Důkladnější normalizaci přes hodnoty ΔCt lze provést tak, že některý ze vzorků v sérii považujeme za vzorek referenční. Může jít o vzorek odebraný před nasazením léčby, vzorek z definované tkáně, pří padně o vzorek téže tkáně od zdravého jedince. V tomto případě se nejprve provede výpočet hodnot ΔCt ve všech vzorcích, a poté se vypočítá rozdíl hodnot ΔCt mezi klinickými vzorky a vzorkem referenčním (získáme hodnotu ΔΔCt). Pouhé porovnání rozdílů absolutních hodnot Ct pro vyšetřovaný gen bez po užití genu referenčního by nijak nezohlednilo ztráty RNA a ztráty, k nimž došlo při reverzní transkripci. ΔΔCt = ΔCt vyšetřovaného vzorku – ΔCt referenčního vzorku Platí, že pokud je exprese referenčního genu stálá ve všech studovaných tkáních, nejvyšší expresi má ta tkáň, kde byla zaznamenána nejvyšší záporná hodnota ΔΔCt. Je-li například v mozku (referenční tkáň) vypočítána ΔCt = 10 jako rozdíl mezi studovaným a referenčním genem, v ledvinách 7,5 a v játrech 5, vycházejí hodnoty ΔΔCt pro ledviny –2,5 a pro játra –5. V játrech je tedy vyšší exprese sledovaného genu než v ledvinách. Nakonec je třeba hodnoty ΔΔCt převést na smysluplné číselné hodnoty. K tomu se využívá norma lizovaná exprese R vztažená k referenční tkáni (v našem příkladu mozek), kdy: R = 2–ΔΔCt Pro mozek vychází Rm = 20 = 1, pro ledviny Rl = 22,5 = 5,6 a pro játra Rj = 25 = 32. Exprese v játrech je tedy 32x vyšší než v mozku a více než šestinásobná v porovnání s ledvinami. Jak již bylo zmíněno, jde o relativní kvantifikaci bez znalosti absolutní exprese v jakékoliv studované tkáni. Vztah platí za předpokladu, že účinnosti reakcí pro studovaný a referenční gen jsou podobné a hodnota ΔCt se nemění s rostoucí či klesající koncentrací templátu DNA. Tento fakt je nutné ověřit experimentálně.
13.5 COLD real-time PCR Real-time COLD-PCR je metoda, která vychází z principů amplifikace při nižší denaturační teplotě popsané v kapitole 12. I zde je používána denaturační teplota rozvolňující výhradně heteroduplexní dvouřetězce. Je-li součástí reakční směsi fluorescenční sonda, lze sledovat průběh amplifikace v reálném
100 F
0
standardní real-time PCR
0
100 F
0
10
20
30
Podíl 50% 25% minoritní alely 12%
40
real-time COLD-PCR 12% 6% 3% 0
10
20
30
40
Obr. 13.6 Porovnání amplifikačních křivek pro standardní real-time a real-time COLD-PCR. Podíl minoritní (mutované) alely je znázorněn v procentech, falešná pozitivita alely wild-type představuje přerušovaná křivka.
98 /
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS217071