Endotoxinas y su adsorción a través de Minazel, Minazel Plus y MycoRaid

ENDOTOXINAS Y SU ADSORCIÓN A TRAVÉS DE MINAZEL, MINAZEL PLUS Y MYCORAID

Jog Raj1*, Simon Jackson2, y Marko Vasiljević1 PATENT CO DOO., Vlade Ćetkovića 1A, 24 211, Mišićevo, Serbia Molendotech Ltd., Brixham Laboratory, Freshwater Quarry, Brixham, Devon, UK *Autor correspondiente: jog.raj@patent-co.com 1

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Los ingredientes de los piensos y los alimentos para animales pueden estar contaminados con diversos residuos de origen químico y biológico, como dioxinas, metales pesados, microbios, endotoxinas y micotoxinas. Entre estos contaminantes, se conoce poco sobre las endotoxinas. En este artículo se abordan los siguientes aspectos sobre las endotoxinas:

1. Estructura de las endotoxinas y sus efectos en los animales 2. Prevención de la absorción de endotoxinas 3. Adsorción de endotoxinas a través de Minazel, Minazel Plus y MycoRaid

Estructura de las endotoxinas y sus efectos en los animales Las endotoxinas son lipopolisacáridos

Las endotoxinas se liberan al medio

(LPS) que se encuentran en la

ambiente cuando las bacterias se

membrana externa de las bacterias

multiplican o cuando sus membranas

Gram negativas. Son componentes

celulares se rompen por lisis bacteriana.

estructurales de la pared celular bacteriana y constituyen parte de los componentes de la membrana externa de estas bacterias.

Las endotoxinas no son intrínsecamente tóxicas per se, como las exotoxinas. Sin embargo, inducen fuertes respuestas inflamatorias que pueden dañar al hospedador e incluso pueden ser letales.

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Los LPS están compuestos químicamente por una cadena externa de polisacáridos O (antígeno O), una cadena interna de Las alteraciones del lípido A pueden

polisacáridos R y un lípido A (Figura 1).

permitir a las bacterias patógenas evadir la respuesta inmunitaria del huésped.

El antígeno O varía entre las distintas cepas bacterianas y es la base de la tipificación serológica de las bacterias Gram negativas, como E. coli.

El lípido A es la parte más bioactiva de la molécula y es una estructura más conservada. Sin embargo, puede haber diferencias estructurales entre cepas y especies bacterianas, alterando la forma en que las células del huésped responden a ellas.

Región central

Lípido A

Cadenas acilo

-

P

NH3*

KD0 -

GlcN

KD0 -

GlcN -

P

KD0

Cadena O-específica

-

P

-

P

Hep

Hep

Hep P

Núcleo interno

Núcleo externo

Polisacárido repetitivo

Figura 1. Estructura esquemática del LPS de E. coli (Adaptado de Abate et al., Journal of Medical Microbiology, 2017).

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Endotoxinas vs. Exotoxinas Tanto las endotoxinas como las exotoxinas son potencialmente peligrosas para los cultivos celulares, los animales y los seres humanos, aunque provocan sus efectos a través de mecanismos diferentes.

EXOTOXINAS

ENDOTOXINAS

Las exotoxinas son potentes sustancias

Las endotoxinas son componentes

tóxicas, generalmente proteínas,

glicolipídicos de la pared celular de

secretadas por las bacterias y

las bacterias y no son secretadas,

liberadas fuera de la célula.

sino que se desprenden durante el

Tienen efectos tóxicos directos

crecimiento o la lisis bacteriana.

sobre las células del hospedador,

No son directamente tóxicas para las

incluyendo la lisis celular y la

células, pero pueden inducir respuestas

alteración del metabolismo celular.

inmunitarias perjudiciales cuando entran en la circulación, pudiendo provocar daños en los órganos y muerte (sepsis).

ENDOTOXINAS Glicolípidos desprendidos de la pared celular Efectos tóxicos indirectos: respuestas inmunitarias perjudiciales (daños en los órganos y sepsis) Termoestables

EXOTOXINAS Proteínas secretadas por las bacterias Efectos tóxicos directos: lisis celular y alteración del metabolismo celular Termolábiles Alta antigenicidad

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Las exotoxinas suelen ser destruidas por el calor, mientras que las endotoxinas son estables al calor (las altas temperaturas ~200°C durante 60 minutos pueden destruir las estructuras de las endotoxinas y deben utilizarse para “despirogenizar” el equipo).

Las exotoxinas son altamente antigénicas y provocan una respuesta de anticuerpos más fuerte que las endotoxinas. De hecho, las exotoxinas desnaturalizadas (toxoides) pueden utilizarse para desarrollar vacunas.

Endotoxinas en la alimentación animal Las endotoxinas están presentes en todas partes del medio ambiente: en el aire, el agua, el suelo y en el tracto gastrointestinal de los animales.

Proteger a todo el ganado de sus efectos nocivos debería ser una prioridad para todos, desde la fabricación del pienso hasta la granja.

A través de los piensos, el ganado está constantemente expuesto a bacterias Gram negativas que contienen endotoxinas.

En 1993, la FDA realizó pruebas para detectar la presencia de Salmonella enterica en muestras de alimentos para animales procedentes de 78 plantas destinadas a la producción de proteína de origen animal. Se detectó la presencia de S. enterica en el 56% de las 101 muestras deproteína de origen animal y en el 36% de las 50 muestras de proteína de origen vegetal.

En 1994, la FDA analizó 89 muestras de piensos acabados procedentes de fábricas y de granjas en las que se mezclaban los piensos, y descubrió que el 25% de las muestras estaban contaminadas con S. enterica.

La exposición a la endotoxina en los piensos está asociada a enfermedades.

Los síntomas más comunes en el ganado son la muerte súbita o los síntomas nerviosos, como el aturdimiento, el tambaleo, la ataxia, el edema subcutáneo, especialmente en la nariz, las orejas, los párpados y la laringe (voz chillona). Por lo tanto, deben tomarse medidas para eliminar o detoxificar eficazmente las endotoxinas antes de que puedan llegar a la circulación sanguínea.

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Transferencia de endotoxinas En los animales de producción, el tracto

Se sabe que varios factores externos aumentan

gastrointestinal es el principal lugar de

la permeabilidad intestinal. Además, una

riesgo por donde las endotoxinas pueden

barrera intestinal alterada se caracteriza por

pasar del lumen al torrente sanguíneo,

un mayor número de receptores TLR-4

desde donde ejercen sus efectos nocivos.

debido a una activación excesiva del sistema inmunitario. Todo ello favorece la filtración de

En los animales sanos, la permeabilidad

endotoxinas al torrente sanguíneo (Figura 2).

intestinal está estrechamente controlada.

En los rumiantes, la translocación de endotoxinas La barrera intestinal está compuesta por células

a la circulación sanguínea también puede

epiteliales intestinales (enterocitos) que están

tener lugar a través del epitelio ruminal.

conectadas por proteínas de unión estrecha.

Este epitelio tiene una estructura multicapa y está cubierto por células queratinizadas que

Esto mantiene las endotoxinas en

actúan como barrera protectora. Además, los

el lado luminal del intestino, donde

receptores TLR-4 también están presentes para

no son tóxicas para el animal.

proteger al animal frente a las endotoxinas.

El sistema inmunitario “detecta” constantemente

No obstante, un pH ruminal bajo y una osmolalidad

estas endotoxinas mediante receptores

elevada reducen la función de barrera epitelial

específicos (TLR-4, Toll-like receptor 4)

y aumentan la translocación de endotoxinas

presentes en la membrana de los enterocitos.

del rumen al torrente sanguíneo. Además, el estrés fisiológico y la exposición a materiales que

En condiciones de buena salud intestinal,

dañan la capa epitelial (como las micotoxinas)

éste es uno de los mecanismos que ayudan

aumentan la permeabilidad intestinal y permiten

a proteger a los animales frente a la

la translocación de grandes cantidades de LPS.

amenaza constante de las endotoxinas.

Uniones estrechas

Reacción inflamatoria

Receptor TLR-4

LPS

LUMEN Células epiteliales Circulación sanguínea HOMEOSTASIS INTESTINAL

ALTERACIÓN DE LA BARRERA INTESTINAL

Figura 2. Transferencia de endotoxinas desde el lumen al torrente sanguíneo (Adaptado de Endotoxins – A constant threat - All About Feed)

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Mecanismos de acción de los LPS Las consecuencias fisiológicas de la presencia de endotoxinas en el torrente sanguíneo (endotoxemia) son bastante complejas.

Activación del sistema del Complemento El LPS activa el sistema del complemento, una serie de proteínas plasmáticas que normalmente

Los LPS actúan como señal de infección, estimulando una vigorosa respuesta inflamatoria que conduce a los efectos patológicos de esta molécula. Las respuestas a los LPS incluyen:

protegen al huésped de los patógenos induciendo una respuesta inflamatoria, uniéndose a los patógenos para ayudar a su eliminación por los fagocitos y formando un complejo de ataque a la membrana (MAC) que perfora las membranas de las bacterias patógenas.

Estimulación de TLR-4 La estimulación del receptor de LPS TLR-4 presente en células inmunitarias

La activación descontrolada del Complemento

como los monocitos y los macrófagos,

por grandes cantidades de LPS causará daños

conduce a la secreción de citoquinas

a las células y tejidos del huésped.

proinflamatorias críticas, principalmente la interleucina (IL) IL-1β, IL-6, IL-8 y el factor de necrosis tumoral (TNF) α y β.

En la sangre, el LPS puede formar complejos con la proteína de unión al LPS (LBP) que facilita la transferencia del LPS al TLR-4 para iniciar la cascada de señalización que conduce a la activación de los genes inflamatorios.

Expresión de FT El LPS estimula la expresión del factor tisular (FT) en las células inmunitarias. El FT forma un complejo altamente procoagulante con el factor VII de coagulación activado (FVIIa), lo que conduce a la formación de coágulos de fibrina. La fibrina también puede iniciar una inflamación que puede conducir a la activación de la coagulación.

La activación excesiva del sistema de coagulación, junto con la supresión de los mecanismos anticoagulantes inducida por el LPS, da lugar a una coagulación intravascular diseminada (CID) que pone en peligro la vida.

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Síntesis de factores proinflamatorios La sepsis con hipotensión profunda se describe como shock séptico y conlleva una elevada mortalidad.

El LPS estimula la síntesis de mediadores lipídicos a partir de los fosfolípidos de la membrana, incluido el FAP (factor activador de las plaquetas). El PAF sanguíneos y en las células de las vías respiratorias.

La endotoxemia está asociada al desarrollo de sepsis, una respuesta inflamatoria e inmunitaria sistémica descontrolada a la invasión microbiana que produce lesiones en los órganos y conlleva una elevada mortalidad.

Las consecuencias de la endotoxemia incluyen hipotensión, acidosis metabólica, hemoconcentración, hemorragia intestinal, fiebre, activación de neutrófilos y células endoteliales y predisposición a la trombosis.

La sepsis puede manifestarse como: Reducción de la presión arterial y aumento de la frecuencia cardíaca (alteraciones hemodinámicas) Anomalías de la temperatura corporal Hipoperfusión progresiva a nivel

TOLERANCIA A LAS ENDOTOXINAS

tiene muchos efectos proinflamatorios en los vasos

Si un animal es desafiado continuamente con endotoxinas, puede aparecer un estado de tolerancia a las endotoxinas y un síndrome de respuesta antiinflamatoria compensatoria (CARS).

Esto consiste en un estado de hiposensibilidad caracterizado por una capacidad reducida de las células inmunitarias para responder a los estímulos inflamatorios, en particular los iniciados por los LPS. Esta depresión del sistema inmunitario deja al animal expuesto a los agentes patógenos reales.

Con la tolerancia a las endotoxinas, la amplia reprogramación denominada “entrenamiento inmunitario innato” conduce a modificaciones de los componentes intracelulares de la señalización TLR y también a alteraciones de los mediadores solubles extracelulares.

del sistema microvascular Daño hipóxico a las células susceptibles Cambios cuantitativos en los niveles sanguíneos de leucocitos y plaquetas Coagulación intravascular diseminada (CID) Fallo multiorgánico Muerte del animal

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¿Cómo podemos mitigar los efectos de las endotoxinas?

Se pueden implementar diferentes estrategias para minimizar la aparición y los efectos de las endotoxinas en los animales:

1

Vacunas con componentes de endotoxinas.

El lípido A se ha utilizado experimentalmente para obtener vacunas de protección. Sin embargo, debido a la variabilidad estructural, no se puede garantizar la protección de los anticuerpos. Además, el gran inconveniente es el elevado costo de producción.

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Para evitar el impacto de las endotoxinas

Adsorción de endotoxinas usando Minazel, Minazel Plus y MycoRaid

al aplicar las bacterinas, es fundamental seguir las recomendaciones sobre la aplicación de las vacunas emitidas por las empresas fabricantes.

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Uso de adsorbentes de micotoxinas

Minazel, Minazel Plus y MycoRaid son productos para solucionar problemas asociados a micotoxinas, son producidos y comercializados globalmente por PATENT CO., Serbia.

(adsorbentes inorgánicos u orgánicos).

Se ha informado del uso de adsorbentes de micotoxinas para captar las

Minazel es un producto basado en Clinoptilolita (zeolita).

endotoxinas; sin embargo, antes de utilizarlos se debe comprobar su capacidad adsorción para estas toxinas.

Un beneficio adicional de estos adsorbentes es la captación de micotoxinas que

Minazel Plus es un producto a base de Clinoptilolita (zeolita) modificada orgánicamente.

están frecuentemente presentes en los piensos y que pueden contribuir a la alteración de la permeabilidad intestinal del ganado, permitiendo la translocación de LPS. También deberían llevarse a cabo ensayos que correlacionen el uso de adsorbentes de micotoxinas con las

MycoRaid es un producto que contiene premezclas minerales, pared celular de levaduras, Bacillus sp . y extracto de hierbas.

tasas de enfermedad y los resultados.

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Molendotech Ltd., Reino Unido, llevó a cabo estudios para determinar la capacidad de unión del LPS de Minazel, Minazel Plus y MycoRaid en un tampón de pH 6,5 utilizando una concentración de adsorbente de 10 mg/ ml y los resultados se muestran en la Figura 3.

% Adsorción

Figura 3. Adsorción de endotoxinas mediante Minazel, Minazel Plus and MycoRaid.

110 100 90 80 70 60 50 40 30 20

99

Endotoxinas: Los LPS de E. coli O111:B4, S. enterica typhimurium, P. aeruginosa , E. coli K-12 a concentraciones finales de 1ng/ml se incubaron con el adsorbente a 10mg/ml en buffer de pH 6,5.

Las endotoxinas de cada fuente se incubaron con buffer a pH 6,5 para obtener una muestra de control sin adsorbente.

Las endotoxinas de cada fuente se incubaron con Polimixina B en buffer a pH6,5 para obtener una muestra de control con ligante positivo.

100

88 75

92

74

57 35

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella enterica

Escherichia coli k12

Endotoxina evaluada Minazel

Protocolo

100

Minazel Plus

MycoRaid

Resultados MycoRaid puede adsorber el 99% de las endotoxinas de Pseudomonas aeruginosa , el 92% de E. coli K1-2 y el 74% de las endotoxinas de Salmonella enterica.

Minazel puede adsorber el 57% de las endotoxinas de Pseudomonas aeruginosa , el 35% de E. coli K-12 y el 100% de las endotoxinas de Salmonella enterica .

Minazel Plus puede adsorber más del 88% de las endotoxinas de Pseudomonas aeruginosa , el 100% de E. coli K-12 y el 75% de las endotoxinas de Salmonella enterica .

Las muestras se incubaron durante 1 hora a 37˚C, se centrifugaron y se determinó la concentración de endotoxinas en el sobrenadante mediante el ensayo LAL (Limulus Amebocyte Lysate).

Cualquier endotoxina presente en el aglutinante, solo o en los buffers, también se determinó mediante el ensayo de LAL.

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Las endotoxinas pueden causar importantes problemas de salud en los animales, estando favorecidos por los contaminantes de los alimentos y el estrés fisiológico. Esto conduce a una baja conversión alimentaria, sacrificios frecuentes y pérdida de ingresos.

La eliminación de las endotoxinas mejora la calidad de los alimentos y el bienestar de los animales. Por lo tanto, se recomienda el uso de absorbentes de micotoxinas con tasas de adsorción eficaces frente a las endotoxinas.

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