Real time PCR Tato technika umožňuje přesně zjistit počet kopií určitých sekvencí nukleové kyseliny v buňkách a tkáních. To je důležité v mnoha oborech medicíny i buněčné biologie, např. při zjištění hladiny virové infekce, počtu kopií amplifikovaného onkogenu v nádorových buňkách nebo změny v hladině specifické mRNA při embryogenezi apod. Konvenční metody jako je Southern a Northern blotting nebo PCR jsou pro tento účel použitelné, ale jsou nepřesné. Real time PCR umožňuje monitorovat množství produktu DNA v každém cyklu PCR. Kvantifikace molekul RNA vyžaduje vytvoření cDNA reverzní transkripcí. K monitorování syntézy PCR produktu je možné použít několik metod, které využívají fluorescenci. Reakce se odehrává v modifikovaném termálním cykleru se zakomponovaným spektrofotometrem, který měří fluorescenci v PCR (Obr. 7.54) DNA čipy Jednou z nejslibnějších moderních metod detekce mutací je použití DNA čipů (DNA chips, microarrays) (viz Kap. 7.4). Mají mnoho vhodných vlastností včetně miniaturizace a využití automatického počítačového hodnocení výsledků. Umožňují rychlou analýzu velkého počtu mutací v jedné reakci. b) Metody detekce specifických mutací Vyšetření vzorku DNA na přítomnost známé specifické mutace je jednodušší než vyhledávání neznámé mutace v genu. Metody, které umožňují určit specifickou mutaci lze použít u těch onemocnění, kde má většina postižených osob v populaci jednu nebo omezený počet mutací. Příkladem takových onemocnění je srpkovitá anemie, kde se vyskytuje v 6. kodonu beta – globinového genu substituce A>T (GAG → GTG), cystická fibrosa s nejčastější mutací v evropských populacích – delta F508 v genu CFTR, achondroplasie s mutací v kodonu 380 (G380R) genu FGFR3 (Fibroblast Growth Factor Receptor). Mezi použitelné metody patří: Mutačně specifický polymorfismus v délce restrikčních fragmentů (PCR -RFLP) V některých případech mutace vytváří nebo ruší restrikční místo pro určitý restrikční enzym a zároveň je příčinou onemocnění. Metodou PCR je amplifikován úsek DNA s restrikčním místem, následuje restrikce specifickým restrikčním enzymem a gelová elektroforéza. Velikost produktů PCR zjištěná na gelu odhalí přítomnost nebo absenci mutace v dané sekvenci. ASO Alelně specifické oligonukleotidy (ASO – Allele-Specific Oligonucleotide probes) jsou syntetizovány k detekci bodové nukleotidové diference v sekvenci DNA. Jsou to krátké řetězce 15–19 nukleotidů komplementární k části sekvence genu, která obsahuje místo se záměnou nukleotidu. Po označení (radioaktivně izotopem P32) je lze použít jako krátké sondy DNA, které hybridizují s amplifikovanou cílovou DNA. Používají se obě možné sekvence ASO dané oblasti: komplementární k standardní DNA a k mutantní sekvenci DNA. Každá sonda je hybridizována s testovanou DNA separátně. Lze využít klasického postupu Southernovy hybridizace nebo bodové hybridizace (dot-blot). Bodová hybridizace spočívá v tom, že na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu je nanesen vodný roztok testované DNA a vysušen. Po denaturaci a hybridizaci se značenou sondou následuje autoradiografie. Při dodržení přesných hybridizačních podmínek umožňuje použití ASO hybridizaci s komplementární DNA, zatímco s DNA v níž je bodová mutace (mismatch) k hybridizaci nedochází.
Existují i metody, které využívají alelně specifické primery pro PCR. c) Diagnostika expanze trinukleotidů Některé choroby člověka souvisejí s expanzemi trinukleotidových sekvencí (viz Kapitola 7.7). DNA diagnostika v případě Huntingtonovy choroby (HD) spočívá v amplifikaci (PCR) oblasti genu, kte98 /
rá obsahuje repetice (CAG)n a elektroforéze produktů PCR v polyakrylamidovém gelu. Počet těchto repetic souvisí s rozvojem onemocnění. Při použití vhodného velikostního markeru lze odečíst počet repetitivních jednotek (počet 40 až více než 100 repetic odpovídá plné mutaci). Syndrom fragilního X je podmíněn expanzí repetice CGG. Při DNA diagnostice tohoto syndromu lze PCR použít jen pro detekci standardních nebo premutantních alel. Plné mutace jsou velmi dlouhé (stovky a tisíce CGG repetic) a mají vysoký obsah GC, proto se špatně amplifikují. Jsou proto detekovány postupem Southernovy hybridizace.
7.9.3 Závěr Oba metodické přístupy k DNA diagnostice jsou stále aktuální. Volba postupu při DNA diagnostice v konkrétních rodinách závisí na mnoha okolnostech. Nepřímá DNA diagnostika vyžaduje přesnou klinickou diagnózu (aby byl vyšetřen správný gen). Poskytuje výsledek v relativně krátké době, což může být významné např. při prenatální diagnostice. V řadě případů nemusí klinický lékař znát povahu konkrétní mutace, stačí je-li informován, zda osoba v riziku mutaci zdědila či nikoliv. Nezbytnou podmínkou provedení nepřímé DNA diagnostiky je získání vzorků DNA ostatních členů rodiny, což někdy bývá obtížné. Přímá DNA diagnostika je v současné době preferovaná, protože umožňuje stanovit přesně místo a typ mutace způsobující onemocnění. Rovněž odpadá řada problémů provázejících přístupy nepřímé diagnostiky, jako je nutnost vyšetřit vzorky DNA mnoha členů rodiny, neinformativnost markerů a možnost rekombinace. Mutace zachycená metodami přímé DNA diagnostiky je porovnána s popsanými mutacemi vyšetřovaného genu v dostupných databázích. Mutace typu frameshift a nonsense jsou považovány za mutace kauzální. V případě dosud nepopsané missense mutace je nutné ověřit, zda je skutečně příčinou onemocnění nebo zda se jedná o neškodný polymorfismus. Jedním z přístupů je ověření segregace mutace v rodině (pak je nutné rovněž vyšetřit co největší počet zdravých i nemocných jedinců v rodině), dále vyšetření kontrolního vzorku osob nebo další moderní expresní a funkční testy. DNA diagnostika je význačným přínosem péče o pacienty a nositele mutovaných alel. Přináší ovšem řadu etických problémů, které je třeba řešit (viz připravovaný Díl III; Kapitola Klinická genetika). Na základě jejích výsledků je možné provést včasné preventivní zákroky u osob v riziku v období, kdy se u nich onemocnění ještě neprojevuje, ale nosičství alely je prokázáno. Neméně významný je i vztah identifikované mutace k stanovení prognózy a volbě terapie onemocnění. Naopak osoby s prokázanou standardní alelou jsou zbaveny strachu a úzkosti z rozvoje onemocnění.
7.10 Genetické manipulace a genová terapie Rychlý rozvoj biotechnologií umožnil provádět genetické manipulace kultivovaných buněk nebo pokusných živočichů a tím i výzkum životních jevů včetně procesů, které vedou k nemoci. Genetické manipulace úzce souvisejí s přenosem genu (specifických sekvencí DNA) do buněk, což je využíváno zejména ke studiu genové exprese a funkce, k vytváření modelů lidských onemocnění u živočichů, k produkci rekombinantních proteinů a v neposlední řadě i genové terapii. Sekvence DNA, která je vnesena do buněk se nazývá transgen. Pokud je gen přenesen do buněk, které vytvářejí zárodečnou linii vzniká transgenní organismus, tzn., že všechny jeho buňky obsahují vnesený gen. Plně transgenní organismus vzniká z transgenní zygoty. Její vznik je umožněn vnesením genu do zárodečných buněk, do gamet nebo do oplozeného vajíčka (před 1. dělením zygoty). Další možností je vnesení DNA do buněk embrya v časném stádiu vývoje (po 1. dělení zygoty), tak aby buňky z nichž vznikají zárodečné buňky obsahovaly transgen. Pak vzniklý organismus vytváří transgenní gamety a další generace jsou plně transgenní. Genetická modifikace savců může spočívat i v tzv. klonování. Jeho podstatou je přenos jádra somatické buňky dospělého organismu do oocytu, ze kterého bylo původní jádro odstraněno. Implantace oocytu do dělohy pokusného zvířete a jeho další vývoj vede také ke vzniku geneticky modifikovaných 99 /
organismů (GMO) (ovce Dolly, r. 1997). Tyto pokusy mimo jiné ukázaly, že genomy buněk dospělého organismu mohou být reprogramovány vlivem oocytu a stávají se opět totipotentními.
7.10.1 Přenos genu a jeho využití Gen může být vpraven do buněk různými cestami prostřednictvím vektorů virové i nevirové povahy (viz Kapitola 7.10.2). Osud transgenu závisí na mnoha faktorech včetně na vlastnostech vektoru. Může integrovat do genomu buněk a stát se jeho trvalou součástí s dlouhotrvající expresí nebo není začleněn do genomu buněk a jeho přítomnost a exprese je přechodná. Využití 1. Vnesení nového funkčního genu za účelem korekce defektního genotypu 2. Vytváření zvířecích modelů lidských onemocnění vnesením genu s definovanou mutací nebo zrušením exprese endogenního genu (genový knockout). Tyto modely jsou pro lékařský výzkum nesmírně důležité. Jako příklad lze uvést myší modely cystické fibrózy, beta-thalassemie, hypecholesterolemie, syndromu fragilního X a další. V obou případech je cílem náhrada určitého endogenního genu genem novým, nikoliv pouze vnesení nového genu a ponechání původního. To je umožněno procesem homologní rekombinace inserčního vektoru s příslušným lokusem. Předpokladem vytvoření vhodného inserčního vektoru je nejen znalost sekvence genu ale i sekvencí, které ho obklopují, a které by měly být identické se sekvencemi lokusu původního genu. Dosud ne zcela známým mechanismem (asi podobným procesům při meióze nebo mitóze) nalezne umělý konstrukt cílové místo a mezi homologními sekvencemi dojde k rekombinaci. 3. Přenos sekvence DNA může způsobit inhibici exprese genu. Jsou to sekvence, které nekódují protein, ale jejich produkt inhibuje expresi genu: např. „antisense“ RNA, dsRNA, malé interferující RNA (siRNA) a ribozymy. a) Na úrovni transkriptu může dojít k inaktivaci specifické mRNA vpravením „antisense“ RNA nebo antisense nukleotidů. Většinou má vpravení takové sekvence pouze přechodný efekt. Řešením by bylo vpravit transgen, který by produkoval antisense RNA konstitutivně. b) Ribozymy jsou RNA enzymy, které štěpí RNA molekuly. Existuje řada důkazů o tom, že molekuly RNA mají enzymatickou aktivitu, která se uplatňuje např. v komplexu telomerasy, RNA a specifických proteinů, při sestřihu RNA na hranicích exonu a intronu apod. Zejména schopnost štěpit cílovou RNA ve specifických sekvencích začala být experimentálně využívána při genové terapii. c) RNA interference (RNAi) RNA interference je jedním z mechanismů regulace genové exprese. Ukázalo se, že přítomnost krátkých molekul dsRNA v buňce má schopnost potlačit expresi genu. Reakce je specifická, neboť je inhibován gen, který nese sekvenci nukleotidů komplementární k dsRNA. Podstata tohoto jevu byla objevena u Caenorhabditis elegans (Nematodes), je to však vysoce konzervovaný proces, který existuje i u savců včetně člověka. RNA interference je komplexní proces. U C. elegans se dsRNA váže na proteinový komplex zvaný Dicer (specifická endonuklesa), který ji rozštěpí na menší fragmenty (siRNA – small interfering RNA) dlouhé 21–25 bp. Fragmenty jsou navázány na korespondující mRNA a vytvoří komplex, kde pracuje sekvenčně specifická RNA endonukleasa zvaná RISC (RNA Induced Silencing Complex). Navázaná mRNA je rozštěpena a degradována a nedochází proto k translaci a tvorbě proteinu (Obr. 7.55). U člověka se nevyskytuje komplex Dicer a RISC, ale v lidském genomu existují stovky genů, které kódují malé molekuly RNA, tzv. mikroRNA. Jsou to malé molekuly jednovláknové RNA (cca 22 nt), které fungují jako antisense regulátoři genů. Váží se na komplementární sekvence mRNA cílových genů a inhibují translaci. Tohoto jevu je možné využít k inhibici specifických genů. 4. Nejčastěji se transgen integruje na náhodné místo v genomu buňky a může tak rozrušit gen v daném místě a tudíž i jeho funkci – dochází k tzv. inserční mutagenezi. 100 /
Ukázka elektronické knihy