Unidad 2. Transferencia de material genético y selección bacteriana

Programa de la asignatura:

GenĂŠtica molecular bacteriana

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Transferencia de material genĂŠtico y selecciĂłn bacteriana

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Genética molecular bacteriana Transferencia de material genético y selección bacteriana

Índice

Presentación de la unidad ......................................................................................................... 2 Propósitos de la unidad ............................................................................................................. 3 Competencia específica ............................................................................................................ 4 Temario de la unidad……..........................................................................................................4 2. Transferencia de material genético y selección bacteriana…….…………….........................5 2.1. Sobrevivencia bacteriana: transferencia y recombinación de ADN y resistencia a drogas…………………………………………………………………...……………….….................5 2.1.1. Recombinación ........................................................................................................... ….6 2.1.2. Transformación………………….……………..…………………………………..................10 2.1.3. Conjugación……………………………………………………………….…….……………..12 2.1.4. Transducción……………..…………………………………………………………………….24 2.1.5. Resistencia a drogas…………………………………………………………………………..26 2.2. Herramientas en la clonación y expresión de genes para obtener bacterias recombinantes…………………………………………………………………………...……………29 2.2.1. Los plásmidos como vectores de clonación………………………………………………..29 2.2.3. Cepas bacterianas…………………………………………………………………………….36 2.2.4. Selección de bacterias recombinantes por resistencia a drogas…………….................39 Actividades .............................................................................................................................. 41 Autorreflexiones....................................................................................................................... 41 Cierre de la unidad .................................................................................................................. 41 Para saber más ....................................................................................................................... 42 Fuentes de consulta ................................................................................................................ 43

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Presentación de la unidad Las bacterias ocupan una posición única en el mundo biológico (Srivastava 2013). Sin ir muy lejos podemos evidenciar su relevancia al revisar el microbioma humano, donde por ejemplo, por cada centímetro cuadrado de superficie de la piel hay unas 10,000 bacterias, en la que existe una gran diversidad de especies. Para darnos una idea, si utilizamos el ecosistema del suelo como analogía del ecosistema de la piel humana, considerando que esta puede tener distintos nichos: "la axila podría ser tan diferente del tronco como una selva tropical de un desierto" (Fredricks 2001).

Si deseas conocer más acerca del Microbioma humano, revisa el siguiente recurso: Cárdenas Guzmán G (2012). “El microbioma humano”. ¿Cómo ves?

167:10-14 Recuperado de http://www.comoves.unam.mx/assets/revista/167/el-microbiomahumano.pdf

Pero ¿cómo es qué se conoce la identidad y fisiología de las bacterias si son tan numerosas y diversas? El método tradicional ha sido aislar o separar las bacterias de las muestras biológicas y cultivarlas en el laboratorio, siendo una labor lenta y costosa, ya que se presenta complicada en términos de determinar las condiciones óptimas de cultivo, como temperatura y nutrientes. Se estima que de todas las bacterias que existen en el planeta, sólo se han cultivado menos del 1%. Afortunadamente, la tecnología avanza a pasos agigantados y la biología molecular ha permitido el desarrollo de nuevas áreas de investigación en este campo, como la metagenómica, donde a través de utilizar técnicas similares a las que se utilizaron para descifrar el genoma humano, ahora se emplean para la identificación de las diferentes especies de bacterias en nuestro planeta (Cárdenas Guzmán, 2012).

Y ¿para qué y por qué nos interesaría conocer las diferentes especies bacterianas? Las respuestas pueden ser muchas, desde el punto de vista de las ciencias de la salud, definitivamente el identificar aquellas especies patógenas se puede relacionar directamente con la búsqueda de medicamentos; algunos casos de bacterias claramente identificadas han sido utilizadas como sistemas modelo de estudio que han permitido comprender más de la estructura celular, el metabolismo, relaciones estructura-función de proteínas, el crecimiento y reproducción bacteriana (Srivastava 2013).

Para la biotecnología, este conocimiento es indispensable, ya que esta disciplina pretende estudiar, modificar y utilizar los sistemas biológicos para un fin en específico y mínimo se requiere la identificación de la especie en cuestión. Ahora bien, es de nuestro interés este

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estudio porque contribuye importantemente al quehacer de la biotecnología, ya que gracias al uso de las bacterias genéticamente modificadas esta disciplina ha tenido una gran influencia en la solución de distintos problemas de la salud, de alimentos y protección del ambiente.

En este sentido, la Unidad 1 del curso proporcionó las bases fundamentales de los procesos moleculares que se expresan en las bacterias, en otras palabras se esboza el flujo de la información genética en los procariontes, más ahora la tarea es desentrañar, en forma detallada los mecanismos de regulación de la expresión genética y cómo este conocimiento puede contribuir al desempeño eficiente de la biotecnología en cuanto al desarrollo de bacterias genéticamente modificadas (BGM).

Acorde a lo anterior, primeramente revisaremos las estrategias de transferencia de material genético que pueden manifestar las bacterias, para posteriormente identificar las herramientas que nos permiten realizar su aislamiento.

Propósitos de la Unidad

Identificar y relacionar las estrategias de transferencia de material genético y de selección bacteriana con objeto de utilizarlas como herramientas en la generación de bacterias genéticamente modificadas.

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Competencia específica

Competencia General Relacionar estrategias moleculares de ingeniería genética mediante la descripción de técnicas de selección bacteriana y genética molecular para la producción de BGM.

Temario 2. Transferencia de material genético y selección bacteriana 2.1. Sobrevivencia bacteriana: transferencia y recombinación de ADN y resistencia a drogas 2.1.1. Recombinación 2.1.2. Transformación 2.1.3. Conjugación 2.1.4. Transducción 2.1.5. Resistencia a drogas 2.2. Herramientas en la clonación y expresión de genes para obtener bacterias recombinantes 2.2.1. Los plásmidos como vectores de clonación 2.2.2. Bacteriófagos 2.2.3. Cepas bacterianas Universidad Abierta y a Distancia de México

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2.2.4. Selección de bacterias recombinantes por resistencia a drogas

2. Transferencia de material genético y selección bacteriana En la presente Unidad 2, se revisarán dos aspectos fundamentales para poder determinar y establecer en la práctica las utilidades y grandes ventajas que puede retribuir la genética molecular bacteriana al desarrollo de toda biotecnología. Por ello, se revisará, conocerá y comprenderá la dinámica que opera en los mecanismos a través de los cuales las bacterias pueden transmitir su información genética, particularmente es de interés poder saber cómo molecularmente estos microorganismos son capaces de transmitir su adaptabilidad a diferentes condiciones ambientales, evidenciando al menos inmediatamente una aplicación terapéutica, pero cabe aclarar que pueden ser microorganismos con un alto potencial para estudiar, modificar y utilizar en diferentes campos. Por tanto, se abordará las bases moleculares, los elementos asociados y algunos ejemplos de cada uno de los tres diferentes mecanismos de transferencia de la información genética bacteriana: transformación, conjugación y la transducción.

Como primera incursión, se reconocerá y fortalecerá el concepto de la recombinación desde el punto de vista de la genética bacteriana y cómo es un evento que será común para los diferentes mecanismos de transferencia a discutir.

Asociado a lo anterior, además de contar con todo este conocimiento previo que facilita a la biotecnología la elección del mejor sistema para poder transmitir la información genética de una forma dirigida, resulta crítico contar con un bagaje amplio en cuanto a las herramientas técnicas que pueden facilitar dicha transferencia de la información. Resulta entonces comprensible, la necesidad de repasar diferentes técnicas, estudiadas previamente en la carrera, pero ahora específicamente enfocadas a su aplicación en la genética bacteriana. Con objeto de alcanzar estos propósitos se identificará de aquellas herramientas que pueden establecer y determinar la clonación y expresión génica, las que resulten ser las más adecuadas para la obtención específica de bacterias genéticamente modificadas (BGM).

2.1. Sobrevivencia bacteriana: transferencia y recombinación de ADN y resistencia a drogas Los procariontes son microorganismos que sobresalen en cuanto a su fascinante capacidad de adaptación a diferentes condiciones ambientales. Con objeto de dilucidar los mecanismos que pueden estar involucrados resulta fundamental conocer desde la Universidad Abierta y a Distancia de México

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estructura de su material genético hasta como fluye dicha información (Betancor et. al., 2006) para entonces poder estudiar su regulación y finalmente reconocer su utilidad biotecnológica.

Por ejemplo, la capacidad infecciosa de una bacteria patógena reside en que contiene la información genética necesaria para colonizar, invadir y/o producir sustancias tóxicas causantes de la enfermedad. Es importante puntualizar que dicha información se transmite y se hereda a la siguiente generación, por lo que resulta necesario conocer su funcionamiento genético. El hecho de que estos microorganismos sean de relativo fácil manejo en el laboratorio, ha favorecido que podamos utilizarlas para sintetizar productos útiles para distintos sectores (Betancor et. al. 2006).

Por ello, en esta Unidad revisaremos las estrategias de transferencia que pueden manifestar las bacterias con objeto de recombinar su material genético y de este modo adquirir cambios como la resistencia a ciertos antibióticos u otras drogas.

2.1.1. Recombinación La recombinación es un proceso que combina elementos genéticos contenidos en los genomas de diferentes individuos, dando como resultado en algunos casos que se adquiera una nueva función, como una mejor adaptación a los cambios ambientales, lo cual resulta ser un evento evolutivo de gran importancia, ya que implica una transferencia de la información genética que puede permitir a una especie adquirir una mejor capacidad de adaptación y por tanto, de sobrevivencia. En los procariontes, a diferencia de los eucariontes, la recombinación comprende una serie de mecanismos que son independientes de su reproducción sexual.

Un requisito común de todas las formas de transferencia de genes entre bacterias, exceptuando la transferencia de plásmidos (que pueden replicarse de forma independiente), es que el fragmento de ADN, sujeto a ser transferido, debe ser insertado en el cromosoma receptor, esto se logra a través de la ruptura de ambas moléculas de ADN, su entrecruzamiento y su unión (Figura 1).

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Figura 1. Recombinación entre dos moléculas de ADN lineal.

Existen diferentes formas de recombinación, donde la recombinación homóloga, se refiere a que ambos fragmentos de ADN proceden del mismo tipo de especie o bien muy cercana, es decir son muy similares, aunque no tienen que ser idénticos. Por su parte, en la recombinación heteróloga, la fuentes del material genético provienen de diferentes especies puede observarse en la siguiente figura.

Figura 2. Recombinación homóloga y heteróloga.

El evento que determinó el surgimiento de lo que ahora conocemos como ingeniería genética o ADN recombinante sucedió en 1970 cuando Hamilton Smith y Daniel Nathans descubrieron una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias específicas.

Las enzimas de restricción, actoras determinantes durante la recombinación

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Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen ADN, los cuales son llamados sistemas de modificación-restricción, y son análogos a un sistema inmune en cuanto a su función, es decir son protectores porque pueden inducir cambios con objeto de lograr la sobrevivencia de la especie. En ciertas bacterias, el propio ADN puede ser modificado en secuencias específicas a través de una enzima de modificación, la cual puede cambiar una base por otra; por su parte, una enzima de restricción solo realiza un corte (digestión) cuando reconoce una secuencia en específico. Las enzimas de restricción suelen identificar secuencias palindrómicas, que son iguales si se leen en una dirección, o en la dirección contraria, como las palabras oso o ala.

-5'CCCGGG3'- -5'TAACCG3'-3'GGGCCC5'- -5'GCCAAT3'Secuencias palindrómicas

En estas secuencias dependiendo de la posición del corte, implica que queden extremos con características particulares, por ejemplo en forma escalonada y se definen como extremos cohesivos o pegajosos, porque pueden hibridar nuevamente (Figura 3). Si ahora los extremos no quedan escalonados sino rectos, se denominan extremos romos y estos no hibridan fácilmente (Figura 3):

Figura 3. Mecanismo de acción de las enzimas de restricción.

Una vez que las enzimas ejercen su acción, se produce un conjunto definido de diferentes segmentos, mismos que pueden visualizarse si se utiliza una electroforesis, ya que los fragmentos pueden separarse por su peso molecular, en un proceso que es análogo a la separación de proteínas:

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Ahora bien, si el fragmento de ADN producto de la digestión de una enzima de restricción de un organismo se asocia con otro segmento de ADN, generado por la misma enzima pero de un organismo diferente, se puede obtener una molécula híbrida o una molécula de ADN recombinante (Soberón 2009).

Para que se reúnan las hebras cortadas, se requiere de la acción de otra enzima que es la ADN ligasa, la cual cataliza la formación del enlace fosfodiéster necesario para que se unan las hebras del material genético. Para que la recombinación sea exitosa es requisito que la nueva secuencia se transcriba y traduzca en una célula y que además se replique.

La recombinación sucede tanto en eucariontes como procariontes, e implica la generación de un nuevo genotipo como resultado del intercambio de material genético entre secuencias homólogas de ADN de dos orígenes diferentes.

Recombinación genética en bacterias A diferencia de las células eucariontes, las bacterias sólo tienen un único cromosoma.

Por tanto, para que suceda la recombinación, el cromosoma homólogo debe ser transferido de una bacteria donadora a una receptora, si se considera que el cromosoma donador debe ser homólogo con el receptor, entonces es de esperarse que ambas bacterias pertenezcan a la misma especie o a especies muy relacionadas. Por tanto, la Universidad Abierta y a Distancia de México

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recombinación bacteriana sucede si y solo si sucede una transferencia del material genético, fragmento de ADN, de la bacteria donadora hacia una célula receptora y se manifiesta porque dicho fragmento se puede transcribir, traducir y replicar en la célula aceptor. Si no hay recombinación, el fragmento de ADN de la bacteria donadora se pierde, porque no se puede replicar de forma independiente.

Ahora bien, también puede suceder la recombinación heteróloga, la cual ha sido ampliamente utilizada por la biotecnología, donde hay muchos ejemplos de genes de origen animal expresados en bacterias y plantas con la finalidad de obtener diversas proteínas recombinantes de gran interés en la industria farmacéutica y alimentaria.

Por tanto, la recombinación genética bacteriana sucede cuando se transfieren fragmentos de ADN de una célula donadora a una receptora, ahora es de nuestro interés conocer dichos mecanismos de transferencia que tienen características, ventajas y desventajas particulares, los cuales son: transformación, conjugación o transducción.

2.1.2. Transformación La transformación es un proceso de recombinación génica mediante el cual las bacterias pueden incorporar ADN exógeno o extraño, que puede provenir de otras bacterias y que se encuentra libre en el medio (Figura 4).

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Figura 4. Recombinación bacteriana por transformación.

No todas las bacterias pueden captar este ADN exógeno, cuando lo conservan en forma estable e interaccionan con el mismo, se dice que son competentes. Esta competencia depende de la presencia de un sistema de captación de ADN específico y que se encuentra asociado a la membrana celular. Como ejemplos de bacterias competentes se encuentran Haemophilus influenzae, Neisseria sp, Streptococcus pneumoniae, etc. Aun cuando no todas las especies de bacterias pueden ser competentes, esta se puede inducir en el laboratorio al generar alteraciones en la membrana celular (Betancor et al. 2006).

Dentro de las técnicas comunes para inducir la competencia se encuentra la electroporación, que consiste en la aplicación de un pulso eléctrico. También se puede utilizar agentes químicos como el cloruro de calcio, y el choque térmico es una herramienta ampliamente utilizada. Es importante precisar que no en todas las células procariontes se puede inducir la competencia y lo usual es probar más de una técnica para alcanzarla.

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2.1.3. Conjugación En la conjugación, la transmisión de ADN se realiza directamente de una célula bacteriana a otra. Los plásmidos son los elementos genéticos que con mayor frecuencia se transmiten a través de este mecanismo. Esta capacidad de transferencia va a depender de la presencia de plásmidos conjugativos que contienen los genes necesarios para realizar dicho evento (Betancor et al. 2006).

Pero ¿qué características presenta y cómo es que se puede favorecer la conjugación?

Resulta que para que se dé la transferencia de genes generalmente contenidos en un plásmido, ya sea de una bacteria a otra bacteria, o bien de una interacción bacteria-célula hospedera, debe existir primeramente un contacto físico entre ambos tipos celulares y establecerse un puente de unión entre las superficies de ambos, para poder introducir y recombinar el material genético. Aun con todos los avances tecnológicos alcanzados, dichos eventos aún no han sido del todo dilucidados, pero se tiene conocimiento muy valioso de cómo pueden operar estos sistemas (Thanassi et al. 2012; Arutyunov y Frost 2013).

Acorde a lo anterior, el primer requisito es que se establezca una unión entre las bacterias involucradas sujetas a ser modificadas genéticamente: 1) Debe existir un acercamiento físico entre ambos tipos celulares, lo cual se alcanza a través de organelos de superficie como el pili, el cual se localiza en la bacteria donante del plásmido y uno de sus objetivos es identificar y promover el acercamiento a la célula receptora.

2) Una vez establecido el puente de comunicación entre los dos tipos celulares, comienza un flujo de material desde la bacteria hacia la célula receptora, donde los sistemas de secreción bacterianos, se encargan de producir y excretar diversas moléculas que no solo pueden favorecer el fortalecimiento del puente de unión, sino también la entrada de factores de virulencia y el ADN candidato a ser insertado en el cromosoma de la célula

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receptora. Hay que recordar que la recombinación es exitosa si y solo si el fragmento de ADN se transcribe, traduce y replica.

Transferencia de genes Bacteria sensible al Ácido Nalidíxico.

Bacteria donadora que acarrea el Bacteria resistente al Ácido Nalidíxico. plásmido resistente a ampicilina amp

Mezcla del cultivo

Agar selectivo que contiene ácido nalidíxico y ampicilina

Bacteria receptora con mutación cromosomal resistente a ácido nalidíxico que contiene el plásmido que confiere resistencia a ampicilina Figura 5. Transferencia por conjugación de un plásmido resistente. La cepa donadora es sensible a ácido nalidíxico y acarrea un plásmido que confiere resistencia a ampicilina (amp). La bacteria receptora es resistente a ácido nalidíxico, debido a una mutación cromosomal y es sensible a ampicilina. Después de haber crecido en la mezcla de cultivo, el plaqueo sobre agar conteniendo tanto ampicilina como ácido nalidíxico, selecciona aquellos receptores que han recibido el plásmido (transconjugantes). El cromosoma bacteriano es omitido para mejorar la claridad (Basado en Dale y Park, 2004).

La Figura 5 ilustra un ejemplo de una estrategia experimental para llevar a cabo la conjugación, en breve, esta transferencia se obtiene por la mezcla de dos cepas, por ejemplo cada una de ellas puede contener información genética que les confiere resistencia a algún antibiótico, esta mezcla después de un periodo de incubación, momento en el que sucede la conjugación, se coloca sobre un medio que contenga

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ambas sustancias ante las que presentan la resistencia, por tanto solo crecerán las bacterias que contenga genes de ambos progenitores. Por ejemplo, en los experimentos mostrados en la Figura 5, una cepa (la donadora) lleva un plásmido que le confiere resistencia a ampicilina, mientras que la segunda cepa no tiene el plásmido pero tiene una mutación cromosómica que la hace resistente a ácido nalidíxico. Después de la incubación del cultivo mixto, una muestra es transferida dentro de un medio que contiene ambos antibióticos. Ninguno de los progenitores puede crecer sobre este medio, por tanto las colonias que se observen serán debido a la transferencia de una copia del plásmido del donador a la célula receptora. Este evento tiene una elevada sensibilidad, ya que se ha observado que basta con que 1 en 106 células receptoras haya obtenido una copia del plásmido transferido, es suficiente para que se obtenga un crecimiento de la progenie en el medio provisto por los dos antibióticos.

Entre las bacterias donde la conjugación se presenta con mayor frecuencia, se encuentran miembros de las Enterobacterias y las bacterias Gram negativas (como los Vibrios y Pseudomonas). Varios géneros de bacterias Gram positivas poseen sistemas de conjugación razonablemente bien caracterizados. Estos sistemas caracterizados incluyen las especias Streptomyces, que tienen importancia comercial como los mayores productores de antibióticos; así como los estreptococos lácticos, que también tienen importancia comercial por sus aplicaciones en varios aspectos de la industria láctea.

La significancia más evidente de la conjugación es que permite la transmisión de plásmidos de un cultivo a otro. Considerando que la conjugación no necesariamente está confinada a miembros de la misma especie, esto provee una ruta para el flujo de información genética a través de una amplia frontera taxonómica. Una consecuencia práctica por ejemplificar, sería que los plásmidos que están presentes en la flora intestinal normal puede ser transferida a patógenos infectivos, los cuales pueden entonces volverse resistentes a un amplio espectro de diferentes antibióticos (Dale y Park 2004).

MECANISMOS DE CONJUGACIÓN Formación de parejas de apareamiento En la mayoría de los casos, la incidencia de la conjugación, depende de la presencia de una cepa donadora que contenga un plásmido que contiene los genes requeridos para promover la transferencia de ADN. En E. coli y otras bacterias Gram-negativas, las células donadoras acarrean apéndices sobre la superficie celular (pilis). Los pilis, varían considerablemente en estructura, por ejemplo, el pili específico para el plásmido F es largo, delgado y flexible, mientras que el pili para el plásmido RP4 es corto, grueso y rígido. Los pilis hacen contacto con receptores sobre la superficie de la células, así forman

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las parejas de apareamiento (Figura 6). El pili, por tanto, atrae la célula para un contacto íntimo y hacer un canal o un poro por medio del cual el ADN pase del donador al receptor.

Pilis

Plásmido

Donador Cromosoma bacteriano

El pili hace contacto con el receptor Receptor

Pareja de apareamiento

Transconjugante

Copia del plásmido transferido al receptor

Donador

Figura 6. Transferencia de ADN por conjugación (Tomado de Dale y Park, 2004).

Interesantemente, este mecanismo tiene mucho en común con el sistema de secreción de proteínas, el cual es usado por algunas bacterias para entregar proteínas tóxicas directamente dentro de las células huésped.

Por transferencia de ADN La transferencia de ADN de un donador a un receptor (Figura 7) se inicia por una proteína que hace un corte sitio específico en una hebra de ADN, conocido como el origen de transferencia (oriT). Un plásmido que codifica para una helicasa desenreda el ADN del plásmido y la hebra cortada es transferida al receptor comenzando por el extremo terminal 5’ generado por el corte. Al mismo tiempo, el extremo terminal libre 3’ de la hebra cortada es extendido para remplazar el ADN transferido, por un proceso conocido como replicación en círculo rodante el cual es análogo a la replicación de hebras simples de plásmidos y bacteriófagos. La proteína cortadora permanece unida al extremo terminal 5’

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del ADN transferido. La síntesis de ADN en el receptor convierte la hebra en una molécula de hebra doble.

Hay que hacer notar que este es un proceso de replicación. Así, si bien se ha puntualizado la transferencia de plásmidos de una célula a otra, lo que realmente significa es la transferencia de la copia de un plásmido. La cepa donadora todavía tiene una copia del plásmido y puede involucrarse en posteriores apareamientos con otros receptores. Es también digno de mención que, después de la conjugación, la célula receptora tiene una copia del plásmido y puede transferir la copia a otra célula receptora.

Las consecuencias pueden ser la diseminación de un plásmido a través de una población mezclada.

Donador

Receptor

El plásmido es cortado en un sitio específico, oriT

Pareja de apareamiento

Sintesis de ADN en el donador por extensión del extremo terminal 3’ de la hebra cortada

Hebra simple transferida

ADN transferid es copiado en la célula receptora.

Figura 7. Mecanismo de transferencia por conjugación de ADN plasmídico. Para mayor claridad, solo el plásmido es mostrado (Basado de Dale y Park, 2004).

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Movilización y transferencia cromosomal No todos los plásmidos son capaces de ser transferidos a otra célula, los plásmidos que pueden hacerlo, como ya se había comentado previamente, son conocidos como plásmidos conjugativos. En algunos casos los plásmidos conjugativos son capaces de promover la transferencia (movilización) de un segundo plásmido no conjugativo de la misma célula donadora. Esto no sucede por casualidad y no todos los plásmidos no conjugativos pueden ser movilizados.

La movilización involucra un gene mob, el cual codifica una nucleasa específica, y el sitio bom (=oriT, el origen de la transferencia), donde la nucleasa mob hace un corte en el ADN. ColE1 tiene los genes para la transferencia de ADN, pero no trae consigo los genes requeridos para la formación de una pareja de apareamiento. La presencia de otro plásmido (conjugativo) permite que el donador pueda formar una pareja de apareamiento con la célula receptora y así puede usar su propia maquinaria para acarrear el ADN transferido.

Algunos plásmidos pueden ser movilizados sin importar el gene mob, dicha movilización depende sobre la habilidad de la nucleasa mob del plásmido conjugativo para reconocer el sitio bom del plásmido a ser movilizado. Esto sólo funciona si los dos plásmidos están estrechamente relacionados. Por otro lado, el sitio bom es esencial para la movilización.

Este es un factor importante durante la modificación genética promovida por la conjugación, la remoción del sitio bom de un vector plasmídico asegura que el plásmido modificado no podrá ser transferido a otras cepas bacterianas.

En la mayoría de los casos, el ADN que es transferido de un donador a un receptor consiste únicamente de una copia de un plásmido. Sin embargo, algunos tipos de plásmidos pueden promover la transferencia del ADN cromosomal. El primero que fue descubierto, y mejor conocido, es el plásmido F (fertilidad) de E. coli, pero sistemas similares existen en otras especies, como en Pseudomonas aeruginosa. En algunos casos, como se describe a continuación, esto involucra la integración del plásmido conjugativo dentro del cromosoma donador (por tanto si el cromosoma es en efecto transferido como parte del plásmido). Sin embargo, en muchos casos la transferencia cromosomal ocurre sin ninguna asociación estable con el plásmido, posible por un mecanismo análogo a movilizarse de un plásmido no conjugado.

Cuando un plásmido es transferido de una célula a otra por conjugación, el plásmido completo ha sido transferido. En contraste, la transferencia cromosómica no involucra una copia intacta. Una razón para esto es el tiempo que es requerido para la transferencia. El proceso es menos eficiente que la replicación normal de ADN y la transferencia de todo el cromosoma podría tomar 100 min (en E. coli). La pareja de apareamiento muy raramente

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permanece junta por mucho tiempo. En contraste, un plásmido de unos 40 kb (kb = kilo bases, 1 kb = 1000 nucleótidos) es equivalente al 1% del tamaño del cromosoma, - así la transferencia del plásmido podría esperarse que se complete en 1 min. La transferencia incompleta del ADN cromosómico significa que esto no constituye un replicón intacto de la célula receptora (Dale y Park, 2004).

El plásmido F El plásmido fue descubierto originalmente durante intentos para demostrar el intercambio genético en E. coli por cultivos mezclados de dos o más cultivos auxotróficos, por tanto se cultivaban sobre medios mínimos para permitir que únicamente los recombinantes crezcan. Fue mostrado muy pronto que los recombinantes eran todos derivados de una cepa progenitora y que una sola vía de transferencia de información era la que estaba involucrada, por parte del donador (macho) al receptor (hembra). La cepa donadora acarreaba el plásmido (F+) mientras que el receptor es F-. Una característica de este sistema que parece ser curioso al mismo tiempo es que la co-cultivación de una cepa F+ y una cepa F- resulta en que las hembras son convertidas en machos. Esto es debido a que la transmisión del plásmido F, por sí mismo, ocurre muy frecuentemente, en contraste a la transferencia de marcadores cromosomales, los cuales son ineficientes ante un F+ donador.

Cepas Hfr La utilidad de la conjugación para el análisis genético fue enormemente incrementada por el descubrimiento de las cepas donadoras en las cuales la transferencia de ADN cromosomal ocurría más comúnmente. Estas cepas Hfr (High Frequency of Recombination, por sus siglas en ingles que significa alta frecuencia de recombinación) surgen de la integración del plásmido F dentro del cromosoma bacteriano. Una característica adicional de una cepa Hfr es que la transferencia cromosomal empieza de un punto definido y procede en una dirección específica. El origen de la transferencia está determinada por un sitio de inserción del plásmido F y la dirección está gobernada por la orientación del plásmido insertado. Esto puede quedar aclarado remarcando la molécula circular en la Figura 7 que contiene un plásmido F integrado al ADN cromosomal. La transferencia es así iniciada del sitio oriT del plásmido integrado, pero que ahora resulta en la transferencia de una copia del cromosoma bacteriano en vez de solamente el plásmido. Un donador F+, en contraste, transfiere genes de una forma más o menos aleatoria, ya que la transferencia no se inicia desde un sitio definido en el cromosoma. La combinación de la transferencia parcial de ADN cromosómico con la transferencia

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ordenada de los genes, hizo de la conjugación una herramienta importante en el mapeo de los cromosomas bacterianos.

Integración y la escisión de F: formación de plásmido F’ La integración del plásmido F se produce por recombinación entre una secuencia en el plásmido y un sitio cromosómico. En la Figura 8a se muestra que ocurre adyacente al operón de lactosa, pero puede ocurrir en un gran número de sitios. Después de la integración, el plásmido F se encuentra en una forma lineal en el sitio de integración (Figura 8c). La integración es reversible ya que la recombinación entre los sitios en los extremos del plásmido integrado dará lugar a su escisión del cromosoma como una molécula circular independiente (Figura 8, pasos c-a). Sin embargo, es posible que para esta escisión se produzca de forma, es decir, la recombinación se produce en un sitio diferente. Si esto sucede, el plásmido resultante habrá incorporado una pequeña cantidad de ADN bacteriano. Esta forma se le conoce como una plásmido F’ (F-prima). Figura 8c-e muestra la formación de un plásmido F’lac, donde el evento de recombinación que lleva a la escisión ha ocurrido en un sitio más allá del operón lac (lactosa), en lugar de entre los sitios que flanquean el plásmido F integrado. El operón lac por lo tanto, se ha incorporado en el plásmido (al mismo tiempo que genera una deleción en el cromosoma) y será transferido con el plásmido a una cepa receptora. Este es un mecanismo por el cual un plásmido puede adquirir genes adicionales a partir de un cromosoma y transferirlos a otra cepa o especie.

Antes de la llegada de la clonación de genes, los plásmidos F’ fueron útiles en un buen número de formas, incluyendo el aislamiento de genes específicos y su transferencia a otras cepas huésped. Esto permitió la creación de diploides parciales, es decir, cepas con una copia de un determinado gen en el plásmido además de la copia cromosómica.

Conjugación en otras bacterias La descripción anterior de la conjugación se aplica principalmente a bacterias Gramnegativas tales como E. coli y Pseudomonas. Muchas de las especies Gram-positivas, que van desde Streptomyces a Enterococcus, también poseen plásmidos que son transmisibles por conjugación y en muchos casos, el mecanismo de transferencia de ADN es bastante similar a lo descrito anteriormente. Sin embargo, hay diferencias sustanciales en los demás aspectos.

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lac

Escisión

Cromosoma

a

Integración

d Escisión aberrante

b Delecion de lac

e

c Plásmido F

Figura 8. La integración y la escisión del plásmido F. La integración se produce mediante recombinación con un sitio cromosómico (a-c). Escisión exacta se produce por recombinación en el mismo sitio, pero la recombinación con diferentes sitios cromosómicos resulta en la incorporación de ADN cromosómico adyacente (en este caso el gene lac) dentro del plásmido (d, e), formando un plásmido F’ y causando una deleción cromosómica (Dale y Park 2004).

En general, el número de genes necesarios para la transferencia por conjugación es de tan sólo como cinco genes, y es mucho menor que en las bacterias Gram-negativas, donde se necesitan 20 o más genes. El número de plásmidos conjugativos en bacterias Gram-positivos, por lo tanto, pueden ser considerablemente más pequeño. Una de las razones para un menor número de genes que se requieren es que parece que no hay necesidad para producir un pili. Esta es probablemente, al menos en parte, un reflejo de la arquitectura diferente de la pared celular en bacterias Gram-positivas que carecen de la membrana exterior característica de los Gram-negativos.

Un grupo de bacterias Gram-positivas, donde los sistemas de conjugación han sido estudiado en detalle son los enterococos, principalmente Enterococcus faecalis. Algunas cepas de E. faecalis secretan péptidos difusibles que tienen una acción similar a las feromonas que puede estimular la expresión de los genes de transferencia (tra) de un plásmido específico en una célula vecina. Hay que hacer notar que, de manera sorprendente es la célula receptora la que produce las feromonas. La célula donante, que lleva el plásmido, tiene un receptor plásmido codificado en la superficie celular al que se une la feromona. Diferentes tipos de plásmidos codificado para diferentes tipos de receptores y que son estimulados por diferentes feromonas. Sin embargo, el receptor produce una gama de feromonas y por lo tanto es capaz de aparearse con las células que llevan plásmidos diferentes.

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Después de que la feromona se ha unido al receptor de la superficie celular, es transportado al citoplasma por una proteína de transporte específica, donde interacciona con una proteína llamada TraA. Esta proteína es un represor de los genes tra en el plásmido y la unión del péptido alivia aquella represión, estimulando de este modo la expresión de los genes tra. Un resultado es la formación de productos de agregación que causan la formación de un agregado de acoplamiento que contiene unidas las células donantes y receptoras. Una consecuencia adicional de la expresión de los genes tra es la estimulación de los eventos necesarios para la transferencia del plásmido, que se produce por un mecanismo similar al descrito anteriormente.

Una ventaja de este sistema es que las células que contienen el plásmido no expresan los genes necesarios para la transferencia de plásmido a menos que exista un receptor adecuado en las proximidades. Esto no sólo reduce la carga metabólica en la célula, sino que también significa que no están expresando antígenos de superficie (tales como pili conjugativo) que podrían ser reconocidas por el sistema inmune del huésped.

Transposones conjugativos E. faecalis también proporciona un ejemplo de una excepción a la regla general de que la conjugación es mediada por plásmidos. Algunas cepas de E. faecalis contienen un transposón conocido como Tn916. Los transposones no se cubren particularmente en esta Unidad, pero por el momento es suficiente saber que son elementos genéticos móviles que son capaces de moverse de un sitio a otro del ADN. Lo que diferencia a Tn916 aparte de otros transposones es su capacidad de transferir de una célula a otra por conjugación.

Transposones conjugativos tales como Tn916 difieren de los plásmidos en que se replican y heredan como parte del cromosoma. No hay forma estable de replicación independiente como la hay con un plásmido. Sin embargo, una inspección más detallada del método de transferencia (Fig. 9) muestra que existe una similitud significativa a la transferencia de un plásmido. En particular, Tn916 contiene un origen de transferencia (oriT) que es bastante similar a la que se encuentra en muchos plásmidos. El primer paso en la transferencia es la escisión del transposón a partir del cromosoma, usando enzimas transposóncodificadas (Int y Xis) que están relacionadas con los responsables de la integración y la escisión del bacteriófago lambda. Produce una molécula circular que se asemeja a un plásmido en todos menos un rasgo vital - que no tiene un origen de replicación por lo que es incapaz de ser copiados en la forma normal. Sin embargo, ya que tiene un sitio de oriT y lleva los genes tra necesarios para la transferencia conjugacional, es como puede ser transferido a una célula receptora.

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Al igual que con los sistemas de transferencia de plásmido descrito anteriormente, la transferencia de Tn916 implica la síntesis de ADN de hebra sencilla iniciado en oriT y la transferencia de la cadena desplazada al receptor. La única hebra transferida a continuación, se circularizá y convierte a una forma circular de doble cadena que se inserta aleatoriamente en el cromosoma receptor por la acción de la integrasa.

Una característica adicional de Tn916 que vale la pena considerar es, si la transferencia se produjo sin la escisión a partir del cromosoma entonces, se esperaría que la movilización del cromosoma ocurriera con la transferencia incompleta del transposón.

Transferencia comienza a partir de oriT y tendría que trabajar justo a la vuelta del cromosoma antes de llegar al resto del transposón. Esto no parece suceder. La razón es que el promotor para la expresión de los genes tra se encuentra hacia el extremo izquierdo del transposón (en la Fig. 9) y se encuentra lejos de los genes tra. En la forma lineal no se pueden expresar los genes tra. Sin embargo, cuando el transposón se escinde del cromosoma y es circularizado, esto trae al promotor a la posición y orientación correcta para la transcripción de los genes tra. Por lo tanto, se expresan a partir del intermediario circular, pero no de la forma lineal. Esto asegura que el sistema de transferencia sólo se activará después de haberse producido la escisión.

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Escisión Donador

Iniciación de la transferencia a partir de oriT

Hebra sencilla transferida y circularizada Síntesis de la segunda hebra Receptor Integración

Figura 9. Transferencia del transposón conjugativo Tn916. El transposón se escinde del cromosoma, usando las enzimas Int y Xis y posteriormente es circularizado. Esto permite a los genes tra ser expresados a partir del promotor mostrado y la transferencia por conjugación se inicia a partir de oriT. En el receptor, el ADN transferido es circularizado, la segunda hebra se hace y el transposón se integra en el cromosoma (Dale y Park 2004).

Tn916 es el prototipo de una familia de transposones conjugativos relacionados que son especialmente extendido en cocos Gram-positivos, aunque los elementos relacionados también se producen en bacterias Gram-negativas (por ejemplo, Bacteroides). Para muchos de estos elementos, incluyendo Tn916, la transmisión conjugativa es promiscua ya que se puede transferir a otras especies o géneros. Es de suponer, pues, que los transposones conjugativos han jugado un papel importante en la difusión de material

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genético, incluidos los genes de resistencia a antibióticos en todo el reino bacteriano. En particular, muchos de estos transposones, incluyendo Tn916, llevan un gen de resistencia a tetraciclina (tetM) que se encuentra en una amplia gama de especies bacterianas, lo que sugiere que han desempeñado un papel en la dispersión de este gen en particular.

2.1.4. Transducción Transducción es la transferencia mediada por fagos de material genético. El paso clave en la transducción es el envase de ADN en las cabezas de fagos durante el crecimiento lítico del fago. Este proceso es normalmente altamente específico para el ADN del fago.

Sin embargo, con algunos fagos, los errores pueden ocurrir en fragmentos de ADN bacteriano (producido por la degradación del cromosoma del huésped mediada por fagos) se empaquetan de vez en cuando por error conduciendo a partículas tipo fago que contienen un segmento de genoma bacteriano (véase la Figura 10).

Estas partículas de transducción son capaces de infectar una célula receptora, ya que la información necesaria para la unión y la inyección de ADN se realiza por las proteínas de la partícula del fago, cualquiera que sea el ácido nucleico que contenga. El segmento de ADN transducido se puede inyectar en una nueva célula huésped.

No todos los bacteriófagos son capaces de llevar a cabo la transducción. Los requisitos básicos de un fago transductor eficaz son que, la infección debería dar como resultado un nivel apropiado de la degradación del ADN cromosómico para formar fragmentos de tamaño adecuado en el momento adecuado para el envasado y que la especificidad del proceso de envasado debe ser comparativamente baja.

En algunos casos, el ADN transducido es un plásmido bacteriano, en cuyo caso la molécula de ADN inyectado es capaz de ser replicado y heredado. Más comúnmente el ADN incorporado en la partícula de transducción es un fragmento de ADN cromosómico que será incapaz de replicarse en la célula receptora. Para que sea replica y heredada, debe ser incorporada en el cromosoma receptor (por recombinación homóloga), como es el caso con otros mecanismos de transferencia de genes.

Este proceso se conoce como transducción generalizada (en oposición a la transducción especializada), ya que prácticamente cualquier gen tiene la misma probabilidad de ser transducido.

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Bacteria donadora

Replicación de ADN Síntesis de partículas del fago

Infección lítica

Empaquetamiento del ADN Dentro de las cabezas de los fagos Lisis Partícula transductora

Incorporación del ADN cromosomal

Infección del receptor

Recombinación con el ADN del huésped Fragmento de ADN transducido

Figura 10. Transducción generalizada (Dale y Park, 2004).

Transducción especializada Algunos fagos (fagos atenuados) son capaces de establecer un estado conocido como lisogenia, en la que se reprime la expresión de genes del fago y de replicación del fago.

En muchos casos, el profago se inserta en el ADN bacteriano y se replica como parte del cromosoma. Cuando empieza la lisogenia y el fago entra en el ciclo lítico, que se escinde del cromosoma por recombinación entre las secuencias en cada extremo del profago integrado. Si este evento de recombinación ocurre en el lugar equivocado, una región Universidad Abierta y a Distancia de México

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adyacente de ADN bacteriano se incorpora en el ADN del fago. Toda la progenie de este fago contendrá entonces este gen bacteriano que por lo tanto, será transducido a una frecuencia muy alta (efectivamente 100 por ciento por partícula de fago) una vez que el fago transductor ha sido aislado. Dado que el ADN transferido se limita a una región muy pequeña del cromosoma, el fenómeno se conoce como transducción especializada (o restringida). Esto es muy similar a la formación de plásmidos F' mencionados anteriormente (véase la Figura 8). Al igual que con los plásmidos F', ahora es mucho más fácil añadir genes lambda ADN creando recombinantes in vitro.

Otro fago que se ha empleado de forma similar es el fago Mu que tiene la ventaja de insertarse en múltiples sitios en el cromosoma por un mecanismo tipo transposón. Por lo tanto, es mucho más fácil para crear una amplia gama de fagos transductores especializados con Mu que se puede utilizar tanto en el mapeo genética y en mutagénesis.

2.1.5. Resistencia a drogas Durante los últimos años el público está cada vez más alarmado por los nuevos datos científicos en los medios de comunicación sobre la conexión entre el abuso drogas en la medicina, la industria agroalimentaria y la agricultura, y la aparición y propagación de bacterias resistentes a drogas. La resistencia de bacterias a drogas va en aumento. Más de 150 drogas antibacterianas están disponibles, los cuales se clasifican en 20 diferentes clases y 10 de estas clases tienen objetivos específicos de acción, incluyendo las paredes y membranas celulares, ácidos nucleicos y proteínas y la síntesis de ácido fólico. Con un menor número de nuevas drogas que llegan al mercado, el problema de resistencia a drogas que ya están en uso se ha convertido en una crisis de salud pública. Un estudio estima que los costos hospitalarios directos de la gestión de resistencia a drogas en los Estados Unidos son de $ 100 a 10,000 millones de dólares al año, y la Oficina de Evaluación de Tecnologías de Estados Unidos ha estimado que los costos hospitalarios mínimos de 5 tipos de infección nosocomial (por ejemplo, infección de la herida quirúrgica y la neumonía) debido a la resistencia a drogas fueron de $ 4500 millones de dólares por año.

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La resistencia microbiana a drogas va en aumento, en parte, debido al uso inadecuado de los antibióticos en medicina, así como también a las prácticas inadecuadas de la industria agrícola, donde la producción animal intensiva implica dar a los animales de ganado grandes cantidades de drogas (antibióticos) para promover el crecimiento y prevenir infecciones. Estos usos promueven la selección de resistencia a antibióticos en poblaciones bacterianas. Las bacterias resistentes de entornos agrícolas pueden ser transmitidas a los seres humanos, en los que causan la enfermedad que no puede ser atendida por los antibióticos convencionales que actualmente existen en el mercado.

Se necesitan dos condiciones para para desarrollar resistencia a drogas en bacterias. En primer lugar, el organismo debe entrar en contacto con la droga. Entonces, la resistencia contra el agente se debe desarrollar, junto con un mecanismo para transferir la resistencia a la progenie o directamente a otros miembros de la misma especie.

Cada droga actúa en un sitio específico dentro de la célula bacteriana. Por ejemplo, algunos se dirigen a las paredes celulares (por ejemplo, bacitracina, cefalosporinas y penicilinas), otras tienen como blanco la membrana celular (por ejemplo, los ionóforos y polimixinas), componentes de las células responsables de la síntesis de proteínas (por ejemplo, aminoglicósidos, cloranfenicol y tetraciclina), ARN (por ejemplo, rifamicinas), ADN (por ejemplo, ácido nalidíxico y quinolonas) o particulares vías bioquímicas tales como la síntesis de ácido fólico (por ejemplo, metotrexato y sulfonamidas). Por lo tanto, cuando surgen organismos resistentes, su resistencia es específica a drogas particulares.

Las bacterias han desarrollado diversos mecanismos para transmitir rasgos de resistencia a otros miembros de su propia especie y para otras especies. Rasgos genéticos para la resistencia a drogas se codifican en dos lugares en bacterias: los cromosomas y los elementos extra-cromosómicos (plásmidos y transposones). Las mutaciones pueden Universidad Abierta y a Distancia de México

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provocar que los genes cromosómicos que por lo general codifican para sensibilidad a las drogas, comiencen a codificar resistencia; tales mutaciones se producen a razón de uno por millón a uno por mil millones de células. Los elementos extra-cromosómicos (plásmidos y transposones) son piezas más pequeñas de ADN circular, cada uno equivalente en tamaño a aproximadamente 1% del cromosoma bacteriano. Los plásmidos pueden ser no conjugativos o conjugativos; este último puede moverse desde una bacteria a otra.

El intercambio genético es otro mecanismo por el cual los plásmidos resistentes a drogas se pueden mover entre bacterias (Figuras 6, 7 y 9). Algunas bacterias son consideradas como "promiscuas", porque una vez que han adquirido plásmidos resistentes a drogas, realizan la transferencia de la resistencia tanto entre la misma especie como con otras especies bacterianas con independencia del medio ambiente (es decir, si las drogas están presentes o no).

Transferencia inusual de secuencias de ADN resistentes a los antibióticos entre especies bacterianas y entre los diferentes nichos ecológicos (por ejemplo, entre los seres humanos y rumiantes) se han documentado. Por ejemplo, en Staphylococcus aureus, una bacteria gram-positiva, el gen cromosómico para la resistencia a la meticilina se originó como un gen de β-lactamasa estafilocócica y un segmento de un gen de unión a penicilina procedentes de una bacteria donante desconocido, tal vez Escherichia coli, un gramo bacteria-negativo.

En lo que se refiere a mecanismos de resistencia, algunas especies de bacterias son intrínsecamente insensibles a ciertos antibióticos, mientras que otras son sensibles. La sensibilidad tiene 3 requisitos: 1) un objetivo para la reacción, 2) un mecanismo para el transporte en la célula antes de la acción de los antibióticos y 3) la ausencia de enzimas que podrían inactivar o modificar el antibiótico. Un cambio en cualquiera de estos requisitos previos podría hacer que una bacteria se vuelva resistente a la droga o antibiotico. Por ejemplo, una o más mutaciones pueden ser adquiridas al cambiar el objetivo de la acción, la captación, el flujo de salida de extrusión de los antibióticos, o la capacidad de la bacteria para inactivar o modificar el antibiótico.

Los fármacos antimicrobianos utilizados para la terapia humana a menudo tienen importantes similitudes estructurales a los que se usan para los animales, lo que lleva a la posibilidad de problemas adicionales. Por ejemplo, la resistencia a la ormetoprim, un medicamento veterinario, podría fomentar la resistencia a la trimetoprima, un compuesto estructuralmente similar que se especifica para su uso en seres humanos.

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Las bacterias resistentes a la estreptogramina, quinupristina y dalfopristina se han encontrado en los pavos que se habían dado virginiamicina, pero no cualquiera de los otros antibióticos, sin embargo, todos estos compuestos tienen una estructura similar.

El uso de alimentos para animales suplementado con tilosina se ha traducido en el desarrollo de resistentes cepas resistentes a eritromicina de estreptococos y estafilococos, no sólo en los animales, sino también en sus cuidadores.

2.2. Herramientas en la clonación y expresión de genes para obtener bacterias recombinantes La genética bacteriana está pasando por una fase interesante de su historia. Las nuevas metodologías y comprensión concomitante de la biología molecular han dado a los científicos nuevos conocimientos que hasta ahora es complicado estimar su impacto final.

La genética bacteriana se está convirtiendo en una herramienta poderosa para el estudio de sistemas genéticos diferentes al de las mismas bacterias, así como desarrollo de procesos aplicables a problemas específicos a nivel industrial, ecológicos, farmacéuticos, u otros problemas específicos en desarrollo (por ejemplo, problemas de fermentación y problemas bioquímicos).

Así, dentro de la genética bacteriana hay varias herramientas, algunas de las cuales serán abordadas en los presentes tópicos.

2.2.1. Los plásmidos como vectores de clonación La constitución genómica de varias bacterias puede consistir en dos componentes, a saber, el cromosoma que lleva los genes para todas las funciones esenciales y su regulación, y de una unidad cromosómica adicional pero autónoma denominado plásmido que inicialmente se pensó para llevar las funciones necesarias para su propia replicación, mantenimiento, y distribución. Sin embargo, los plásmidos no deben ser considerados moléculas egoístas o promiscuas ya que muchos de ellos se han descrito para transportar genes que proporcionan funciones de ventaja selectiva. Por ejemplo, se pueden codificar resistencia a varios agentes antimicrobianos, tales como antibióticos, metales pesados o toxinas, o para la producción de antibióticos, pigmentos, toxinas, H2S, y otros, o pueden proporcionar capacidades catabólicas inusuales, o dotar fertilidad, etc. También pueden inducir tumores de plantas, y otras respuestas simbióticas y patógenas en plantas y animales, para nombrar unos pocos. Además, un plásmido también puede llevar algunos genes esenciales.

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Los plásmidos han jugado un papel muy importante en la evolución bacteriana ya que célula que contuvo, en su momento, un plásmido puede haber tenido una ventaja adaptativa sobre las bacterias libres de plásmidos. En los últimos años, su importancia se ha incrementado enormemente debido a su aplicación en la investigación en ingeniería genética como un portador de ADN recombinante, y les ha traído reconocimiento generalizado. Una célula bacteriana puede o no llevar a un plásmido o puede llevar más de un tipo o de copias de un plásmido. Los plásmidos que a menudo han sido comparados con los organismos vivos mediante la aplicación de los mismos atributos que se hace en busca de virus. Por lo tanto, un organismo'' es el elemento unidad de un linaje continuo con una historia evolutiva individuo''. Esta definición se ajusta muy bien sobre los virus, plásmidos, y ciertos transposones, todos los cuales han sido considerados para pertenecer a una familia de organismos primitivos. La característica común entre estas unidades es su replicación, el mantenimiento, y la difusión.

Así, los plásmidos son moléculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una unidad de replicación independiente del cromosoma, razón por la que pueden presentarse en más de una copia dentro de la célula bacteriana. Los plásmidos representan uno de los principales agentes que contribuyen en la diseminación de la resistencia antimicrobiana.

Contribuyen en la expansión de importantes determinantes de resistencia, promueven la transferencia de genes horizontal entre especies no relacionadas, Curiosamente, los plásmidos fueron identificados en cepas de bacterias no relacionadas que se aislaron de áreas geográficamente muy separadas sin ningún problema epidemiológico involucrado.

Los plásmidos provienen de familias de bacterias que prevalecen importantemente en forma natural, normalmente poseen múltiples determinantes genéticos que les confieren a las bacterias la resistencia a múltiples clases de antibióticos. Pero además contienen factores de virulencia y sistemas adicionales que promueven su estabilidad y mantenimiento en la bacteria hospedera en diferentes condiciones ambientales (Carattoli 2013).

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La características transmitidas por los plásmidos que ha sido más estudiada, es el de la resistencia a los drogas (Figura 11). Muchas bacterias pueden volverse resistentes a drogas por la adquisición de un plásmido. Aunque no todas las resistencias a antibióticos son transferidas por plásmidos como lo es la resistencia a algunos fármacos tales como el ácido nalidíxico y la rifampicina (en ambos casos, la resistencia se produjo por la mutación del gen que codifica para la proteína blanco en ambos casos). Los genes involucrados en la resistencia a antibióticos son muchos y variados, que van desde enzimas llamadas beta lactamasas codificadas en plásmidos que destruyen las penicilinas, hasta proteínas de membrana que reducen la acumulación intracelular de tetraciclina. La capacidad de los plásmidos para ser transferido de una bacteria a otra, a veces incluso entre especies muy diferentes, ha contribuido en gran medida a la amplia difusión de genes de resistencia a antibióticos. Las bacterias pueden volverse resistentes a un número variado de antibióticos, ya sea por la adquisición de varios plásmidos independientes o mediante la adquisición de un único plásmido con muchos determinantes de resistencia en él. Se cree que los transposones han desempeñado un papel importante en el desarrollo de plásmidos con resistencia a drogas, mediante la circulación, entre diferentes plásmidos, de los genes responsables de la resistencia a drogas o directamente a partir del cromosoma de un organismo resistente, copiado y transmitido, naturalmente, en un plásmido.

Se debe apreciar que también se producen otros mecanismos de resistencia a drogas y que tal resistencia no siempre es debido a plásmidos: de hecho muchas de las bacterias que actualmente están causando problemas en hospitales debido a infecciones cruzadas son o bien intrínsecamente resistentes o deben su resistencia a drogas por genes cromosómicos propios.

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Figura 11. La resistencia a una droga es el resultado de una recombinación exitosa.

2.2.2. Bacteriófagos Los bacteriófagos (fagos o para abreviar) son simplemente los virus que infectan bacterias. Ellos jugaron un papel central en el desarrollo de la biología molecular, especialmente en nuestra comprensión de la estructura del gen, la expresión y son también importantes en el laboratorio y en la naturaleza como proveedores de medios por los cuales los genes se pueden transferir de una bacteria a otra. Con el desarrollo de la clonación de genes, los fagos se llevaron en un papel adicional como vectores para la clonación de ADN. En muchas de sus propiedades básicas, los fagos son similares a otros virus. Ellos contienen ARN o ADN encerrado en una capa de proteína. El fago infecta mediante la unión a un receptor específico en la superficie de la bacteria y el ácido nucleico entra en la célula. Algunos de los genes del fago (los genes tempranos) se expresan casi de inmediato, utilizando enzimas del huésped pre existentes, en general, éstos codifican para las proteínas necesarias para la replicación del ácido nucleico del fago. A continuación, se realizan varias copias del ácido nucleico del fago, y la expresión de los genes tardíos comienza: estos genes son los que se necesitan para la producción de la partícula del fago. La naturaleza de la transición desde la primera expresión del gen a la expresión tardía del mismo varía entre diferentes fagos. Las partículas de fago se ensamblan y la

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célula sufre lisis, liberando una serie de partículas de fago, cada uno de los cuales pueden luego pasar a infectar otra célula bacteriana (véase la Figura 12).

Inyección del ADN del Fago

Infección

Replicación del ADN Sintésis de partículas del fago

Lisis

Empaquetamiento del ADN en las cabezas del fago

Figura 12. Crecimiento lítico de bacteriófagos (Dale y Park, 2004).

Si un bacteriófago infecta un cultivo líquido de bacterias, puede dar como resultado un aclaramiento completo del medio. Por otro lado, si las bacterias están esparcidas en la superficie de una placa de agar, las partículas de fago liberadas de una célula infectada individual sólo será capaces de infectar a bacterias vecinas que se traducirá en un aclaramiento localizado en las cercanías de la colonia bacteriana, misma que son conocidas o referidas como placas. Esto nos permite determinar la concentración de partículas de bacteriófago en una suspensión (esto recibe el título de fago), usando la suposición de que el número de placas se corresponde con el número de partículas de bacteriófagos presentes en la muestra. Dado que la suposición no siempre es válida, los resultados se expresan generalmente en términos de Unidades Formadoras de Placa, o UFP. En la práctica, dichos ensayos son realizados generalmente con el cultivo bacteriano (las células indicadoras) y el fago suspendido en agar blando que se vierte como una sobrecapa en la parte superior de una placa de agar, en lugar de esparcirla en la superficie. Esto le da a una placa de tres dimensiones, que es más fácil de ver.

Algunos bacteriófagos, tales como  (lambda), no siempre entran en el ciclo lítico descrito anteriormente. Estos fagos son llamados temperamentales y pueden establecer una

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relación más o menos estable con la célula huésped, conocido como lisogenia. En este estado, casi todos los genes del fago están completamente reprimidos, como es la replicación del ácido nucleico, por lo que no se producen partículas de fago hasta que se rompe el estado lisogénico una vez más. Los bacteriófagos temperamentales por lo general producen placas en una capa de agar utilizando un indicador bacteriano adecuado ya que muchas de las células infectadas se lisan en lugar de convertirse lisogénicas. Sin embargo, como las células que entran en el estado lisogénico seguirán creciendo (y son más resistentes a una posterior infección), las placas serán turbias en lugar de las placas claras se observan con un fago virulento (por ejemplo, un fago que no puede establecer lisogenia).

Muchos fagos se han caracterizado en mayor o menor medida, los principales ejemplos son todos los virus que infectan a E. coli. Estos vienen en una variedad de formas y tamaños como se muestra en la Figura 13, incluyendo estructuras simples y pequeñas como X174 y MS2 a estructuras más complejas con cabezas y colas identificables (lambda, T4) y estructuras filamentosos tales como M13.

Figura 13. Morfología de algunos bacteriófagos seleccionados. Hay que hacer notar que la estructura filamentosa del fago M13 es muy larga y no puede ser tomada su representación en este esquema como representativa de su verdadero tamaño (Dale y Park, 2004).

La partícula de fago se compone de una molécula de ácido nucleico contenido dentro de una capa de proteína. En los fagos más simples, tales como MS2, la capa contiene un número de copias de una sola proteína importante que esencialmente polimeriza espontáneamente. La forma en que se asocian define tanto la forma como el tamaño de la partícula del fago. En principio, estructuras filamentosas también se pueden producir por polimerización espontánea de subunidades proteicas, pero esto no es suficiente para Universidad Abierta y a Distancia de México

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definir la longitud del filamento. Una forma común de asegurar que se producen filamentos de una longitud definida es utilizar una plantilla o molde, alrededor de la cual la proteína se polimeriza. Con fagos filamentosos tales como M13 el ADN del fago proporciona la plantilla o molde.

El montaje de M13, donde las proteínas de la cubierta del fago se polimerizan alrededor del ADN, hace un marcado contraste con fagos más grandes, tales como  (lambda) y T4, en donde el DNA se empaqueta en cabezas de fagos vacíos pre formados y por lo tanto el tamaño de la cabeza del fago se define por las proteínas de las que está compuesto. El tamaño y la complejidad de estas estructuras requiere un enfoque diferente para su producción, la polimerización espontánea sería demasiado ineficiente y las estructuras son generalmente inestables hasta que están completas. El ensamblaje de estos fagos se dirige por lo tanto por la presencia temporal de un número de proteínas adicionales, que se eliminan antes de la maduración final del fago (véase la Figura 14). Estos componentes que ayudan con el montaje, pero no están presentes en la partícula final se denominan proteínas de andamiaje.

Montaje del andamio

Eliminación del andamio

Subunidad de la cápside Ensamble

Estructura madura

Figura 14. Montaje del andamiaje. Ensamble de fagos complejos con la asistencia de proteínas andamios. Estas se eliminan una vez ensamblado la estructura (Dale y Park 2004).

Los bacteriófagos también difieren en la naturaleza de su contenido de ácido nucleico. Los fagos M13 y X174 contienen ADN circular de cadena sencilla, MS2 tiene un genoma de ARN, mientras  y las partículas del fago T4 contienen ADN de doble hebra.

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2.2.3. Cepas bacterianas Acorde a lo revisado, los procariontes modifican su expresión genética acorde a las condiciones ambientales, ya sea promoviendo o inhibiendo la síntesis de proteínas. Estos mecanismos determinan la variación fenotípica, lo cual se manifiesta con cambios en el fenotipo celular o de la población procarionte. A su vez, también tienen mecanismos de variación genotípica, que serán igualmente traducidos en cambios fenotípicos, pero que se basan en una modificación de la información genética contenida en la célula (Betancor et. al. 2006).

La diversidad genética en última instancia, puede explicar la variabilidad fenotípica en la mayoría de las bacterias, como la distribución geográfica, la especificidad de huésped, de patogenicidad o resistencia a los antibióticos, y la virulencia. Esto, nos lleva a la generación de variantes, la selección de variantes con propiedades deseables y el surtido de características entre las cepas por intercambio genético. Por ende, a la aplicación de programas de mejora de cepas de microorganismos comercialmente útiles, sobre todo para aumentar la formación de un producto deseado (Li, et.al. 2009).

Se definirá, antes de proseguir, que es una cepa bacteriana. De acuerdo con la primera edición del Manual de Bergey’s de Bacteriología sistemática, “una cepa se compone de los descendientes de un solo aislamiento en cultivo puro y por lo general se compone de una sucesión de cultivos que en última instancia son derivados de una sola colonia inicial” (Dijkshoorn et al. 2000).

Así, dada esta definición, podemos mencionar que hay cuatro tipos de bacterias, de las cuales se obtienen cepas bacterianas de interés práctico para la actividad humana. Estos tipos de bacterias son: Staphylococcus aureus El Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva de forma esférica que crece entre los 10° y45°C, con un pH de entre 4 y 9. Sin embargo, su temperatura óptima de desarrollo está comprendida entre los 30° y 37°C, y el rango óptimo de pH oscila entre 7 y 7,5.A pesar de no ser esporógenas, las bacterias estafilococos muestran una notable resistencia a las condiciones ambientales desfavorables. Generalmente, se encuentra en el agua, en la piel y en las mucosas. Cuando se introduce en nuestro organismo, puede generar infecciones de distinta naturaleza.

Las infecciones provocadas por el Staphylococcus aureus, contraídas en ambientes hospitalarios, suelen estar causadas por estípites resistentes a las quimioterapias y, a menudo, se manifiestan en forma epidémica. El brote de estas epidemias puede significar, Universidad Abierta y a Distancia de México

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en determinadas salas, un evento de particular gravedad, que puede ocasionar serios problemas profilácticos y terapéuticos (Suzuki et. al. 2012, Rolo et. al. 2012).

Escherichia coli (E.coli) Pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae, microorganismos Gram negativos ubiquitarios, que se encuentran en el suelo, el agua, la vegetación y forman parte de la flora intestinal de la mayor parte de los animales, incluido, el ser humano. Su cultivo es muy sencillo y presenta una gran tolerancia de variación de pH, con un valor óptimo de 7.5; la temperatura ideal de crecimiento es 37°C. Esta bacteria es resistente al calor: temperatura de encubado 45°C. El Escherichia coli es un huésped habitual del organismo humano y representa la especie predominante de la comunidad bacteriana facultativa que reside en el intestino grueso; por ello, su presencia en un material determinado (por ejemplo, agua) puede considerarse un indicio seguro de contaminación fecal (Jafari et. al. 2012, Pobiega et. al. 2013).

Pseudomonas aeruginosa La Peudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, que crece a temperaturas que oscilan entre los 4° y 42°C. Sin embargo, no puede desarrollarse con un pH inferior a 4,5. Generalmente se le encuentra en el agua, el suelo y, como huésped, en la piel y el intestino. Su desarrollo se vea favorecido por cualquier tratamiento con medicamentos antibacteriales, ya que su desarrollo se ve favorecido por cualquier antibiótico. Al reducir el resto de la población microbiana, permite que la bacteria incremente su número; bajo otras circunstancias, este incremento resultaría imposible (Haynes 1951).

Enterococcus faecalis Dentro de las especies de procariontes clasificadas como Gram positivas, los enterococos representan una especie que suele estar presente de forma natural en la microbiota intestinal de los animales, aunque también pueden estar presentes en las plantas e insectos. Acorde a lo anterior suelen ser empleados como indicadores de contaminación fecal en el agua y en los alimentos. Las condiciones de crecimiento que las favorecen, involucran temperaturas entre los 10o y los 45o, incluso pueden sobrevivir a 60o durante un tiempo de 30 minutos; en medios con soluciones de NaCl al 6,5% y pH de 9,6.

Los enterococos son bacterias dotadas de un bajo poder patógeno pero poseen genes que codifican la resistencia a algunos antibióticos y, por consiguiente, logran sobrevivir en

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ambientes en los que éstos son muy utilizados. De hecho, en los últimos 15 años, han sido frecuentemente causa de infecciones hospitalarias (Jett et. al. 1994).

Las cepas bacterianas relacionadas con las bacterias relacionadas anteriormente se presentan en la siguiente tabla:

Tabla I.Cepas bacterianas Número Nombre de cepa Característica Identificación Bacilo gramnegativo Enteropatógeno Grupo E. coli Escherichia coli O157:H7 Sin número Enterohemorrágico, ECEH. Cepa No Toxigénica Bacilo gramnegativo, familia Escherichia coli ATCC 25922 Enterobacteriaceae Bacilo gramnegativo Escherichia coli ATCC 35218 Familia Enterobacteriaceae Enterococcus faecalis ATCC 29212 Cocácea grampositiva Cocácea grampositiva, resistente a Enterococcus faecalis ATCC 51299 vancomicina fenotipo Van B. Pseudomonas Bacilo gramnegativo, no ATCC 27853 aeruginosa fermentador (BNF) Staphylococcus aureus ATCC 25923 Cocácea grampositiva, en racimo Cocácea grampostiva, negativa Staphylococcus aureus ATCC BA 976 resistencia inducible a clindamicina. gen msrA Cocácea grampostiva, positiva Staphylococcus aureus ATCC BA 977 resistencia inducible a clindamicina. gen ermA * Las siglas ATCC significan American Type Culture Collection.

Como las cepas bacterianas suponen cada vez mayores retos para la salud humana, incluyendo aumento de la virulencia y la transmisibilidad, la resistencia a múltiples antibióticos, la expansión de los espectros de acogida, y la posibilidad de manipulación genética para el bioterrorismo. Se han creado nuevas herramientas para la tipificación de cepas bacterianas o la identificación de las bacterias a nivel de cepa, es particularmente importante para el diagnóstico, tratamiento y vigilancia epidemiológica de las infecciones bacterianas. Este es especialmente el caso para las bacterias que exhiben altos niveles

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de resistencia a los antibióticos o la virulencia, y aquellos implicados en las infecciones nosocomiales o pandemias.

Así, durante las dos últimas décadas, los métodos moleculares han reemplazado progresivamente ensayos fenotípicos para describir cepas bacterianas. En teoría, hay dos sistemas de tipificación distintos: fenotipificación y genotipificación. El fenotipo bacteriano es determinado por la morfología de las colonias en diversos medios de cultivo, pruebas bioquímicas, serológicas, patogenicidad y susceptibilidad a los antibióticos. Más recientemente, la genotipificación, que se refiere a la discriminación de las cepas bacterianas en función de su contenido genético, se ha convertido en la tipificación ampliamente utilizada para una cepa bacteriana debido a su alta resolución. El perfil genético de una cepa dada generada por un método de determinación del genotipo específico puede ser tan único como una huella dactilar. Por lo tanto, genotipificación también se conoce como huella de ADN. Métodos de caracterización de cepas bacterianas actuales pueden clasificarse en tres categorías principales: patrón de bandas de ADN, secuenciación de ADN, y los métodos basados en la hibridación de ADN. Los métodos basados en el patrón de bandas ADN discriminan las cepas estudiadas sobre la base de las diferencias en el tamaño de las bandas de ADN (fragmentos) generados por la amplificación de ADN genómico o mediante la escisión de ADN utilizando enzimas de restricción (ER).

Los métodos basados en la secuenciación de ADN generan una secuencia original de nucleótidos y discrimina entre las cepas bacterianas directamente de polimorfismos en el ADN. Los métodos basados en la hibridación de ADN se refiere principalmente a que el estudios de microarreglos de ADN. En esta técnica, las cepas bacterianas se discriminan por el análisis de la hibridación de su ADN para sondas de secuencias conocidas.

Con la excepción de la secuenciación del genoma, la capacidad discriminatoria de métodos de genotipificación es dependiente de la especie (Li et. al. 2009)

2.2.4. Selección de bacterias recombinantes por resistencia a drogas Con objeto de identificar el éxito de la recombinación, resulta fundamental revisar el concepto de selección, ya que cuando se trata de examinar una población bacteriana (más de 108 células/mL promedio en un cultivo celular) no es factible realizar un análisis macroscópico, ya que en muchas ocasiones los cambios involucrados suelen ser a nivel de una ruta metabólica y resulta imposible distinguir un cambio físico a simple vista en la población bacteriana. Por tanto, valorar el crecimiento en determinadas condiciones Universidad Abierta y a Distancia de México

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nutrimentales o bien ambientales, resulta ser una excelente estrategia, ya que solo aquellas células que hayan adquirido un nuevo fenotipo (una o más característica observables) como resultado de la transferencia de ADN serán capaces de crecer y dividirse en dichas condiciones. Ejemplos de agentes de selección utilizados para prevenir el crecimiento de las células parenterales (aquellas que carecen de ADN recombinante) son: antibióticos, bacteriófagos y pueden requerir de factores de crecimiento (Birge 2006).

Ahora bien la elección de dichos agentes para la selección bacteriana va a depender del sistema de expresión que se utilice, es decir, en el caso de un plásmido, el uso de un antibiótico determinado dependerá de que dicho vector de expresión tenga el gen que le confiere la resistencia al antibiótico (Figura 11).

A continuación se presentan los pasos generales para determinar el éxito del evento de transferencia del material genético a través de valorar su transmisión a la progenie por su resistencia a una droga que fue adquirida por la célula receptora, siendo el principio para la obtención de una bacteria genéticamente modificada.

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Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar.

Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BGMB _U2_A1_XXYZ, donde BGMB corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación.

Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BGMB _U2_ATR _XXYZ, donde BGMB corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

Cierre de Unidad En la presente Unidad se revisó básicamente las bases moleculares que sustentan la recombinación bacteriana a través de revisar detalladamente los mecanismos de transferencia del material genético.

Los mecanismos de transferencia revisados fueron la transformación, la conjugación y la transducción, enfocándonos a definir el evento celular, detallar sus características generales y en algunos casos, como la conjugación, ejemplificar más especificamente algunos mecanismos. Lo anterior obedece a que una vez revisados dichos tópicos se cuenta con el conocimiento básico para poder comprender las bases moleculares que Universidad Abierta y a Distancia de México

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operan para que las bacterias puedan tener una mejor adaptabilidad a diferentes condiciones ambientales, en particular la resistencia a drogas. Si bien, lo anterior permite comprender el significado biológico y evolutivo de este evento, resulta además, ser una estrategia para el desempeño de la biotecnología con objeto de generar organismos genéticamente modificados y que a través de esta adquisición de nuevo material genético pueda ser una herramienta para su aislamiento.

Por su parte y para complementar lo previamente señalado, se revisaron las herramientas necesarias para promover la generación de bacterias genéticamente modificadas, particularmente, los vectores de expresión, los criterios de selección bacteriana y la resistencia a drogas como estrategia para su aislamiento adecuado.

Para saber más

Si te interesa conocer más de la relación que guardamos con los procariontes te recomiendo revisar la lectura del microbioma humano: Cárdenas Guzmán G (2012). El microbioma humano. ¿Cómo ves? 167:10-14 Recuperado de http://www.comoves.unam.mx/assets/revista/167/el-microbioma-humano.pdf ¿Sabías que existe una normatividad para el manejo de los organismos genéticamente modificados? puedes enterarte al respecto: Ley de bioseguridad de organismos genéticamente modificados. Recuperado de http://www.diputados.gob.mx/LeyesBiblio/pdf/LBOGM.pdf Debemos o no producir organismos genéticamente modificados, conoce la opinión de la Academia Mexicana de Ciencias:

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Comité de Biotecnología de la Academia Mexicana de Ciencias (2007). Por un uso responsable de los organismos genéticamente modificados. Recuperado de http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/por_un_uso_responsable_ogms.pdf

Fuentes de consulta

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