Udvikling af analysemetoder til karakterisering af stivelse
Natriumcyanoborhydrid. Produkt nr.: S86285G. Lot.: 038H3627. Sigma. Diverse standardstoffer. Kolorimetrisk stivelsesbestemmelse Stivelseskoncentrationen i prøverne måles spektrofotometrisk ved hjælp af en farvereaktion med KI3-. KI3- , som er en stor ion med negativ ladning, er hydrofil og kan derfor kompleksbinde sig i en α-helix struktur i stivelse og udvide denne, hvilket medfører ændret spredning af lyset, og en resulterende blå farve. Der skal minimum være 5-6 glucosemolekyler for at kunne danne en α-helix struktur som kan kompleksbinde med kaliumtriiodid. Den udviklede blå farve måles spektrofotometrisk. Der skal tages højde for baggrundsabsorption fra kalium triiodid (rødbrun farve). Målingen foretages i ELISAbakker ved hjælp af ELISA Reader (Bio-Tek Instruments, USA). Selve forsøgsproceduren omfatter afvejning af 1 mg prøve til 1 mL. Den opløste prøve koges 1 time og omrystes ca. hver 10 min. Prøven afkøles og centrifugeres. Fra supernatanten udtages 100µL til ELISApladens første brønd (A1). Der kan køres 12 prøver af gangen. (A112). Der fortyndes ved 2-trinsfortynding fra AH med Milli Q vand (50µL vand i B-H inden fortyndingsrækken begyndes, der overføres 50µL for hver gang, og de sidste 50µL smides ud). 200µL Milli Q vand tilsættes alle brøndene. Volumen er herefter 250 µL. 50µL 100x fortyndet KI3 tilsættes alle brøndene. Der blandes godt. Total assay volumen er 300µL. Pladen sættes i ELISA-readeren og måles ved 360nm. Enzymatisk nedbrydning Der anvendes 2 forskellige enzymer ved udvikling af den enzymatiske analysemetode. Termamyl er en varmeresistent α-amylase. Ved varmepåvirkning øges aktiviteten samtidigt med at de fleste andre enzymer eller mikroorganismer inaktiveres. Ved nedbrydning med Termamyl katalyseres spaltningen af α-1,4 bindinger. Herved er det både amylose og amylopektin der nedbrydes. Produkterne er primært glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose og grænsedextriner (oligosaccharider med α-1-6 og α-1-4 glucosidbindinger).
Figur 1. Eksempel på α-(1-4) glucosidbundne D-glucoseenheder som findes bl.a. i amylose fra stivelse
soamylase katalysere spaltningen af α-1,6 bindingerne, hvorved sidekæderne fraspaltes den lange polymere kæde. I teorien er det muligt at få et mål for længden af sidekæderne ved efterfølgende HPCE analyse samt strukturopklarende spektrofotometriske metoder (LC-MS og NMR).
Figur 2. Eksempel på struktur af glucosid med α-1,6 bundne sidekæder, som findes bl.a. i amylopektin fra stivelse.
Selve forsøgsproceduren omfatter afvejning af 1 mg prøve til 1 mL. Der tilsættes 10 µL 1 mg/mL Thyminose standard pr. mg. prøve. Den opløste prøve koges 1 time og omrystes ca. hver 10 min. Prøven afkøles og er klar til videre brug. Termamylbehandling; Der tilsættes 40µL 10x fortyndet Termamyl til 1 mL prøve, som henstår ved 100 ºC i vandbad i 1½ time. Efter afkøling derivatiseres prøverne (se nedenfor) Isoamylasebehandling; Der tilsættes 40µL 40x fortyndet Isoamylase til 1 mL tempereret prøve. Prøverne inkuberes i stuetemperatur i 1½ time. Prøverne er herefter klar til derivatisering. Prøverne fra enzymbehandlingerne opbevares på frost indtil derivatisering gennemføres. Derivatisering af kulhydrater Kulhydrater mangler en chromofor og giver derfor et meget begrænset respons ved spektrofotometrisk måling. For at afhjælpe dette er anvendt tryptaminderivatisering, hvorved der
Faglig Årsberetning 2003
131