ensayos LC-SRM para la aparición de 16,018 proteínas. Los autores usaron este recurso para cuantificar 634 enzimas para estudiar los efectos de la oncogénesis en las vías metabólicas. Debido a que el desarrollo de un ensayo LC-MS dirigido puede ser muy exigente y puede llevar mucho tiempo, pero el desarrollo de ensayos de proteínas humanas en todo el proteoma ha resultado favorable en la accesibilidad de esta poderosa herramienta
que pueden usar los científicos en un amplio espectro de campos de investigación biomédica que le pueden servir al ser humano.
Conclusión
La proteómica ha evolucionado mucho más allá de la elaboración de perfiles proteómicos básicos utilizando DDA LC-MS. La proteómica dirigida se ha utilizado para cuantificar de forma sólida la abundancia, síntesis, degradación, PTM y otras modificaciones químicas de las proteínas. Además, las aplicaciones proteogenómicas tienen la función de identificar isoformas de empalme, polimorfismos de aminoácidos individuales y otras variantes genéticas, así como la identificación de proteínas que faltan y la cuantificación de la regulación de la expresión de proteínas a nivel ADN y ARN, como por ejemplo la interferencia de ARN. En el trabajo, la proteómica funcional tiene como propósito la inclusión cinómica y ensayos de actividad enzimática relacionados con la modificación de proteínas como es la fosforilación, proteólisis, etc. Además se introdujo la medición de la conformación de proteínas, interacción proteína-proteína, interacción de las proteínas con otras moléculas y proximidad subcelular de proteína-proteína. Estas tecnologías nos facilitan el mapeo, la simulación y la ingeniería de rutas biológicas, y la interesante combinación de la proteómica dirigida integrada con otras tecnologías como la transcriptómica y la metabolómica, las cuales han sido especialmente funcionales y productivas. La proteómica dirigida ha surgido como una tecnología poderosa por los grandes resultados que ha dado, ya que ha desarrollado ensayos LC-SRM para casi todo el proteoma humano, y gracias a estos resultados, se puede llegar a aplicar en distintas ramas de la medicina, como es la biomedicina. Pero también sirve y ofrece grandes aportaciones a las aplicaciones clínicas, la investigación y al gran desarrollo que está teniendo la biotecnología, convirtiéndola en una herramienta eficaz y eficiente para la humanidad.
Referencias
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https://www.news-courier.com/analysis/articles/lc-ms-what-is-lc-mslc-ms-analysis-and-lc-msms-348238
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Sigmaaldrich.
