SECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CONKAL
MANUAL DE PRÁCTICAS DE HONGOS Y NEMATODOS FITOPATÓGENOS
DR.JAIRO CRISTÓBAL ALEJO
Conkal, Yucatán, México 2010
CONTENIDO Pag PRÁCTICA 1. SÍNTOMAS Y AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATOGENOS
1
PRÁCTICA 2: IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
6
PRÁCTICA 3: EFECTIVIDAD IN VITRO DE FUNGICIDAS
10
PRÁCTICA 4. SINTOMATOLOGÍA DE NEMATODOS
14
PRÁCTICA 5. MUESTREO Y EXTRACCIÒN DE NEMATODOS
17
PRÁCTICA 6. MORFOLOGÍA DE NEMATODOS
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE HONGOS Y NEMATODOS FITOPATÓGENOS
PRÁCTICA 1. SÍNTOMAS Y AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATOGENOS
INTRODUCCIÓN
El primer paso en el diagnóstico de parásitos en plantas, es un análisis del cultivo para estimar la distribución de las plantas afectadas, posteriormente la observación cuidadosa de las plantas individuales en donde hay que considerar; raíces, hojas maduras u hojas jóvenes, tallos en parte externa e interna, flores, entre otros. Sin embargo, la apreciación visual de los síntomas es limitada e imprecisa sobre todo si se carece de experiencia. Por lo tanto, la simple observación del síndrome de una patología vegetal tiene poco fundamento para el diagnóstico, por lo que debe de acompañarse de un análisis más cuidadoso en el que se implique el aislamiento e identificación de los patógenos involucrados. Para el caso de hongos presentes en un cultivo agrícola, es importante que el material colectado se guarde en bolsas de polietileno transparente y conservarlos en ambiente fresco, para después trasladarlos al laboratorio para su análisis.
En general, los medios de cultivos son mezclas de substancias que se utilizan para el aislamiento, desarrollo y reproducción de hongos, bacterias o microorganismos, exceptuando a los considerados como parásitos obligados. por ejemplo, los hongos que producen “mildius” (Peronosporales), “cenicillas” (Erysiphales) y “royas” (Uredinales). Los medios de cultivo, tienen cuatro componentes esenciales, fuente de carbono, nitrógeno, minerales y vitaminas, existe una gran variedad de fuentes de carbono en los medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacaridos, glicoles, glucósidos, ácidos e hidroxiácidos ya sean solos o en combinación. Por otra parte, la autoclave es un recipiente cilíndrico de metal, con dobles paredes, salvo por delante y construido para resistir una presión de vapor no inferior a cuatro atmósferas, lo que corresponde a un temperatura de 121 °C efectiva para esterilizar el material utilizado en 15 minutos y suficiente para 1 DR. JAIRO CRISTÓBAL ALEJO
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destruir tanto células vegetales como esporas en una sola operación. Debe tomarse ciertas precauciones para que la esterilización no fracase. La máxima fuente de contratiempos es la evaluación incompleta del aire del recinto, no basta observar el manómetro, sino que ha de tenerse además en cuenta la temperatura adecuada.
Con fines microbiológicos, los microorganismos se exterminan in situ: por calor o gases, como el formaldehído, óxido de etileno o β-propiolactona; soluciones de varios agentes químicos, rayos ultravioleta. Pueden ser eliminadas mecánicamente por centrifugación rápida o filtración. Los procedimientos usuales para esterilizar materiales de laboratorio se valen del calor.
OBJETIVO
1. Caracterizar y conocer algunos síntomas inducidos por hongos fitopatógenos 2. Conocer el proceso de preparación y selección de diferentes medios de cultivo para el aislamiento de hongos.
MATERIALES •
Matraces aforados
•
Autoclave / olla de presión
•
Campana de flujo laminar
•
Balanza digital
•
Cajas petri estériles de 10 cm de diámetro
•
Cinta parafilm
•
Agujas de disección
•
Pinzas
•
Filtros milipore 0.45 micras
•
Papel sanitas
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REACTIVOS •
Reactivo Papa _Dextrosa-Agar (PDA)
•
Hojas y raíces infectadas con hongos
•
Hipoclorito de cloro 2%
•
Jugo de verduras V8
•
Agar
•
Agua destilada estéril
•
CaO3
PROCEDIMIENTO
Preparación de medio de cultivo PDA
Pesar 39 g de reactivo Papa dextrosa Agar (PDA) y aforar a un litro con agua destilada.
Cuadro 1. Preparación para el medio de cultivo V8 Ingrediente
Cantidad
Jugo de tomate centrifugado (se obtiene de 90 mL
90 mL
de jugo de tomate) CaCO3
0.6 g
Agar
14 g
Agua destilada
950 mL
Este procedimiento de cultivo es apropiado para aislamientos de Oomycetes, y lograr un adecuado crecimiento micelial.
Disolver el CaCO3 en 90 mL de tomate, dejarlo reposar durante 10 minutos. Para clarificar, centrifugar durante 20 minutos a 3,000 rpm, decantar y juntar el liquido
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sobrante hasta completar la cantidad requerida (60 mL). Esterilizar el líquido con el filtro Milipore de 0.45 micras. Disolver el agar en agua destilada, esterilizando a 121 ºC durante 15 minutos; concluido este tiempo añadir la solución centrifuga a la solución de agar y aforar a un líquido con agua destilada estéril.
Colecta de material vegetal 1. Se toma una planta de un cultivo con fungosis 2. Tomar tejidos de cada planta y depositarlas en bolsas de polietileno 3. Llevarlas al laboratorio para su aislamiento
Aislamiento 1. Hacer de cuatro a cinco cortes de 0.5 cm del área dañada, de área aparentemente sana, y desinfestar con hipoclorito de cloro al 2% durante 1 minuto y enjuagarlo con agua destilada estéril. 2. Colocar los cortes de cada daño en una caja petri con medio de cultivo para su crecimiento, en campana de flujo laminar. También colocar cotes en sanitas húmedas estériles, para hacer cámaras húmedas de crecimiento y observar crecimiento y esporulación del hongo. 3. Sellar con cinta parafilm. Colocar las cajas en estufa de crecimiento y observar cada 24 hrs por 3 días el crecimiento micelial.
CUESTIONARIO 1. ¿Qué es un medio de cultivo y cuales son sus componentes? 2. ¿Para que sirve un medio de cultivo? 3. ¿Menciona cinco medios de cultivos? 4. ¿Cómo podemos clasificar los medios de cultivo de acuerdo a su consistencia?
BIBLIOGRAFÍA
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Agrios, G. N. 1999. Fitopatología. Editorial. Limusa, México, D.F. 743 p. Bauer, M. L. 1991. Fitopatología. Colegio de postgraduados. Editorial. Limusa. México, D.F. 49 p. Rodríguez, M. L. 1994. Manual de identificación de bacterias Fitopatogenas. Departamento de Parasicología agrícola. Universidad Autónoma de Chapingo. Tuite, J. 1998. Plant Pathological Methods. Departament of Botany and Plant pathology. Burgess Publishing Company Purdue Universyty Lafayett, Indiana, Mineapolis Minn. U.S.A. 239 p.
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PRÁCTICA 2: IDENTIFICACIÓN DE HONGOS INTRODUCCIÓN
Los hongos son organismos productores de esporas, generalmente microscópicos, eucarióticos ramificados y a menudo filamentosos que carecen de clorofila y que tienen paredes celulares con quitina. Aproximadamente 8000 especies, producen enfermedades en las plantas, algunos crecen y se reproducen sólo cuando establecen una cierta asociación con las plantas que le sirven de hospedante, durante todo su ciclo de vida; estos se conocen como parásitos obligado o biotróficos. Otros requieren de un planta hospedante durante una cierta etapa de su ciclo de vida, el cual lo pueden concluir desarrollándose en materia orgánica muerta o bien creciendo y reproduciéndose tanto en materia orgánica muerta como en plantas vivas, son llamados parásitos facultativos y saprofitos facultativos (Agrios, 1999).
La mayoría de los hongos están constituidos de filamentos ramificados o tubos llamados hifas. Las hifas contienen citoplasma donde están los núcleos. En algunos hongos, las hifas están divididas en células por medio de paredes transversales llamados septos. En otros sin embargo, no hay septos. Aun en los hongos con septos, el citoplasma es continuo. Las hifas de un hongo crecen y se ramifican para formar redes complejas. Una red de hifas de hongos es un micelio o cuerpo del hongo. El micelio se extiende por la superficie o hacia adentro de la fuente de alimentación en que está creciendo el hongo (Alexander et al., 1985; Agrios, 1999).
La reproducción se efectúa en dos procedimientos: asexual y sexual. La gran mayoría de los hongos, muestran estos dos tipos de reproducción.
Las esporas asexuales denominadas conidios que se desprenden de las células terminales o laterales de hifas especializadas denominadas conidióforos (Agrios, 1999). Por lo contrario, en muchos hongos de la división Deuteromycotina 6 DR. JAIRO CRISTÓBAL ALEJO
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las hifas conidiogénicas se agrupan en cuerpos fructíferos asexuales más o menos complejos. Estos son: sinema, esporodoquio, picnidios y acérvulos (Herrera, 1998).
La reproducción sexual se dá con la unión de gametangios sexuales en la que comprende dos procesos: la fecundación y la meiosis. Los Ascomycotina forman las ascas y ascosporas y en Basidiomycotina los basidios y basidiosporas. Los principales ascocarpos son: cleistotecio, apotecio, peritecio y pseudotecio para los primeros y basidiocarpos; sin que se tenga una clasificación en los segundos (Herrera, 1998).
La identificación de los hongos se basa en el tipo de esporas que formen durante su desarrollo y reproducción.
OBJETIVOS -
Identificar los hongos que presentan las muestras a analizar
-
Clasificar los hongos encontrados en las muestras
-
Describir lo que se observó en la muestra
MATERIALES -
Microscopio compuesto
-
Microscopio estereoscopio
-
Mechero o lámpara de alcohol
-
Muestras con lesiones
-
Cinta adhesiva
-
Portaobjetos y cubreobjetos
-
Preparaciones con estructuras de hongos
-
Material vegetal con cuerpos fructíferos de resistencia
-
Filos
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REACTIVOS •
Alcohol
•
Azul de metilo
PROCEDIMIENTO 1. Se observan las muestras en el microscopio estereoscopio para visualizar las lesiones y posibles estructuras formadas. 2. Posteriormente se observa la presencia de hongos causante de las lesiones, en la muestra se realizan cintazos, que consiste en tomar un segmento de cinta adhesiva por los extremos, la cual se presiona sobre el material enfermo para que las estructuras presentes se adhirieran a la cinta, y después se coloca sobre un portaobjeto que contiene una gota de azul de metileno para la tinción de las estructuras del material con los cuerpos fructíferos realizar cortes al estereoscopio para observar el tipo de estructuras y ubicar el orden taxonómico. 3. Para la identificación, se procede a observar la forma de la espora y se localiza en las claves dicotómicas las cuales darán la clasificación de dicho hongo causante de las lesiones.
CUESTIONARIO 1.- ¿Qué es un conidio? 2.- ¿Qué es un conidióforo? 3.- Menciona las estructuras que se forman en la reproducción sexual 4.- Menciona las estructuras que se forman en la reproducción asexual 5.- Investigar sobre el hábitat general de los hongos
BIBLIOGRAFIA Agrios, G. N. 1999. Fitopatología. Editorial. Limusa, México, D.F. 743 p. Alexander P; Jean M.B; Chaves J. Courts G; Dálessio N.S. 1985. Biología. Editorial Printice-Hall. New Jersey. 230 p. 8 DR. JAIRO CRISTÓBAL ALEJO
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Barnett, H. L. and Hunter, B. B, 1999. Illustrate Genera of Imperfect Fungi, Fourth Edition. Burgess Publishing company. Minessota, U.S.A. 218 p. Hanlin, R. T., 1990. Illustrate Genera of Ascomycetes.The American Phytopathological Society St. Paul. Minnesota. 263 p. Herrera T., Ulloa M.1998. El reino de los hongos. Micología básica y aplicada. Editorial Fondo de Cultura Económica. México. pp 51-66.
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PRÁCTICA 3: EFECTIVIDAD IN VITRO DE FUNGICIDAS
INTRODUCCIÓN
La presencia de enfermedades en los cultivos agrícolas inducidos por hongos, representan en muchas áreas agrícolas factores limitativos. Por lo que como estrategia para la reducción de pérdidas económicas debidas a estas enfermedades, se utilizan varias tácticas de control de estos patógenos (Nieto et al., 2001; Zaletas, 2003; Browers y Locke, 2000).
Por otra parte, el control químico es la táctica más recurrente para manejar las enfermedades fungosas a un plazo inmediato, esto se debe a que dicha táctica se adapta a cualquier situación ambiental. Sin embargo, su uso no planificado puede originar resistencia en hongos y contaminación al ambiente. Una forma de disminuir tales efectos es con el uso y dosis adecuadas de productos según el patógeno de interés.
Las razones por las se realiza pruebas de sensibilidad in vitro de fungicidas, tradicionalmente empleados para el manejo de hongos fitopatógenos, es una práctica común que debiera estar incluida en los sistemas de producción agrícola.
Fungicidas de contacto Fueron los primeros en ser utilizados, son normalmente preventivos, por lo cual deben aplicarse antes de aparecer la enfermedad, también se denominan fungistáticos, ya que inhiben principalmente la germinación de las esporas del hongo y el progreso subsiguiente de la enfermedad. Algunos ostentan propiedades curativas, consiguiendo eliminar la enfermedad o detenerla si se aplica debidamente; iniciando el tratamiento, debe continuarse a ritmo regular, para que el cultivo se encuentre siempre protegido (Zaletas, 2003).
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Fungicidas sistémicos Las plantas absorben este tipo de fungicidas a través de su follaje o raíces y los translocan en sentido ascendente y por vía interna a través de su xilema. En general, son traslocados en sentido ascendente en la corriente de transpiración y puede acumularse en el borde de las hojas, mientras que su translocación en sentido descendente y a través del floema es poco frecuente o no se lleva acabo. Casi todos los fungicidas sistémicos muestran su acción al inhibir algunas o varias etapas específicas del metabolismo de los hongos a los cuales controlan. Como resultado, al cabo de algunos años después de haber introducido alguno de esos compuestos, aparecen nuevas cepas de esos hongos, que son resistentes a algún fungicida sistémico (Agrios, 1999).
OBJETIVOS 1. Efectuar pruebas de sensibilidad in vitro de hongos fitopatógenos con un fungicida sistémico y uno de contacto. 2. Estimar la sensibilidad in vitro de un fungicida sistémico y uno de contacto contra hongos fitopatógenos
MATERIALES •
Cepas de hongos fitopatógenos
• •
Fungicida sistémico y de contacto Matraz Erlermmeyer
•
Papa Dextrosa Agar (PDA)
•
Agua destilada estéril
•
Ácido láctico o amikacina
•
Cajas petri
•
Papel aluminio
•
Algodón o gasas
•
Sacabocados
•
Alcohol 11
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•
Balanza digital
•
Olla de presión
•
Parafilm
•
Pinzas
PROCEDIEMIENTO 1.- Realizar los cálculos de las dosis de los ingredientes activos de los fungicidas. 2.-Se pesa la cantidad a utilizar de PDA con la balanza digital 3.-Con el PDA ya pesado se le agrega agua destilada estéril, en matraces de 100 ml, se tapa con algodón envueltos en gasa. 4.-En la olla de presión se procede a esterilizar el material (pinzas, sacabocados, PDA previamente preparado) 120 libras de presión durante 20 minutos. 5.-Una vez que el medio se esterilizó y antes de que este se solidifique, en una campana de flujo laminar, se agregan las dosis de fungicidas al medio PDA se agitan con el propósito de homogeneizar los productos en el medio. 6.-Se dosificaron en cajas Petri estériles, vaciando en ellas 25 ml de medio con amikacina o ácido láctico y el fungicida incorporado a la dosis comercial, según información del producto, obteniendo 4 cajas Petri con medio por matraz, a 4 cajas Petri no se le agrega fungicidas ya que estas serán para los testigos, sin embargo, sí se le agrega ácido láctico o en su caso amikacina. 7.-Las cajas se mantienen en observación durante 72 horas para asegurarse que no estén contaminadas. 8.-Al cabo de las 72 horas, en los medios de cultivo se coloca
con un
sacabocados discos con micelio de un hongo fitopatógeno en el centro de cada caja, y se sella las estas permanecieron selladas con papel parafilm en condiciones de laboratorio (28+/- 1°C). 9.-Durante el crecimiento del hongo se procede a medir el crecimiento micelial de cada hongo en las cajas con fungicidas para hacer la estimación junto con el
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testigo, la medición del crecimiento micelial será hasta que el testigo sin fungicida llene por completo la caja Petri con crecimiento micelial.
CUESTIONARIO 1. ¿Cómo actúan los fungicidas sistémicos? 2. ¿Cómo actúan los fungicidas contacto? 3. Que implicaciones puede tener aplicar fungicidas en campo sin hacer pruebas de sensibilidad in vitro? 4. ¿Por qué es importante realizar pruebas de sensibilidad in vitro con fungicidas?
BIBLIOGRAFÍA Agrios, G. N. 1999. Fitopatología. Editorial. Limusa, México, D.F. 743 p. Bowers, J.H. and Locke, J.C. 2000. Efefct of Botanical Extracts on the Population Density of Fusarium oxysporum in Soil and Control of Fusarium Will in the Greenhouse. Plant Disease 85 (3): 236-305. Nieto, A. D; Acosta, R. M; Valencia, A. M; Mena, N. G. 2001. Estudio de efectividad biológica con fungicidas. En: Bases para realizar estudios de efectividad biológica de plaguicidas. (eds) Bautista, M. N; Díaz, G. O. Colegio de Postgraduados. Montecillo, Texcoco, Estado de México. p 106. Zaletas, M. E. 2003. Control químico y epidemiología de la mancha foliar del Chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) en Yucatán México. Tesis. De Maestría en Ciencias en Horticultura Tropical. ITA # 2. Conkal Yucatán. pp 15-26.
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PRÁCTICA 4. SINTOMATOLOGÍA DE NEMATODOS INTRODUCCIÓN Los hábitos parasíticos de los nematodos pueden ser agrupadas en ecto y endoparásitos; pudiendo ser sedentarios o migratorios. Los ectoparásitos se alimentan de las raíces de las plantas, introduciendo solo su estilete; los endoparásitos pasan la mayor parte de su ciclo biológico dentro de los tejidos vegetales; algunos se mueven libremente dentro de ellos (migratorios) y pueden invadir las partes aéreas, en tanto que otros se vuelven sedentarios después de entrar al hospedante, por lo cual quedan sujetos al ambiente determinado por la planta. Los síntomas causados por los nematodos en las plantas es variada y fácilmente pueden confundirse con las causadas por otros organismos, así como por condiciones de estrés (como la falta de riego) y deficiencias nutrimentales (Agrios 1999). Los nematodos que infectan a las plantas causan síntomas tanto en las raíces como en los órganos aéreos de las plantas. A continuación se presentan algunos de los síntomas causados por nematodos fitoparásitos.
Rotylenchulus reniformis Las raíces son infectadas solamente por hembras jóvenes. La hembra joven introduce la cabeza en la raíz, causa necrosis en las células dañadas, se alimenta de las células del floema con su estilete. Las células del floema aumentan hasta seis veces su tamaño. Las células agrandadas del floema no son multinucleadas ni son grandes, como las células gigantes asociadas con la respuesta del hospedante a la alimentación de raíz de nematodos agalladores o formadores de quistes. R. reniformes. esta asociado con interacciones fungosas, especialmente con especies de Fusarium, causando marchitez hasta un 81.4% (Cepeda, 1996).
Helicotylenchus spp. Estos nematodos ocasionan lesiones a sus hospedantes, y propician la entrada de microorganismos. Cuando se incrementan sus poblaciones, las plantas
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manifiestan una pérdida de vigor gradual, lo que repercute con una merma en la producción (Cepeda, 1996).
Meloidogyne incognita En plantas susceptibles las poblaciones de M. incognita inducen agallas individuales, pero generalmente éstas coalescen para formar agallas grandes y algunas veces masivas. Asimismo, los nódulos o agallas no son los únicos síntomas del ataque, ya que en un momento dado, puede haber formación de escobillas, reducción en el crecimiento, clorosis entre otros (Cepeda, 1996).
Tylenchorhynchus spp. Son conocidos como nematodos del raquitismo, son parásitos radicales, algunas veces penetran la raíz, convirtiéndose en endoparásitos. Las plantas que son atacadas por estos nematodos presentan disminución en el crecimiento de la porción aérea y del sistema radical.(Cepeda, 1996).
OBJETIVOS •
Observar los síntomas causados por lo nematodos fitoparásitos en material vegetal fijado en formol.
•
Reconocer síntomas en campo.
•
Describir los síntomas inducidos por fitonematodos.
MATERIALES •
Material fijado en formol
•
Cámara fotográfica
•
Plantas en campo con síntomas
PROCEDIMIENTO 1. Con el material vegetal fijado en formol observar y describir los síntomas de nematodos presentados en diferentes plantas de cultivo 15 DR. JAIRO CRISTÓBAL ALEJO
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2. Visitar un área en campo que presente síntomas causados por nematodos y describir la distribución de los síntomas en dicha área observando los diferentes daños 3. En ambos casos tomar fotografías para documentar el reporte de la práctica
CUESTIONARIO 1.- ¿A que se le llama ectoparásito? 2.- ¿A que se le llama endoparásito? 3.- ¿Cuándo se dice que es un nematodo endoparásito migratorio? 4.-Describe algunos de los síntomas que ocasionan los nematodos fitopatógenos 5.- ¿Como diferenciarías el daño de un nematodo del daño de otro organismo o alteración por falta de nutrimentos
BIBLIOGRÁFIA Agrios, G. N. 1999. Fitopatología. Editorial. Limusa, México, D.F. 743 p. Cepeda S.M. 1996.Nematología Agrícola. Editorial trillas. México. 96-98 p.
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PRÁCTICA 5. MUESTREO Y EXTRACCIÒN DE NEMATODOS
INTRODUCCIÓN
El muestreo se refiere a la toma de muestras para su análisis, que permita obtener información real de las poblaciones de nematodos fitopatógenos presentes en el suelo, en asociación con el interior de los tejidos y órganos vegetales, ya sea de tipo cuantitativo o cualitativo. El diagnóstico oportuno de la presencia de nematodos fitopatógenos en un terreno agrícola es importante, ya que permite prevenir o establecer estrategias de control que reduzcan riesgos de daños severos en rendimientos. Por lo cual, el muestreo, la extracción, y la cuantificación de nematodos, fitoparásitos son consideraciones importantes para el manejo de poblaciones.
Para el muestreo de poblaciones de fitopatógenos, existen diferentes tipos: el estratificado, al azar, en forma de estrella y en zig-zag.
Al obtener las muestras, una condición es que éstas deberán ser representativas al área de estudio, y el material colectado (suelo y/o partes vegetales) deben estar en condiciones de humedad y almacenados en bolsas de polietileno transparente, además de conservarlos en ambiente fresco.
Después de colectada las muestras, deberán trasladarse al laboratorio para su extracción a través del método mas apropiado que dependerá del tipo de suelo. Los métodos de extracción de nematodos del suelo y raíces más empleados son: método de gravedad, tamizado y centrifugado, método del embudo de Baerman, pero el que mas se utiliza es el método de tamizado y centrifugado (Agrios, 1999).
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OBJETIVO -
Comparar dos métodos de muestreo de suelo en un cultivo de crecimiento anual y otro perenne.
-
Extraer nematodos de las muestras tomadas en el cultivo.
-
Determinar el mejor método de muestro según el cultivo
MATERIAL •
Etiquetas y lápiz
•
Bolsas de polietileno transparentes
•
Juego de tamices de los números 20, 50, 100, 200 y 400 mall
•
Centrifuga de 3,000 rpm
•
Cámara cuenta nematodos
•
Tubo para centrifuga de 50 ml de capacidad
•
Microscopio compuesto
•
Microscopio estereoscópico
•
Solución sacarosa al 46%
•
Kaolín
•
Frascos gerber
PROCEDIMIENTO DE MUESTREO 1.- En un 1/8 aproximadamente de hectárea con cultivo anual en pie, colectar 4 muestras de 500 g. Siguiendo un patron de muestreo en zig-zag (Figura 1), que cubra todo el campo por muestrear. En el caso del cultivo perenne se utilizará el muestreo en forma de estrella.
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Figura 1. Patrón de muestreo para nematodos en suelo (Nemapix, 2002)
1. Ya adoptado el patrón de muestreo, se procede a que en cada punto, con la ayuda de una pala, se eliminan los primeros 5 cm de la capa superficial del suelo y se toma una muestra de tierra, aproximadamente 50 g a una profundidad de 15-30 cm alrededor de las raíces. En el caso del cultivo perenne, el muestreo debe hacerse en la zona de goteo, en cinco puntos distribuidos en forma de los picos de una estrella y cerca del tronco, así como en otros puntos alternados, se colectarán a 2 o 3 profundidades distintas (5, 10, 15 cm).
2. Serán muestreados 4 árboles, por lo que se tendrán 4 muestras de 500 g. Coloque las muestras en una bolsa de polietileno, cierrela y etiquétela, ésta debe pegarse en la cara externa de la bolsa que contenga la muestra, ya que si esta se coloca adentro, con el suelo se torna ilegible de preferencia se usa doble bolsa y la etiqueta se coloca entre las dos.
3. La etiqueta debe incluir los siguientes datos: nombre del colector, predio o parcela, localización del campo o propiedad, fecha de muestreo y cultivo.
Al tomar las muestras, el suelo debe estar húmedo, de preferencia a su capacidad de campo. Estas muestras deben manejarse con cuidado, ya que contienen los 19 DR. JAIRO CRISTÓBAL ALEJO
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nematodos vivos y es necesario mantenerlos fisiológicamente activos para facilitar su extracción de la muestra.
TAMIZADO a) Para el tamizado, homogenice perfectamente la muestra del suelo b) Vierta de 200 a 250 cm3 de suelo en una cubeta y agregue de 2 L de agua c) Se agita para romper los terrones y se deja reposar 60 segundos d) Después se pasa la suspensión por el tamiz de 50 mallas recogiéndola en otra cubeta, se deja reposar y se lavan los residuos retenidos en el tamiz. e) Pase la suspensión por el tamiz de 100 mallas, se recoge en la cubeta limpia y se deja reposar, los residuos del tamiz se lavan cuidadosamente y se obtienen en un vaso de precipitado. f) Se pasa la suspensión por un tamiz de 200 mallas y se repite la operación anterior. Los residuos del tamiz se colectan en el mismo recipiente de los anteriores. h) Los nematodos obtenidos se vierten en un vaso precipitado.
CENTRIFUGADO
a) Una vez que se obtiene los residuos de los tamices de 100, 200, 325 y 400 mallas en un vaso de precipitado: b) Vierta su contenido en los tubos de la centrifuga cuidando que su peso sea el mismo. c) Agregue un gramo de Kaolín por cada tubo para eliminar las partículas que están pegadas al cuerpo del nematodo y centrifugue durante 5 minutos a 2,500 rpm. d) Tire el sobrante que contiene solo materia orgánica y agrega la solución de sacarosa al 46% cuidando que sea la misma cantidad por tubo para no descalibrar la centrifuga. e) Agite y vuelva a centrifugar durante 3 minutos a 2, 500 rpm.
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f) Vierta el sobrante en el tamiz de 400 mallas, el cual contiene los nematodos que flotan en la solución de azúcar. g) Proceda a lavar inmediatamente con cuidado para evitar que el azúcar distorsione a los nematodos. h) Se recogen los residuos en tamiz de 400 mallas en un vaso de precipitado de 250 mL para su observación e identificación con ayuda de un microscopio estereoscopio y/o compuesto.
CUESTIONARIO
¿Porque es importante hacer un muestreo de nematodos? ¿Cuales son los factores a considerar para realizar un buen muestreo? ¿Cuáles son los factores a considerar para elegir el método de extracción mas adecuado? ¿Con base a qué se determina el número de muestras a colectar en una superficie? En caso de que una muestra no se pueda procesarse inmediatamente, ¿que medidas deben considerarse para su almacenamiento?
BIBLIOGRAFIA
Agrios, G. N. 1999. Fitopatología. Ed. Limusa, México, D.F. p 734.
Ayoub, M. S. 1977. Plant nematology an agricultural training aid. Departamento of food and Agriculture. Division of Plant industry laboratory servicesNematology. Calif., U. S. A. 157 p. Carrillo, F. 1994. Practicas de nematología Agrícola. Departamento de Parasitología. Universidad Autónoma de Chapingo. p 104 Mc sorley, R. 1987 Plot size and design for acquisition of field data in nematology.In: Vistas on Nematology, Society Of Nematologists. Eds. Veech, J. and Dickson, D. Florida, U.S.A. 52-58 p.
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PRÁCTICA 6. MORFOLOGÍA DE NEMATODOS
INTRODUCCIÓN Los nematodos están clasificados en el phylum Nemata (Agrios, 1999). Los nematodos que afectan a las plantas causan daños mecánicos directos producidos al momento de alimentarse. La mayoría de los daños son ocasionados por la secreción de sustancias que el nematodo inyecta en la planta mientras se alimenta (Bauer, 1991).
En general, los nematodos fitopatógenos son organismos pequeños de 2001000 µm, los nematodos tienen forma filiforme y en corte transversal se ven redondos, presentan cuerpos lisos no segmentados sino anillados y carecen de apéndices. Al igual que los animales superiores poseen todos los sistemas fisiológicos principales, excepto el circulatorio y respiratorio. Su cuerpo carece de segmentos internos y está cubierto por una cutícula de múltiples capas no mayor a cuatro. Dentro de la cutícula, está la hipodermis, la cual dicha hipodermis penetra lateral, dorsal y centralmente dentro de la cavidad del cuerpo (Figura 1) (Cepeda, 1996).
El principal centro del sistema nervioso, llamado anillo, rodea al esófago en la región del itsmo, en donde también se encuentra ganglios asociados. Los nervios somáticos están contenidos en la hipodermis y se conecta a los órganos sensoriales de la región de la cabeza, esófago y sistema reproductivo (Agrios, 1999).
En general, el sistema excretor se abre al exterior por un poro situado ventralmente, más o menos a nivel del anillo nervioso; el sistema digestivo es tubular y está dividido en tres regiones: esófago, intestino y recto. El orificio oral anterior es terminal y casi siempre está rodeado por varios tipos de estructura de labios y órganos sensoriales o papilas (Figura 2) (Pérez, 2004). 22 DR. JAIRO CRISTÓBAL ALEJO
MANUAL DE PRÁCTICAS DE HONGOS Y NEMATODOS FITOPATÓGENOS
Figura 2: Nematodo fitopatógeno.
OBJETIVO -
Observar las partes que conforman un nematodo
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Localizar los órganos principales de los nematodos fitopatógenos
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Diferenciar las hembras de los machos
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Clasificar según las características a nivel orden
MATERIAL Y EQUIPO •
Muestras de preparaciones de nematodos
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Microscopio compuesto
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Claves de identificación
PROCEDIMIENTO a) Se toma una preparación de un nematodo y se coloca bajo el microscopio compuesto. b) A continuación se procede a localizar las cuatro partes en que se divide un nematodo. c) Una vez localizado las partes principales, se visualiza los órganos que componen a cada parte.
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d) Se localiza el órgano principal de los nematodos fitopatógenos e) Se observa los órganos de reproducción con la finalidad de diferenciar entre machos y hembras. f) Se clasifica con la ayuda de las claves de identificación
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son las partes principales en las que se divide un nematodo? 2.-De qué órganos están constituidas las partes principales en las que se divide un nematodo: 3.- De qué sistemas carecen los nematodos: 5.- Menciona tres familias de nematodos y algunas características principales 6.- ¿Cuál es el principal género en nematodos fitopatógenos con gran importancia en la agricultura?
BIBLIOGRAFÍA Agrios, G. N. 1999. Fitopatología. Editorial Limusa. Noriega. 273-745 p. Bauer, I.M.L. Fitopatología. 1991. Colegio de posgraduados. Editorial Noriega Limusa. México. 49-83 p. Cepeda, S.M. 1996.Nematología Agrícola. Editorial trillas. México. 93-135 p. Pérez, M.L.L. 2004. Niveles de extractos vegetales in-vitro para el control de meloidogyne incognita. Tesis de Licenciatura en Biología. Instituto Tecnológico de Conkal, Yucatán. 4-6 p.
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