EB967058

Marta Kalousová a kolektiv

PATOBIOCHEMIE ve schématech

Pořadatelka díla:

Marta Kalousová

Autorský kolektiv:

Lenka Fialová, Marta Kalousová, Jiří Kraml, Evžen Křepela, Kateřina Mrázová, Jan Pačes, Jan Pláteník, Ivan Šebesta, Jan Štěpán, Stanislav Štípek, Martin Vejražka, Miroslav Zeman, Tomáš Zima, Aleš Žák

Recenze:

Doc. MUDr. Ivan Matouš-Malbohan, CSc.

© Grada Publishing, a.s., 2006

Cover Photo © profimedia.cz/CORBIS, 2006

Vydala Grada Publishing, a.s.

U Průhonu 22, Praha 7 jako svou 2410. publikaci

Odpovědná redaktorka PhDr. Anna Monika Pokorná Fotografie na obálce profimedia.cz/CORBIS

Obrázky dodali autoři.

Sazba a zlom Martin Hanslian Počet stran 264

První vydání, Praha 2006

Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a.s. Husova ulice 1881, Havlíčkův Brod

Názvy produktů, firem apod. použité ve skriptech mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v těchto skriptech, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.

Všechna práva vyhrazena. Tato skripta ani jejich část nesmějí být žádným způsobem reprodukovány, ukládány či rozšiřovány bez písemného souhlasu nakladatelství.

ISBN 80-247-1522-8

Seznam autorů

MUDr. Lenka Fialová, CSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, Ústav lékařské biochemie

Doc. MUDr. Marta Kalousová, Ph.D.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky, Ústav lékařské biochemie

Prof. MUDr. Jiří Kraml, DrSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, Ústav lékařské biochemie

MUDr. Evžen Křepela, CSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, Ústav lékařské biochemie; Fakultní nemocnice

Na Bulovce a 3. lékařská fakulta, Klinika pneumologie a hrudní chirurgie, Laboratoře molekulární a buněčné biologie

MUDr. Kateřina Mrázová

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky

Mgr. Jan Pačes, Ph.D.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, Ústav lékařské biochemie; Akademie věd České republiky, Ústav molekulární genetiky

MUDr. Jan Pláteník, Ph.D.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, Ústav lékařské biochemie

MUDr. Ivan Šebesta, CSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky

Prof. MUDr. Jan Štěpán, DrSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, III. interní klinika – klinika endokrinologie a metabolizmu, Osteocentrum

Prof. MUDr. Stanislav Štípek, DrSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, Ústav lékařské biochemie

MUDr. Martin Vejražka

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, Ústav lékařské biochemie, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky

MUDr. Miroslav Zeman, CSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, IV. interní klinika – klinika hepatologie a gastroenterologie

Prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky

Doc. MUDr. Aleš Žák, DrSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, IV. interní klinika – klinika hepatologie a gastroenterologie

Předmluva

„Patobiochemie ve schématech“ je určena především studentům lékařských fakult a dalších biomedicínských oborů. Autorský kolektiv připravil učební pomůcku ke studiu patobiochemie nejčastějších klinických stavů. Obsahuje teze a schémata přednášek a seminářů o obecných mechanizmech vzniku nemocí jako jsou oxidační stres, zánět, změny vnitřního prostředí a apoptóza. V dalších kapitolách je pojednáno o příčinách a monitoraci diabetes mellitus, o mechanizmu vzniku aterosklerózy, dyslipoproteinemiích, dědičných poruchách metabolizmu či nádorových markerech. Skriptum má sloužit k přípravě na výuku a po doplnění vlastními poznámkami k přípravě na zkoušku. Má pomoci studentům nalézt vztahy mezi biochemií a klinickou medicínou. Může být prospěšné i studentům nelékařských oborů k přiblížení problematiky vzniku nejčastějších onemocnění.

Autorský kolektiv zahrnuje nejen zkušené biochemiky, ale také klinické pracovníky, kteří promítají poznatky teoretického studia do každodenní lékařské praxe a ukazují studentům význam kvalitních teoretických základů pro pochopení chorobných stavů.

Tomáš Zima Stanislav Štípek

1 Patobiochemie volných radikálů

Jan Pláteník

Co je volný radikál?

molekula, atom, neboion schopnýsamostatné existence, který obsahujealespoň jeden nepárový elektron

radikál ion molekula

Spinovárestrikcekyslíku

•Normální(triplet) O2 je biradikál,svysokouafinitou k elektronům.

•Alepříjemelektronuvyžaduje, abyjedenzestávajících nepárových elektronů změnil svůjspin, cožjerelativně pomalýproces.

•Beztétorestrikcebychom v kyslíkovéatmosféře planety okamžitě shořeli.

•SingletovýO2 jeexcitovaná, vysoce reaktivní forma kyslíku.

Superoxid

• Zdrojev těle:

–Únik elektronů na kyslík

–dýchací řetězec v mitochondriích

–jinépodobné redoxní systémy, např.mikrozomální cytochromP450monooxygenáza

–NAD(P)H oxidáza:

–fagocyty („respiratory burst”)

–nefagocytárníbuňky

–Některéenzymy:

–xantinoxidáza

–cyklooxygenáza

–lipooxygenáza

–ReakceFeII-hemoglobinu s kyslíkem

–Autooxidace(reakce s kyslíkem) různýchlátek(askorbát, glutathionajinéthioly,katecholaminy)

(Green,MJ,HillHAO; Meth. Enzymol. 1984, 105, 3–22. Upraveno.)

Superoxidvznikáv dýchacím

řetězci mitochondrií

•1–2 % z celkové tělesnéspotřebykyslíku

•Únik elektronů z redoxních centerkomplexů I a III, nejvíce ze semichinonu

Respiračnívzplanutífagocytu

Vzniksuperoxiduz oxyhemoglobinu

nibolgomehtem

Štípek, S. et al.: Antioxidanty a volnéradikály ve zdravíanemoci. GradaPublishing, Praha, 2000.

Superoxid

• Vlastnosti: – Nepřílišreaktivní, oxidační i redukční činidlo – Omezenámožnost průchodu přes membrány(jen skrzaniontové kanálynebovesvéprotonované formě)

– Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

• Osud:

– Dismutace:

O2 + O2 + 2 H+ → O2 + H2O2

– Reakces oxidemdusnatým:

NO + O2 → OONO– (peroxynitrit)

Peroxidvodíku

• Tvorbav těle:

–Dismutacesuperoxidu(spontánnínebo katalyzovanásuperoxiddismutázou):

O2·– + O2·– + 2 H+ → O2 + H2O2

–Přímo činnostíněkterýchenzymů: •xantinoxidáza

•monoaminooxidáza(MAO)

Peroxidvodíku

• Vlastnosti:

–Není radikál –Volně procházískrzbiologickémembrány –Sámo sobě celkemnereaktivní –Alerychlereagujesredukovanýmipřechodnýmikovy jakoželezoaměď (Fentonovareakce)

• Osud: –Fentonovareakce: –Bezpečnéodstraněníglutathionperoxidázou nebo katalázou

H2O2 +Fe2+ → OH– + OH·+ Fe3+ hydroxylovýradikál

Hydroxylovýradikál

• Vznikvtěle:

–Ionizačnízáření:

H2O → H· + OH·

–Fentonovareakce:

OH

·

H2O2 +Fe2+ → OH– + OH·+ Fe3+

• Vlastnosti: – Extrémně reaktivní.Poškozujebiomolekulyblízko místasvého vzniku.

Oxiddusnatý

• Vznikvtěle:

–NO syntázováreakce:

NO

·

L-arginin+ O2 +NADPH → L-citrulin + NADP+ +NO

–TřirůznéNO syntázy:

–NOSI(neuronální,konstitutivní)

–NOSII(fagocyty,inducibilní) –NOS III (endoteliální, konstitutivní)

Oxiddusnatý

• Vlastnosti:

· –Plynnýradikál –Reakceskyslíkemnadusitan(pomaláinvivo):

–Reakceshemovýmželezemhemoglobinu (…fyziologická inaktivace):

–Reakce s hemovýmželezemguanylátcyklázy (…fyziologickéúčinky,relaxacehladkéhosvalstvaatd.): 4NO + O2 + 2 H2O → 4 NO2– + 4H+

Hb-Fe2+-O2 +NO·→Hb-Fe2+-OONO → Hb-Fe3+ +NO3–

GC-hem-Fe2+ + NO·→ GC-hem-Fe2+-NO

Oxiddusnatý

• Vlastnosti(pokračování):

NO

·

–Reakce se sulfhydrylovouskupinouglutathionuatd. na nitrosothiol(…transport NO):

NO + GSH → GSNO + H+ + e–

–Reakcese superoxidemna peroxynitrita konečně hydroxylovýradikál(…toxicita):

NO + O2 → OONO–peroxynitrit

OONO– + H+ → HOONO → OH· + NO2· kyselina peroxydusitá hydroxylový radikál

Reaktivníformy kyslíku

(Reactive Oxygen Species, ROS)

• Radikály: –superoxid,O2 ––hydroperoxyl, HO2 –hydroxylovýradikál, OH· –peroxyl, ROO· –alkoxyl, RO·

• Ne-radikály: –peroxidvodíku,H2O2 –kyselinachlorná, HClO –ozón, O3 –singletovýkyslík, 1O2

Reaktivníformydusíku

(Reactive Nitrogen Species, RNS)

• Radikály: –oxiddusnatý,NO –oxiddusičitý, NO2

• Ne-radikály: –nitrosonium, NO+ –nitroxyl, NO––kyselinadusitá, HNO2 –oxiddusitý, N2O3 –oxiddusičitý, N2O4 –nitronium, NO2+ –peroxynitrit, ONOO ––alkylperoxynitrit, ROONO

Oxidativnípoškozenílipidů: lipoperoxidace

•Změny fluidity a permeability membrán

•Produkce toxických& reaktivních aldehydů (malondialdehyd,4-hydroxynonenal):

–zesítění(cross-link)proteinů –chemoatraktantypromakrofágy

Peroxidace

Další osud

lipoperoxidů

Oxidativnípoškozeníproteinů

•Oxidativnímodifikace aminokyselinových zbytků

•Hydroxylacearomatickýchaminokyselin hydroxylovýmradikálem

•Nitracearomatickýchaminokyselin peroxynitritem

•Agregace a síťováníproteinů reaktivními aldehydy(produktylipoperoxidace)

•Železemkatalyzovanáoxidace ε-NH2 skupin zbytků Lys, produkujícíkarbonylové skupiny

•Ztrátafunkceenzymunebotransportéru

•Proteolytickádegradacemodifikovanýchproteinů

•Změny v antigenicitě autoimunitníreakce

OxidativnípoškozeníDNA

•Reakcehydroxylovéhoradikálu s deoxyribózou: produkcemalondialdehydu a zlomuv řetězciDNA

•Hydroxylacepurinových/pyrimidinových bází: změna párování bází

–..... mutageneze, kancerogeneze,apoptóza, stárnutí

Kde jsouRONS prospěšné

•Monooxygenázy: hydroxylacesteroidů, xenobiotik etc.

•Fagocyty:zabíjenímikrobů nebo nádorových buněk

•Mediátoryzánětlivéreakce

•Lokálníhormony/mediátory:

–NO:

–neurotransmitér/neuromodulátorv CNS, funkce v synaptické plasticitě,učenía paměti –relaxace hladkéhosvalstvacévnístěny,gastrointestinálního traktu, corpus cavernosumpenis –inhibice adheze a agregace trombocytů, adheze leukocytů –superoxid stejně tak,účinkyprotichůdnéNO?

•Intracelulárnísignalizace(ROS jako„second messengers”,redoxnísenzorynaproteinech?)

Výzbrojfagocytu

• MembránováNADPH oxidáza:

2 O2 + NADPH → 2 O2 + NADP+ +H+

• Myeloperoxidáza:

H2O2 + Cl– → HClO + H2O kyselina chlorná

R’R-NH + HClO → R’RNCl + H2O (N-chloramin)

• Proteázy:

–synergizmusmeziROSandproteázami:

•HClO, R’RNCl → inhibice α1-antitrypsinu

•aktivacemetaloproteinázoxidací

Centrálníúloha železa/mědi v oxidačním stresu

•Redoxně aktivnípřechodné kovy(Fe, Cu) přijímají/dávajíjedenelektronsnadno –...obcházejíspinovourestrikcikyslíku –...kovyjsouvaktivníchcentrechvšechproteinů pracujícíchs kyslíkem

•Tytéžvlastnosti Fe, Cu jsou však škodlivé,pokud nejsou kontrolovány

–Fentonovareakce:

H2O2 + Fe2+ → OH– +OH·+ Fe3+

oxidativnípoškození biomolekul

Železo v těle

–„volné” neexistuje

–FeII se oxiduje molekulárním kyslíkemnaFeIII zavzniku kyslíkových radikálů –FeIII tvořínerozpustnéoxohydroxidy

•Lidskétělo obsahuje kolem 4 g železa

•Hemoglobin:70 %

•Myoglobin, cytochromy, enzymyobsahující hemové nebo nehemovéželezo:10% % 20–30

Feritin: •

•Transferin, laktoferin

Pool„nízkomolekulárního“ železa

•komplexy Fe s polyfosfáty, nukleotidy, polykarboxylovými kyselinami (citrát)

•fyziologicky pouze uvnitř buněk, plazma 0

•pouze toto železo může reagovat ve Fentonově reakci

•kontrola/minimalizace tohoto poolu reaktivního železa představuje základní antioxidační strategii organizmu

ECT ICT

Superoxid PeroxidFe/Cu

superoxiddismutáza glutathionperoxidáza kataláza

glutathion tokoferol askorbát

low-molecular-weight Fe přítomno

Superoxid PeroxidFe/Cu

Antioxidačníenzymy& hladiny glutathionuvelminízké

tokoferol

askorbát karotenoidy,kyselinamočová, albumin, glukóza, bilirubin...

Sekvestraceželezaa mědi: –transferin,laktoferin –hemopexin –haptoglobin

–ceruloplazmin(ferroxidáza) –Cu vázáno naalbumin

Volné radikály vpatogenezi lidských onemocn

• Příčina chorobnéhostavu,např.:

•kancerogenezevdůsledkuexpoziceionizačnímu záření

•retinopatienovorozenců (fibroplasia retrolentalis)

•iron-overloaddisease

• Významnýpodílnapatogenezi,např.:

•chronickýzánět(např. revmatoidní artritida)

•ARDS

•ateroskleróza

•mozkovétrauma/hemoragie

•diabetesmellitus

•konceptischemie/reperfuze

•stárnutí

• Jenepifenomenon (obecný důsledek tkáňového poškození)

Antioxidačníochrana

•prevencetvorbyROS/RNS (regulace produkujícíchenzymů, sekvestracepřechodných kovů)

•vychytávání, lapání a zhášení radikálů

•reparačnísystémy(fosfolipázy, proteazom, enzymyopravujícíDNA)

Antioxidačníochrana:enzymy

• Superoxiddismutáza:

•Cu, Zn-SOD (cytosolová)

•Mn-SOD (mitochondriální)

•EC-SOD (extracelulární)

• Glutathionperoxidáza:

2 GSH + H2O2 → GS-SG + 2 H2O

• Kataláza: O2 + O2 + 2 H+ → O2 + H2O2

2 H2O2 → 2 H2O + O2

glutathionperoxidáza

H2O glutathionreduktáza

pentózovýcyklus

Antioxidačníochrana: vysokomolekulární endogenníantioxidanty

•Proteinyzacházející s železema/nebo mědí: –transferin –laktoferin –feritin –haptoglobin –hemopexin –ceruloplazmin –albumin

•Chaperony

Antioxidačníochrana: nízkomolekulární

endogenníantioxidanty

–askorbát (vitamin C)

– α-tokoferol(vitamin E)

–ubichinon (koenzymQ)

–karotenoidy, vitamin A

–glutathion

–kyselinalipoová

–kyselinamočová

–bilirubin

–flavonoidy

membránovýkompartment:hydrofilníkompartment:

LH

L tokoferol

·

řetězováreakce lipoperoxidace

tokoferyl radikál

semidehydroaskorbát

dehydroaskorbát +e-e-

dehydroaskorbátreduktáza

askorbát

LOOH

LOO

2GSH

GSSG

2 Antioxidační systém a jeho insuficience, stárnutí

Stanislav Štípek

Úvod

V biologických systémech v etn lidského organizmu se dvouatomová molekula kyslíku metabolicky redukuje na reaktivní formy kyslíku (ROS –reactiveoxygen species –tj. superoxid, peroxid a hydroxylový radikál). Tyto formy jsou užite né v ad katalyzovanýchreakcí a p i uvol ování energie ze živin. Jejich koncentrace je udržována na fyziologické hladin antioxida ním systémem. Pokud p evládne tvorba ROS nebo se zpomalí jejich odstra ování, poruší se oxidoreduk nírovnováha, ROS patologicky oxidují biomolekulya poruší signálnímetabolizmus bun k. Je to stav oxida ního stresu, jeden ze základních patogenetických mechanizm vedoucíchk r zným onemocn ním (zán t, ateroskleróza, hypertenze, degenerativní choroby CNS, maligní nádory a projevystárnutí).

Oxidoreduk níprost edí (redoxnístav) bu ky

Jedefinováno intenzitouoxida ní zát že, které jsou bu kanebo její oddíl vystaveny(v etn tvorby ROS), kapacitou antioxida níhosystému a dostupností reduk ních ekvivalent

Zdroje ízené produkce ROS

•NADPH oxidáza

•xantinoxidoreduktáza(XOR)

•oxidoreduktázydýchacího et zce vnit ní mitochondriálnímembrány

•lipooxygenázy

P íklad ízené produkce superoxidu

ízení aktivace NADPH oxidázysignálními cestami

Fosforylacepodjednotky p47 je podstatná pro sestavení aktivního membránového komplexu

galektin3 imunokomplexy cytokiny LTB4 f-Met-Leu-Phe

bakteriální komponenty, fragmenty poškozené tkán

plazmatickámembrána p íslušný receptor

plazmatickámembrána gp91phox FAD FADH Rap1A

p22phox

Fe Fe

ROS z různých zdrojů ovlivňují v buněčných kompartmentech aktivitu signálních molekul, regulačních faktorů a enzymů tím, že mění oxidoredukční stav senzorových struktur (sulfhydrylových skupin a komplexů iontů železa). Tím se mění jejich konformace, aktivita a vazebné schopnosti. Na obrázku je znázorněno ovlivnění transkripčních faktorů AP-1 a NFκB hladinou ROS a změnami vlastností signálních molekul.

endogenní lektíny

extracelulární signály (hormony, r stovéfaktory, cytokiny)

plazmat.membrána p íslušný receptor RPTK

fosforylace cytoplazm. podjednotek

5-lipooxygenáza

GPx, PHGPx

GSH/GSSG aj. antioxidanty

LOH (neškodné metabolity)

forbolové estery

NADH/NADPH oxidáza

TyrPK fosfatázy

oxidanty procházející membránou (O2 , H2O2)

GPx H2O KAT

GSSG GSH

fosforylace, ubiquitinace, degradace

proteinkinázy MAPK, JNK aktivace p i GSSG (oxida ní prost edí) p50 p65

p50 p65

aktivace p i GSSG (reduk níprost edí) thioredoxin

(cFospromoter)

syntéza TNF

syntéza regula ních protein

jaderná membrána

adheznímolekuly zán t excitotoxicita

PROLIFERACE DIFERENCIACE APOPTÓZA

P íklady redoxníchsenzorových molekul

•Transkrip ní faktory

(bakteriální OxyR, SoxR, p53, NF B)

•Signálnímolekuly (proteinfosfatázy)

ANTIOXIDA NÍ OCHRANNÝ SYSTÉM

je tvo en antioxidanty, tedy látkami, které jsou schopny v relativn nízké koncentraci sout žit s jinými oxidovatelnými biomolekulami, a tak významn zpomalit nebo inhibovat oxidaci t chto substrát . Jsou to:

–neenzymovélátky, zejména tokoferol(vit. E), karoten, askorbát(vit.C) a glutathion

–enzymy,které m ní reaktivní formy kyslíku a dusíku (RONS) vmén reaktivní produkty

–bun néa biochemické ochranné systémy, odstra ující nebezpe né oxida n poškozené struktury z organizmu

ANTIOXIDA NÍ OCHRANNÝ SYSTÉM

Nízkomolekulární látky

•askorbát •tokoferoly •karotenoidy

•koenzym Q(ubichinon) •thiolya disulfidy

•lipoovákyselina

•urát •bilirubin •flavonoidy

Antioxida níenzymy

•superoxiddismutázy(SOD) •glutathionperoxidázy(GPX) •glutathiontransferázy(GST) •kataláza(CAT)

Jiné antioxida níproteiny

•transferin

•feritin

•ceruloplazmin

•haptoglobinahemopexin

Jiné antioxida nímechanizmy

•repara nímechanizmy DNA

•apoptóza

Nízkomolekulární antioxidanty

Nízkomolekulární antioxidanty

(askorbát, tokoferoly, karotenoidy, koenzymQ(ubichinon),thioly a disulfidy, lipoovákyselina, urát, bilirubin, flavonoidy) poskytují sv j elektron reaktivní form kyslíku, tím ji inaktivujía samy se zm ní vrelativn neškodnou slou eninu(tokoferylovýradikál, dehydroaskorbát, disulfidapod.). Takto zm n né antioxidanty se asto regenerují do p vodní formy redukcí, dodáním elektron zživin prost ednictvím glutathionreduktázynebo jinými reduk ními reakcemi.