Real time PCR Tato technika umožňuje přesně zjistit počet kopií určitých sekvencí nukleové kyseliny v buňkách a tkáních. To je důležité v mnoha oborech medicíny i buněčné biologie, např. při zjištění hladiny virové infekce, počtu kopií amplifikovaného onkogenu v nádorových buňkách nebo změny v hladině specifické mRNA při embryogenezi apod. Konvenční metody jako je Southern a Northern blotting nebo PCR jsou pro tento účel použitelné, ale jsou nepřesné. Real time PCR umožňuje monitorovat množství produktu DNA v každém cyklu PCR. Kvantifikace molekul RNA vyžaduje vytvoření cDNA reverzní transkripcí. K monitorování syntézy PCR produktu je možné použít několik metod, které využívají fluorescenci. Reakce se odehrává v modifikovaném termálním cykleru se zakomponovaným spektrofotometrem, který měří fluorescenci v PCR (Obr. 7.54) DNA čipy Jednou z nejslibnějších moderních metod detekce mutací je použití DNA čipů (DNA chips, microarrays) (viz Kap. 7.4). Mají mnoho vhodných vlastností včetně miniaturizace a využití automatického počítačového hodnocení výsledků. Umožňují rychlou analýzu velkého počtu mutací v jedné reakci. b) Metody detekce specifických mutací Vyšetření vzorku DNA na přítomnost známé specifické mutace je jednodušší než vyhledávání neznámé mutace v genu. Metody, které umožňují určit specifickou mutaci lze použít u těch onemocnění, kde má většina postižených osob v populaci jednu nebo omezený počet mutací. Příkladem takových onemocnění je srpkovitá anemie, kde se vyskytuje v 6. kodonu beta – globinového genu substituce A>T (GAG → GTG), cystická fibrosa s nejčastější mutací v evropských populacích – delta F508 v genu CFTR, achondroplasie s mutací v kodonu 380 (G380R) genu FGFR3 (Fibroblast Growth Factor Receptor). Mezi použitelné metody patří: Mutačně specifický polymorfismus v délce restrikčních fragmentů (PCR -RFLP) V některých případech mutace vytváří nebo ruší restrikční místo pro určitý restrikční enzym a zároveň je příčinou onemocnění. Metodou PCR je amplifikován úsek DNA s restrikčním místem, následuje restrikce specifickým restrikčním enzymem a gelová elektroforéza. Velikost produktů PCR zjištěná na gelu odhalí přítomnost nebo absenci mutace v dané sekvenci. ASO Alelně specifické oligonukleotidy (ASO – Allele-Specific Oligonucleotide probes) jsou syntetizovány k detekci bodové nukleotidové diference v sekvenci DNA. Jsou to krátké řetězce 15–19 nukleotidů komplementární k části sekvence genu, která obsahuje místo se záměnou nukleotidu. Po označení (radioaktivně izotopem P32) je lze použít jako krátké sondy DNA, které hybridizují s amplifikovanou cílovou DNA. Používají se obě možné sekvence ASO dané oblasti: komplementární k standardní DNA a k mutantní sekvenci DNA. Každá sonda je hybridizována s testovanou DNA separátně. Lze využít klasického postupu Southernovy hybridizace nebo bodové hybridizace (dot-blot). Bodová hybridizace spočívá v tom, že na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu je nanesen vodný roztok testované DNA a vysušen. Po denaturaci a hybridizaci se značenou sondou následuje autoradiografie. Při dodržení přesných hybridizačních podmínek umožňuje použití ASO hybridizaci s komplementární DNA, zatímco s DNA v níž je bodová mutace (mismatch) k hybridizaci nedochází.
Existují i metody, které využívají alelně specifické primery pro PCR. c) Diagnostika expanze trinukleotidů Některé choroby člověka souvisejí s expanzemi trinukleotidových sekvencí (viz Kapitola 7.7). DNA diagnostika v případě Huntingtonovy choroby (HD) spočívá v amplifikaci (PCR) oblasti genu, kte98 /