Informe resistentica bacteriana e coli

Informe de laboratorio - Microbiología Resistencia antimicrobiana y recombinación genética mediada por transformación de Escherichia coli Johan A. Villada Ramos Laboratorio de biología, Dpto. biología, Facultad de ciencias básicas y tecnologías, Universidad del Quindío, Armenia, Colombia.

E-mail: johanvilladaramos@gmail.com, javilladar@uqvirtual.edu.co

RESUMEN La resistencia bacteriana es un problema antiguo pero de gran actualidad, ya que en un marco de “austeridad” en cuanto al número de nuevas moléculas de antibióticos disponibles en el mercado, la presencia de microorganismos multirresistentes es cada vez más frecuente. Siendo E. coli el microorganismo más frecuentemente implicado en bacteriemias nosocomiales y comunitarias. Escherichia coli fue expuesta a 4 antimicrobianos (gentamicina, ampicilina, imipenem y penicilina) con el fin de verificar su resistencia/sensibilidad, tomando como punto de referencia el diámetro de la zona de inhibición (halo) expresada por la cepa bacteriana frente al antimicrobiano, donde dos antibióticos betalactamicos (penicilina – ampicilina) fueron inhibidos por enzimas (betalactamasas) producidas por la cepa, presentado resistencia hacia estos. Por otra parte, se quiso probar la capacidad de recombinación genética específicamente transformación donde se introdujo una cepa normal (no resistente a ampicilina) de E.coli en un ambiente acuoso de bacterias lisadas resistente al antibiótico ampicilina mostrando su capacidad de recombinación y a su vez la resistencia adquirida hacia la ampicilina pudiendo así crecer en medios donde halla presencia de este-antimicrobiano.

Palabras-clave: Escherichia coli, resistencia bacteriana, recombinación genética, antibiótico.

INTRODUCCION La resistencia bacteriana es un fenómeno biológico natural, de modo que cada vez que se pone en uso un nuevo agente antimicrobiano (AAM) en la práctica clínica, el laboratorio de microbiología detecta cepas resistentes. Una cepa resistente se define como aquella que es capaz de multiplicarse en presencia de concentraciones mayores que las

alcanzadas con dosis terapéuticas (García, 2003).

En general, todos los mecanismos de resistencia pre-existen o se modifican en la naturaleza, ya sea por transferencia de genes de resistencia o por mutaciones, que pueden localizarse en el cromosoma bacteriano o en plásmidos. Por esto se puede suponer que los AAM tendrán actividad por un tiempo limitado, según la

Informe de laboratorio - Microbiología presión selectiva que este AAM ejerza sobre la población bacteriana. La presión selectiva resulta de la administración de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento de microorganismo susceptibles pero selecciona cepas resistentes (intrínsecas o adquiridas) al AAM (García, 2003).

La utilización terapéutica de la penicilina y otros antibióticos a partir de los años cuarenta ha sido uno de los logros más importantes de este siglo. Desde entonces se han obtenido, comercializado y utilizado una gran cantidad de antimicrobianos y sin embargo, así como al comienzo de la era antibiótica se tenía la falsa esperanza de que las enfermedades producidas por microorganismos desaparecerían, pronto se puso de manifiesto que las bacterias eran capaces de desarrollar mecanismos de resistencia y así en los años 50 ya se conocían cepas de Staphylococcus aureus resistentes a penicilina entre otros (Daza, 1998).

Las bacterias, por su tremenda capacidad de adaptación, pueden desarrollar mecanismos de resistencia frente a los antibióticos. Existe una resistencia natural o intrínseca y su aparición es anterior al uso de los antibióticos, es decir, todas las bacterias de la misma especie son resistentes a algunas familias de antibióticos y eso les permite tener ventajas competitivas con respecto a otras cepas y pueden sobrevivir en caso que se emplee ese antibiótico y, por otra parte la resistencia adquirida cuya aparición de dicha resistencia bacteriana se produce a

través de mutaciones (cambios en la secuencia de bases del cromosoma) y por la trasmisión del material genético extracromosómico procedente de otras bacterias.

En el primer caso, la resistencia se trasmite de forma vertical de generación en generación. En el segundo, la trasferencia de genes se realiza horizontalmente a través de plásmidos u otro material genético movible como integrones y transposones; esto último no solo permite la trasmisión a otras generaciones, sino también a otras especies bacterianas. De esta forma una bacteria puede adquirir la resistencia a uno o varios antibióticos sin necesidad de haber estado en contacto con estos (Díaz, 2003).

Las bacterias han desarrollado varios mecanismos para resistir la acción de los antibióticos. El primero de ellos es por la posición de un sistema de expulsión activa del antimicrobiano, una especie de bomba expulsora que utilizan las bacterias para la excreción de productos residuales o tóxicos, con la que puede eliminar además muchos de estos agentes antibacterianos. El segundo, se realiza mediante la disminución de la permeabilidad de la pared bacteriana, con la pérdida o modificación de los canales de entrada (porinas). La producción de enzimas inactivantes de los antibióticos constituye el tercer mecanismo y por último, algunos antibióticos ejercen su acción contra las bacterias uniéndose a una proteína esencial para la supervivencia de estas. La resistencia bacteriana se produce cuando el microorganimo modifica la proteína

Informe de laboratorio - Microbiología diana, y cambia su función o produce enzimas distintas (Diaz, 2003).

transformadas para algún (Acosta & Zavala, 1996).

En el caso de las bacterias existen tres mecanismos de trasnferencia genetica: transformación, conjugación y transducción. Dado que en el presente trabajo solo se promovió la transformación (recombinación genética) por consiguiente se va a profundizar más en este mecanismo de recombinación.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En determinadas condiciones fragmentos de ADN exógeno o ADN transformante (tamaño superior a 3 x 105 dalton y longitud comprendida entre 5 x 106 y 15 x 106, que equivale a 200.000 pares de bases) con estructura helicoidal intacta pueden unirse a células bacterianas competentes y entrar en su interior. La entrada de estos segmentos necesita de la presencia de iones de k+, Mg++ y Ca++.

El ADN entra en el espacio periplasmático, entre la pared celular y la membrana plasmática, allí una endonucleasas corta las dobles hélices en fragmentos de menor tamaño, posteriormente se degrada una de las dos hélices, de manera que lo que entra en el citoplasma el ADN de una hélice (monocatenario). Estos fragmentos de ADN monocatenario o ADN transformante pueden sustituir a fragmentos de ADN homólogo del cromosoma principal bacteriano mediante un mecanismo especial de recombinación.

La recombinación genética tiene lugar entre el ADN transformante y el ADN de la bacteria receptora y se detecta por la aparición de bacterias descendientes

carácter.

La cepa de Escherichia coli aislada presento los siguientes resultados al ser tratada con los cuatro antibióticos (Véase.

Tabla.1) (Fig.1).

Fig.1. Prueba de resistencia bacteriana con discos (antibióticos) para la detección de resistencia/sensibilidad de E.coli.

Penicilina (P). Ampicilina (AMP).

Gentamicina (CN). Imipenem (IMP).

Tabla.1. Valores de halos inibitórios de E.coli. Antibióticos a los que fue sometida la cepa bacteriana de E.coli presentado un halo al cual se le tomo la medida (mm) respectiva.

Antibiótico Penicilina - P10 Ampicilina – AMP 10 Imipenem - IMP 10 Gentamicina - CN 10

Diámetro de la zona de inhibición No presento 12mm 24 mm 14mm

La cepa estudiada fue clasificada como susceptible, de susceptibilidad intermedia

Informe de laboratorio - Microbiología o resistente según el antibiótico siguiendo las normas del NCCLS (2000).

La cepa de E.coli aislada presento resistencia a la penicilina G (P10) dado que no se observó el halo característico de posible sensibilidad al antibiótico (Fig.1), entonces la cepa bacteriana está en condiciones óptimas para crecer en entornos que contengan penicilina G, esto siguiendo las recomendaciones de National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1999).

Seguramente la cepa bacteriana aislada sea productora de betalactamasas y dado que la penicilina es un antibiótico betalactámico de acción bactericida que actúa inhibiendo en la última fase la síntesis del peptidoglicano, por consiguiente la producción de betalactamasas, enzimas capaces de hi drolizar el enlace amida del anillo betalactámico, sería el principal mecanismo de resistencia (betalactamasas plasmídicas) de E.coli para este caso (Garcia et al. 2011).

Según García et al.2011 la resistencia a betalactámicos está mediada por varios mecanismos que en su mayoría se dan en Gram-positivos y en algunos Gram – negativos como la alteración de la diana (PBP), disminución de la permeabilidad, mecanismos de eflujo o expulsión del antibiótico, inactivación enzimática por betalactamasas, de las cuales podría suceder 1) betalactamasas cromosómicas, y 2) betalactamasas plasmídicas: Betalactamasas de espectro extendido (BLEE). Además dado que penicilina G fue el primer antibiótico empleado

ampliamente en medicina, no es sorprendente que para bacterias tan comunes en el ambiente y que estén asociadas a enfermedades como E.coli al ser tratadas con este antibiótico hayan desarrollado un total mecanismo de resistencia frente a penicilina G. Escherichia coli también presento resistencia frente ampicilina (AMP) debido a que a el diámetro del halo correspondió a 12 mm (Tabla.1)(Fig.1), indicando que el antibiótico betalactámico ejerció plenamente la acción bactericida (NCCLS 2000). Según el método Kirby & Bauer (2011) E. coli presenta resistencia frente a la ampicilina marcando un halo inhibitorio inferior a 13 mm caso que concuerda con los resultados obtenidos (Tabla.1) dado que la cepa aislada presento bectalactamasas que inhiben la acción bactericida de AMP, sin embargo en estudios realizados por Valdivieso et al. (1999) y Vignoli & Seija (2001) aseguran que no siempre es suficiente con que el microorganismo posea un gen que codifica un mecanismo de resistencia en particular. Ese gen o esos genes deben ser expresados en cantidad y calidad suficiente, y muchas veces deben interactuar distintos mecanismos de resistencia para alcanzar la sobrevivencia bacteriana, destacando la expresión en E. coli de su betalactamasa de clase C (tipo Amp-C). El gen que codifica para esta enzima capaz de romper distintos antibióticos betalactámicos se encuentra naturalmente codificado en el cromosoma de dicha bacteria, sin embargo la expresión de esta enzima es mínima debido a que este

Informe de laboratorio - Microbiología microorganismo carece del promotor natural (Amp-R). De este modo, si bien E. coli posee un gen capaz de producir un efectivo mecanismo de resistencia, su escasa expresión (asociada a la acción residual de algún promotor que se encuentre corriente arriba en el cromosoma bacteriano) hace que el microorganismo pueda comportarse como sensible a ampicilina.

Dado que estos aportes son un poco antiguos comparándolos con las tasas de crecimiento bacteriano que se dan a nivel exponencial que incrementa a su vez las tasas de generaciones. En base a este análisis se dedujo que la cepa de E.coli es resistente frente a ampicilina, además hay más estudios que corroboran estos resultados como la GREBO (2011) que afirman que las enzimas tipo OXA como el gen blaOXA-1 ha sido identificado en Enterobacterias resistentes a ampicilina como son E. coli, Shigella flexneri y Salmonella spp, este gen está asociado con genes que codifican β- lactamasas de espectro extendido (BLEE).

Al usarse los antibiogramas clínicamente para estudiar la resistencia de un microorganismo específico y así prever si alguna terapia antimicrobiana puede tener resultados favorables en un paciente, se usan ciertos rangos (diámetro del halo de inhibición) para determinar la sensibilidad o resistencia del microorganismo frente a concentraciones de uno o varios antibióticos, pero hay diámetros en los que no se puede determinar esto, este rango se encuentra bajo el nombre de indeterminado; en el

estudio realizado a la cepa de E.coli se encontró que la Gentamicina según el diámetro del halo inhibición presentado se encuentra bajo la etiqueta indeterminado, ya que a partir de los datos obtenidos no es posible concluir con certeza si la bacteria es resistente o susceptible al antimicrobiano.

El antimicrobiano Gentamicina es un aminoglúcido que actúa en los una de las subunidades de los ribosomas, no permitiendo la correcta síntesis de proteínas y favoreciendo la permeabilidad a otros antimicrobianos, al formar canales gracias a las proteínas defectuosas sintetizadas por el microorganismo. La resistencia a los amino-glúcidos (en este caso Gentamicina) está determinado por tres principales factores: vías de enzimáticas (similar al caso de los βlactamicos), modificación al sitio de acción (subunidad ribosomal) o disminución de la vía de captación (Forbes, 2009).

Para este caso en el que se presenta una indeterminación puede presentarse el inicio de un proceso de resistencia por disminución de la vía de captación, esto es muy común en bacterias Gram negativas debido a la capa lipídica exterior y al tamaño de sus porinas (proteínas canal), otro mecanismo puede ser la utilización por parte de la bacteria de alguna enzima que fosforile el grupo hidroxilo, una vez modificado el aminoglúcido puede perder la afinidad de la unión a la subunidad 30s del ribosoma parcial o totalmente, permitiendo así la correcta expresión de las proteínas (Forbes, 2009).

Informe de laboratorio - Microbiología En el caso del sensidisco con Imipenem fue el único con el que la bacteria analizada presento sensibilidad, esto es debido a la resistencia del antibiótico a la acción de las β-lactamasas, ya que el antibiótico es de la familia de los carbapenem, que son una variedad de antibióticos β-lactamicos altamente resistentes a la acción de las β-lactamasas, al ser un antibiotico β-lactamico presenta un mecanismo de acción similar al previamente descrito con la penicilina. La actividad in vitro del Imipenem ha demostrado que el antibiótico tiene una buena acción frente a enterobacterias tales como E. coli, esto apoya el resultado obtenido acerca de la sensibilidad de la bacteria analizada hacia el Imipenem (Mendoza, 2008).

Tabla.2. Interpretación del diámetro de la zona de inhibición de la Tabla.1 para los cuatros antimicrobianos seleccionados contra Escherichia coli.

Antibiótico

Concentració n del disco (mm)

Interpretación

Penicilina Ampicilina Imipenem Gentamicina

10µg 10µg 10µg 10µg

Resistente Resistente Sensible ---------

El serotipo de Escherichia coli sensible al antibiótico o cepa normal que fue expuesta en el medio de bacterias transformadas y lisadas (resistente a la ampicilina), expreso luego su resistencia adquirida al crecer en un medio MK con ampicilina, es decir, la cepa bacteriana (F-) adquirió fragmentos de ADN exógeno proveniente de las bacterias

lisadas, que se encontraban libre en el medio, e incorporándolo en su ADN plasmídico y realizando todo el proceso de síntesis de enzimas (posiblemente betalactamasas) para poder inhibir el antibiótico betalactamico, convirtiéndose en una cepa bacteriana resistente a la ampicilina (F+) o competentes para la transformación. Esta resistencia adquirida se pudo realizar gracias a uno de los mecanismos de recombinación genética llamada transformación que poseen las bacterias y es el de interés académico para este estudio.

Según Cejudo et al. (2000) el método de transformación mediante choque térmico de células competentes con cationes divalentes es muy rutinario dada la facilidad de realización del mismo y la no necesidad de utilizar aparatos sofisticados, a diferencia de la electroporación o la biobalística. No obstante la eficiencia del mismo puede resultar baja según el caso, y dado que no se conocía el plásmido específico que fue transferido a la célula transformada para poder inhibir el antibiótico, no se puedo hacer un estudio más detallado de este, sin embargo, se sabe que para que se produzca la transformación de una bacteria ésta debe encontrarse en un estado fisiológico denominado “de competencia”. Las células competentes son aquellas susceptibles de ser transformadas y, por lo tanto, tomar ADN externo e introducirlo en su citoplasma.

Este análisis es el más certero y profundo que se puede realizar dado los datos obtenidos. Además el ADN asimilado de esta forma puede expresar sus genes en la

Informe de laboratorio - Microbiología bacteria transformada produciendo enzimas capaces de inhibir la acción bactericida de los antibióticos siendo el caso de la ampicilina.

CONCLUSIONES Los mecanismos de resistencia a antimicrobianos son muy variados, las mutaciones y la transferencia genética permiten a las bacterias sobrevivir ante la acción bactericida de diferentes compuestos utilizados para su eliminación o control.

En E. coli encontramos una mayor resistencia bacteriana a antibióticos bectalactamicos dando como mayor porcentaje de resistencia a penicilina G y en segundo puesto a ampicilina.

La transformación genética bacteriana se realizó a través de la transferencia de un plásmido a la bacteria E. Coli, para que está adquiriera resistencia a la ampicilina.

El método que se utilizó para transformar genéticamente las bacterias es relativamente sencillo, obteniéndose resultados comprobables sin necesidad de procesos sofisticados.

Se confirmó que las características que proporcionan los plásmidos le otorgan ventajas a la bacteria, las cuales son útiles en la supervivencia de las bacterias en ambientes hostiles.

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