Andersen, K.E., Bjergegaard, C., Mortensen, K., Møller, P. & H. Sørensen
derivatiserede kulhydrater, kan en yderligere forbedring af sensitiviteten opnås ved derivatisering med chromophore komponenter som 3-(4-carbohydroxyben-zoyl)-2-quinolincarboxaldehyd (CBQCA) (Leu et al., 1991), 4-aminobenzosyre (Grill et al., 1993), 4aminobenzonitril (Schwaiger et al., 1994), 2aminopyridin (Honda et al., 1989; Delgado et al., 1992), 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5on (Honda et al., 1991) og (S)-1phenylethylamin (Noe & Freissmuth, 1995; Richter et al., 1997; Noe et al., 1999). Kobling af chromophore/flourophore molekyler til kulhydrater giver en betydelig forbedring af detektionsgrænserne, men denne teknik er kun anvendelig til kulhydrater med ”frie” carbonylgrupper, specielt reducerende kulhydrater. Således kan de glycosidbundne og dermed ikke-reducerende kulhydrater som sucrose og α-galactosider af sucrose (Figur 1) ikke derivatiseres ved denne metode.
Figur 1.
Sucrose og oligosaccharider i raffinosefamilien. En fraspaltning af fructose fra sucrose-delen af de ikke-reducerende αβ-fructofuranosidase aktivitet) galactosider (β vil resultere i følgende reducerende kulhydrater: glucose (fra sucrose), melibiose (fra raffinose), manninotriose (fra stachyose), verbascotetraose (fra verbascose) og ajugopentaose (fra ajugose).
Indirekte detektion, der er baseret på et fald i baggrundsabsorptionen ved analytternes fortrængning af en i baggrundselektrolytten opløst chromophor/flourophor, åbner mulighed for analyse af ikke-reducerende kulhydrater som α-galactosiderne (Figur 1). 138
Metoden til analyse af α-galactosider er således baseret på omvendt detektion, hvor analytternes fortrængning af chromophoren PDC giver negative toppe. Da PDC har absorptionstop ved 275 nm og ingen absorption ved 350 nm kan de negative toppe, der således fremkommer ved anvendelse af 275 nm som detektionsbølgelængde, vendes til positive toppe ved at benytte signalet ved 350 nm (signalbølgelængde) fratrukket signalet ved 275 nm (referencebølgelængde) til nulstilling af detektoren. Figur 2 viser adskillelsen af sucrose (β-D-fructofuranosyl-α-D-glucopyranosid) samt de tre homologe α-galactosider, raffinose, stachyose og verbascose (Figur 1) opnået ved FZCE. α-Galactosidernes struktur er følgende: α-D-galactopyranosyl(1→6)-[α-D-galactopyranosyl-(1→6)]n-α-Dglucopyranosyl-(1→2)-β-D-fructofuranosid, hvor n = 0, 1, 2 og 3 for hhv. raffinose, stachyose, verbascose og ajugose. På electroferogrammet ses det, at de valgte interne standarder, maltitol og methyl-α-D-glucopyranosid (MGP), har migrationstider (MT) hhv. lavere (22,0 min) og højere (33,5 min) end de fire kulhydrater der ønskes bestemt. Ydermere ses det, at molekylvægten af α-galactosiderne er omvendt proportional med migrationstiden idet verbascose (Mw = 828,7 g/mol) detekteres efter 27,1 min., mens stachyose (Mw = 666,6 g/mol), raffinose (Mw = 594,5 g/mol) og sucrose (Mw = 342,3 g/mol) detekteres ved hhv. 28,1, 29,4 og 32,0 min. Metoden giver en effektiv bestemmelse af de ikke-reducerende oligosaccharider målt ved traditionelle parametre for chromatografiske metoder (Sørensen et al., 1999). Dette fremgår af antal teoretiske bunde (N), der ligger fra 76000 til 133000 pr. meter, og af basislinieseparation med resolution fra 3,73 til 8,61 med undtagelse af stachyosestandarden, der indeholder en forurening af galactinol med MT 27,8 min. Den negative top omkring 37 min modsvarer omtrent arealet af positive toppe og repræsenterer den fortrængte mængde af chromophoren PDC.
Faglig Årsberetning 1999