Sítnice (Ukázka, strana 99)

Sítnice

3

(NIH) přibližně 1 800 klinických studií zabývajících se problematikou genové terapie. Hlavními třemi oblastmi výzkumu byla kardiologie, onkologie a monogenní choroby. Hereditární oční nemoci zaujímaly 1,3 % všech onemocnění (43).

Genovou terapii lze zjednodušeně charakterizovat snahou o jednorázovou korekci chybného genu, kdy je do buňky vložena genetická informace, která vyvolá reakce vedoucí k prevenci či léčbě onemocnění, nebo dochází k modulaci genetických procesů v buňce, či terapie ovlivní přímo opravu chybného genu. Samozřejmě základním předpokladem je, že jsme schopni přesně identifikovat chybný gen, máme k dispozici fungující gen a umíme ho dopravit na místo nebo utlumíme či zmírníme aktivitu tohoto chybného genu. Nukleová kyselina sama o sobě nemá schopnost procházet buněčnou membránou, proto potřebuje vektor, který ji dopraví na místo. Výzkum se tedy nejprve obrátil na to, jak technicky dostat cizí DNA do hostitelské buňky. Zejména aby došlo k zacílení na specifické buňky, byla možnost přenosu i velkých genů a vyhnuli jsme se zabudování genu mimo specifický cíl. Současně jsou kladeny nároky na to, aby nebyla vyvolána imunitní a zánětlivá odpověď organismu. Vektory v obecné rovině dělíme na virové a nevirové. Nejvíce se uplatnily v klinických studiích virové vektory zejména adenovirus a lentivirus (retrovirus), dále jsou často používány adenovirus associated virus (AAV) a herpes simplex virus (HSV). Z virových částic jsou odstraněny geny, které souvisí s patogenitou a množením virových částic (44).

Prvními nemocemi, u kterých je schválená a používána genová terapie, jsou např. cystická fibróza (některé mutace), spinální svalová atrofie, dále beta talasemie, metachromatická leukodystrofie a deficit adenozin deaminázy (SCID – severe combined imunodeficiency syndrome). Z hereditárních očních onemocnění je to retinální dystrofie (Leberova kongenitální amauróza – LCA) způsobená mutacemi v genu RPE65. Jedná se o preparát Voretigen Neparvovec, Luxturna. Genová terapie je také používána k modifikaci imunitních buněk k rozpoznání specifické infekce či nádorových buněk.

3.4.1 Historie genové terapie u onemocnění sítnice Prvním pokusem byl myší model s retinitis pigmentosa (defekt v β podjednotce cGMP fosfodiesterázy-βPDE), kdy byl subretinální injekcí transferován gen pomocí adenovirového vektoru (Bennerr a Maguire).

82

Dále bylo pokračováno stejnou technikou na psech briardech v roce 2001 (léčba LCA). Léčba Leberovy kongenitální amaurózy měla úspěch a v letech 2008 a 2009 proběhla I. fáze studie u dětí s LCA. U všech 12 pacientů došlo k signifikantnímu zlepšení zrakové ostrosti. V prosinci roku 2017 byla tato genová terapie uznána FDA (Food and Drug Administration USA) k léčbě pacientů s LCA2 ve Spojených státech amerických (43). V dalších letech byl zaznamenán obrovský nárůst klinických studií na poli i dalších retinálních onemocnění. Sítnicová onemocnění jsou klinicky heterogenní skupinou, kde bylo identifikováno mnoho genů, které zasahují do buněčných mechanismů (ovlivňují metabolismus, vedou k poruchám v retinoidovém cyklu, ciliárním dyskinezím, poruchám v transportu bílkovin), což vede následně k poruše zraku (obr. 3.15).

3.4.2 Princip a metody genové terapie Oko je relativně malý a uzavřený kompartment, tzn. nízké dávky a riziko systémové reakce je zanedbatelné (tzv. immune privileged status) (45). Dalšími výhodami je také to, že oko je dobře přístupné k aplikaci léčby a že buňky sítnice po narození již neproliferují, tzn. jedna aplikace má dlouhodobý efekt. Navíc oči jsou párový orgán, tzn., že léčbu lze nejprve vyzkoušet na jednom oku, a tak posoudit její účinnost a bezpečnost.

Genová terapie modifikuje defektní DNA v buňkách příjemce nebo tkáních k dosažení požadovaného terapeutického efektu. Zahrnuje kopii wild type genu, promotoru, který kontroluje genovou expresi v cílových buňkách a vektor. Vektory se používají k přenosu do cílových buněk (tzv. transdukce), cílem je zasáhnout co největší množství cílových buněk. Z virových vektorů se, jak již bylo zmíněno na začátku této kapitoly, využívá adenovirů patřících do rodiny DNA virů, které mohou infikovat klidovou buňku, dělící se buňky a replikovat se v hostitelské buňce bez integrace do genomu hostitele. Adenoviry se v současnosti v klinických studiích vy­užívají v terapii retinoblastomu, jinak se u očních onemocnění nyní nepoužívají, protože vyvolávaly imunitní reakci, která způsobovala zánět a eliminaci transdukovaných buněk (46, 47).

Při použití adenoviru byly hlášeny závažné vedlejší účinky a úmrtí pacienta se systémovou horečkou a poškozením jater v klinické studii metabolického onemocnění (48). Z dalších vektorů jsou to tzv. adenoassociated viry (AAVs), jsou to defektní jednořetězcové DNA parvoviry s více než 20 integračními místy do lidského genomu, v současnosti asi nejpoužívanější vektory v genové terapii

Genetika a genová léčba chorob sítnice

3

Obr. 3.15 Retinoidový cyklus 11-cis-Ral – 11-cis-retinal, 11-cis-RDH – 11-cis-retinol dehydrogenáza, 11-cis-Rol – 11-cis-retinol, ABCR – transportér vázající ATP pro fotoreceptorové buňky, at-Ral – all-trans-retinal, at-Rol – all-trans-retinol, CSNB – kongenitální stacionární noční slepota (congenital stationary nocturnal blindness), Gt aktivace – aktivace G proteinu, IPM – interfotoreceptorová matrix, IRBP – interfotoreceptor retinoid vázající protein (interphotoreceptor retinoid-binding protein), LCA – Leberova kongenitální amauróza, LRAT – lecithin retinol acyltransferáza, RDH12 – retinoldehydrogenáza 12, ROS – zevní segmenty tyčinek, RP – retinitis pigmentosa, RPE – retinální pigmentový epitel, RPE65 – retinoidová izomeráza RPE65, VPMD – věkem podmíněná makulární degenerace očních onemocnění. Nevýhodou je, že nemohou být použity u onemocnění, které jsou kódovány velkými geny, např. u Usherova syndromu (49).

Dále jsou používány lentiviry, jde o jednovláknové retroviry ribonukleové kyseliny s větší kapacitou (ABCA4, MYO7A). Nevirové vektory jsou výhodnější vzhledem k nelimitující kapacitě přenosu, simultánnímu přenosu více terapeutik, nízkou imunogenicitou a nízkými náklady na výrobu. Nevirové systémy užívají fyzikálních a chemických procesů, aby se dostaly do DNA. Chemické

systémy zahrnují přenos na bázi lipidů, polymerů nebo peptidů pronikajících do buněk. Tvoří nanokomplexy s genetickým materiálem a pronikají přes buněčnou membránu, nebo mohou být endocytovány (50). Tyto komplexy také chrání genetický materiál před předčasnou degradací. Bylo prokázáno, že nanočástice nesoucí genetický materiál účinně přecházejí přes vnější sítnici, pokud jsou subretinálně injikovány (50, 51).

Fyzikální metody jsou variabilnější a technicky vy­ užívají různé přístupy k usnadnění dodávání genetického

83

Sítnice

3

materiálu do buněk. Příkladem jsou elektrické impulzy, ultrazvuk, magnetická pole, tzv. genová děla a lasery (50, 51). Elektrotransfekce je nevirová metoda genové terapie, která využívá vysokonapěťové krátké elektrické pulzy, jež zvyšují propustnost buněčné membrány pro genetický materiál. Prozatím neexistují žádné publikace týkající se bezpečnosti elektrotransfekce u lidského oka. V různých skléra choroidea sítnice

A

intravitreální aplikace

zrakový nerv

subretinální aplikace

B

C

suprachoroideální aplikace

Obr. 3.16 Aplikace genové terapie intravitreální (A), subretinální (B) suprachoroidální (C) injekcí

studiích provedených na králících a hlodavcích nebyly hlášeny žádné problémy (52–55). Pooperační zánět nebylo možné přesně posoudit, protože studie byly provedeny na zvířecích modelech s nitroočním zánětem. Studie však prokázaly, že elektrotransfekce byla v těchto modelech účinná při utlumování zánětu oka (52–55).

Mezi hlavní výhody nevirových metod patří nižší riziko imunitní odpovědi a inzerční mutageneze (protože většina se neintegruje s chromozomy), schopnost dodat velké množství genetického materiálu a snadnost produkce. Za hlavní nevýhodu této metody lze považovat krátkodobou expresi transdukovaného genetického materiálu (50, 55).

3.4.3 Aktuality v genové terapii a přínos do budoucna Při léčbě onemocnění sítnice se k aplikaci užívají subretinální či intravitreální injekce. Aplikace do sklivce je méně invazivní pro sítnici, ale účinnost je větší při subretinálním podání. Nevýhodou u intravitreální injekce je možné větší riziko nežádoucích účinků, zejména imunitní odpovědi. Suprachoroidální podávání je potenciál­ ně jednodušší a bezpečnější přístup k podávání genové terapie, ale další studie musí teprve určit jeho bezpečnost, pokud jde o imunitní a zánětlivé reakce (obr. 3.16).

Způsob podání genové terapie stejně jako základní oční patologie ovlivňují pooperační zánětlivé a imunitní reakce. Klíčové rozdíly mezi různými typy způsobů podávání genové terapie shrnuje tabulka 3.8.

V současné době (rok 2023) lze dohledat na stránkách https://clinicaltrials.gov/ přes 150 studií spojených s očními onemocněními, které právě probíhají, pokračují nebo jsou ukončeny. Mnoho z těchto studií se zabývá makulární degenerací sítnice v dospělosti či Leberovou hereditární atrofií optiku (mutace CEP290, RPE65). Dále probíhají např. studie s X-vázanou retinoschisis spojené s mutacemi v genu RS1, RHO – retinitis pigmentózou, X-vázaná RP (RPGR), retinitis pigmentózou způsobenou patogenními variantami v genech PDE6A, PDE6B, RLBP1, MERTK, Usherovým syndromem (MYO7A), Stargardtovou chorobou, achromatopsií. Probíhající aktivní studie přehledně znázorňuje tabulka 3.9.

Závěrem lze říct, že zlepšení diagnostiky a identifikace genů zapříčiňujících onemocnění je důležité pro pochopení a rozšíření znalostí o patogenezi jednotlivých očních onemocnění, a do budoucna samozřejmě tak i povede ke zlepšení možnosti terapií očních onemocnění včetně genové terapie.

84 Ukázka elektronické knihy