Unidad 2. Microbiología

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Microbiología y taxonomía microbiana Microbiología

Programa de la asignatura:

Microbiología y taxonomía microbiana

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Microbiología

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Índice

Presentación de la Unidad………………………………………………………..….…………..2 Propósitos…………………………………………………………………………...………………3 Competencia específica………………………………………………………………...…………3 2.1. Definición de microbiología……………………………………………………..……….…..4 2.1.1. Microbiología ambiental …………………………………………………….…………..…6 2.1.2. Microbiología industrial …………………………………………………………..….….…8 2.2. Crecimiento microbiano …………………………………………………..………………….9 2.2.1. Crecimiento individual ………………………………………………………………...….10 2.2.2. Crecimiento poblacional ………………………………………………………….………11 2.3. Cultivo de microorganismos ………………………………….………………...………….11 2.3.1. Tipos de cultivos ………………………………………………………………………….12 2.3.2. Preservación de microorganismos ……………………………..……...……………….27 Actividades…………………………………………………………………………………...……29 Autorreflexiones……………………………………………………………………………..........29 Cierre de la Unidad………………………………………………………………………………30 Para saber más……………………………………………………………………………………30 Fuentes de consulta………………………………………………………………………………31

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Presentación de la Unidad La importancia de la Microbiología deriva de la necesidad biológica de estudiar los organismos que no son visibles a simple vista, y que sólo con ayuda de un microscopio se pueden observar, pero que su presencia en diferentes ambientes naturales o en la industria es indispensable, ya sea participando dentro de los ciclos de incorporación de nitrógeno, azufre y carbono, como aportando sus propiedades metabólicas dentro de algún proceso. Una de sus características importantes es que poseen la propiedad de adaptar su medio encontrando rápidamente las condiciones óptimas para crecer y colonizar lugares y ambientes tan variados e inimaginables que puedan existir, como la superficie de una prótesis ya implantada en el cuerpo de un paciente, un geiser a altas temperaturas, aguas con alto contenido en sales, las cavidades corporales de animales una herida, un reactor, entre muchos otros.

La microbiología es una rama auxiliar de la biología dedicada al estudio de la vida microscópica, es decir de los microorganismos de los que ya hemos hablado que comúnmente se les suele llamar microbios; podemos encontrarlos en todas partes (ubicuos) ya que son los más abundantes de la Tierra, El ser humano pudo darse cuenta de su existencia y observarlos hasta la llegada del microscopio a mediados del siglo XVII. Los primeros en visualizar la abundancia y diversidad de microorganismos a pesar de lo rudimentario de sus instrumentos, por ejemplo, los primeros microscopios fueron Robert Hooke y Antonie van Leeuwenhoek, observaron diferentes formas de vida microscópicas como levaduras, algunas bacterias entre otros microorganismos presentes en el agua de lluvia encharcada, fluidos corporales, superficies como suelos y rocas, entre otras.

Figura 1. Robert Hooke (1635-1703)

Figura 2. Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)

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Propósitos de la Unidad

En esta Unidad comprenderás cuestiones básicas sobre los microrganismos, así como su importancia dentro del ámbito industrial y ambiental. Asimismo, revisarás conceptos fundamentales de microbiología, medios de cultivo, y condiciones óptimas del crecimiento con el fin de entender el desarrollo cualitativo de las bacterias.

Competencia específica

Analizar el crecimiento bacteriano mediante el estudio de su fundamentación química para determinar el tipo y medio de cultivo según los distintos criterios de análisis de crecimiento.

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2.1. Definición de microbiología La Microbiología etimológicamente proviene de los vocablos griegos micro que significa pequeño, bios que significa vida y logos que quiere decir estudio o tratado; por lo tanto es la ciencia que estudia los seres vivos muy pequeños, cuyo tamaño se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano, por lo que se requiere el empleo del microscopio. Abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonómicos: desde partículas no celulares como los virus y hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos.

Figura 3. Campo de estudio de la microbiología

Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de tamaño microscópico dotados de individualidad, con una organización biológica sencilla, y que necesitan para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. Las características estructurales, su fisiología bioquímica, genética, taxonomía, ecología, entre otras son aspectos del estudio de la microbiología.

También se ocupa del estudio de las diferentes actividades microbianas y su relación con el ser humano, ya que pueden acarrear consecuencias tanto benéficas, como perjudiciales; por esta razón se estudian los nichos ecológicos de los correspondientes agentes, sus modos de transmisión, los diversos aspectos de la microbiota patógena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de éste, así como los métodos desarrollados para combatirlos y controlarlos, no olvidándose de aquellas que reportan beneficios por medio de los procesos microbianos para la obtención de materias primas o elaboradas, y de su modificación y mejora racional con vistas a su imbricación en los flujos productivos de las sociedades.

La microbiota comúnmente denominada flora nativa de un cuerpo sano (los integrantes de esta microbiota son bacterias), son un conjunto de microorganismos que intervienen benéficamente en los procesos vitales como la digestión de alimentos, la síntesis de vitaminas en el intestino, protección frente a patógenos, entre otras.

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A continuación se muestra un cuadro de las bacterias consideradas flora normal en humanos y su localización anatómica: Bacterias

Piel Conjuntiva Nariz Faringe Boca Intestino Uretra Vagina Grueso Staphylococcusepidermidis ++ + ++ + ++ + ++ + Staphylococcusaureus + +/+ + + ++ +/+ Streptococcusmitis + ++ +/+ + Streptococcussalivarius ++ ++ Streptococcusmutans + ++ Streptococcusfaecalis +/+ ++ + + Streptococcuspneumoniae +/+/+ + +/Streptococcuspyogenes +/+/+ + +/+ Neisseriae + + ++ + + + Neisseriameningitidis + + ++ + Veillonellae + +/B. Coliformes (E. coli) +/+/+/+ ++ + + Proteusmirabilis +/+ + + + + + Pseudomonasaeruginosa +/+/+ +/Haemophilusinfluenzae +/+ + + Bacteroides + + ++ + +/Espiroquetas + + + Lactobacilos + ++ + ++ Clostridios +/++ Clostridiumtetani +/Corinebacterias ++ + ++ + + + + + Micobacterias + +/+/+ + Actinomicetos + + Micoplasmas + + + +/+ ++ = más frecuente + = común +/- = irregular, ocasional o transitorio Tabla 1. Copyright 2011 Mama.com.mx Derechos reservados

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Figura 4. Localización de la flora normal del cuerpo humano.http://rantes22.blogspot.com/2011/04/la-flora-bacteriana-intestinal-podria.html

Finalmente, la Microbiología se ocupa de todas las técnicas y metodologías destinadas al estudio experimental, manejo y control de los microorganismos.

2.1.1. Microbiología ambiental La microbiología ambiental abarca el estudio de los microorganismos que habitan o existen en ambientes naturales o artificiales. El origen de los trabajos científicos en este campo se basa en las observaciones de Antonie van Lewenhoeck (1677). Los microorganismos pueden existir como células aisladas o como agregados celulares. Las células microbianas aisladas son capaces de llevar a cabo sus funciones vitales de crecimiento, generación de energía y reproducción independiente de otras células.

Además pueden alcanzar una elevada densidad poblacional en cultivos y son más fáciles de manipular para estudios genéticos como la manipulación de su ADN. La microbiología, además de ser una ciencia que auxilia a la biología, es una ciencia que proporciona herramientas para determinar la naturaleza de los procesos característicos de la vida en los que intervienen algunos microorganismos, enfocándose en la resolución de muchos problemas prácticos que son importantes en medicina, agricultura y la industria.

La fertilidad de los suelos depende en gran medida de los procesos que algunos microorganismos llevan a cabo, por entre ellosla fijación biológica del nitrógeno Universidad Abierta y a Distancia de México

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atmosférico, este proceso consistente en la reducción de N2 (nitrógeno molecular) a NH4+ (amonio) a cargo de la enzima nitrogenasa, es después de la fotosíntesis, la ruta metabólica más importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera.

Curiosamente, este proceso crucial sólo puede ser llevado a cabo por unos pocos procariotas; los microorganismos fijadores de nitrógeno no constituyen un grupo taxonómico homogéneo, la única característica que comparten es la presencia de la enzima nitrogenasa en sus procesos metabólicos, dichas bacterias comprendenorganismos fototrofos, como bacterias pertenecientes a la familia Rhodospirillaceae, Clorobiaceae y Cianobacteriae; organismos quimioautotrofos, como bacterias de los géneros Thiobacillus, Xanthobactery Desulfovibrioy organismos heterotrofos como las bacterias petenecientes a la familia Frankiaceae, al grupo Rhizobiaceae y a los géneros Azotobacter, Enterobacter, Klebsiellay Clostridium.

Figura 5. Ciclo de nitrógeno donde intervienen las bacterias. http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_24.asp?cuaderno=24

Estos organismos pueden realizar la fijación biológica de nitrógeno independientemente o estableciendo relaciones simbióticas con otros organismos; estas formas simbióticas son entre las rizobiáceas y las leguminosas, que antiguamente eran aprovechadas para la renovación de los suelos mediante la práctica de la rotación de cultivos.

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Figura 6. Ubicación de las bacterias fijadoras de nitrógeno.http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_24.asp?cuaderno= 24

2.1.2. Microbiología industrial A la Microbiología industrial también se le ha denominado biotecnología microbiana se puede definir como el ámbito de la microbiología orientado a la producción de elementos de interés industrial mediante procesos en los cuales intervenga, en algún paso, un microorganismo.

Por ejemplo, la producción de: alimentos (fermentación del pan o cerveza) y suplementos dietéticos (como los cultivos de algas, vitaminas o aminoácidos), biopolímeros, como el xantano, alginato, celulosa, ácido hialurónico, polihidroxialcanatos;3biorremediación de entornos contaminados4o tratamiento de desechos;5así como la producción de principios activos de interés en medicina, como la insulina y hormona del crecimiento o de sustancias implicadas en el diagnóstico.

La microbiología industrial es tan antigua como la manipulación de alimentos fermentados como el vino, pan o yogur. No obstante, durante el siglo XX su aplicación se diversificó con el ánimo de generar un gran número de compuestos químicos complejos de forma más sencilla y barata que mediante síntesis orgánica; este hecho se debe a la enorme versatilidad metabólica de los microorganismos que, frecuentemente, son capaces de producir los compuestos deseados o sus precursores. Por ejemplo, la microbiología industrial ha sido clave en la producción de penicilinas, naturales, como la penicilina G (esto es, producidas de forma totalmente microbiológica) o semi sintéticas, como la meticilina, que requieren la purificación de un intermediario que luego ha de modificarse química o enzimáticamente. Finalmente, la tecnología del ADN recombinante ha permitido, con un enfoque de ingeniería genética, diversificar aún más la disciplina,

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llegando a producirse proteínas humanas mediante microorganismos transformados con genes humanos.

Figura 7. Ámbito industrial de la microbiología. Editar de la web http://luisita28.blogspot.com/, http://sociologiarural.skyrock.com/

En la industria de los lácteos, frecuentemente se utilizan bacterias de tipo Gram (+) anaerobias, se caracterizan por una gran producción de acido láctico, se incluyen los géneros Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Por ejemplo la acidificación de la leche llevada a cabo por Streptococcuslactis y cremoris, la producción del yogurt y quesos de pasta cocida Steptococcusthermophilus.

Figura 8. LactobacilluscaseiShirotay algunos productos lácteos Obtenida de: www.sciencephotolibrary.com, http://www.sciencephoto.com/search?subtype=keywords&searchstring=lactobac illus&oldsearchstring=bacterias&matchtype=&sort_results=&media_type=image s&license=both&channel=sc

2.2. Crecimiento microbiano En un sistema biológico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo; por ejemplo cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para Universidad Abierta y a Distancia de México

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"fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. El aumento de la masa celular producido por acumulación de productos de reserva no constituyen crecimiento.

Figura 9. Visualizacion del crecimiento en caja petri y en el microscopio. Editar de la web

2.2.1. Crecimiento individual Consiste en el aumento del tamaño y peso de las células que precede a la división celular.

Esta división implica también un aumento en el número de células (proliferación de la población). Uno de los procesos que comúnmente experimentan las bacterias para dividirse es la fisión binaria, a través de la cual una célula madre al alcanzar un determinado volumen se divide dando dos células hijas. El proceso de fisión binaria consiste en la autoduplicación del material hereditario seguido de la repartición en las dos células hijas, las que se separan por estrangulamiento de la membrana celular y formación de la pared celular. Podemos referirnos más específicamente al crecimiento individual cuando realizamos el famoso experimento de germinar una semilla de frijol o de maíz, al cabo de unos cuantos días observamos que comienzan a brotar las partes que van a conformar una planta madura.

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Figura 10. División celular de una bacteria mediante el proceso de fisión binaria. Editar de la web http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Binary_fission_es.svg y http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.kj%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf

2.2.2. Crecimiento poblacional Es un crecimiento respecto al número de células (proliferación de la población). Se conoce como tiempo de duplicación generacional al tiempo en que tarda una población en duplicar su número. Los tiempos de duplicación varían según el microorganismo del que se trate. Por ejemplo, para obtener la primera generación de Escherichacoli(bacteria causante de infecciones intestinales) tarda en promedio12.5 min., Rhizobiummeliloti(bacteria que fija nitrógeno atmosférico) 1.8 hr y Nitrobactersp(bacterias que fijan nitrógeno atmosférico) aprox. 20 hr.

Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial prolongado. Si ello ocurriera en poco tiempo la tierra estaría cubierta de una masa microbiana mayor que la de la tierra misma. El crecimiento está normalmente limitado por la disponibilidad de nutrientes y por la acumulación de productos del propio metabolismo microbiano que en altas concentraciones resultan tóxicos para la población.

2.3. Cultivo de microorganismos Un medio de cultivo, es un recurso que sirve para lograr la multiplicación de microorganismos tales como bacterias, hongos y parásitos en el laboratorio, la finalidad

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de un medio de cultivo es proporcionar el ambiente óptimo para favorecer el crecimiento del microorganismo deseado.

Los cultivos son empleados en los campos de la medicina humana y veterinaria como métodos de propagación para el estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades. Por ejemplo nuestras manos que están en continuo contacto con diversas superficies que contienen un sinfín de microorganismos, por eso se recomienda lavarse antes de cada alimento y después de ir al baño.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura óptima ajustada a las necesidades particlares del microorganismo, al igual que la humedad y presión de oxígeno, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

Se recomienda por ejemplo lavarse las manos con frecuencia para evitar que la piel adquiera características ideales para alojar microorganismos que puedan causar algún daño.

Figura 11. Medio muy óptimo el que crecen bacterias. Editar de la web http://cienciaslacoma.blogspot.com/2010/09/microorganismos-en-nuestras-manos.html

2.3.1. Tipos de cultivos Un medio de cultivo para bacterias, es una mezcla de sustancias que permiten el crecimiento de las bacterias en el laboratorio. Un microorganismo se puede cultivar o sembrar en medio líquido o en medio sólido. Los medios de cultivo deben estar enriquecidos con distintos nutrientes que van, desde carbohidratos simples (azúcares), proteínas, lípidos (grasas) hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne, así como los requerimientos que nosotros necesitamos para crecer. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria Universidad Abierta y a Distancia de México

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individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

Figura 12. Izquierda medio de cultivo sólido y derecha medio de cultivo líquido. Editar de la web http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_(microbiolog%C3%ADa)

Se pueden clasificar según sus características físicas en: sólidos, semisólidos y líquidos.

La diferencia es sólo la cantidad de una sustancia que llevan para solidificar (agar): 

Líquidos: se preparan todos los constituyentes en una disolución acuosa (agua destilada). Ya disueltos, se reparten en matraces o tubos de ensayo que tapamos y esterilizamos con calor, proporcionan nutrientes a las bacterias y, además, es más fácil determinar sustancias producidas por las bacterias porque es más fácil purificar sustancias en medio líquido. Por ejemplo el medio de cultivo líquido de cerebro corazón infusión es apto para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobias como los estreptococos y neumococos.

Figura 13. Forma de esquematizar un medio de cultivo líquido. Editar de la web http://www.google.com.mx/imgres?q=cultivos+bacterianos+en+tubos+de+ensaye&um=1& hl=es&biw=1280&bih=593&tbm=isch&tbnid=51jS9cBFRnSynM:&imgrefurl= y http://www.slideshare.net/breid/pruebas-bioqumicas-y-medios-de-cultivo-en-bacterias

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

Sólidos: Se procede del mismo modo que con los medios líquidos, pero, al disolver en agua destilada, añadimos de 15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos en placas o cajas petri cuando está a unos 60 °C y cuando alcance los 50 °C ya serán sólidos. El agar nutritivo es utilizado como medio de cultivo sólido general para obtener el crecimiento de bacterias con pocas exigencias nutritivas, otro medio el agar Mac Conkey que se utiliza para el crecimiento d bacilos Gram negativos.

Figura 14. Forma de esquematizar un medio de cultivo sólido.



Semisólidos: su apariencia es de gel. Sólo llevan 5 g/l de agar, se utilizan poco, por ejemplo para determinar la movilidad bacteriana. Si se hace una siembra y la bacteria es inmóvil, la bacteria crecerá en la cara interna del tubo donde hicimos la siembra, pero si la bacteria es móvil crecerá alrededor de ese tubo.

El agar es un polisacárido obtenido de la pared celular de varias especies de algas rojas de los géneros Gelidium, Euchema y Gracilaria, la palabra agar viene del malayo agaragar, que significa jalea; es un elemento solidificante empleado frecuentemente para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse, no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

Figura 15. Agar. Editar de la web http://www.slideshare.net/breid/pruebas-bioqumicas-ymedios-de-cultivo-en-bacterias

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La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

Los medios de cultivo deben contener agua (H2O), carbono (C), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P), calcio (Ca), sodio (Na), magnesio (Mg), molibdeno (Mo), cobre (Cu) y zinc (Zn); es decir como si quisiéramos preparar un pastel necesitamos, leche, harina, huevo, mantequilla, saborizantes; entre otros, si alguno de estos faltara el paste no se podría terminar. Lo mismo sucede con los medios de cultivo, si falta algún nutriente no podrá propiciar el crecimiento de los microorganismos.

Figura 16. Ingredientes que debe contener un medio. Editar de la web http://www.slideshare.net/guested7523/crecimientomicrobiano

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

El oxígeno, como constituyente del agua, es esencial para todos los organismos. Sin embargo, el oxígeno molecular es requerido de diferentes maneras por los microorganismos Microorganismos aerobios: Requieren de manera obligada del oxígeno necesariamente para llevar a cabo su metabolismo. Existen dos grupos los organismos aerobios estrictos que requieren oxígeno en concentraciones similares a la atmosférica (20%) y los aerobios microaerófilos que requieren oxígeno en concentraciones inferiores a las de la atmósfera (5-10%).

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Microorganismos anaerobios: son aquellos organismos que no requieren de oxígeno para llevar a cabo sus funciones metabólicas, pudiendo ser de tres tipos: anaerobios facultativos aquellos que crecen en ausencia y en presencia de oxígeno pero crecen mejor con oxígeno, anaerobios estrictos aquellos que no solo no requieren oxígeno, sino que su presencia los destruye y los anaerobios aerotolerantes son aquellos que no requieren oxígeno pero lo toleran; no mueren en su presencia.

Medios de Cultivo: en función de su composición, distinguimos dos grupos de medios de cultivo:



Medios sintéticos o definidos: aquellos que contienen cantidades precisas de sustancias orgánicas e inorgánicas puras disueltas en agua destilada.



Medios complejos o indefinidos: contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composición indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos de levadura, bovril; la ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de crecimiento, por lo que podemos cultivar en él gran número de microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que el microorganismo está consumiendo, ejemplos: Caldo nutritivo: extracto de carne + peptona + agua, Agar nutritivo: extracto de carne + peptona + agua + agar.

Clasificación de los medios de cultivo 

Generales: son medios que requieren contenidos mínimos de C, N, S, P, energía, oligoelementos, pH adecuado.



Enriquecidos: se le llama así porque algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo generales; para lograrlo es necesario enriquecerlo con sustancias nutritivas como la sangre, el suero, extractos de tejidos animales, tales medios son enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos son microoorganismos exigentes o fastidiosos; un ejemplo de este tipo de medio de cultivo es el de agar-sangre.



Selectivos: aquellos que contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos; por ejemplo el cristal violeta inhibe las Gram +. Otra manera es modificar la fuente de carbono; si sustituimos la glucosa por maltosa, seleccionamos aquellos microorganismos capaces de digerirla.

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

Diferenciales: son medios que contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que determinados microorganismos adquiere coloraciones específicas o reaccionan de una manera determinada. Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos permiten diferenciar a las colonias que viven en el medio. Escherichiacoli forma colonias de color verde claro, mientras que E. enterobacter forma colonias de color rosa salmón.



De transporte: su única función es mantener vivas a las bacterias desde la toma de la muestra hasta su llegada al laboratorio. Les proporciona humedad (agar) y elimina los productos tóxicos (carbono activo).

Medios de Cultivo de uso Habitual Existen un sinfín de medios de cultivo, la mayoría de ellos son específicos para que crezca una bacteria en común, los más importantes se enuncian en la siguiente tabla:

Caldo común Caldo de extracto de carne bovina Caldo exento de azúcares Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa (TCBS) Prueba de VogesProskauer Caldo Suero

Tabla 2.

Agar-hígado Agar-patata glicerinado

Medio SIM Medio cerebral de Hibler

Medio biliado-verde brillante Agar eosina azul de metileno (EMB)

Medio al huevo de Dorset

Agar verde brillante

Agar huevo glicerinado

Caldo formiato-ricinoleato

Medio de LowensteinJensen Medio sintético de Dorset Agar-sangre-glucosa-cistina Medio #110 para estafilococos Agar Bacto-Middlebrook 7H10 Agar Bacto-Middlebrook OADC Enrichment Agar oleico base BactoDubos

Agua-suero de Hiss Solución Dunham Caldo triptósa fosfatado

Agar-desoxicolato Caldo base tetrationato Agar citrato de Simmons

Leche

Caldo urea

Caldo de enriquecimiento para PPLO Agar-nutritivo

Medio para la producción de toxina por estafilococos Agar SS (SalmonellaShigella)

Medio al suero hemático de Loeffler

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Agar-suero Agar-sangre Medio de Edwards Agar-sangre violeta-azidasódica Medio CIN para Yersinia Agar-chocolate Agar cetrimida Caldo con carbohidratos

Agar-urea base Medio descarboxilasa base Agar fenilalanina Agar nitrato

Agar de endo Medio al tioglicolato Patata Otros medios vegetales

Agar acetato de plomo Agar hierro de Kliger Gelatina nutritiva Agar Mueller-Hinton

Agar soya tripticasa Agar marino Zobell Agar Mac Conkey Medio Campy

A continuación se enuncian características de algunos medios: Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB) Es un medio utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilosentéricos Gram negativos. Este medio también es conocido como Agar EMB por sus siglas en inglés.

Permite la diferenciación de las colonias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras. Lasacarosa está incluida en el medio para detectar a los miembros del grupo coliforme que fermentan más rápidamente la sacarosa que la lactosa.

El envase donde viene el medio de cultivo contiene Digerido Pancreático de Gelatina 10.0 g/L, Lactosa 5.0 g/L, Sacarosa 5.0 g/L, Fosfato Dipotásico 2.0 g/L, EosinaY 0.4 g/L, Azul de Metileno 0.065 g/L, Agar Bacteriológico 15.0 g/L a un pH de 7.2± 0.2.

Se prepara suspendiendo 36 g del medio en un litro de agua purificada, calentar con agitación suave hasta su completadisolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles, recolectar las muestras y sembrarlas tan pronto lleguen al laboratorio, sembrar las placas por estría, incubar las placas a 35- 37°C durante 18 a 24 horas y observar el crecimiento.

Las colonias de Salmonella y Shigella son translúcidas, de color ámbar o incoloras. Los coliformesqueutilizan la lactosa y/o sacarosa producen colonias de color azul a negro con centros obscuros y brillometálico. Otros coliformes como Enterobacter presentan colonias mucosas de color rosa. Las cepas deEnterococcusfaecalis son parcialmente inhibidas.

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Figura 17. Medio de cultivo Agar EMB y colonias bacterianas de Enterobacteraerogenes. Editar de la web http://www.instrumentalmedico.com/productos/medios-de-cultivo-deshidratados/agareosina-azul-metileno-emb-levine-500g y http://archive.microbelibrary.org/ASMOnly/details.asp?id=2553&Lang

Agar MuellerHinton: Es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos por el método de Bauer-Kirby. Este medio también es conocido como Agar M-H. Se llevan a cabo pruebas de susceptibilidad a antibióticos, con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana.

En este me dio la infusión de carne y la peptona de caseína proveen la fuente de nitrógeno, vitaminas, carbón y aminoácidos. El almidón es agregado para absorber cualquier metabolito tóxico y el agar es adicionado como agente solidificante. Contiene infusión de carne 300.0 g/L, almidón. 1.5 g/L, peptona de caseína H 17.5 g/L, agar bacteriológico 17.0 g/L a un pH de 7.4 ± 0.2.

Agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto, esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas de Petri estériles. Para obtener desarrollo de Neisseria enfriar el medio a 45-50 °C y agregar sangre de borrego desfibrinada estéril al 5%calentada a 80 °C. Para realizar pruebas de oxacilina y meticilina con estafilococcos el medio deberá sersuplementado con 2% de cloruro de sodio.

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Figura 18. Agar Mueller-Hinton y una colonia de Pseudomonas aeruginoses. Editar de la web http://www.azuldiagnosticdb.com/upload/index.php?route=product/product&product_id=1366 y http://atlas.medmicro.info/index.php?jazyk=en&sekce=1&podsekce=8

Caldo nutritivo: Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto bacteriano. Puede ser utilizado además, como pre-enriquecimiento en la búsqueda de Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar células de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrógeno necesarias para el adecuado desarrollo dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias. Contiene pluripeptona 5.0g/L y extracto de carne 3.0g/L a pH final: 6.9 ± 0.2. Se prepara empleando 8 g de polvo por cada litro de agua destilada, calentar hasta disolver, distribuir y esterilizar en autoclave 118-121 °C durante 15 minutos, dejar enfriar y sembrar los microorganismos por inoculación directa incubándose después en aerobiosis a 35-37°C durante 24 horas.

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Figura 19. Envase de medio de cultivo de caldo nutritivo. Editar de la web http://www.jampar.com.pe/product/detalle/013010079.html

Agar Hierro de Kliger: Es un medio que se emplea para la diferenciación de cultivos puros de bacilos Gram negativos con base en su capacidad para fermentar la dextrosa y la lactosa y la producción de sulfuro de hidrógeno. Presenta extracto de levadura y peptonas que fungen como fuentes de nitrógeno, vitaminas y minerales, el sulfato férrico y el tiosulfato son indicadores de la producción desulfuro de hidrógeno.

También tiene cloruro de sodio que ayuda a mantener la presión osmótica. Funciona como agente solidificante. Contiene una mezcla de peptonas 20g/L, cloruro de sodio 5.0g/L, lactosa 10.0g/L, tiosulfato de sodio 0.5g/L, dextrosa 1.0g/L, citrato de hierro y amonio 0.5g/L, rojo de fenol 0.025g/L, agar bacteriológico 15.0g/L, a un pH de 7.4 ± 0.2 El método de preparación del medio, es suspender 52 g del medio en un litro de agua destilada, calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto, dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos, dejar enfriar en posición inclinada, el color del medio preparado es rojo y se suele colocar en tubos para la siembra de microorganismos.

Posteriormente para la siembra tomar una colonia bien aislada a partir de un medio sólido, inocular los tubos inicialmente por picadura en el fondo del tubo (de 3 a 5 mm) y posteriormente por estría en la superficie, incubar los tubos con las tapas flojas a 35- 37°C durante 18 a 48 horas, leer los tubos para la producción de ácido en el fondo y la superficie, así como la producción de gas y sulfuro de hidrógeno.

Los resultados se leen una superficie alcalina y un fondo ácido (rojo/amarillo) indica fermentación solo de la dextrosa, una superficie y fondo ácido (amarillo/amarillo) indica la fermentación de dextrosa y lactosa, una superficie y fondo alcalino (rojo/rojo) indica que Universidad Abierta y a Distancia de México

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no hubo fermentación de ninguno de los carbohidratos, la presencia de burbujas o fracturas en el medio indica la producción de gas, la presencia de un precipitado negro indica la producción de sulfuro de hidrógeno.

Figura 20. Formas en las que se visualizan resultados de la siembra de microorganismos en agar Hierro de kliger. Editado de la web http://www.slideshare.net/roberchavez/medios-de-cultivo-ypruebas-bioquimica-presentation

Caldo triptosa fosfatado: Medio que sirve para propósitos generales, útil para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, especialmente Streptococcusspp., a partir de diversas muestras. En el medio de cultivo, la tripteína aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo de microorganismos. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. Este medio de cultivo, es utilizado para el crecimiento de bacterias nutricionalmente exigentes. También puede agregarse como adyuvante a cultivos celulares, y permite el agregado de agar, sangre o acida sódica para ser utilizado en determinados propósitos. Contiene triptosa 20 g/L, glucosa 2.0 g/L, cloruro de sodio 5.0 g/L, fosfato disódico 2.5 g/L a un pH 7.3 ± 0.2. Se siembra directamente, a partir del material de estudio, incubándose en aerobiosis, a 35-37 ºC, durante 18-24 horas.

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Agar Salmonella-Shigella: También conocido como Agar SS, es utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clínicas y de alimentos. El Agar Salmonella Shigela tiene un desempeño superior a otros medios para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella.

En este medio las sales biliares #3.3 y el verde brillante actúan como inhibidores de bacilos Gram positivos, de la mayoría de bacilos coliformes y del swarming en Proteusspp., mientras que permiten el crecimiento de Salmonella spp. El tiosulfato de sodio y el citrato férico permiten la detección de la producción de H2S (sulfuro de hidrógeno). La lactosa proporciona la fuente de carbohidratos, el rojo neutro y el verde brillante actúan como indicadores de pH y el agar es agregado como agente solidificante, actúa a un pH de 7.0 ± 0.2°C Para prepararlo se suspenden 60 g del medio en un litro de agua destilada, calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto, enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas Petri estériles. No esterilizar en autoclave.

Para la siembra se recolectan las muestras en contenedores estériles o con hisopos estériles transportados en un medio de transporte, sembrar las muestras por el método de la estría para obtener colonias aisladas, incubar las placas a 35-37 °C durante 24 a 48 horas y examinar el crecimiento.

Algunas cepas de Shigellaspp. son inhibidas en este medio por lo que es recomendable utilizar medios adicionales. Las enterobacterias pueden ser diferenciadas en base a su capacidad de fermentar la lactosa. Las especies de Salmonella y Shigella son no fermentadoras de la lactosa y forman colonias incoloras en el Agar SS. Las especies de Salmonella que son productoras de sulfuro de hidrógeno desarrollan colonias concentro obscuro. Los coliformes son parcialmente inhibidos. E. Coli produce colonias de color rosa a rojo y pueden presentar una zona de precipitado. Las colonias de Enterobacteraerogenes son cremosas de color rosa.Citrobacter y Proteusspp. Pueden crecer produciendo colonias con centros de color gris o negro debido ala producción de H2S. Enterobacterfaecalis es parcialmente inhibido presentando colonias incoloras.

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Figura 21. Medio de cultivo Agar SS y micrografía electrónica de colonias bacterianas de Salmonella spp. Editar de la web http://www.azuldiagnosticdb.com/upload/index.php?route=product/product&product_id=1369 y http://blogs.umh.es/microbiologia/files/2010/09/salmonella_t.jpg

Como se preparan los medios Los medios de cultivo, siempre deben prepararse utilizando agua destilada (salvo el Marino). Es necesario ajustar siempre el pH. Todos los utensilios deben estar perfectamente limpios. Todos los medios deben esterilizarse.

Los medios se preparan en matraces cónicos con tapa. Se pesa la cantidad de medio requerida, se disuelve o suspende en el agua. Se ajusta el pH. Se esteriliza a 121°C por 20 min. Se espera a que enfrié (42°C) Servir 20 ml aprox. en cada caja de Petri en un área estéril para evitar contaminación de los medios; de preferencia limpiar el área con alcohol y tener cerca un mechero.

Figura 22. Pasos para elaborar un medio de cultivo en cajas petri y en tubos. Editar de la web http://ocwus.us.es/produccion-vegetal/sanidad-vegetal/tema_22/page_09.htm

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Esterilización – Húmeda, autoclave (como una olla de presión).

– Seca, horno – Gaseosa: óxido etileno, formaldehido o peróxido (H2O2).

– Filtración: membranas de 0.45 y 0.22 μm.

Figura 23. Autoclaves para esterilizar medios de cultivo comúnmente usadas.

Editar de la web http://www.figursa.com/autoclaves.php

Método de siembra por agotamiento o en estría Se necesita una caja o placa petri en la cual se coloca el medio de cultivo y se procede a sembrar una muestra ya sea sólida o líquida, se recomienda el uso de un asa de platino para realizar la siembra.

La metodología a seguir es como se esquematiza en la figura siguiente donde: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero hasta que tenga tonalidad del rojo vivo, (b) introducirla en la suspensión bacteriana u objeto para recoger una muestra, (c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas y (e) después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa. Para que los microorganismos crezcan se incuba a 37 °C durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda, parte Universidad Abierta y a Distancia de México

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de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.

Figura 24. Forma de sembrar en caja petri con medio de cultivo sólido.

Editar de la web http://bioservice77.obolog.com/esterilizacion-calor-cultivo-luz-microrganismos335412

Método de siembra en tubo A diferencia del cultivo en placa se necesitan tubos bacteriológicos estériles, los cuales pueden contener tanto medio de cultivo líquido como sólido.

El método de siembra es tomando un asa de platino y esterilizarla por flameado en la llama de un mechero hasta que tenga tonalidad del rojo vivo, introducirla en la suspensión bacteriana u objeto para recoger una muestra, sembrar haciendo una picadura cuando el medio es sólido, siembra en superficie diagonal y agitando el asa dentro del tubo cuando el medio es líquido.

En los tubos con medio de cultivo líquido se pueden llevar a cabo diluciones sucesivas a tal grado de obtener un cultivo puro con pocas células que después se sembraran en un medio sólido.

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Figura 25. Formas de sembrar en tubo Editar de la web http://mediateca.educa.madrid.org/imagen/tags.php?pag=3&tag=ensayo

Después de llevarse a cabo la siembra de los microorganismos, los medios de cultivo se ponen a incubar tal y como se especifica para cada bacteria que se desea obtener o aislar.

Figura 26. Equipo usado para el crecimiento de microorganismos “estufa incubadora o incubadora”. Editar de la web http://uriel-93.over-blog.com/article-32831322.html

2.3.2. Preservación de microorganismos Antiguamente los microorganismos han sido empleados como materia prima esencial de trabajo en la obtención de una variedad de medicamentos (antibióticos, vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que sus propiedades permanezcan estables.

La preservación de cepas (muestras) microbianas debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, características que coinciden con los objetivos de un buen método de conservación Con frecuencia la elección de la técnica más adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los criterios de viabilidad

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y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos, número y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como la frecuencia del uso de los cultivos.

El método de conservación que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las células por un período considerable de tiempo, de forma tal que la población sobreviviente se asemeje a la original como sea posible, conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la ocurrencia de los eventos genéticos. De igual manera debe reducir al mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del cultivo permanezca inalterable.

A esto se le suma la distribución, para la cual se necesitarán réplicas conservadas y empaquetadas convenientemente que permitan la llegada al lugar de destino en las mejores condiciones. Los microorganismos son enviados por varios medios: correo aéreo, postal o a través de las manos, de un laboratorio a otro dentro de un mismo país y con frecuencia a través de las fronteras o continentes. Su distribución y manipulación está regulada en el ámbito internacional y nacional, y para su transportación es necesario el uso del “triple” empaque para asegurar que todo el personal involucrado en este proceso esté protegido de la exposición a cualquier agente contenido en el envase.

Algunos cultivos son empleados como cepas controles, cepas de ensayo, cepas de producción industrial y pueden ser utilizadas frecuentemente en un laboratorio. En estos casos, la facilidad del recobrado y el riesgo de contaminación de los cultivos necesitan ser considerados Existen dos formas más importantes de conservación: I.

Congelación (a –70 °C y –196 °C) y liofilización como técnicas que minimizan al máximo el riesgo de cambio genético en las células y las mantienen viables por 10 años o más, así se han podido conservar materiales biológicos como cultivos de hongos, bacterias y levaduras, algas, suero, células sanguíneas, entre otros. El elevado costo de los equipos que emplean estos métodos dificulta su implementación en muchas instituciones. Se necesitan mantener libres de humedad, por lo que se ocupan materiales extra para lograrlo como arena, sílica gel, perlas de vidrio; donde cesa el crecimiento, así como el almacenamiento en tierra, parafina líquida y la suspensión en agua estéril (destilada o de mar).

Figura 27. Izquierda un congelador y derecha un liofilizador. Editar de la web Universidad Abierta y a Distancia de México

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http://www.misequipos.com/refrigeracion/Congeladores_Acero_Inoxidable.php y http://www.lobov.com.ar/site/ntecnica_det.php?id=4

II.

Se propone llevar a cabo la resiembra periódica, que es una técnica que permite la supervivencia de los cultivos en cortos períodos de tiempo. De lo que se trata es de transferir el cultivo del medio seco a uno fresco proporcionándole las condiciones óptimas de crecimiento, lo que condiciona el elevado riesgo de contaminación y variabilidad de las características de las cepas.

Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar.

Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BMTM_U2_A1_XXYZ, donde BMTM corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación.

Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BMTM_U2_ATR _XXYZ, donde BMTM corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

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Cierre de la Unidad Con los temas vistos en esta Unidad te pudiste dar cuenta como los microorganismos se pueden reproducir de manera muy rápida, colonizar diversos hábitats y sobre todo cuales son las condiciones y los requerimientos para dicho proceso. Pudiste constatar que los microorganismos se utilizan en muchos estudios tanto en el medio ambiente, la salud, industria entre otros. Ahora podrás integrar estos conocimientos junto con los de la Unidad anterior donde tendrás un bosquejo mayor de cómo es el desarrollo cualitativo de las bacterias.

Para saber más

Ver Video http://www.youtube.com/watch?v=pI3V5KPj5XQ&feature=related analiza cómo fue que se llegó al conocimiento de los microorganismos y su impacto significativo en las ciencias biológicas.

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Fuentes de consulta

Bibliografía básica  González,G. M. y C. A. M. (2007) Microbiología ambiental. Corpus. 120 pp.  Pidello,A. (2011).Ecología microbiana. Corpus  Willey,J., Sherwood, L. M. y Woolverton, C. J. (2009).Microbiología.7a ed.

MGrawHill-Interamericana.

Bibliografía complementaria  Atlas, M. R. y Bartha, R. (2002). Ecología microbiana y Microbiología ambiental. 4° ed. Pearson Addison Wesley. 677pp.  Brock, D. T. y Madigan, T. M. (). Microbiología. ed. Prentice Hall. 956 pp.  Brooks, G. F., Butel, J. S. y Morse, S. A. (2011). Microbiología Médica. 25° ed. Mc Graw Hill. pp 815.  Madigan, M. T., Martinko, J. M. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los microorganismos. 10 a ed. Prentice Hall. 1089 pp.  Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. (2005). Microbiología. 5a ed. McGrawHill Interamericana. 1236 pp.  Solomon, P. E., Berg, R. L. y Martin, W. D. (2008). Biología. 8a ed. McGraw Hill.

1338 pp.  Tórtora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. (2007). Introducción a la microbiología.

9aed.Médica Panamericana. 956pp.

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