užívá pro vyšetření chromosomů v mitóze nebo v interfázi. V praxi je možné použít několik typů sond – centromerické, lokus-specifické, malovací. Konkrétní sondu volíme podle indikace vyšetření. Centromerické sondy jsou tvořeny alfa-satelitními sekvencemi repetitivní DNA přítomné v oblasti centromery. Dovolují rychlou detekci numerických aberací, zejména v nedělících se buňkách. Lokus-specifické sondy se váží se specifickým lokusem na chromosomu. Umožňují stanovení některých strukturálních změn, jako jsou mikrodeleční syndromy (viz Početí a prenatální vývoj), specifické translokace u některých malignit atp. Celochromosomové sondy (malovací) jsou připravené jako směs fragmentů DNA konkrétního chromosomu. Po jejich aplikaci dojde k „obarvení“ celého chromosomu. Používají se pro určení některých strukturálních aberací, jako jsou translokace, inserce nebo komplexní přestavby (hlavně v buňkách nádorů), a dále pro stanovení původu nadpočetných markernebo ring-chromosomů. Tyto sondy vyžadují metafázické chromosomy, pro interfázní jádra je nelze použít. Komparativní genomová hybridizace (CGH) slouží k zjišťování odchylek v množství genetického materiálu mezi různými genomy. Nevyžaduje přítomnost dělících se buněk, provádí se z izolované DNA. Zásadní význam má proto pro analýzu buněk solidních nádorů, kde ostatní postupy vyšetření chromosomů často selhávají. Princip CGH představuje současná hybridizace dvou rozdílně značených DNA (vyšetřované a kontrolní) k metafázickým chromosomům zdravého dárce v poměru 1 : 1. V oblasti zmnožení nebo ztráty DNA je detekována změna poměru intenzity signálů obou fluorochromů. Demonstrace barvících technik: Bakalářské studium, Biologie člověka (přednášky), http://biol.lf1.cuni.cz/Pregrbak.htm
7.3 Změny struktury nebo počtu chromosomů V karyotypu mohou být nalezeny různé odchylky, jak ve struktuře, tak v počtu chromosomů. Tyto odchylky mohou podmiňovat onemocnění obecně označovaná jako chromosomálně podmíněné syndromy. Syndrom je soubor příznaků charakterizujících určitý fenotyp (chorobu).
7.3.1 Numerické odchylky – aneuploidie a polyploidie Polyploidie Polyploidie znamená zmnožení (násobek) celé sady chromosomů. Na příklad 3n – triploidie, 4n – tetraploidie. Je možný vznik triploidní zygoty (např. po oplození vajíčka dvěma spermiemi, poruchou I. nebo II. zracího dělení vajíčka), ale není slučitelný se životem. Těhotenství končí potratem. Skupiny polyploidních buněk mohou být nalezeny v některých tkáních. V kostní dřeni mají megakaryocyty 8–16násobek haploidního počtu chromosomů. V regenerujících se játrech, a i v jiných regenerujících se tkáních, se vyskytují tetraploidní buňky. Vznikají endomitózou; chromosomy se dělí dvakrát a buňky jen jednou.
98 Ukázka elektronické knihy, UID: KOS199276
Aneuploidie Aneuploidie je změna počtu jednotlivých homologních chromosomů. Trisomie: 2n + 1, monosomie: 2n–1 atp. Ke vzniku aneuploidií může dojít během meiózy (nondisjunkce – nesprávný rozchod chromosomů nebo chromatid k pólům buňky, viz Meióza) nebo i během mitotického dělení. Meiotická nondisjunkce postihuje všechny buňky organismu. Chyba v rozchodu chromatid k pólům buňky při mitotickém dělení vede ke vzniku klonů aneuploidních buněk – k mozaice. Pokud například dojde k mitotické nondisjunkci chromosomu 21 v časném postzygotickém období, vzniká Downův syndrom s rozsahem klinických příznaků, které odpovídají poměru buněk s normálním karyotypem a s trisomií – např. mos46,XY[10]/47,XY,+21[25]. Číslo v hranaté závorce udává počty buněk ve vyšetřeném vzorku.
7.3.2 O nemocnění podmíněná numerickými odchylkami a jejich hlavní fenotypové charakteristiky 7.3.2.1 Numerické odchylky autosomů Downův syndrom (též Morbus Down) – trisomie chromosomu 21 Karyotyp jedince s Downovým syndromem podmíněným prostou trisomií je 47,XX,+21 nebo 47,XY,+21. Downův syndrom má výskyt 1/700 narozených dětí. Charakteristickým klinickým příznakem je zpomalení vývoje, mentální retardace (duševní zaostalost), krátké široké ruce, dlaň s „opičí rýhou“, malá postava, hyperflexibilita kloubů, široká plochá tvář, ploché záhlaví, otevřená ústa se zbrázděným velkým jazykem, oční řasa (epikantus), vrozené vývojové vady (VVV) srdce i jiných orgánů. Postižení jedinci jsou náchylní k infekcím a nádorovým onemocněním (zejména leukémie), dožívají se v průměru 50 let. Patauův syndrom – trisomie chromosomu 13 U jedinců s Patauovým syndromem nalézáme karyotyp 47,XX,+13 nebo 47,XY,+13. Výskyt je 1/10 000 narozených dětí. Klinické příznaky u tohoto syndromu jsou mentální postižení, hluchota, rozštěp rtu/patra, polydaktylie, anomálie vývoje srdce, ledvin a pohlavních orgánů. Postižení umírají většinou do prvního měsíce života. Edwardsův syndrom – trisomie chromosomu 18 Edwardsův syndrom je podmíněn karyotypem 47,XX,+18 nebo 47,XY,+18. Výskyt je 1/5000 narozených dětí. Edwardsův syndrom provázejí malformace mnoha orgánů. U postižených jedinců bývají například zdvojené ledviny. Jedinci s Edwardsovým syndromem mají dozadu ubíhající mandibulu, malá ústa a nos, deformity prstů, „koňskou nohu“. Obdobně jako u dvou výše popsaných syndromů jsou nízko posazené malformované uši. Postižení jsou duševně zaostalí. 90 % jedinců postižených Edwardsovým syndromem umírá během prvních šesti měsíců po narození.
99 Ukázka elektronické knihy, UID: KOS199276
7.3.2.2 Aneuploidie heterochromosomů Turnerův syndrom – monosomie chromosomu X Karyotyp 45,X podmiňuje Turnerův syndrom. Výskyt je 1/2500–1/4000 narozených dívek. Jsou to ženy s narušeným sexuálním vývojem. Chybí jim sekundární pohlavní znaky, obyčejně jsou sterilní (nevyvinuté vaječníky) a nemenstruují.. Po stranách krku mají patrné kožní řasy (pterygium colli), vlasová hranice je nízká. Mají štítovitý hrudník. Vyznačují se malou postavou. Výšku postavy lze terapeuticky ovlivnit podáváním růstového hormonu v dětství. Klinefelterův syndrom – trisomie XXY Klinefelterův syndrom je podmíněn karyotypem 47,XXY, ale vzácně i 48,XXXY; 49,XXXXY. Výskyt je 1/1000 narozených chlapců. Postižení chlapci většinou nemají zvláštní problémy až do dospívání. Jen někteří mají poruchy učení a řeči. Muži jsou neplodní. Pro Klinefelterův syndrom jsou charakteristická malá a tuhá testes (bez tvorby spermií a testosteronu), někdy zvětšená prsa (gynekomastie), vysoká postava, dlouhé končetiny, ochlupení je variabilní (ženský typ). V porovnání s muži s normálním karyotypem mají zvýšené riziko vzniku nádoru prsu. Syndrom tří X (Superfemale) Syndrom tří X je trisomie 47,XXX s výskytem 1/1000 žen. Pro tyto ženy je charakteristická vyšší postava. Vzácně se objevují poruchy chování, problémy s učením a opožděný vývoj řeči a motorických dovedností. Ženy mají normální sexuální vývoj a mohou mít děti. Většina žen s karyotypem 47,XXX je asymptomatická, diagnostikováno je jen asi 10 % z nich. Syndrom dvou Y (Supermale) Jedinci mají karyotyp 47,XYY. Výskyt syndromu dvou YY je 1/1000 mužů. Muži mají vyšší postavu a jsou bez klinických příznaků. Jejich sexuální vývoj je normální a jsou plodní. Mají zvýšené riziko poruch učení, opožděného vývoje řeči a motorických dovedností.
chrom. aberace / 1000 narozených
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
věk matky (roky)
Downův syndrom
Chrom. aberace celkem
Graf 7.1 Závislost výskytu syndromů podmíněných aneuploidiemi na věku matky
100 Ukázka elektronické knihy, UID: KOS199276