Biología molecular. Técnicas

Biología molecular Laboratorio clínico y Biomédico Iratxe Sierra Calvo

Biología molecular

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Contenido Calibración de micropipetas …………………………………………………................................... 5.        

Introducción ……………………………………………………………................................................... 5.

Partes de la micropipeta ……………………………………………………………………………….............. 5.

Manejo de las micropipetas …………………………………………………………..............……………… 6.

Inventario y codificación de micropipetas ……………………………………………...................... 7.

Manual de buenas prácticas, mantenimiento y calibración de micropipetas ………….... 8.

Protocolo de calibración ……………………………………………………………………..............…........ 9.

Plantilla de calibración de micropipetas ………………………………………………………………….. 10.

Resultados e interpretación …………………………………………………………….......................... 10.

Extracción de ADN de sangre ..................................................................................12.        

Objetivo ........................................................................................................................12.

Fundamento .................................................................................................................12.

Reactivos ......................................................................................................................12.

Material y Aparataje .....................................................................................................12.

Muestra ........................................................................................................................13.

Procedimiento ..............................................................................................................13.

Resultados e interpretación .........................................................................................13.

Preguntas .....................................................................................................................14.

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Reacción en Cadena de la Polimerasa .....................................................................16.        

Objetivo ........................................................................................................................16.

Fundamento .................................................................................................................16.

Reactivos ......................................................................................................................17.

Material y Aparataje .....................................................................................................17.

Muestra ........................................................................................................................17.

Procedimiento ..............................................................................................................17.

Resultados e interpretación .........................................................................................17.

Preguntas .....................................................................................................................18.

Electroforesis en gel agarosa ..................................................................................20.        

Objetivo ........................................................................................................................20.

Fundamento .................................................................................................................20.

Reactivos ......................................................................................................................20.

Material y Aparataje .....................................................................................................21.

Muestra ........................................................................................................................21.

Procedimiento ............................................................................................................. 21.

Resultados e interpretación .........................................................................................23.

Preguntas .....................................................................................................................24.

¿Qué he aprendido? ..................................................................................................................25.

Bibliografía ................................................................................................................................28.

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Cronograma Con este cronograma hemos querido organizar la asignatura. Nos hemos organizado de tal forma en la que todos los trabajos estuvieran acabados para el día 10, así tener libre la semana de exámenes.

Los trabajos individuales a pesar de ser independientes del grupo nos propusimos tenerlos acabados en los dos días siguientes de realizar la práctica en el laboratorio, para que esto no entorpeciera el trabajo grupal.

Para la semana de exámenes solo dejamos pendiente la revisión del Mapa Conceptual.

A continuación, se muestra el cronograma y leyenda correspondiente.

Leyenda

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Calibración de micropipetas Dentro del equipamiento genérico de un laboratorio de biología molecular las micropipetas son dispositivos que requieren una especial atención. Es por ello que se hace necesario un programa de mantenimiento y verificación de las mismas.

Introducción Las exigencias impuestas a las pipetas han aumentado continuamente en los últimos años dada la tendencia a usar volúmenes cada vez más pequeños, en técnicas cada vez más precisas.

La transferencia de líquidos es una aplicación central en los laboratorios de producción e investigación biológica, química y farmacéutica.

La pipeta y sus distintas variantes fueron una herramienta muy útil durante mucho tiempo hasta que a mediados del siglo XX la micropipeta consiguió bajar el rango del volumen que se podía manejar con precisión al orden de uL.

Partes de la micropipeta.

Fig.1. Partes de la micropipeta

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Manejo de las micropipetas Ajustar el volumen girando la barra graduada hasta que en la escala aparezca el volumen deseado. Colocar un tip o punta de plástico en la punta de la pipeta, según sea el caso, haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste.

Oprimir el botón pulsador con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo introducir verticalmente la pipeta hasta que el tip se sumerja de 5 a 10 mm dentro del líquido.

Liberar lentamente la presión sobre el botón. Después de 2–3 segundos retirar, siempre verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la punta contra la pared del recipiente.

Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el líquido, presionar lentamente el botón pulsador hasta el primer tope. Después de un segundo y sin soltar el botón pulsador, terminar de vaciar la pipeta presionando hasta el segundo tope.

Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente.

Fig.2. Manejo de micropipetas

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Inventario y codificación de pipetas

Número de identificación

Codificación

Marca comercial

Volumen (µl)

1

1LV_100/1000

Labopette

100-1000 µl

2

2LV_10/100

Labopette

10-100 µl

3

3LV_100/1000

Labopette

100-1000 µl

4

4LV_100/1000

Labopette

100-1000 µl

5

5Lv_0.5/10

Labopette

0.5-10 µl

6

6RV_0.5/10

Rafer

0.5-10 µl

7

7RV_100/1000

Rafer

100-1000 µl

8

8RV_10/100

Rafer

10-100 µl

9

9RV_10/100

Rafer

10-100 µl

10

10RV_0.5/10

Rafer

0.5-10 µl

11

11DMV_10/100

Dragon MED

10-100 µl

12

12DF_100

Digypette Nahita

100 µl

13

13DF_100

Digypette Nahita

100 µl

14

14DF_100

Digypette Nahita

100 µl

Digypette Nahita

500 µl

Digypette Nahita

100 µl

Digypette Nahita

100 µl

15 16 17

15DF_500 16DF_100 17DF_100

18

18DF_100

Digypette Nahita

100 µl

19

19DF_100

Digypette Nahita

100 µl

Rafer

0.5-10 µl

20

20RV_0.5/10

21

21RV_100/1000

Rafer

100-1000 µl

22

22DV_2/20

Digypette Nahita

2-20 µl

Tabla. 1. Inventario y codificación de micropipetas

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Manual de buenas prácticas, mantenimiento y calibración de micropipetas Controles gravimétricos periódicos y un ajuste de las micropipetas, son requisitos fundamentales de los modernos sistemas de garantía de calidad. El mantenimiento de las micropipetas implica diferentes acciones: 

Control de fugas

Poner la micropipeta al volumen máximo, cargar con agua destilada y observar durante 20 segundos la mantención del volumen cargado. No deben formarse gotas en el extremo inferior del tip. 

Control de mantenimiento

Para asegurar que la micropipeta funciona correctamente, es decir, aspira y mantiene el volumen deseado: 1. Ajustar el volumen nominal 2. Colocar una punta nueva en la micropipeta 3. Sumergir la punta en agua Fig.3. Control de mantenimiento

4. Subir y bajar el émbolo lentamente 10 veces 5. Sacar la punta con el líquido, y mantenerla en posición vertical por 10 segundos. No se debe formar una gota. 

Limpieza y mantenimiento

Fig.4. Limpieza y mantenimiento

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Protocolo de calibración El apartado 8655 de ISO (International Standardization Organization) de 1990, y la DIN 12650, son las reglamentaciones más utilizadas para establecer las condiciones de una micropipeta.

Estas reglamentaciones de ISO y DIN definen diferentes niveles de controles para micropipetas, (testeo funcional, testeo rápido, testeo de calibración, etc.); sin embargo, ambas coinciden en recomendar una calibración completa cada 6 meses.

Por calibración de micropipeta se entiende la comparación del volumen real y el volumen teórico. El volumen real se determina por vía gravimétrica.

Con este control se pretende determinar la variación del volumen indicado y el volumen que realmente toma la micropipeta. Consiste en realizar varias mediciones, consignar los valores en una tabla y calcular el error.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Determinar la temperatura del agua. poner un recipiente en la balanza y tarar.

Ajustar el volumen nominal.

Colocar una punta nueva en la micropipeta.

Aspirar el líquido de control.

Expulsar el agua poniendo la punta en un ángulo de 30º con el recipiente.

Anotar el valor que registra la balanza, y tarar.

Repetir los pasos 10 veces.

Expulsar la punta.

Realizar el mismo procedimiento para el 50% y 20% del volumen nominal.

Fig.5. Protocolo de calibración

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Plantilla de calibración de Micropipetas

Tabla.2. Plantilla de calibración de micropipetas

En la tabla superior se pueden observar las distintas fórmulas utilizadas para calcular los distintos valores necesarios para ver si las micropipetas son válidas o no, media, inexactitud e imprecisión.

Resultado e interpretación

Tabla.3. Interpretación de los resultados obtenidos

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Tras analizar los datos obtenidos de la calibración de micropipetas, observamos que la mayoría de las micropipetas no son válidas para su uso, ya que son inexactas e imprecisas, y así viene indicado en la tabla superior.

Los valores de inexactitud e imprecisión admitidos son 0.6% y 0.20% respectivamente. Todas las micropipetas nos han dado por encima de esos valores. La diferencia se observa en las micropipetas de volumen fijo, estas son exactas pero imprecisas. Aunque la 14. 17 y 19 tampoco son válidas.

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Extracción de ADN de sangre Objetivo Extracción de ADN a partir de una muestra sanguínea. En nuestro caso nosotros realizaremos la prueba control con H2O destilada para comprobar que el proceso no está contaminado.

Fundamento Existen diferentes métodos muy diferentes para obtener ADN. A pesar de esto, todos los protocolos de extracción de ADN incorporan los mismos pasos básicos: 1. Lisis celular y posterior lisis nuclear.

2. Separación del ADN del contenido celular: protección frente a nucleasas.

3. Purificación del ADN.

Reactivos Tampón de lisis NaCl 0,9% SDS 20% Proteinasa K 20 mg/ml NaCl saturado (6M) Etanol absoluto Etanol 70 %

Fig.1. Madeja de ADN

Material y aparataje Centrífuga 1 tubo de fondo cónico 15 ml 12

Biología molecular Laboratorio clínico y Biomédico Iratxe Sierra Calvo 1 varilla para capturar la madeja de ADN 2 pipetas Pasteur de 3 ml

Muestra Muestra de sangre total anticoagulada con EDTA

Procedimiento 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Partir de 2ml de sangre periférica en EDTA. Añadir 10 ml de Tampón de lisis. Mezclar por inmersión.

Dejar en la nevera (4°C) durante 30 minutos.

Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm.

Eliminar el sobrenadante con pipeta Pasteur o mediante decantación.

Añadir el precipitado NaCl 0,9% hasta 4ml. Disolver completamente el precipitado.

Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm.

Eliminar el sobrenadante con pipeta Pasteur o mediante decantación.

Añadir al precipitado 500 µl de Tampón de lisis, 25 µl de SDS 20% y 2,5 µl de Proteinasa K. Agitar con vortex (opcional).

10. Incubar a temperatura ambiente toda la noche.

11. Añadir 160 µl de NaCl saturado. Dar un pulso con vortex (opcional).

12. Añadir volúmenes* de etanol absoluto frío. Mezclar por inversión muy lentamente observando la formación del ovillo de ADN precipitado. *Un

volumen es una medida relativa, de manera que el volumen de líquido contenido en un tubo constituye un volumen, siendo dos volúmenes el doble de lo que haya en el tubo (ej. Si en el tubo hay 1 ml de líquido, añadir dos volúmenes implicaría añadir 2 ml, para sumar un total de 3ml).

13. Capturar la madeja de ADN con una varilla.

14. Lavar la madeja en un microtubo con 1ml de etanol 70% 15. Dejar secar el ADN en la varilla durante 30 minutos, apoyando la varilla sobre una gradilla. Pasar la varilla por un microtubo vacío.

16. Resuspender en 300 µl agua destilada estéril. Con este procedimiento se obtiene una concentración de ADN promedio 100 – 200 ng/µl.

Resultado e interpretación En nuestro caso, no se ha precipitado el ADN. Esto puede ser debido a: 

Poca cantidad de ADN debido a: o Ya que al no entrar los tubos en la centrífuga dividimos la muestra y esto hace que disminuya la concentración de ADN o Lisis parcial o No ha habido una correcta sedimentación o Se realizaron más lavados de los indicados en el protocolo, lo que conlleva una posible pérdida del precipitado.



Contaminación de la muestra

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Preguntas

1. Enumera y ordena en función de la cantidad de células presentes, los distintos tipos de muestras humanas a partir de las cuales se pueden hacer una extracción de ADN. 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Semen Sangre (Leucocitos) Tejido muscular Pelo Hueso Saliva Orina

2. ¿Qué cantidad de ADN comparten una célula epitelial, un hepatocito y una neurona?

No solo estas tres células contendrán la misma cantidad de ADN, sino todas las células del cuerpo lo tienen.

Sin embargo, la función de la célula es la que va a provocar que proteínas sean sintetizadas.

3. ¿A partir de qué células sanguíneas se puede aislar ADN? El ADN está presente en los glóbulos blancos (o leucocitos), pero no en los glóbulos rojos humanos (eritrocitos o hematíes), pues éstos carecen de núcleo.

4. ¿En qué parte de la célula está el ADN? En el caso de las células procariotas, como las bacterias, el ADN está en el citoplasma en forma de molécula circular.

En las células eucariotas podemos diferenciar dos tipos de ADN según su localización: el ADN del núcleo formado por varias moléculas lineales (dependiendo de la especie), y el ADN mitocondrial, formado por algunos miles de copias de ADN circular.

5.

En función de la muestra biológica de partida empleada, aproximadamente ¿a partir de cuántos núcleos celulares hemos extraído ADN en esta práctica?

En un ml hay aproximadamente entre 4500 y 11000 núcleos celulares. Nosotros en esta práctica hemos usado 2 ml de muestra por lo que sabemos que hemos extraído aproximadamente entre 9000 y 22000 núcleos celulares

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Biología molecular Laboratorio clínico y Biomédico Iratxe Sierra Calvo 6. ¿Por qué precipita el ADN en el paso 12?

El ADN precipita ya que es una molécula polar por lo que es insoluble en alcohol, y el alcohol es apolar y precipita en este.

7.

¿Se podría lavar el ADN en el paso 14 con Etanol al 40%?

El ADN no se podría lavar con Etanol al 40%, ya que correríamos el riego de que se disolviese.

8. ¿Cuál es la finalidad de lavar el ADN con Etanol 70%?

La finalidad de lavar el ADN con Etanol al 70% es que si lo lavásemos en otro tipo de disolución se podría disolver, usamos etanol al 70% ya que es apolar y no se puede disolver en él.

9. ¿Por qué es importante que el Etanol se evapore bien en el paso 15?

Es importante que el Etanol se evapore bien ya que los restos de este podrían interferir en el resto de pasos que tengamos que realizar.

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Reacción en Cadena de la Polimerasa Objetivo El objetivo de la práctica es la amplificación de un segmento del gen de la metil-tetra-hidrofolato-reductasa (MTHFR) que se encuentra localizado en el cromosoma 1.

Fig.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa

Fundamento La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:   

Desnaturalización Unión Elongación 16

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Reactivos   

Tampón de actividad 5x Cebadores o Primers: Forward y Reverse Enzima Taq polimerasa

Material y aparataje    

Gradilla Microtubo Tubos Eppendorf Termociclador Fig.2. Termociclador

Muestra Muestra de ADN

Procedimiento 1. Mezclar en un tubo Eppendorf de 0,2 ml los siguientes reactivos, para un volumen total de 25 µl. Mezclar siempre por pipeteo, no emplear el vortex.

ADN Taq polimerasa Tampón 5x (con dNTPs y MgCl2) Primers 20 µM Agua destilada estéril Volumen total

X1 tubo 5 µl 0,4 µl 5 µl 0,5 µl de cada uno 13,6 µl 25 µl

2. Efectuar la PCR en el termociclador con el siguiente programa.

Desnaturalización inicial Desnaturalización Anillamiento Elongación final

Temperatura 95 °C 95 °C 57 °C 72 °C 72 °C 14 °C

Tiempo 5 min 15 s 15 s 10 s 5s

x 40 ciclos

3. Comprobar el resultado de la reacción mediante una electroforesis en agarosa y explicar los patrones de bandas obtenidos.

Resultado e interpretación A continuación, analizaremos la PCR mediante una electroforesis en gel de agarosa, observaremos las distintas bandas obtenidas y en función de esto analizaremos el resultado.

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Preguntas 1. ¿Qué particularidad tiene el ADN polimerasa para que pueda emplearse en este procedimiento?

En este procedimiento se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas. Ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.

2. ¿Cuál es el factor limitante del proceso?

Los factores limitantes en la eficiencia de la PCR son: 

Actividad de la Taq ADN polimerasa

El principal factor limitante es la ausencia de actividad correctora en la Tac polimerasa, por lo que se añade una cantidad menor de otra enzima con capacidad de corrección de pruebas (por ejemplo, la Pfu, polimerasa de Pyrococcus furiosus) para contrarrestar la carencia de esta actividad y, al mismo tiempo, seguir aprovechando la eficacia de elongación de la polimerasa principal (Taq o similar).

A medida que la amplificación simultánea va aumentando, la cantidad de enzima y de los nucleótidos se convierte en un factor limitante y es necesario más tiempo de extensión para que la polimerasa pueda completar la síntesis de todos los productos.

3. ¿Qué sucede en cada etapa de un ciclo de temperaturas: desnaturalización, anillamiento, elongación? 

Desnaturalización. Durante la desnaturalización, se separan las dos cadenas de las cuales está constituido el ADN. El ADN se somete a temperaturas elevadas (94-95°C), a fin de convertir el ADN bicatenario en monocatenario.



Anillamiento. Esta fase (annealing) se refiere a la unión de los primers (que se encuentran en muy altas concentraciones) a la hebra del ADN monocatenario, al momento de descender la temperatura del termociclador. Se da a la temperatura de 57 °C.



Elongación. Esta fase consiste en la extensión de la cadena de ADN por adicción de nucleótidos a partir de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador. Se da a la temperatura de 72°C.

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4. ¿Cómo podemos asegurar que estamos amplificando el gen que necesitamos analizar?

Tras la extracción y purificación obtenemos el ADN que queremos amplificar. De este ADN aislado, solo amplificamos una secuencia conocida concreta, para ello usamos primers o cebadores complementarios de la cadena que vamos a amplificar.

Para llevar a cabo el experimento de amplificación es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora...) y utilizar su primer o cebador complementario.

5. Enumera los motivos por los que no se produciría amplificación por PCR. ¿Qué ocurre si hay una mutación en la secuencia complementaria de unión de los cebadores?

Que no se produzca la amplificación del ADN puede ser debido a diferentes factores como, no tener suficiente ADN para que se produzca la amplificación.

Durante esta práctica hemos trabajado con volúmenes tan pequeños, que es muy fácil que se produzca el mínimo error al añadirlos, si el volumen echado no es el mismo que el necesario la amplificación no se dará de manera correcta.

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Electroforesis en gel de Agarosa Objetivo Separación de fragmentos de ADN por medio de la electroforesis en gel agarosa.

Fundamento Los ácidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que cuando se someten a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo. Esta migración (electroforesis) se suele llevar a cabo en el interior de un gel (agarosa o poliacrilamida), de manera que los fragmentos de menor tamaño se desplazan con mayor facilidad por la trama del gel que los más largos. Tras la electroforesis, aparecen varias bandas que corresponden a los fragmentos de distinto tamaño.

Para visualizar el ADN, el gel se debe teñir con marcadores que tienen una gran afinidad por los ácidos nucleicos y además, bajo la luz ultravioleta, emite fluorescencia cuando se hallan unidos a ADN o ARN; por este motivo, son utilizados para la detección de dichas sustancias en la trama del gel.

Reactivos     

Agarosa Tampón TBE 10x Midori Green Marcador peso molecular Tampón de carga

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Material y aparataje      

Microtúbulos Micropipetas Puntas de micropipeta Cubeta de electroforesis Transiluminador UV Gafas de seguridad de metacrilato

Muestra Muestra de ADN obtenido en la primera práctica “Extracción de ADN en sangre” y “PCR”.

Procedimiento 

Preparación del gel Agarosa

Reactivos Agarosa TBE 1x *Ajustar

Gel 1% 0,5 g 50 ml

Gel 2% 1g 50 ml

las cantidades de agarosa y TBE 1x en función del tamaño de la bandeja donde se vaya a realizar el gel.

1. Prepara la bandeja con el peine.

2. Pesar la agarosa directamente en el vaso de precipitados. Añadir el TBE 1x.

3. Hervir en el horno microondas hasta la disolución total de la agarosa, agitando el vaso con la mano de vez en cuando.

4. Mantener en agitación hasta alcanzar los 65 °C aproximadamente (temperatura orientativa).

5. Añadir 5 µl de Midori Green a la agarosa líquida. Mover para distribuir uniformemente.

6. Servir en la bandeja con el peine colocado.

7. Dejar polimerizar a temperatura ambiente, hasta que la agarosa deje de estar transparente.

8. Quitar el peine levantándolo verticalmente de gel y evitando moverlo hacia los lados para no romper los pocillos.

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

Realización de la electroforesis

a. Para preparar el Tampón de Electroforesis (TBE 1x) Reactivos TBE 10x Agua destilada (para biología molecular o destilada)

Cantidad 25 ml Hasta 250 ml

b. Para preparar las muestras Por cada alumno Muestra de ADN Tampón de carga Agua destilada Por cada peine Marcador de peso molecular Tampón de carga Agua destilada

Según tipo de muestra 5 µl 5 µl 4 µl 5 µl 11 µl

9. Preparar el tampón de electroforesis.

10. Mezclar la muestra de DNA (gDNA, producto de PCR, producto de digestión tras RFLP…) con el tampón de carga y agua para aumentar el volumen de la muestra a cargar.

Fig.1. Muestras para electroforesis

Fig.2. Muestras en frio

11. Introducir el gel y tampón de electroforesis en la cubeta e insertar las muestras de ADN en los pocillos, anotando el orden de colocación en el gel, con precaución de no dañar el pocillo.

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Fig. 3. Carga del gel agarosa.

12. Conectar la cubeta a la fuente y poner a voltaje constante (100-120 V) hasta que el frente de la electroforesis haya recorrido las tres cuartas partes del gel.

13. Desconectar la fuente.

Resultado e interpretación

Según el resultado obtenido, una de las hipótesis que podemos decir, es que posiblemente ha habido un fallo durante la amplificación y esta no se ha llevado a cabo. Así, no hay suficiente ADN para que se pueda ver en la electroforesis.

Fig.4. Resultado de la electroforesis

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Preguntas 1. Explicar brevemente en qué se basa la electroforesis de ácidos nucleicos.

La electroforesis de ácidos nucleicos es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias.

Esta técnica se basa en la separación de especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica.

Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel, con una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración.

2. ¿Qué función tiene el tampón de carga?

El tampón de carga tiene tres funciones principales:  

Añadir color a la muestra.

Aportar densidad a la muestra, para que las gotas de ADN caigan uniformemente en el pocillo

3. ¿Por qué aparecen bandas con distinta intensidad?

Las bandas con distinta intensidad aparecen por distintos motivos:

 

Debido al tamaño de los fragmentos, los pequeños corren más y están más próximos al polo + y los grandes corren menos y están más próximos al polo -.

Por la cantidad de ADN unido al fluorocromo es más intenso no.

4. ¿Por qué no se hace la electroforesis en agua en vez de en tampón TBE? La electroforesis no se hace en agua ya que no tiene carga, no hay iones y el gel no correría del polo – al polo +.

5. Interpretar los resultados obtenidos al analizar el ADN genómico y/o el producto de PCR y la restricción enzimática mediante electroforesis en agarosa.

Durante el desarrollo de la práctica se ha cometido algún error ya que la electroforesis no se ha realizado correctamente y no hemos obtenido ningún resultado. Esto ha podido ser porque el ADN no se ha amplificado durante la PCR.

6. ¿Por qué la electroforesis en agarosa es sumergida?

La electroforesis en agarosa es sumergida para que se cree un potencial eléctrico, el tampón es muy conductor de la corriente.

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¿Qué he aprendido?

Durante este curso académico he podido ver más de cerca y poner en práctica distintas técnicas de biología molecular.

La primera evaluación me sirvió de repaso de algo que ya había visto pero tenía olvidado. Creo que este repaso ha sido necesario para poder desarrollar las distintas técnicas que hemos visto en la segunda evaluación.

En biología molecular se trabaja con volúmenes muy pequeños, por lo que es necesario un correcto manejo y calibración de las micropipetas. Además, hemos visto como una mala calibración y un error en el volumen nos lleva a un resultado erróneo.

La electroforesis ya habíamos visto el año pasado y no era algo nuevo para mí, pero si lo ha sido la PCR y el termociclador, que es un aparato que con el que no había trabajado nunca.

Además de todos los conocimientos teóricos que he podido aprender, he visto la importancia del orden y la limpieza en un laboratorio, así como la necesidad de cumplir las medidas de seguridad e higiene.

Creo que está asignatura es muy importante en el Grado de cara a posibles salidas laborales, por eso me parece que se le tendría que dar más importancia.

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Bibliografía La mayoría de la información esta obtenido de la guía con la que se ha trabajado en clase.     

https://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm https://bpl2009.wikispaces.com/file/view/Equipos+micropipetas.pdf http://metabolismodelnitrogeno.blogspot.com.es/2013/03/caso-practico-n1calibracion-de.html https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

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