7.4 MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKA FISH (fluorescenční in situ hybridizace) FISH je kombinací metod klasické cytogenetiky a molekulární genetiky. Používá fluorescenčně značené sondy (fragmenty DNA). Proces probíhá ve dvou krocích, nejprve je provedena tepelná denaturace DNA i sondy a poté následuje hybridizace. Krátké sondy se na principu komplementarity navazují k cílové sekvenci DNA (viz Molekulární genetika). Po odmytí nenavázané sondy následuje hodnocení pomocí fluorescenčního mikroskopu. Jednotlivé typy sond se navzájem liší tím, na jakou oblast chromosomu se navazují. Rozlišujeme centromerické, telomerické, lokus specifické a celochromosomové sondy. Některé typy sond můžeme použít jak na chromosomy v metafázi, tak na interfázní jádra. Příkladem jsou centromerické sondy a lokus specifické sondy. Celochromosomové sondy lze použít pouze na metafázní chromosomy. Centromerické sondy se vážou na repetitivní alfa-satelitní sekvence v oblasti centromer. Využívají se např. k rychlé detekci numerických aberací nebo k přesnějšímu vyčíslení numerické mozaiky. Lokus specifické sondy se vážou na konkrétní lokus na chromosomu. Lze je využít například k potvrzení mikrodelečních syndromů a v nádorové cytogenetice. Použití celochromosomových (malovacích) sond je omezeno pouze na metafázní chromosomy. Sondy jsou tvořeny směsí fragmentů DNA, které se na principu komplementarity vážou ke konkrétnímu chromosomu po celé jeho délce. Výsledkem je fluorescenční obarvení celého chromosomu. M-FISH – vícebarevná fluorescenční in situ hybridizace je obdobou této metody. Při M-FISH se obarví všechny chromosomy, každý jinou fluorescenční barvou. Malovací sondy se uplatňují především v nádorové cytogenetice.
7.4.1 Microarray aCGH (array comparative genomic hybridization) aCGH vychází z metody FISH s tím rozdílem, že DNA sondy jsou při aCGH umístěny na pevném nosiči – mikročipu. Metoda umožňuje detekci nebalancovaných chromosomových přestaveb tedy duplikací/delecí (tzv. CNVs – copy number variants) v celém genomu v jedné reakci. Citlivost metody je 100× vyšší než karyotypování. aCGH se využívá v prenatální diagnostice nebo v případech, kdy patologický fenotyp pacienta nekoreluje s nálezem v karyotypu. Nezastupitelnou roli má při vyšetřeních pacientů s podezřením na některý z mikrodelečních syndromů. Principem metody je porovnání počtu kopií vybraných lokusů zkoumaného vzorku DNA s referenční DNA (pocházející od zdravého jedince). Vzorky DNA jsou označeny fluorochromy odvozenými od cyaninu (CY). DNA pacienta je označena např. CY3 (zelená) a referenční vzorek CY5 (červená). DNA vzorku i referenční DNA (v poměru 1 : 1) hybridizují současně na mikročipu s 60 000 oligonulkeotidovými sondami. Mikročip je skleněná destička, na které jsou ukotveny sondy – fragmenty DNA z různých lokusů celého genomu. Vysoká hustota sond je především v klinicky důležitých oblastech. V průběhu hybridizace „vzájemně soutěží“ (kompetuje) DNA vzorku s referenční DNA o sekvenci sondy ukotvenou na čipu. Delece se jeví jako místa na čipu, kam se navázala převážně referenční DNA (červený signál), duplikace jako místa, kde převažuje DNA pacienta nad referenční DNA (zelený signál) a na místech bez kvantitativní změny 98
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS288732