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03/04/08 Título de la práctica: Determinación cuantitativa de urea Fundamento: La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en la muestra, en amoníaco (NH3) y anhídrido carbónico (CO2). El amoníaco formado se incorporan al -cetoglutarato por acción de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidación paralela de NADH a NAD+ : Ureasa Urea + H2O + 2 H+ 2 NH3 + CO2 2 NH3 + α-Cetoglutarato + NADH H2O + NAD+ + L-Glutamato GLDH La disminución de la concentración de NAD+ en el medio es proporcional a la concentración de urea de la muestra ensayada. Material: - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm. -Micropipeta de 1000 μl. -Micropipeta de 10 μl. - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS - Suero o plasma heparinizado1: No usar sales de amonio o fluoruro como anticoagulantes. - Orina: Diluir la muestra al 1/50 con agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por 50 (factor de dilución); Evitar el crecimiento bacteriano, manteniendo el pH < 4. La urea es estable 5 días a 2-8ºC. REACTIVOS R 1 Tampón TRIS pH 7,8 -Cetoglutarato 80 mmol/L 6 mmol/L R 2 Enzimas Ureasa Glutamato 3750 U/L 6000 U/L 0,32 deshidrogenasa (GLDH) mmol/L NADH UREA CAL Patrón primario acuoso de Urea 50 mg/dL Procedimiento: 1. 1. Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su

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contenido. Estabilidad: 1 mes en nevera (2-8ºC) o 10 días a temperatura ambiente. 2. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 37ºC / 15-25ºC 3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 4. Pipetear en una cubeta: Blanco RT (mL) Patrón (Nota23) (L) Muestra (L)

Patrón 1,0 --

1,0 10

--

--

Muestra 1,0 -10

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Mezclar y leer las absorbancias a los 30 s (A1) y a los 90 s (A2). 6. Calcular: A= A1 – A2. Resultados: (ΔA Muestra) x 50 (Conc. Patrón) = mg/dL de urea en la muestra (ΔA Patrón) 10 mg/L urea BUN dividido por 0,466 = 21 mg/L de urea = 0,36 mmol/L urea. Factor de conversión: mg/dL x 0,1665 = mmol/L Realizada la práctica los resultados son los siguientes: (0,894-0,890) x 50 (Conc. Patrón) =50 mg/dL de urea en la muestra (0,883-0,879) Dos días después se volvió a realizar la técnica pero con una muestra distinta los resultados fueron: (0,957-0,945) x 50 (Conc. Patrón) =15 mg/dL de urea en la muestra (0,965-0,961) Suero: de 15 a 45 mg/dL (2.49-7.49 mmol/L) Orina: de 20 a 35 gr/24 horas Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Por lo tanto los resultados están el primero un poco por encima y el segundo un poco por debajo de los rangos normales. Interpretación clínica de los resultados:

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La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas; se forma en el hígado a partir de su destrucción. Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en dietas con exceso de proteínas, enfermedades renales, insuficiencia cardiaca, hemorragias gástricas, hipovolemia y obstrucciones renales. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

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03/04/08 Título de la práctica: Determinación cuantitativa de Ácido Úrico Fundamento: El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de hidrógeno (2H2O2) que en presencia de peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS) forma un compuesto rosáceo: Uricasa Ácido úrico + 2H2O + O2

Alantoína + CO2 + 2H2O2

2H2O2 + 4-AF + DCPS

Quinonaimina + 4H2O POD La intensidad de quinonaimina roja formada es proporcional a la concentración de ácido úrico presente en la muestra ensayada Materiales: - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 520 nm. - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. -Micropipeta MUESTRAS - Suero o plasma: Estabilidad 3-5 días a 2-8ºC y 6 meses a –20ºC. - Orina (24 h): Estabilidad 3 días a temperatura ambiente a pH > 8. Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por 50 (factor de dilución); Si la muestra es turbia, calentarla a 60ºC 10 min para disolver los precipitados de urato y ácido úrico. No refrigerar. REACTIVOS R 1 Tampón Fosfatos pH 7,4 2-4 50 mmol/L 4 mmol/L Diclorofenol Sulfonato (DCPS) R 2 Enzimas Uricasa Peroxidasa (POD) 60 U/L 660 U/L 200 U/L 1 Ascorbato oxidasa 4 mmol/L Aminofenazona (4-AF) URIC ACID CAL Patrón primario acuoso de Ácido úrico 6 mg/dL Procedimiento: 1. Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Tampón. Tapar y

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mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 1 mes en nevera (2-8ºC) o 10 días a temperatura ambiente. 2. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . .520 nm (490-550) Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC / 15-25ºC 3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 4. Pipetear en una cubeta: Blanco

Patrón

Muestra

RT (mL)

1,0

1,0

1,0

Patrón (Nota1-2) (L)

--

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--

Muestra (L)

--

--

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5. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC ó 10 min. 15-25ºC. 6. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos. Interpretación clínica de los resultados: El ácido úrico y sus sales son el producto final del metabolismo de las purinas. En una insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de urea, creatinina y ácido úrico. Niveles altos de ácido úrico son indicativos de patología renal y generalmente se asocia con la gota. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Resultados: Suero o plasma A(Muestra) A (Patrón)

x 6 (Conc. Patrón) = mg/dL de ácido úrico en la muestra

Orina 24 h (A)Muestra (A) Patrón

x 50 (dilución) x 6 x vol. (dL) orina/24h = mg/24 h de ácido úrico

Factor de conversión: mg/dL x 59,5= mol/L.

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Suero o plasma: Mujeres Hombres Orina:

2,5 - 6,8 mg/dL 149 – 405 mol/L 3,6 - 7,7 mg/dL 214 – 458 mol/L 250 - 750 mg/24 h 1,49 - 4,5 mmol/24 h Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

06/05/08 Título de la práctica: Esterilización en autoclave Fundamento: Acción del vapor húmedo sobre el material queremos esterilizar Procedimientos:

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1. Se condiciona en paquetes las placas Petri que queremos esterilizar, se envuelven en papel de filtro. 2. El interior de autoclave se llena de agua hasta la rejilla. 3. Se colocan encima de está regido una pota y en su interior se introducen los paquetes de placas Petri, se cierra la autoclave girando la manibela. 4. Se introducen los datos que ha de procesar y realiza en autoclave, 15 minutos, 120ºC, 11 atm.. Se cierran adornos de salida del vapor y bravo. 5. Una vez que sea terminado sobre la válvula del vapor para que sal, previamente sea para autoclave Material:

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Autoclave Papel de filtro Tira adhesiva Pota

11/04/08 Título de la práctica: Realización de un cultivo faringeo Fundamento: Investigación de procesos infecciosos a través de cultivos en placa en garganta. Materiales: • Placa Petri con agar o agar sangre • Hisopo • Mechero • Asa de siembra • Depresor lingual 7


Procedimiento: 1. Con una luz colocada de forma que enfoque la cavidad oral del paciente dirigimos un hisopo hacia la porte posterior de la faringe, se le indica al paciente que respire profundamente y se deprime la lengua con un depresor, luego se extiende ese hisopo por los pilares de las amígdalas, pero con cuidado de no tocar los laterales de la boca, se debe pedir al paciente que diga “A” para que levante la úvula. 2. El hisopo debe moverse de atrás hacia delante para que la muestra sea idónea. 3. Inoculamos en un extremo del medio de cultivo con el hisopo que está impregnado con la muestra faringea y lo colocamos en un medio de transporte y lo reservamos. 4. Se esteriliza un asa de siembra en la llama y se deja enfriar. Con el asa en posición ligeramente horizontal hacemos unas estrías, haciendo oscilar esa asa sobre una porción del agar moviendo suavemente y rápido la muñeca. 5. Volvemos a esterilizar el asa, la dejamos enfriar y rozamos el asa con las estrías sembradas y sobre otra porción virgen de agar hacemos otra tanda de estrías procurando que no toque con la primera. No se debe hacer mucha presión sobre el agar, y el asa no debe estar rota. 6. Se lleva la placa a la estufa de cultivo de 24-48 horas en posición invertida, y observamos. Se deben ver colonias aisladas. Interpretación clínica de los resultados: Los cultivos de garganta se obtienen sobre todo para poder detectar estreptococos β- hemolíticos del grupo A. Clínicamente se puede sospechar de una faringitis estreptocócica si se observa una mucosa enrojecida en una paciente que además presenta dolor y dificultad para deglutir. Existe una flora comensal que está formada por un grupo de bacterias y algunas levaduras, así que normalmente en la zona de la oroforinge hay combinaciones y concentraciones de estreptococos α- hemolíticos, algunas especies de Neisserias, estafilococos y algunas enterobacterias.

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Los estreptococos β- hemolítico es importante porque produce infecciones que al ser repetitivas puede llegar a producir secuelas, las 3 secuelas más importantes son: las glomerulonefritis, endocarditis y fiebres reumáticas.

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15/04/08 Título de la práctica: Obtención de un cultivo puro Fundamento: Al diseminar sobre un medio de cultivo sólido una muestra de bacterias, diluida convenientemente, las células individuales quedarán lo suficientemente separadas unas de otras y crecerán en forma de colonias aisladas, a partir de las cuales se puede obtener un cultivo puro. Materiales: • Placa de cultivo agar sangre en la que se observe una colonia que haya podido provocar hemólisis • Placa de cultivo agar sangre virgen • Asa de siembra • Mechero • SSF • Pipeta Pasteur • Portaobjetos Procedimiento: 1. Se parte de un cultivo en agar-sangre en el que cogemos la muestra de una colonia sospechosa de haber producido hemólisis. 2. Se esteriliza un asa de siembra en el mechero, se pincha en la colonia sospechosa. 3. Se emulsiona en un portaobjetos con 2 gotas de Solución Salina Fisiológica. 4. Se vuelve a esterilizar el asa de siembra y se procede a extender la placa en tres segmentos. 5. Se realizan las estrías separadas en la placa y se mete en la estufa de cultivos unas 24 horas. Resultados:

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08/05/08 Título de la práctica: Preparación de un medio de cultivo Instrucciones generales: Ya que se van a elaborar 3 medios de cultivo distintos hay que tener una serie de pautas de procedimiento comunes a todos ellos que son las siguientes: Hacer 250 ml. De un medio de cultivo, seguir las instrucciones del bote, esterilizar, colocar en Placa Petri, abrir la caja lo mínimo posible, no se puede llenar la placa Petri según sale del autoclave ya que hay que esperar a que alcance los 40ºC. El Agar Hierro de Kligler Fundamento: El Agar Hierro de Kligler es un medio empleado para la diferenciación de cultivos puros de bacilos Gram negativos en base a su capacidad para fermentar la dextrosa y la lactosa y a la producción de sulfuro de hidrógeno. El Agar Hierro de Kligler es una modificación de la fórmula original de Kligler que era un medio con bajos nutrientes, dextrosa, indicador de Andrade y acetato de plomo. Russell trabajó con un medio con dextrosa, lactosa y un indicador de pH para la diferenciación de bacilos Gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Kligler encontró que el acetato de plomo usado para la detección del sulfuro de hidrógeno, podrìa dar mejores resultados combinado con el medio de dos azucares de Russell para la diferenciación de los grupos tifoídico, paratifoídico y disentérico. Bailey y Lacy simplificaron la fórmula usando rojo de fenol como indicador. Un medio similar conteniendo sacarosa, triptofano, sulfato férrico y tiosulfato fue desarrollado por Sulkin y Willett. El extracto de levadura y las peptonas proveen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales, el sulfato férrico y el tiosulfato son indicadores de la producción de sulfuro de hidrógeno. El cloruro de sodio mantiene la presión osmótica y el agar es adicionado como agente solidificante. Composición: • Mezcla de Peptonas 20.0 • Cloruro de Sodio 5.0 • Lactosa 10.0 • Tiosulfato de Sodio 0.5 • Dextrosa 1.0 • Citrato de Hierro y Amonio 0.5 • Rojo de Fenol 0.025 12


• Agar Bacteriológico 15.0 pH 7.4 ± 0.2 Procedimiento: Preparación: 1. Suspender 52 g. en 1 litro de agua destilada 2. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto 3. Esterilizar a 121ºC durante 15 min. 4. Echar en la placa Petri. El Agar nutritivo: Fundamento: El Agar Nutritivo es utilizado para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos. A principios de 1900 la APHA (American Public Health Association) sugirió esta formulación como un medio de cultivo estándar para el análisis de agua. El Agar Nutritivo se encuentra descrito en los Métodos Estándar de la APHA y de la AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists) para el análisis de agua, leche y sus derivados, alimentos y otros materiales. El Agar Nutritivo sigue siendo un medio ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no fastidiosos. En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrógeno, vitaminas y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante. Composición: • Peptona de Gelatina 5.0 • Extracto de Carne 3.0 • Agar Bacteriológico 15.0 pH 6.8 ± 0.2 Procedimiento: Preparación: 5. Suspender 23 g. en 1 litro de agua destilada 6. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto 7. Esterilizar a 121ºC durante 15 min. 8. Echar en la placa Petri. El Agar CLED Fundamento: Agar CLED (por sus siglas en inglés Cystine Lactose-Electrolyte-Deficient) es utilizado para el cultivo, diferenciación y enumeración de bacterias en orina. El Agar Cled es una modificación de la fórmula desarrollada por Sandys, quien desarrolló un medio deficiente en electrolitos, lo que ayudaba a evitar la formación 13


de swarming por el género Proteus. Mackey y Sandys modificaron la fórmula original sustituyendo la lactosa y sacarosa por manitol y aumentando la cantidad de indicador y agar. Una nueva fórmula revisada omite la sacarosa e incluye cistina (Cystine Lactose – Electrolite-Deficient). El Agar Cled es un medio recomendado para siembra en placa por estría para la determinación de bacterias en orina. Este medio favorece el crecimiento de patógenos urinarios y hace distinción en la morfología de las colonias. El Agar Cled carece de electrolitos (sales) necesarios para el crecimiento de cierto tipo de bacterias que crecen en el tracto urinario. Las peptonas contenidas en el medio proporcionan el nitrógeno, vitaminas y aminoácidos. La L-Cistina es añadida como suplemento para el crecimiento de coniformes cistina dependientes. La lactosa se incluye como fuente de carbón. Los organismos capaces de fermentar la lactosa bajarán el pH y cambian el color del medio (de verde a amarillo). El azul de bromotimol es empleado como indicador del pH. El Agar bacteriológico se usa como agente gelificante. Composición: • Lactosa 10.0 • Peptona Bacteriológica 4.0 • Triptona 4.0 • Extracto de carne 3.0 • L-Cistina 0.128 • Azul de Bromotimol 0.02 • Agar Bacteriológico 15.0 pH 7.3 ± 0.2 Procedimiento: Preparación: 9. Suspender 36 g. en 1 litro de agua destilada 10. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto 11. Esterilizar a 121ºC durante 15 min. 12. Echar en la placa Petri. Resultados:

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05/06/08 Título de la práctica: Control de calidad de un pipeteo Para asegurar el buen estado de los instrumentos de medida utilizados en un laboratorio de análisis clínicos, en primer lugar, se deben seguir las instrucciones de mantenimiento recomendadas por los fabricantes de dichos instrumentos, pero, además, es necesario aplicar sobre ellos unos mecanismos de control, encaminados a comprobar su buen funcionamiento. El control de las pipetas dispensadoras de líquidos incluye el estudio de la exactitud y de la precisión de la dispensación. Esto se puede realizar con un método gravimétrico o mediante un método espectrofotométrico. El método gravimétrico consiste en dispensar repetidamente el mismo volumen de agua en el interior de un recipiente previamente dispuesto en una balanza debidamente tarada y anotar los resultados de las sucesivas pesadas que se efectúan. Con el cálculo de la diferencia entre los resultados de cada pesada y la inmediatamente anterior, se obtiene el peso de cada uno de los volúmenes de agua dispensados. A partir de estos resultados, se puede efectuar una evaluación de la calidad de la dispensación a través del cálculo del coeficiente de variación de la serie de valores y de la exactitud de su valor medio con respectosl que teóricamente se ha de obtener. El coeficiente de variación permite evaluar la precisión de la dispensación y la exactitud del valor medio con respecto al valor teóricamente real indica el grado de error sistemático que existe en ella. El método espectrofotométrico consiste en preparar repetidamente la misma disolución de una sustancia, cuya absorbancia es conocida, y, después, medir espectrofotométricamente la absorbancia obtenida con cada una de las disoluciones preparadas. Con los resultados así obtenidos, se puede efectuar una evaluación de la calidad de la dispensación mediante el cálculo de su coeficiente de variación y de la exactitud de la absorbancia media con respecto a la absorbancia teórica de la disolución. El control de los espectrofotómetros de absorción molecular ultravioleta-visible abarca numerosos aspectos, uno de ellos es la verificación de la exactitud y de la precisión en la medida de las absorbancias. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante la preparación de la disolución de una sustancia, cuya absorbancia es teóricamente conocida, y la posterior medida repetitiva de su absorbancia con el espectro-fotómetro sometido a control. Con ello

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se obtienen una serie de valores que, al ser procesados estadísticamente, indican el grado de calidad de la medición. Fundamento: Tras la preparación repetitiva de la misma dilución de paranitrofenol, se puede evaluar la calidad del pipeteo necesario para esta preparación, mediante la medición espectrofotométrica de la absorbancia de cada una de las diluciones de paranitrofenol elaboradas a 400 nm. Además, también se puede evaluar la calidad de la medición espectrofotométrica mediante la medida repetitiva de la absorbancia de una sola de las diluciones de paranitrofenol, previamente preparadas. Material: • Una piepeta de vidrio graduada y capaz de dispensar 1ml. • Una pipeta automática capaz de dispensar 50 μl. • Una punta de pipeta automática de color amarillo. • Una cubeta de espectrofotometria, desechable y de tipo semimicro. • Un espectrofotómetro capaz de hacer lecturas de absorbancia a 400 nm. • Agua destilada. • Solución de paranitrofenol (pnitrofenol) en sosa (hidróxido sódico o NaOH). Esta solución se puede preparar, por ejemplo, de la siguiente forma: • Disolver 800 mg de sosa en 1 litro de agua destilada (solución de sosa a 20 mmol/l). Disolver 50 mg de paranitrofenol en 1 litro de la solución de sosa preparada previamente (solución de paranitrofenol a 0,36 mmol/l).

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Procedimiento: Depositar, con la pipeta de vidrio graduada, 1 ml de agua destilada en el interior de una cubeta de espectrofotometría de tipo semimicro. Añadir 50 μl de la solución de paranitrofenol a 0,36 mmol/l al agua destilada mediante la pipeta automática. Mezclar ambos líquidos mediante sucesivas aspiraciones y eyecciones, ejecutadas con la pipeta automática. Seleccionar la longitud de onda de 400 nm en el espectrofotómetro. Medir la absorbancia de la dilución de paranitrofenol preparada, frente a un blanco de agua destilada. Repetir la preparación de la dilución de paranitrofenol y la lectura de su absorbancia con el mismo material al menos 15 veces. Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de la serie

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de valores así obtenidos. 8. Con el blanco y con la última dilución de paranitrofenol preparada, realizar al menos 20 mediciones repetidas de la absorbancia de esta dilución. Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de esta segunda serie de valores. Interpretación clínica de los resultados: El coeficiente de variación de la primera serie de valores de absorbancia, obtenidos a partir de las múltiples diluciones de paranitrofenol preparadas, nos indica el grado de precisión con el que se han preparado las diluciones y, por lo tanto, nos expresa el nivel de repetibilidad del pipeteo. La repetibilidad del pipeteo sólo es aceptable si el coeficiente de variación obtenido no supera el 1%. El coeficiente de variación de la segunda serie de valores, obtenida a partir de las repetidas lecturas ele absorbancia efectuadas sobre una sola dilución de paranitrofenol, nos indica el nivel de repetibilidad de la medición espectrofotométrica y, por lo tanto, el estado de funcionamiento del espectrofotómetro. Resultados:

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30/05/08 Título de la práctica: Realización de un antibiograma Fundamento: Existen diferentes técnicas para estudiar la actividad de los antibióticos frente a distintos microorganismos, utilizándose en clínica pruebas esencialmente cualitativas, aunque en muchos casos se requieren determinaciones cuantitativas. En estas prácticas vamos a efectuar ensayos de ambos tipos. Las pruebas cualitativas o antibiograma se van a efectuar con la bacteria problema mientras que las cuantitativas las haremos con una bacteria conocida (E.coli ). Cada pareja deberá pues inocular el día anterior al del ensayo su bacteria problema E. coli en sendos tubos de caldo común, procurando evitar contaminaciones. Las pruebas que vamos a realizar se basan en la difusión del antibiótico sobre una placa de medio a partir de un punto central. En este caso, una cantidad concreta del antibiótico se encuentra incluido en un disco de papel que se deposita sobre una placa de agar común, que ha sido previamente inoculada con una fuerte dosis de la bacteria a ensayar. Así, el disco de papel absorbe agua de la placa, se disuelve el antibiótico y se inicia el proceso de difusión de éste hacia las zonas que lo rodean, generándose un gradiente de concentración cuyo nivel máximo se encuentra bajo el disco. Las bacterias que se inocularon crecerán durante su incubación allí donde la concentración del antibiótico sea lo suficientemente baja como para no impedírselo (normalmente alejado del disco), mientras que no podrán hacerlo en las proximidades del disco donde las concentraciones del antibiótico son elevadas. Puesto que los límites de concentración de antibiótico que afectan al cultivo son por regla general muy estrechos, se suelen formar halos de inhibición, esto es, zonas sin bacterias alrededor de los discos, de bordes bastantes definidos y cuyo diámetro tiene que ver con la concentración de antibiótico que había en el disco y con la sensibilidad a éste de las bacterias ensayadas. Procedimiento: 1. Funda el medio de cultivo y déjelo enfriar a 45-50°C. 2. Vierta asépticamente suficiente cantidad de medio de cultivo en una placa de Petri, para obtener una capa de 4 mm de espesor. Para una placa de 10 cm.

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de diámetro se requieren 30 mL de medio y para una de 15 cm se requieren 70 mL. Deje solidificar el medio de cultivo y luego seque las placas durante 30 minutos antes de usarlas para la inoculación. Inocule la placa mediante un hisopo estéril utilizando una suspensión del germen de 18 a 24 horas .Frote el hisopo sobre la superficie del medio de cultivo. Repita esta operación por tres veces sucesivas, rotando la placa para obtener una dispersión uniforme del inóculo en toda la superficie. Coloque la tapa a la placa y deje secar el inóculo por 3 a 5 minutos. Coloque los discos con los antibióticos sobre el agar mediante pinzas estériles o usando un aplicador de discos. Oprima los discos suavemente con una pinza para asegurar un buen contacto con el medio de cultivo. Los discos deben estar espaciados de manera que su distancia a la pared de la placa sea de 15 mm y entre ellos de 30 mm. Incube a 35 – 37°C hasta el siguiente día (aproximadamente 18-19 horas). Si se requieren los resultados con rapidez se pueden leer las zonas de inhibición después de 6-8 horas de incubación, pero estos resultados deben ser confirmados mediante una nueva lectura después de la incubación por las 18 -19 horas.

Resultados: En el caso del antibiograma, se hará un cuadro de sensibilidad (S) o resistencia (R) para cada uno de los antibióticos frente a esta estirpe, y posteriormente serán utilizados como criterio para la determinación de la bacteria problema. El criterio a seguir, internacionalmente reconocido, será: Sensible (S) si el diámetro del halo es mayor de 15 mm Resistente (R) si el diámetro del halo es menor de 13 mm (Las dos placas hechas no han producido halo, por lo tanto se dice que el microorganismo es resistente al antibiótico) Intermedio (R/S) si el diámetro del halo está comprendido entre 13 y 15 mm En el caso del ensayo cuantitativo se representará el diámetro del halo frente al logaritmo de la concentración correspondiente. Los puntos obtenidos entonces se ajustarán a una recta, de la que se extrapolará la concentración necesaria para generar un halo de 15 mm, que será considerada como la concentración mínima inhibitoria (CMI) de este antibiótico frente a la bacteria ensayada. Interpretación clínica de los resultados: Ciertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se inscriben en el DNA bacteriano. Su expresión en el organìsmo, en donde las

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condiciones en cuanto a medios son diferentes, expondría al riesgo de fracaso terapéutico. Para evitar esto, el antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir, a través de la comparación de las respuestas para cada antibiótico, un mecanismo de resistencia incluso débilmente expresado. Así, gracias a la interpretación, una cepa que aparece como falsamente sensible será categorizada como I o R (Ejemplo: Una cepa de Klebsiella pneumoniae productora de BLSE puede aparecer sensible in vitro a las cefalosporìnas de 3" generación. El resultado de Sensible debe ser corregido a Intermedio o Resistente, ya que la utilización de estos antibióticos correría el riesgo de provocar un fracaso terapéutico).

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02/06/08 Título de la práctica: Realización de una gráfica de control de calidad a partir de datos sobre glucosa hexokinasa. Procedimiento: 1. Se necesita una serie considerable de datos para realizar la gráfica (unos 20). 2. Se realizan las medidas de las 20 preparaciones de la misma muestra a través de fotocolorímetro. 3. Una vez obtenidas las absorvancias se calculan las concentraciones en mg./dl. 4. Se haya la media y la desviación estandar que no debe ser superior al 5%. Resultados:

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02/06/08 Título de la práctica: Elaboración de una gráfica de Levey- Jennings Fundamento: La desviación estándar es el parámetro para crear la gráfica en la cual se indican los valores diarios de los controles. Esta gráfica se crea para cada prueba y para cada nivel de control Los límites de la gráfica son ±1SD,±2SD,±3SD, respecto al promedio aritmético. Procedimiento:

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30/05/08 Título de la práctica: Realización de un antibiograma

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Practicas recogida, preparación y conservación de muestras biológicas humanas