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Cultivo de tejidos vegetales I Técnicas de esterilización y diseño de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

Programa de la asignatura:

Cultivo de tejidos vegetales I

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Técnicas de esterilización y diseño de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

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Índice

Presentación de la unidad .......................................................................................... 3 Propósitos de la unidad .............................................................................................. 3 Competencia específica...............................................................................................4 3.1. Tipos de esterilización……………………………..…..…………………...........4 3.1.1. Esterilización por calor seco…......……………..………………………….….5 3.1.2. Esterilización por calor húmedo……………………………………………….6 3.1.3. Esterilización por filtración……………….…...…………………………….....7 3.1.4. Esterilización superficial……………………………………………………….8 3.2. Manipulación aséptica…...…………..………………….…………………….....10 3.2.1. Cristalería y equipo de disección………………………….……………….....10 3.2.2. Inóculos vegetales……………………………………………….……………..12 3.2.3. Medios de cultivo y constituyentes termolábiles…………………………….16 3.2.4. Siembra y transferencia de inóculos………………………………………...18 3.3. Diseño de un laboratorio de tejidos vegetales…………………....………….19 3.3.1. Área de lavado y esterilización………………………………………………19 3.3.2. Cuarto para la preparación de medios y material vegetático…………….20 3.3.3. Área de transferencia (siembra y disección)……...………………………..21 3.3.4. Sala de incubación………………………………………………………..…..21 3.3.5. Almacén de reactivos…………………………………………………………22 3.3.6. Invernadero………………………………………………………………….…22 Actividades .............................................................................................................. 23 Autorreflexiones........................................................................................................ 23 Cierre de la unidad ................................................................................................... 23 Para saber más ........................................................................................................ 24 Fuentes de consulta………………………………………………………………………..25 Anexo ....................................................................................................................... 26

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Presentación de la unidad Hemos llegado a la tercera y última unidad. Esto quiere decir que hemos estudiado los conceptos fundamentales relacionados al cultivo in vitro, el proceso histórico y empleo general de los componentes de un medio de cultivo. Ahora, esta unidad presenta las actividades al interior del laboratorio. Aunque siempre los datos se presentan desde el punto de vista teórico, esta información es importante para llevarse a cabo en cada proceso y manipulación de los cultivos de tejidos vegetales. Al concluir con esta primera materia, estarás preparado para documentar los procesos necesarios en el establecimiento de un cultivo de tejidos vegetales, a través de los diversos protocolos enmarcados en el “cultivo de tejidos vegetales II”.

Propósitos de la unidad

 

Determinar las actividades dentro de un laboratorio que coadyuven al establecimiento de un cultivo in vitro. Identificar las técnicas de esterilización y de manipulaciones asépticas durante el trabajo in vitro.

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Competencia específica

Clasificar los diferentes tipos de medios de cultivos y reguladores de crecimiento, para su empleo en el cultivo de tejidos vegetales con el fin de establecer un cultivo in vitro en laboratorio, considerando el destino final del cultivo.

3.1. Tipos de esterilización Un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales es esencialmente igual a cualquier otro, sin embargo es de suma relevancia preservar las condiciones de esterilidad. Al respecto. Manzanares comenta (1991): Las condiciones de esterilidad de éste son de fundamental importancia porque todos los medios empleados contienen nutrientes, los cuales facilitan el crecimiento de muchas bacterias y hongos. El crecimiento abundante de ellos destruiría el crecimiento, más lento, de los tejidos vegetales; aun los contaminantes con crecimiento lento son indeseables, pues pueden producir toxinas que afectan el crecimiento de las células vegetales (Manzanares, 1991, pág. 31) Por estas razones, el material vegetativo se desinfesta superficialmente antes de iniciar un cultivo in vitro, y todo el manejo de los tejidos se hace en condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar de aire, en áreas específicas para este propósito. Así todos los medios, instrumentos y recipientes de cultivo deben esterilizarse para matar las células vegetativas, esporas y otras estructuras reproductivas para los microorganismos, que son los causantes de la contaminación de los cultivos. Universidad Abierta y a Distancia de México 4


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Cabe mencionar que la esterilización definida por la Organización Mundial de la Salud, OMS (2013), es la técnica de saneamiento cuya finalidad es la destrucción de toda forma de vida, aniquilando todos los microorganismos, tanto patógenos como no patógenos, incluidas sus formas esporuladas, altamente resistentes. Ahora presentaremos los diferentes tipos de esterilización y su empleo general.

3.1.1. Esterilización por calor seco Los recipientes de cristal e instrumentos para la disección/ manipulación pueden ser esterilizados por calor seco, así como aluminio y contenedores metálicos cerrados. Hoy en día ciertos tipos de plásticos de uso en laboratorio pueden también ser esterilizados por calor seco, por ejemplo, el polipropileno, polimetilpropileno, polialómeros y teflón pueden ser repetidamente esterilizados a 121°C (Bhojwani, S.S. y Razdan, M.K., 1996). La esterilización por calor seco, se realiza a través de un horno a temperaturas entre 160180ºC por 2-4 horas. Es inadecuado para materiales orgánicos e inorgánicos. La esterilización del calor seco provee una baja circulación y penetración de la temperatura,

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por ello la carga del horno es esencial. La cristalería debe permanecer en el horno hasta enfriarse, nunca retirarse caliente. Si se retira antes de estar lo suficientemente frío, el aire del exterior que está más frío, es succionado por el horno, exponiendo el material a una carga de contaminación bacteriana y eleva el riesgo de fractura. Existen cajas metálicas para contener este tipo de material (cánulas). La incineración es proceso muy efectivo para la esterilización y disposición final. Es también usado para esterilizaciones “puntuales” de asas bacteriológicas o pinzas, tales como los empleados en procedimientos de cultivo microbiológico.

3.1.2. Esterilización húmedo

por

calor

La esterilización por vapor húmedo, es el método más socorrido. En él sólo es inadecuado introducir el papel aluminio y los contenedores metálicos cerrados. Existen en la actualidad diferentes tipos de autoclaves, sin embargo todas ellas requieren de cuidados puntuales similares, es la razón de indicar a continuación los pasos para el empleo de una autoclave de vapor:

Paso 1 2

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Tabla 1. Procedimiento 1 Empleo de una autoclave de vapor Instrucciones Asegurarse que la autoclave tenga el nivel de agua suficiente, el agua debe ser destilada con el fin de evitar incrustaciones en la resistencia. Colocar en el interior de la autoclave los materiales a ser esterilizados, si se trata de frascos de vidrio con tapa, se sugiere dejarla sobrepuesta. Cada uno de ellos deberá estar debidamente empaquetado. Cerrar la autoclave, recordando cerrar los tornillos sujetadores en forma de cruz, esto con el fin de proveer un cerrado uniforme. Abrir la válvula de salida y encender el instrumento, esto proporcionará un calentamiento inicial de la cámara y eliminará todo el aire contenido en el. Este paso se completa cuando la salida del aire por la válvula no es intermitente y se aprecia un sonido continuo. Si se cierra la válvula antes de la indicación anterior, al final del proceso dejará mojados todos los paquetes. Cerrar la válvula de salida. Una vez cerrada la válvula dejar que el control automático mantenga la presión y temperatura a los niveles especificados. En caso de no contar con un control automático, observe el manómetro del instrumento y cuando se acerque a los 121ºC o 15 lb/in2 (1.06 kg/cm2), apagarlo, Universidad Abierta y a Distancia de México 6


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cronometrar el tiempo, asegurándose que la aguja no baje de la temperatura o presión ya mencionada. Una vez concluido con el tiempo fijado, desconectar el instrumento y dejar que se descomprese hasta que la aguja indique “cero” de presión. Abrir la tapa de la autoclave de la forma en que fue cerrada, sacar el material estéril con los cuidados necesarios para evitar su contaminación. Observar si el agua residual se encuentra limpia, sin no lo está, drenar, limpiar el instrumento y agregar nuevamente agua hasta la indicación de nivel.

El tiempo total del ciclo antes descrito esto es, la suma de todas las etapas descritas, depende del tipo del aparato, pero de manera general un ciclo de 15 a 20 min puede demorar entre 50 a 70 min.

Figura 1. Autoclave horizontal (Scipho, 2013).

3.1.3. Esterilización por filtración La esterilización por filtración es empleada principalmente para soluciones termolábiles (ver la siguiente ilustración). Estas pueden ser esterilizadas al pasar a través de filtros estériles que pueden retener bacterias, tales como, filtros de membrana (derivados de celulosa), plásticos, cerámica porosa o filtros de vidrio sinterizado, o combinaciones de ellos. Los filtros que contienen asbesto no deben ser usados. Se deben tomar las medidas adecuadas para evitar la pérdida de soluto por adsorción sobre el filtro y evitar la liberación de contaminantes en el filtro. Filtros adecuados evitarán el paso de microorganismos, pero la filtración debe ser seguida por una transferencia aséptica de la solución esterilizada de los envases definitivos que se sellan inmediatamente con mucho cuidado para excluir cualquier recontaminación.

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Figura 2. Filtro ensamblado a una jeringa esterilizada, conteniendo un pequeño volumen de líquido. La aguja no es siempre requerida (Scipho, 2013).

Generalmente, deben de ser usadas membranas no mayores a 0.22 µm de poro nominal. La eficacia del método de filtración debe ser validada si se emplean tamaños de poros más grandes. Es importante revisar la integridad del filtro de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Todos los filtros, tubos y equipos utilizados "después del proceso" deben ser estériles. Los filtros capaces de soportar el calor pueden ser esterilizados en el montaje antes de su uso en autoclave a 121ºC por 15 - 45 minutos, dependiendo del tamaño del conjunto de filtro. La eficacia de esta esterilización debe ser validada. Para la filtración de un líquido en el que es posible el crecimiento microbiano, el mismo filtro no se debe utilizar para los procedimientos que duran más de un día de trabajo. En el cultivo de tejidos vegetales, generalmente se emplean filtros que se usan una sola vez y son comprados estériles.

3.1.4. Esterilización superficial La esterilización superficial es empleada de manera común en el cultivo de tejidos vegetales, sobre todo para desinfestar explantes y para esterilizar instrumento de manipulación de uso continuo. Los agentes desinfectantes más comunes son: Hipoclorito de sodio (NaOCl), este se encuentra en los blanqueadores de lavandería, la cual es una solución con concentración aproximada de 5.25% (v/v). De manera general el blanqueador de lavandería se diluye en agua en concentraciones de 5 a 25% (v/v), con dos gotas de Tween20 por cada 100 ml (Tween-20/100 ml). La duración del tratamiento es generalmente de 5 a 30 min seguido por tres a cinco enjuagues con agua destilada. Las soluciones obtenidas a partir de un blanqueador Universidad Abierta y a Distancia de México 8


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comercial necesitan ser elaboradas previo a su uso, ya que el gas cloro se disipa. Es preferible emplear botes pequeños de cloro y etiquetarlos cuando se ha abierto. Algunos laboratorios ajustan el pH del blanqueador ya diluido a un pH cercano a 7, usando HCl 5M. Lo anterior debido a que el cloro se disipa más rápidamente a un pH menor. Hipoclorito de calcio (Ca(OCl)2) al 0.8% (p/v) (8 g de hipoclorito de calcio en un litro de agua, agitar por 1-5 min, permitir que se precipite, decantar la solución, y mezclar con partes iguales de agua), adicionar dos gotas de Tween-20/100 ml, tratar el tejido por 5-30 min. Alcohol etílico o isopropilico al 70% (v/v). Este agente puede ser usado para limpiar el material vegetal antes de la desinfestación, y puede ser usado para sumergir el material vegetal durante 1-5 min antes o después del tratamiento con hipoclorito de calcio o sodio. Peróxido de hidrógeno (H2O2). El H2O2 es un oxidante fuerte, y puede ser usado del 310% (v/v) por 1-30 min, antes de esterilizar enjuagar con agua en combinación con otros desinfectantes o solo. Una interacción entre el NaOCl y el H2O2 es tóxico al tejido para plantas, por lo que es importante enjuagar el explante vigorosamente si ambas soluciones son empleadas. El gas cloro (Cl2) es efectivo para desinfestar en seco semillas. Se colocan semillas secas en una caja de Petri dentro de un desecador al vacío (esto debe llevarse a cabo bajo una campana de extracción). Abrir parcialmente la tapa de la caja de Petri, colocar 100 ml del blanqueador comercial en un vaso de precipitados dentro del desecador. Abrir en el desecador una rendija e introducir lentamente 3.3 ml de HCl concentrado con ayuda de una pipeta, al vaso con blanqueador. Inmediatamente sellar el desecador para que el gas cloro sea generado y concentrado. Después de 16-18 h, abrir cuidadosamente el desecador y usar una varilla de vidrio para cerrar la caja de Petri. Cerrar la campana de extracción nuevamente y permitir que el gas cloro se disipe por un par de horas. Sellar la caja de Petri con parafilm y almacenar las semillas estériles hasta su uso. La sal disódica del ácido dicloroisocianúrico (NaDCC), puede ser menos tóxica a los tejidos de planta que son sensibles al hipoclorito de sodio y calcio y no necesita el enjuagado. Los antibióticos (gentamicina y amplicilina) pueden ser benéficos para reducir la contaminación sobre el explante después de la desinfestación empleando etanol o blanqueador. Una inmersión del explante en una solución antibiótica (51-100 mg/l) durante 30 min antes del cultivo, puede eliminar algunos microorganismos. Por otra parte, los instrumentos usados para la manipulación aséptica, tales como pinzas, bisturís, agujas y espátulas, son normalmente esterilizadas por inmersión en alcohol al 95% en etanol, seguido de flameado y enfriado. Esto se lleva a cabo al inicio del trabajo Universidad Abierta y a Distancia de México 9


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de transferencia y varias veces durante la operación (Bhojwani, S.S. y Razdan, M.K., 1992). Esta operación debe ser realizada con cuidado, separando el recipiente conteniendo el alcohol a un lado de la campana de transferencia lejos de la flama. Nunca coloque el alcohol al lado de un mechero de bunsen o lámpara de alcohol.

3.2. Manipulación aséptica En función a las consideraciones indicadas en la sección 3.1, existen dos precauciones obvias a seguir: i) no compartir el área de cultivo de tejidos vegetales con secciones de microbiología o patología y ii) remover cultivos contaminados del área de cultivo tan pronto sea detectado. De igual manera, es importante sabe que existen varias posibles fuentes de contaminación al medio de cultivo: a) el recipiente de cultivo, b) el medio mismo, c) el explante, d) el medio ambiente del área de transferencia, e) los instrumentos usados y la manipulación del material vegetal durante la inoculación y subcultivo, y f) el medioambiente del cuarto de cultivo. Sabiendo lo anterior se presentan a continuación alternativas de cuidado a los cultivos contra la contaminación (Bhojwani, S.S. y Razdan, M.K., 1996).

3.2.1. Cristalería disección

y

equipo

de

Cuando existan materiales de cristal nuevos, solo deberán ser usados después de un lavado vigoroso. Tradicionalmente se ha empleado ácidos fuertes como el dicromato de sodio y el ácido sulfúrico, pero por motivos medioambientales, hoy en día se prefiere protocolos más amigables con el medioambiente, por ejemplo la cristalería nueva debe ser sumergida en una solución de HCl 5% durante toda la noche, seguida de un enjuague con agua corriente y después con agua destilada para remover completamente toda traza de ácido. Cuando se trate de material usado, lavar cuidadosamente con detergentes especiales para laboratorio en función a la delicadeza del trabajo, por ejemplo el uso de extran al 23% es adecuado para sustiuir el empleo de ácido, seguido por los enjuagues con agua, tal como se describió anteriormente. Sin embargo el uso de detergentes comerciales tradicionales es empleado sin problema en algunos laboratorios. En el caso de contar con material conteniendo agar, es adecuado fundirlo empleando un autoclaveado a baja temperatura. Si el caso implica material contaminado, no deberá abrirse hasta que esté debidamente esterilizado, de acuerdo a las especificaciones dadas en la sección 3.1.2. Universidad Abierta y a Distancia de México

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Una vez lavado el material, se deja escurrir y/o secar en gabinetes de aire caliente (~75ºC) y almacenarlo en lugares libres de polvo. Todos los recipientes de cristal e instrumentos para la disección, son frecuentemente esterilizados juntos con el medio de cultivo por vapor húmedo. Si la esterilización se lleva a cabo empleando vapor seco, la manipulación se llevará de acuerdo al material estéril. Por ejemplo, si se trata de un bisturí, pinzas o tijeras de disección, estas se colocan dentro de un tubo de traslado conteniendo alcohol al 95% sumegidas dos terceras partes. El tubo de traslado deberá contener en el fondo algodón o un paño que evite que el instrumento a trasladar rompa el tubo. Es conveniente que el tubo sea colocado dentro de un vaso robusto o en un vaso de precipitados, de igual manera colocar un poco de agua en él, proveera una mayor estabilidad y evitará que el tubo de traslado se caiga. Cuando desee emplear el instrumento, este deberá ser flameado antes de su uso (Smith, 2013). Si el esterelizado se realiza por vapor húmedo, la cristalería deberá ser cubierta con tapones (algodón y gasa) cubiertos con papel tipo estraza o en su caso por papel aluminio. En caso de instrumentos, éstos pueden ser forrados en su totalidad para ser destapados bajo una campana de flujo laminar, siguiendo el protocolo de uso ya mencionado.

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3.2.2. Inóculos vegetales

Figura 3. Explante de Lobelia cardinalis (SciPhoto, 2013)

Uno de los más grandes problemas en un laboratorio de cultivo de tejidos es el de tener una infestación de insectos, especialmente ácaros. Existen diferentes tipos de ácaros, Dermataphagoides pteronyssimus, Dermataphagoides farinae y Tyrophagus putrescentiae o ácaros del polvo, el cual puede ser un problema mayor. Los ácaros pueden vivir en los ductos y filtros del aire acondicionado y pueden encontrarse en la ropa y cabello. Pueden ser desplazados por las corrientes de aire y generalmente son más activos durante el inicio de la noche y son atraídos por la humedad y material orgánico. Se alimentan de hongos y no de material vegetal. Su ciclo de vida media es de cerca de dos semanas. Los cultivos son contaminados debido al desplazamiento de ácaros en el interior o al exterior de los medios de cultivo sin ser notados, hasta que sus huellas son visibles debido al crecimiento de hongos, los cuales fueron diseminados por las patas de los ácaros. Los insectos pueden ser introducidos por el personal del laboratorio (sobre el cabello, sobre sus ropas, zapatos, etc.), por las macetas de plantas, por explantes grandes de plantas, por laboratorios adyacentes con trabajos sobre insectos o por el almacenamiento de grandes cantidades de semillas o material seco de plantas. La contaminación de ductos del aire acondicionado, especialmente con organismos fúngicos también es común (Smith, 2013). No debe olvidar que aunque la mayoría de los microorganismos se encuentran en la superficie de los órganos vegetales, existen evidencias de la presencia de algunos en la parte interna de las plantas. Así, se ha reportado que existen bacterias en los espacios intercelulares de las hojas de petunia, lo cual trae como consecuencia una serie de problemas durante el cultivo, pues no pueden ser eliminadas por la desinfestación superficial del tejido. Las bacterias contaminantes que son encontradas con mayor frecuencia, pertencen a los géneros Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, Klebsiella, Staphylococcus, Lactobacillus, sin Universidad Abierta y a Distancia de México 12


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embargo, su crecimiento en el medio de cultivo puede controlarse por la adición de antibióticos. Las siguientes combinaciones de antibióticos se han aplicado con éxito en cultivo de tejidos de plantas: Cefotaxime, Gentainicina, Rifampicina, Nystatina + Carbenicilina, Gentamicina + Amphotericina B, Vancomicina HCI + Mycostatin and Streptoinicina + Carbenicilina. Existen reportes de toxicidad causada en algunos cultivos por: Penicilina, Estreptomicina, Bactericina y Sparsomicina (Manzanares, 1991). Algunos explantes, tales como semillas muy pequeñas o esporas de helechos, son desinfectados superficialmente en tubos con tapa de centrífuga cónicos, después del centrifugado el “pellet” de semillas se obtiene decantando la solución con el empleo de una pipeta (Smith, 2013) (ver sección 3.1.4.). No se debe olvidar que aunque la mayoría de los microorganismos se encuentran en la superficie de los órganos vegetales, existen evidencias de la presencia de algunos en la parte interna de las plantas. Así, se ha reportado que existe una bacteria en los espacios intercelulares de las hojas de petunia, lo cual trae como consecuencia una serie de problemas durante el cultivo, pues no pueden ser eliminadas por la desinfestación superficial del tejido. Sin embargo, su crecimiento en el medio de cultivo puede controlarse por la adición de antibióticos. Otro ejemplo lo proporciona una bacteria sistémica, encontrada en yemas auxiliares de vainilla (Manzanares, 1991). El trabajo que se realiza en la sala de siembra o cultivo puede hacerse en una mesa de laboratorio, creando un área estéril con unos mecheros Bunsen, pero para reducir la posibilidad de contaminación, el trabajo se lleva a cabo en un área estéril, proporcionada por una cámara de flujo laminar de aire. Lo ideal consiste en tener estas cámaras en cuartos independientes, los cuales se esterilizan previamente con luz ultravioleta (UV). Estos cuartos tienen, además de la cámara, una superficie como área de trabajo y los servicios esenciales, así como un filtro de aire o unidad de ventana. En una cámara de flujo laminar de aire, este es forzado bajo presión a través de un filtro por la parte trasera de la cámara y fluye sobre el área de trabajo a una velocidad uniforme. La velocidad del flujo de aire evita que las partículas se depositen en el área de trabajo. Estas cámaras pueden ser de uso individual o para dos o tres personas (Manzanares, 1991).

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Figura 4. Mechero Bunsen (Scipho, 2013).

Una campana de transferencia de flujo laminar, está equipada con una ventilación de presión positiva con un filtro HEPA (high-efficiency particulate air) a prueba de bacterias. Una campana de flujo laminar puede ser de dos tipos. Generalmente el aire es forzado a entrar al gabinete a través de un filtro de polvo y de un filtro HEPA, posteriormente direccionada en flujo vertical u horizontal sobre la superficie de trabajo de manera constante. El constante flujo de aire filtrado libre de bacterias y esporas de hongos previene que el aire no filtrado y partículas se depositen sobre el área de trabajo, manteniéndolo limpio y desinfectado. Un gabinete simple de transferencia es un encierro de plástico o gabinete con una lámpara de UV. En una campana de transferencia, se debe tener listo algunas herramientas de uso común tales como bisturís, pinzas de disección largas, y algunas veces espátulas. Ocasionalmente son necesarias pinzas con punta, tijeras, hojas de rasurar o sacabocados (Beyl, 2005).

Figura 5. Campanas de flujo laminar (Scipho, 2013).

Algunas personas prefieren realizar manipulaciones estériles sobre superficies preesterilizadas, tales como cajas de Petri o tejas de cerámica. Otras alternativas de trabajo es el empleo de toallas de grado laboratorio. Estas pueden ser protegidas en papel aluminio y ser esterilizadas antes de su uso. El siguiente protocolo de trabajo (procedimiento 2), es un ejemplo del trabajo dentro de una campana (de transferencia) de flujo laminar (Beyl, 2005).

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Tabla 2. Procedimiento 2 Trabajo bajo la campana de flujo laminar (Beyl, 2005) Instrucciones Encienda la campana de flujo laminar, observar que se mantiene aire a presión positiva. Esto asegura que todo el aire que pasa sobre la superficie de trabajo es estéril. Se debe sentir el flujo de aire contra el rostro (si se trata de un flujo horizontal). Asegurar que ninguna corriente de aire proveniente de una ventana o aire acondicionado interfiera con el flujo de la campana. Usar un bote con espray conteniendo etanol al 70% (v/v), aplicar en el interior de la campana, pero NUNCA aplicar al filtro HEPA. Este tipo de alcohol es más efectivo que el alcohol absoluto, ya que el etanol al 70% desnaturaliza el DNA. Usar una pieza de gasa o algodón para saturar con etanol al 70% ayudando a distribuirlo de manera uniforme. Permitir que seque. Para mantener la línea de limpieza, cualquier cosa que sea colocada al interior de la campana, debe ser rociada con etanol 70%. Esto incluye la lámpara de alcohol, el recipiente conteniendo etanol al 80 o 90% para ayudar a flamear los instrumentos, un contenedor para los frascos que contendrán el medio de cultivo, toallas o cajas de Petri / tejas de cerámica pre-esterilizadas y herramientas varias (pinzas de disección, espátulas, bisturís, etc.). Cuando se decida iniciar, quitar todo tipo de joyería y lavar las manos (con uñas cortas) vigorosamente con agua y jabón, manteniendo el frotado por 30 segundos. Justo en el momento de colocar las manos en la campana, rociarlas con etanol al 70%. Iniciar el trabajo abriendo las cubiertas de los materiales de trabajo y colocándolas sobre las superficies de trabajo. Nunca bloquear el flujo de aire que proviene de la unidad filtrante. De igual manera NO hacer pasar la mano interfiriendo el flujo que va hacia la superficie u objeto de trabajo. Hablar mientras se está en la unidad compromete la esterilidad. Si por alguna razón se debe hacerlo, hay que mover la cabeza a un lado. Si se tiene cabello largo, atarlo para que no cuelgue sobre la superficie de trabajo. Nunca dejar contenedores estériles abiertos por mucho tiempo. Cuando se abra un contenedor que ha sido esterilizado, mantener los dedos fuera del área abierta. Si se abre un contenedor o vaso de cristal, como regla Universidad Abierta y a Distancia de México 15


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general, flamear a través de una flama. Esto creará una corriente ascendente desde el vaso, auxiliando a prevenir que la contaminación entre a él. 6

Flamear los instrumentos puede ser azaroso si olvida que el etanol es flamable. Cuando se flamee para esterilizar instrumentos, tales como pinzas de disección, sumergir el instrumento al recipiente que contiene etanol al 80%. Cuando se levante sacándolo, mantener en un ángulo tal que lejos de los dedos escurra el exceso de alcohol. Entonces pasar el extremo del instrumento por la flama de la lámpara de alcohol, permitir que la herramienta enfríe sobre el área preesterilizada, con el fin de que se encuentre lista para su empleo posterior. NUNCA dejar herramientas calientes cerca del contenedor de etanol al 80%.

No debemos olvidar que en un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, la limpieza y la organización eficiente, tanto en el laboratorio como en el trabajo, contribuirá a reducir el riesgo de contaminación (Manzanares, 1991).

3.2.3. Medios de cultivo constituyentes termolábiles

y

Los contaminantes microbianos están normalmente presentes en el medio desde su preparación inicial. Para destruirlos, es necesario cerrar la boca del matraz (si ese es el caso) con un tapón apropiado para evitar la entrada de bacterias y autoclavear el medio de cultivo, empleando calor húmedo bajo presión, 1.06 kg/cm2 (121ºC) durante 15-40 min a partir de que se haya alcanzado la temperatura requerida. La esterilización depende de la temperatura y no directamente de la presión. El tiempo de exposición varía con el volumen del líquido a ser esterilizado (ver siguiente tabla). Monnier (1976) reportó que el calentamiento a 120ºC hace decrecer el valor nutritivo del medio de cultivo para embriones jóvenes de Capsella. Mejores resultados fueron observados cuando el medio de cultivo se esterilizó a 100ºC por 20 min. En el caso de que una autoclave no esté disponible, una olla de presión doméstica es adecuada. Debe tenerse sumo cuidado en respetar el tiempo de enfriado. Una rápida pérdida de presión hará que el líquido contenido ebulla vigorosamente. El indicador de presión de la autoclave deberá indicar cero (temperatura no mayor a 50ºC) antes de que la autoclave sea abierta. Algunos reguladores de crecimiento de plantas (RCP), tales como GA3, zeatina, ABA y ciertas vitaminas, son termolábiles. Ellas no deben ser esterilizadas. Cuando sea necesario a un medio de cultivo adicionar algún componente termolábil, el medio de Universidad Abierta y a Distancia de México

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cultivo es esterilizado en un matraz y se mantiene después de su esterilización en una campana de flujo laminar hasta que la temperatura descienda. Las soluciones termolábiles son esterilizadas por filtración con membrana (ver sección 3.1.3) y adicionado al medio estéril, cuando se encuentre a una temperatura aproximada de 40ºC, en el caso de que se trate de un medio semisólido (justo antes de que el agar solidifique), si el medio es líquido se espera a que se encuentre a temperatura ambiente. Tabla 3. Tiempo mínimo necesario para la esterilización de medio de cultivo por vapor húmedo, sugerido por Biondi y Thorpe (1981). Volumen (ml)

Minutos de esterilización (121°C)

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20-50 75 250-500 1000 1500 2000

15 20 25 30 35 40

3.2.4. Siembra y transferencia de inóculos La siembra y transferencia de inóculos, sigue los mismos protocolos de trabajo que los indicados en la sección 3.2.2. Cada uno de los explantes o cultivos de material vegetal establecidos previamente, son transferidos a medio nuevo, de acuerdo a los protocolos aplicados en cada caso. En condiciones de asepsia y siempre bajo la campana de flujo laminar se transfieren explantes. El ejemplo que se muestra a continuación es el proceso de generación de un cultivo en suspensión de células a partir de callos. Con ayuda del bisturí se fragmenta el callo, se transfiere siempre el desarrollo joven. En cada nuevo matraz deben transferirse entre 500 a 750 mg de material con el objeto de asegurar la iniciación por transferencia. Si el deseo es obtener un cultivo de células en suspensión, se emplea medio fresco líquido y se mantiene en agitación, a una velocidad entre 30-150 rpm, en algunos casos es necesaria la oscuridad, pero siempre a temperaturas entre 25 y 27ºC. Si durante los tres primeros días el medio tiene apariencia lechosa, es señal de que el medio se ha contaminado. Lo que procede es retirarlo inmediatamente y se esteriliza antes de desecharlo. El subcultivo inicial puede realizarse 7 o 10 días después de hecho el cultivo; es necesario fíltrarlo a través de un filtro de nylon estéril para eliminar residuos del inóculo y de los racimos celulares grandes. Para determinar la densidad celular se emplean los siguientes métodos: i) Conteo celular. Un cultivo en suspensión invariablemente portará colonias celulares de varios tamaños, por lo que es difícil realizar un conteo celular de forma directa. La exactitud de este conteo puede ser mejorado si las células y agregados celulares son Universidad Abierta y a Distancia de México 18


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primero dispersados por tratamiento con ácido crómico (5-8 %) o pectinasas (0.25%). Este método fue empleado para el conteo de células de sicómoro (Street, 1977) de la forma siguiente: se añaden por cada volumen de células en suspensión dos volúmenes de trióxido de cromo al 8%; esta mezcla se calienta a 70ºC de 2 a 15 min (la duración está determinada por el crecimiento del cultivo). Se enfría y se disgrega la muestra con un pipeteo constante o por una agitado vigoroso durante 10 min, posteriormente se realiza el conteo en hematocitómetro. ii) Volumen del paquete celular (VPC). Para determinar el VPC se transfiere un volumen conocido de una suspensión dispersa y uniforme a un tubo de centrifuga graduada a 15 ml, se centrifuga a 200 g durante 5 minutos. El VPC se expresa en ml de “pellet” por ml de cultivo. iii) Peso fresco celular. Esto puede ser determinado al colectar células sobre la condición de un pre-pesado (en condición húmeda) a través de un filtro circular o soporte de nylon soportado en un filtro, las células se lavan con agua para remover el medio, se drenan con vacío y se pesan nuevamente. iv) Peso seco celular. Siguiendo el proceso antes mencionado de pre-pesado, las células colectadas por el filtro, son secadas durante 12 h a 60ºC y repesadas. El peso celular es expresado por litro de cultivo (Bhojwani, S.S. y Razdan, M.K., 1996).

3.3. Diseño de un laboratorio de tejidos vegetales En la planeación y organización de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales para la producción comercial deben tomarse en cuenta, principalmente, las condiciones de asepcia en las que se debe trabajar, así como las funcionalidades, i.e. los flujos de trabajo, permitiendo el movimiento diario de suministros, personas, cultivos y el producto final en un patrón facil y lógico. En muchas ocasiones, ante la imposibilidad de construir un laboratorio desde el principio, la remodelación de casas residenciales para acomodar las necesidades es siempre una opción. Con el objetivo de mantener los contaminantes que se mueven por el aire, las instalaciones ideales deben tener pocos sitios de entrada (puertas) y frecuentemente grandes áreas designadas como “cuartos limpios” con aire purificado (empleando filtros HEPA), fluyendo bajo presión positiva (Manzanaes, 1991; Suttle, 2005). Las áreas básicas de un laboratorio son las siguientes:

3.3.1. Área de lavado y esterilización En esta sala se llevará a cabo el lavado de la cristalería en general; también puede emplearse el primer lavado con detergente del material vegetativo. Aquí se puede instalar el autoclave para esterilizar tanto el medio de cultivo como el material contaminado. Universidad Abierta y a Distancia de México 19


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También es recomendable instalar una lavadora de cristalería (opcional) y una estufa u horno para el secado de la cristalería. Por el calor generado por las autoclaves, es recomendable una buena ventilación limpia. Es indispensable contar con el material siguiente:  Cristalería  Gabinetes para la cristalería (de preferencia con puertas para evitar que se empolve)  Estufa u horno de secado por convección  Autoclave  Agua caliente y fría  Agua destilada, agua desionizada (destilador y desionizador opcionales)  Fregadero (de preferencia de doble tarja profunda)  Instalación eléctrica: 110 y 220 V.

3.3.2. Cuarto para la preparación de medios y material vegetativo En esta sala se preparan los medios de cultivo que serán utilizados en las siguientes fases de desarrollo de los inóculos, al igual que el material vegetativo del cual se tomará el inóculo seleccionado. Aquí el medio de cultivo es transferido a los recipientes de cultivo, tales como frascos de vidrio. Es indispensable contar con el material siguiente:  Gabinetes para guardar los reactivos  Gabinetes para almacenar cristalería  Gabinete o cajones para guardar los tubos de ensaye, así como las tapas para matraces y frascos de vídrio  Cánulas para esterilizar cajas de Petri

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 Cánulas para esterilizar pipetas  Charolas de plástico para transportar soluciones “stock” y medio preparado  Gradillas de material para colocar los tubos con medio de cultivo (preferentemente 40 tubos por gradilla)  Agitadores magnéticos con calentamiento  Dosificador automático de medio de cultivo (puede suplirse con soportes, anillos y embudos de 500 ml con manguera de hule y pinzas Mohr)  Reloj alarma de 120 min  Balanza granataria y analítica  Ponteciómetro  Refrigerador y congelador  Instalación eléctrica de 110 y 220 V  Instalación de gas  Instalación de vacío.

3.3.3. Área de transferencia (siembra y disección) En esta sala se deben tener los máximos cuidados de asepsia, para lo cual se empean cámaras de flujo laminar de aire, utensilios estériles, cubrebocas, cubrecabezas y aire filtrado en la sala. Esta sala es el corazón de cualquier laboratorio, ya que en él se lleva a cabo el inicio del cultivo y los subsecuentes subcultivos. En él deben existir: Aire acondicionado y filtración, vacío para esterilización por filtrado, cámara de flujo laminar de aire, microscópio estereoscópico, lupa con lámpara, instalación eléctrica 110 y 120 V, instalación de gas, gabinetes, instrumentos de disección, lámpara de luz UV.

3.3.4. Sala de incubación Generalmente esta sala es la más grande de cualquier laboratorio, aquí es donde los cultivos son incubados en anaqueles bajo regímenes de luz y temperatura específica. La cantidad y calidad de luz son el factor clave para el éxito del cultivo. De manera general son usadas las lámparas fluorescentes regulares o de alta intensidad de iluminación fría.

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En esta sala deben tenerse muy en cuenta las instalaciones eléctricas, pues las diferentes fases del crecimiento de los inóculos necesitarán diferentes fotoperiodos, temperatura, intensidad lumnínica, etc. No deben faltar aire acondicionado y filtrado, control de temperatura, anaqueles para incubación, se sugiere su construcción en seis niveles con 50 cm entre cada nivel. Colocación de las balastras fuera de la sala, un reloj por nivel, termostatos separados parea temperatura de día y de noche, apagado automático de temperatua de emergencia para cada sala, fotoperiodo programable.

3.3.5. Almacén de reactivos Debe guardar los reactivos y la cristalería en existencia. El material debe mantenerse en condiciones de baja humedad relativa y en un lugar no caliente y de preferencia oscuro. Es importante señalar que nunca debe almacenarse demasiado, el almacén debe guardar aspectos básicos de temporada. La localización lógica para un almacén debe estar cerca de una puerta externa o cerca del área de preparación de medios.

3.3.6. Invernadero Son muy importantes las condiciones del o los invernaderos a los cuales se van a transferir las plantas provenientes del laboratorio, pues en este lugar donde se pueden recontaminar o sufrir daños por insectos, roedores, etc. Lo más adecuado e indispensable será contar con:         

Regulación de la luz, tanto en intensidad como en fotoperiodo Regulación de la temperatura Control de humedad Pisos de concreto Aire filtrado Exclusión de insectos (mosquitero) Sistema de nebulización Fertilización e irrigaciñon automática Área de almacenamiento para los implementos del invernadero Universidad Abierta y a Distancia de México

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 Mezclas de suelos estériles  Bancales para maceteros.

Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar. Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BCTV1 _U3_A1_XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BCTV1 _U3_ATR _XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Cierre de la unidad Como ha podido darse cuenta, muchos de los procedimientos estudiados, requieren tener siempre en mente los elementos que pueden permitir una contaminación. Esto con el fin de evitarlos y proveer un cultivo de tejidos en condiciones asépticas. El diseño de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, implican entre otras cosas permitir su funcionalidad y el flujo lógico de las actividades desarrolladas en él. Universidad Abierta y a Distancia de México

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Esta unidad 3, nos hace concluir con los objetivos de “cultivo de tejidos vegetales I”, la siguiente materia corresponderá a comprender los protocolos más empleados en el cultivo de tejidos vegetales.

Para saber más

Diseño de un laboratorio de propagación de plantas. Información en inglés. http://aggiehorticulture.tamu.edu/tisscult/microprop/facilities/microlab.html Cultivo de tejidos vegetales, información en inglés. http://www.accessexcellence.org/LC/ST/st2bgplant.php Procedimientos para germinación de germoplasma de arroz silvestre, información en inglés: http://www.ars.usda.gov/Main/docs.htm?docid=19960&pf=1&cg_id=0 Manual de procedimientos para trabajos en invernadero, información en inglés: http://ricelab.plbr.cornell.edu/greenhouse_procedures_manual Catalogo de equipos de laboratorio: http://lumistell.com.mx/campanas-horizontales/

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Fuentes de consulta

Beyl C.A. 2005. Getting started with tissue culture: Media preparation, sterile technique, and laboratory equipment. En: Trigiano RN y Gray D.J. Plant development and biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6. Bhojwani S.S. y Razdan M.K., 1996. Plant Tissue Culture: theory and practice. USA: Elsevier. ISBN 0-444-81623-2 Biondi, S. y Thorpe, T.A., 1981. Requirements for a tissue culture facility. En: T.A. Thorpe (Ed.), Plant Tissue Culture: Methods and applications in agriculture. New York, NY.: Academic Press. Freepho, 2013. http://www.freedigitalphotos.net Labconco 2013. Proyectos de diseño de laboratorios [en línea] http://www.labconco.com/company/laboratory-design-projects (consultado el 7 de noviembre 2013). Manzanares, M.E., 1991. “Técnicas de esterilización y manipulaciones asépticas” En: Hurtado M.D.V. y Merino M.M.E. (Eds.). Cultivo de tejidos vegetales. México: Trillas. ISBN 968-24-2159-4. Monnier, M. 1976. Culture in vitro de l’embryon immature de Capsella bursa-pastoris Moench (1). Rev. Cytol. Biol. Veg. 39:1-120. Smith, 2013. Plant tissue culture, techniques and experiments (3rd Ed.). USA: Academic Press Suttle, G.R.L. 2005. Commercial laboratory production En: Trigiano RN y Gray D.J. Plant development and biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6. Universidad Abierta y a Distancia de México

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OMS, 2013. Third Supplement to the Fourth Edition of The International Pharmacopoeia. World Health Organization (WHO) [en línea] (consultado el 26 de octubre 2013). Scipho, 2013. Science photo library [en línea] www.sciencephoto.com (consultado el 25 de octubre 2013).

Anexo En síntesis, un labratorio de cultivo de tejidos vegetales debe contar, indispensablemente, con el material siguiente (Manzanares, 1991):                               

Autoclave Balanza analítica Balanza granataria Potenciómetro Refrigerador Lavadora de cristalería (opcional) Destilador Desionizador Lavadora de pipetas Agitador magnético con calentamiento Espátulas Microespátulas Frascos ambar para guardar soluciones “stock” Buretas Soporte universal Anillos Pinzas de Mohr Pinzas largas de disección Filtro millipore Termómetros (-10ºC a 120ºC) Guantes de asbesto Tapones para tubos de ensaye Tapones para frascos de vidrio Gradillas para 40 tubos Matraces Erlenmeyer Matraces aforados Desecador Picetas Aspersores Pipetas graduadas y volumétricas Goteros Universidad Abierta y a Distancia de México

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                                    

Propipetas Probetas Vasos de precipitado Cámaras de flujo lamina de aire Microscopio estereoscópico Lupa con lámpara Estuche de disección Bisturies Navajas para bisturí Tijeras Pinzas Mechero bunsen Bomba de vacío Cajas de Petri Cánulas para cajas de Petri Cánulas para pipetas Tuberías de plástico Agitadores magnéticos Papel filtro Pepel parafilm Gasa Algodón Toallas de papel Detergente Blanqueador de lavandería Escalera de tijera Tambores rotatorios (para cultivo sumergido) Agitador para matraces Erlenmeyer Timer (reloj con alarma) Lámparas de luz fría Termostatos Balastras Gradillas para tubos, tubos de ensaye 25x150 y 25x200 Microccopio de inmersión Cubreobjetos Portaobjetos Lámara de alcohol.

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Unidad 3. Técnicas de esterilización y diseño de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales  

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