6
Hemochromatóza
protože vzniká hybridní molekula, jejíž jednotlivé řetězce pocházejí z různých zdrojů. Je-li jeden řetězec (klonovaný fragment) označen, může sloužit jako tzv. sonda k vyhledávání komplementárních úseků v komplexní směsi DNA. Takovou komplexní směsí může být např. kompletní lidská genomová DNA naštěpená restrikčním enzymem a rozdělená na gelové elektroforéze (kde lze hybridizací detekovat specifický fragment) nebo knihovna lidské DNA (v níž hybridizace umožňuje nalezení klonu nesoucího sekvenci komplementární k použité sondě). Jako sonda může být po označení použit i oligonukleotid připravený uměle organickou syntézou. Hybridizace může probíhat v roztoku nebo na pevném podkladě (nejčastěji na nitrocelulózové membráně). V druhém případě je jeden řetězec (např. analyzovaná DNA) vázán na hybridizační membráně a druhý řetězec (značená sonda) se nachází v roztoku obklopujícím membránu [121, 289]. Detekce mutací pomocí reverzní hybridizace využívá vazby na základě komplementarity mezi testovaným vzorkem a sondou. Při této metodě se často používají komerční kity. Po izolaci DNA je prvním krokem PCR amplifikace úseku, který má obsahovat mutaci a v dalším kroku následuje hybridizace se sondou imobilizovanou na membráně (proto reverzní – imobilizována je sonda, nikoliv DNA). Tato membrána je přelita amplifikačním produktem a v případě komplementarity dochází k vazbě mezi vzorkem a sondou. Kity jsou často postaveny tak, že na jedné membráně je na přesně definovaných místech naneseno více sond, a tak detekujeme více mutací najednou. Na membráně jsou umístěny sondy komplementární jak k mutované, tak k nemutované sekvenci, abychom jednoznačně určili, zda jde o homozygota pro danou mutaci, heterozygota nebo jedince bez mutace (obr. 6.3 a 6.4). Detekovány mohou být i mutace ve více genech, konkrétně u hemochromatózy jsou již k dispozici kity, které detekují kromě mutací v HFE genu i vybrané mutace v genu pro transferinový receptor 2 (hemochromatóza typu 3) a feroportin (hemochromatóza typu 4 – feroportinová choroba).
Alelická diskriminace využívající 5´-nukleázovou assay Alelická diskriminace (AD) je metodou detekující varianty sekvence DNA. Při této metodě lze opět využít PCR. Metoda je postavena na systému multiplexové reakce (více než jeden pár primer/sonda na reakci) a end-point (data jsou sbírána na konci PCR). Přítomnost dvou párů primer/sonda v každé reakci umožňuje genotypizaci dvou možných variant SNP (single nucleotid polymorfism) v cílové sekvenci. U této 98
Hemochromatóza.indd 98
26.3.2010 12:29:06 Ukázka elektronické knihy, UID: KOS180797