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EU COMMUNITY REFERENCE LABORATORY FOR LISTERIA MONOCYTOGENES

DOCUMENTO DI LAVORO Versione 2 – Novembre 2008 DOCUMENTO TECNICO DI ORIENTAMENTO per gli studi sulla vita commerciale degli alimenti pronti al consumo inerenti alla Listeria monocytogenes

Annie BEAUFORT, Marie CORNU, Hélène BERGIS, Anne-Laure LARDEUX, Unit Quantitative Microbiology and Risk Assessment, Bertrand LOMBARD, CRL Coordinator AFSSA-LERQAP, CRL for Listeria monocytogenes, Maisons-Alfort, France In collaborazione con i rappresentanti di 6 Laboratori Nazionali di Riferimento per la Listeria monocytogenes: Caroline DE BACKER, National Reference Laboratory for Food Microbiology, University of Liège, Belgium; Ife FITZ-JAMES, Laboratory of the Food and Consumer Product Safety Authority (VWA), Zutphen, The Netherlands; Bernadette HICKEY, Department of Agriculture, Fisheries & Food Laboratories (Dairy Science Laboratory), Co Kildare, Ireland; Taran SKJERDAL and Semir LONCAREVIC, National Veterinary Institute, Oslo, Norway; Andrei NICOLAU, Institute for Hygiene and Veterinary Public Health, Bucharest, Romania; Suzanne THISTED-LAMBETZ, National Food Administration, Livsmedelsverket (SLV), Uppsala, Sweden; e di un 7° laboratorio: Roy BETTS, Campden & Chorleywood Food Research Association, Gloucestershire, United Kingdom.

Traduzione non ufficiale a cura di O. Bassoli, M. Piumi, R. Seghedoni - SVET AUSL Modena - 09/03/09

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INDICE 1. Introduzione ............................................................................................................................................... 1 1.1. Premessa ............................................................................................................................................ 1 1.2. Obiettivi..................................................................................................................................... 2 2. Challenge test di valutazione del potenziale di crescita................................................................... 9 2.1. Caratteristiche del prodotto .................................................................................................... 10 2.2. Protocollo per il challenge test di valutazione del potenziale di crescita................................. 10 2.2.1. Numero di lotti.......................................................................................................................... 10 2.2.2. Scelta dei ceppi........................................................................................................................ 10 2.2.3. Preparazione dell'inoculo.......................................................................................................... 10 2.2.4. Preparazione e inoculazione delle unità di prova..................................................................... 11 2.2.5. Condizioni di conservazione dell'alimento inoculato................................................................ 12 2.2.6. Determinazione delle caratteristiche chimico-fisiche................................................................ 13 2.2.7. Analisi microbiologiche............................................................................................................. 13 2.2.8. Calcolo del potenziale di crescita............................................................................................. 15 2.2.9. Estrapolazione dei risultati........................................................................................................ 17 2.2.10. Referto d'analisi...................................................................................................................... 19 3. Challenge test di valutazione del tasso di crescita massimo............................................................... 20 3.1. Caratteristiche del prodotto.................................................................................................... 20 3.2. Protocollo per il challenge test di valutazione del tasso di crescita massimo........................... 20 3.2.1. Numero di lotti.......................................................................................................................... 20 3.2.2. Scelta dei ceppi........................................................................................................................ 20 3.2.3. Preparazione dell'inoculo......................................................................................................... 20 3.2.4. Preparazione e inoculazione delle unità di prova..................................................................... 21 3.2.5. Condizioni di conservazione dell'alimento inoculato................................................................ 22 3.2.6. Determinazione delle caratteristiche chimico-fisiche............................................................... 22 3.2.7. Metodi di rilevazione................................................................................................................ 22 3.2.8. Metodi di conteggio.................................................................................................................. 22 3.2.9. Calcolo del tasso di crescita massimo (µmax)........................................................................... 22 3.2.10. Estrapolazione dei risultati..................................................................................................... 23 3.2.11. Referto d'analisi...................................................................................................................... 25 4. Studi di conservabilità.................................................................................................................... 27 4.1. Campionamento dell'alimento................................................................................................ 27 4.1.1. Introduzione.............................................................................................................................. 27 4.1.2. Il campionamento casuale semplice.................................................................................. 27 4.2. Condizioni di stoccaggio........................................................................................................ 28 4.3. Analisi microbiologiche.......................................................................................................... 28 4.4. Calcolo.................................................................................................................................... 29 4.5 Referto d'analisi....................................................................................................................... 30

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GLOSSARIO

Abuso di temperatura: temperatura superiore alle temperature di trasformazione e stoccaggio nella vendita al dettaglio prescritte in base alla legislazione nazionale o ai regolamenti europei, comprese le condizioni di stoccaggio domestico ragionevolmente prevedibili. L'abuso di temperatura comprende l'intera catena del freddo tenendo conto, in particolare, della deviazione della temperatura nei frigoriferi della vendita al dettaglio, nonché dello stoccaggio domestico.

Lotto: un gruppo o una serie di prodotti identificabili ottenuti mediante un determinato processo in circostanze praticamente identiche e prodotti in un luogo determinato entro un periodo di produzione definito; (Reg (CE) N. 2073/2005).

Catena del freddo: il sistema continuo che provvede alla conservazione con il freddo degli alimenti deperibili lungo tutto il percorso dalla produzione al consumo.

Popolazione: il gruppo o la serie di unità che rappresenta il campo di indagine in relazione a un dato processo e una data ricetta. In pratica: il lotto analizzato.

Campionamento: procedura usata nella scelta di uno o più unità.

Sotto-popolazione campionata: le unità campionate, presumibilmente rappresentative della popolazione.

Vita commerciale: il periodo che corrisponde al periodo che precede il termine minimo di conservazione o la data di scadenza, come definiti rispettivamente agli articoli 9 e 10 della direttiva 2000/13/CE Unità di prova: aliquota di una unità commerciale, utilizzata per essere analizzata.

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1. Introduzione 1.1. Premessa Questo documento è stato preparato dal Laboratorio Comunitario di Riferimento (LCR) dell'UE

per la

Listeria monocytogenes in collaborazione con un gruppo di lavoro costituito da 10 laboratori, di cui 9 Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR) per Listeria monocytogenes: o National Reference Laboratory for Food Microbiology, University of Liège, Belgium, o Department of Agriculture & Food Laboratories, (Dairy Science Laboratory), Co Kildare, Ireland, o Laboratory of the Food and Consumer Product Safety Authority (VWA), Zutphen, The Netherlands, o National Veterinary Institute, Oslo, Norway, o National Food Administration, Livsmedelsverket (SLV), Uppsala, Sweden, o National Institute of Hygiene, Department of Food and Consumer Articles Research (PZH), Varsaw, Poland, o Institute of Hygiene and Public Heath (IISPV), Bucharest, Romania, o State Veterinary and Food Institute Dolný Kubín (SVPUDK), Slovakia, o Experimental Institute of Animal Health (IZT) of Abruzzo and Molise, Teramo, Italy, and: o Campden & Chorleywood Food Research Association, Gloucestershire, United Kingdom.

Hanno fornito un contributo attivo i rappresentanti dei LNR belga, olandese, irlandese, norvegese, rumeno e svedese e del laboratorio del Regno Unito.

Questo documento tecnico di orientamento è stato elaborato su richiesta della DG SANCO in risposta alle esigenze espresse dagli Stati membri dell'UE. La DG SANCO ha riconosciuto come necessario un documento in grado di fornire informazioni dettagliate e pratiche sulle modalità di effettuazione degli studi sulla vita commerciale inerenti Listeria monocytogenes nei prodotti alimentari pronti al consumo (RTE) al fine di garantire la conformità ai criteri microbiologici di cui al Regolamento (CE) n. 2073/2005.

Altri documenti, come quelli elaborati da AFNOR (2004, 2007) e dall'Università di Liegi (2007), fungono da riferimenti nazionali per la stessa materia.

L'allegato I del regolamento (CE) n. 2073/2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari stabilisce i criteri di L. monocytogenes in alimenti RTE. L'allegato II del regolamento precisa che gli operatori del settore alimentare (OSA) devono effettuare, se necessario, studi per valutare la crescita di L. monocytogenes, che può essere presente nel prodotto, durante la vita commerciale nelle condizioni di stoccaggio ragionevolmente prevedibili. Ma l'allegato II non descrive la procedura per lo svolgimento degli studi sulla vita commerciale.

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1.2. Obiettivi Questo documento tecnico di orientamento è fondamentalmente destinato ai laboratori per lo svolgimento degli studi sulla vita commerciale inerenti la L. monocytogenes in alimenti RTE in collaborazione con l'OSA. I Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR) sono incaricati di assistere i laboratori dei rispettivi paesi a condurre tali studi. In alcuni casi, possono condurre loro stessi tali studi.

Il presente documento fornisce consigli su come selezionare, implementare ed eseguire le prove richieste.

Un altro documento della DG SANCO, dal titolo "Documento di orientamento per gli studi sulla vita commerciale degli alimenti pronti al consumo inerenti la Listeria monocytogenes, ai sensi del regolamento (CE) n. 2073/2005 della Commissione, del 15 Novembre 2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari ", è diretto agli OSA che producono alimenti pronti al consumo.

Il presente documento descrive le procedure microbiologiche per determinare la crescita di L. monocytogenes utilizzando challenge test e studi di conservabilità nel quadro applicativo del Regolamento (CE) n. 2073/2005.

Le procedure microbiologiche descritte sono le seguenti: • challenge tests -valutazione del potenziale di crescita (δ) -valutazione del tasso di crescita massimo (µmax) • studi di conservabilità L'uso delle informazioni fornite dalle caratteristiche del prodotto, dalla letteratura scientifica e dai dati storici è dettagliato nel documento di orientamento destinato agli OSA, Challenge test I challenge test hanno lo scopo di fornire informazioni sul comportamento, in determinate condizioni di conservazione, di L. monocytogenes inoculata artificialmente in un alimento. Essi possono tener conto della variabilità dei prodotti alimentari (utilizzando diversi lotti) e della contaminazione specifica dei prodotti alimentari (inoculando i ceppi isolati dal alimento). Tuttavia, il livello di contaminazione, l'eterogeneità della contaminazione e lo stato fisiologico dei batteri sono difficili da riprodurre in un challenge test.

I challenge test possono essere eseguiti con due diversi obiettivi: o (1) la valutazione della crescita potenziale (cioè la capacità di L. monocytogenes di crescere negli alimenti), o (2) la stima dei parametri di crescita (ad esempio il tasso di crescita massimo).

Challenge test di valutazione del potenziale di crescita Un challenge test microbiologico di valutazione del potenziale di crescita (δ) è uno studio di laboratorio che misura la crescita di L. monocytogenes in alimenti contaminati artificialmente e conservati nelle prevedibili condizioni di trasporto, distribuzione e

stoccaggio. Un challenge test microbiologico deve riflettere le

condizioni che potrebbero realisticamente verificarsi lungo tutta la catena del freddo, comprese le condizioni Guida sugli studi della vita commerciale LCR L. monocytogenes

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di stoccaggio dalla produzione fino al momento del consumo.

Il potenziale di crescita (δ) è la differenza tra il log10 delle ufc/g alla fine della prova e il log10 delle ufc/g all'inizio della prova. I risultati sperimentali relativi al δ possono mostrare un'ampia dispersione, soprattutto perché è inclusa la fase di latenza. δ dipende da molti fattori, i più importanti sono: - il ceppo inoculato, - lo stato fisiologico del ceppo inoculato, - le proprietà intrinseche del prodotto alimentare (ad esempio: pH, contenuto di NaCl, aw,, contenuto nutrizionale, microflora associata, costituenti antimicrobici), - le proprietà estrinseche (ad esempio: il profilo tempo-temperatura, l'atmosfera di gas).

Tra questi fattori, la temperatura è quella che prevedibilmente può avere la massima influenza sulla crescita della L. monocytogenes in un determinato tipo di alimento.

Nel contesto dell'applicazione del regolamento (CE) n. 2073/2005, δ può essere utilizzato: - per classificare un prodotto alimentare: quando δ > 0,5 log10 ufc/g, il prodotto è classificato come "Alimenti pronti che costituiscono terreno favorevole alla crescita di L. monocytogenes, diversi da quelli destinati ai lattanti e a fini medici speciali " (categoria 1.2), quando δ ≤ 0,5 log10 ufc/g, il prodotto è classificato come "Alimenti pronti che non costituiscono terreno favorevole alla crescita di L. monocytogenes, diversi da quelli destinati ai lattanti e a fini medici speciali " (categoria 1.3), −

per quantificare il comportamento di L. monocytogenes in un prodotto alimentare di categoria 1.2 definito in base alle condizioni ragionevolmente prevedibili tra produzione e consumo.

−

per consentire il calcolo di una concentrazione di L. monocytogenes in un punto qualsiasi della produzione, tale da non portare al superamento del livello di 100 ufc/g al termine della vita commerciale.

I principali vantaggi di questo metodo sono: (i) che è relativamente semplice da attuare e (ii) che i risultati possono essere usati direttamente (vedi sopra). Il suo svantaggio è la mancanza di flessibilità in sede di interpretazione: i risultati sono validi solo per il alimento studiato nelle condizioni allestite, cosicché nuovi esperimenti devono essere eseguiti ogni qualvolta

c'è un cambiamento (ad esempio, il ricevimento è

cambiato, sono utilizzati diversi profili tempo-temperatura , ...). Inoltre, il potenziale di crescita in genere copre un lungo periodo di tempo (ad esempio l'intero periodo della vita commerciale) e quindi non può essere usato per predire la crescita nel corso di una frazione di tale periodo di tempo.

Challenge test di valutazione del tasso di crescita massimo Gli inconvenienti del precedente approccio possono essere risolti mediante la combinazione dei modelli predittivi di microbiologia e i challenge test di valutazione del tasso di crescita massimo µmax (tassi di crescita). Questi esperimenti sono più costosi e richiedono più tempo rispetto al challenge test di valutazione Guida sugli studi della vita commerciale LCR L. monocytogenes

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del potenziale di crescita. Essi sono limitati ai casi in cui la microbiologia predittiva è applicata da laboratori con una formazione specifica.

Un challenge test microbiologico per valutare il tasso di crescita massimo è uno studio di laboratorio che misura il tasso di crescita di L. monocytogenes negli alimenti contaminati artificialmente e conservati a una temperatura adeguata. La temperatura usata per l'esperimento non è (necessariamente) quella utilizzata nelle previsioni poiché è possibile prevedere la crescita a un altra temperatura diversa da quella di prova, o lungo un profilo tempo-temperatura scelto come rappresentante delle condizioni prevedibili di trasporto, distribuzione e stoccaggio.

Una volta che la prova è stata eseguita, il tasso di crescita massimo (µmax) del ceppo di L. monocytogenes studiato alla temperatura stabilita è calcolato sulla curva di crescita. In fase di crescita esponenziale, rapportando il logaritmo naturale del numero di cellule al tempo si ottiene una linea retta. La pendenza di questa linea è il µmax. Esso si esprime, per il nostro scopo, in giorni-1. Il tasso di crescita massimo è un importante parametro della curva di crescita che dipende da: − ceppo inoculato, − proprietà intrinseche dei prodotti alimentari (ad esempio, pH, contenuto di NaCl, aw, contenuto nutrizionale, microflora associata, costituenti antimicrobici), − proprietà estrinseche (ad esempio: la temperatura, l'atmosfera di gas).

Quindi, utilizzando ad esempio l'equazione suggerita nel presente documento, è possibile estrapolare questo µmax ad una data temperatura per prevedere gli altri valori di µmax,, nello stesso alimento, alle altre temperature.

Questo tipo di challenge test microbiologico permette: −

se la concentrazione iniziale è nota, una stima della concentrazione di L. monocytogenes in un determinato giorno della vita commerciale,

−

una stima della concentrazione massima ammissibile di L. monocytogenes presente il giorno della produzione in un prodotto alimentare, al fine di rispettare il limite di 100 ufc/g fino alla fine della vita commerciale.

Studi di conservabilità Gli studi di conservabilità consentono una valutazione della crescita di L. monocytogenes negli alimenti contaminati naturalmente durante lo stoccaggio in base alle condizioni ragionevolmente prevedibili.

Gli studi di conservabilità possono essere considerati più realistici per i singoli alimenti rispetto al challenge test perché la contaminazione è naturale.

L'interpretazione dei risultati degli studi di conservabilità può essere difficile a causa della bassa probabilità di analizzare un campione contaminato, del numero molto ridotto inizialmente presente di L. monocytogenes e della eterogeneità della distribuzione nell'alimento. In queste situazioni può essere necessario utilizzare il challenge test per raccogliere le informazioni necessarie a stabilire la vita commerciale e garantire il rispetto di mantenere un livello < 100 ufc/g fino alla fine della vita commerciale del prodotto.

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Gli studi di conservabilità possono essere utilizzati quando L. monocytogenes è sistematicamente rilevata nelle verifiche sui prodotti finiti.

Selezione di procedure microbiologiche appropriate La scelta delle prove da effettuare dovrebbe essere fatta dall'OSA, con la collaborazione del laboratorio che li condurrà. La scelta si deve basare sulle informazioni che si vogliono ottenere, come illustrato nella figura 1.

Alcune regole di base sono suggerite qui sotto: − il challenge test di valutazione del δ potrebbe essere la prova di "prima scelta" nella maggior parte dei casi, soprattutto quando si devono distinguere i prodotti capaci o meno di sostenere la crescita di L. monocytogenes. − l'esecuzione del challenge test per valutare il µmax dovrebbe essere considerata soprattutto come prova di "seconda scelta”, cioè nei casi specifici in cui possono essere molto utili le informazioni supplementari che si prevede di ottenere. Per interpretare i risultati sono necessarie conoscenze di base sulla microbiologia predittiva. − gli studi di conservabilità sono particolarmente appropriati quando la prevalenza di L. monocytogenes è alta.

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Figura 1. Dati ottenuti dai challenge tests e dagli studi di conservabilitĂ

2. Challenge test di valutazione del potenziale di crescita Per condurre un challenge test di valutazione del potenziale di crescita, devono essere presi in considerazione come minimo i seguenti fattori: o

caratteristiche del prodotto,

o

vita commerciale del prodotto,

o

numero di lotti,

o

scelta del ceppo,

o

preparazione dell'inoculo,

o

preparazione e inoculazione dell'unitĂ di prova,

o

condizioni di stoccaggio,

o

misurazione delle caratteristiche fisico-chimiche,

o

analisi microbiologiche

o

calcolo del potenziale di crescita

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2.1. Caratteristiche del prodotto Devono essere descritte le caratteristiche del prodotto alla fine della produzione e queste devono essere rappresentative della variabilità delle caratteristiche dell'alimento. Queste caratteristiche dovrebbero comprendere sia le proprietà intrinseche sia quelle estrinseche: −

caratteristiche fisico-chimiche, come il pH, aw, contenuto di sale, concentrazione del conservante;

−

microflora associata (conteggio totale) o microflora specifica (ad esempio, batteri lattici, Pseudomonas, ...)

−

le condizioni di confezionamento (aria, sottovuoto, in atmosfera modificata).

2.2. Protocollo del challenge test di valutazione del potenziale di crescita 2.2.1.

Numero di lotti

Prova di almeno 3 diversi lotti dello stesso prodotto.

2.2.2.

Scelta dei ceppi

Eseguire il challenge test con una miscela di almeno 3 ceppi per tener conto delle variazioni di crescita tra i ceppi. Tra i ceppi selezionati uno deve essere un ceppo di riferimento (ATCC, NCTC, CIP o equivalente). Gli altri ceppi devono essere isolati dalla medesima matrice alimentare o da una analoga.

2.2.3.

Preparazione dell'inoculo

Prima dell'effettuazione del challenge test, condurre dei test preliminari per determinare il tempo necessario a raggiungere la fase stazionaria. Trapiantare ogni ceppo in un terreno [ad esempio Tryptone Soy Broth (TSB) o Brain Heart Infusion (BHI)] e ad una temperatura ottimale (37 °C) per la crescita di Listeria monocytogenes, per un tempo sufficiente a raggiungere l'inizio della fase stazionaria. Questo primo trapianto è volto principalmente a mantenere le cellule nello stesso stato fisiologico. Preparare un secondo trapianto e incubare a una temperatura vicina alla temperatura dell'alimento, al fine di adattare il ceppo alle condizioni di stoccaggio del prodotto. Incubare questa coltura per un tempo sufficiente alla crescita dei ceppi fino alla fine della fase esponenziale o all'inizio della fase stazionaria. Miscelare in parti uguali le colture di ciascuno dei 3 ceppi alla stessa concentrazione. Preparare le successive diluizioni delle colture miste in acqua fisiologica per ottenere una concentrazione nel prodotto alimentare simile a quello che potrebbe realisticamente verificarsi naturalmente.

Controllare il livello di inoculo su Tryptone Soy Agar (TSA).

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2.2.4. Preparazione e inoculazione delle unità di prova Preparare almeno il numero di unità di prova indicato nella tabella 1.

L'intero esperimento richiede il campionamento distruttivo.

Tabella 1. numero minimo di unità di prova da preparare per lotto

"giorno 0" a)

"ultimo giorno"

Determinazione della concentrazione di L. monocytogenes

3

3

Individuazione e/o conteggio di L. monocytogenes in unità di prova non inoculate (opzionale)

3

3

Determinazione delle caratteristiche fisico-chimiche

3 c)

3 c)

Determinazione della concentrazione della microflora

3

3

b)

a) "giorno 0": il tempo immediatamente dopo l'inoculazione del prodotto b) "ultimo giorno": la fine della vita commerciale c) una unità è sufficiente se l'OSA è in grado di dimostrare che i prodotti sono omogenei.

In questa tabella, sono considerati solo il "giorno 0" e l'"ultimo giorno", ma si raccomanda di aggiungere punti di analisi intermedi.

2.2.4.1. Preparazione delle unità di prova non inoculate Le unità di prova possono essere utilizzate per individuare e/o contare la L. monocytogenes presente naturalmente nell'alimento, questi "campioni

bianchi" non sono inoculati. Anche se L. monocytogenes

dovesse essere presente nel " campione bianco ", il risultato del challenge test resterebbe valido. Esso fornirebbe le informazioni supplementari sui ceppi di L. monocytogenes naturalmente presenti a livelli realistici e che andrebbero a sommarsi alla miscela dei ceppi inoculati.

Per determinare le caratteristiche chimico-fisiche e la concentrazione della microflora, non inoculare le unità di prova con L. monocytogenes ma iniettare acqua fisiologica sterile. La determinazione delle caratteristiche fisico-chimiche e la microflora associata sono necessarie per comparare i prodotti sottoposti al challenge test con quelli fabbricati di routine (vedere i dati richiesti nel § 2.1.). Inoltre, la determinazione della concentrazione della microflora associata può dare alcune informazioni sulle possibili interazioni tra L. monocytogenes e la microflora associata. Tali interazioni possono influenzare la crescita di L. monocytogenes.

2.2.4.2. Preparazione e inoculazione delle unità di prova per la determinazione della concentrazione di L. monocytogenes Alimento Il challenge test può essere effettuato su una parte o sulla totalità delle unità commerciali dell'alimento. Se il alimento è composto di più parti, deve essere contaminata artificialmente la parte che più probabilmente può essere contaminata da L. monocytogenes (ad esempio, la farcitura di un tramezzino). La distribuzione dell’inoculo nel prodotto alimentare deve simulare la distribuzione plausibile di L. monocytogenes, che potrà essere o non essere uniforme.

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Procedura di inoculazione L'inoculazione deve simulare il più possibile le condizioni naturali di contaminazione e il mantenimento delle proprietà intrinseche del prodotto alimentare. Al fine di ridurre al minimo le modifiche alle proprietà chimicofisiche del prodotto, l'innesto non deve superare l'1% del volume delle unità di prova, altrimenti si possono alterare le proprietà intrinseche del prodotto e di conseguenza anche le caratteristiche di crescita dell'inoculo.

Assicurarsi che il metodo di inoculazione non modifichi la composizione dei gas all'interno della confezione alimentare e che nella fase di incubazione la composizione dei gas all'interno della confezione inoculata sia identica a quella che ci si aspetterebbe di trovare in una simile non inoculata. Ciò è possibile inoculando attraverso una membrana che si sigilli immediatamente dopo la rimozione del dispositivo, così da mantenere la corretta condizione gassosa, oppure inoculando il prodotto dopo aver sconfezionato l'unità commerciale e riconfezionandolo in modo tale da garantire che il gas sia identico a un prodotto integro.

Inoculare il prodotto alimentare, o la parte specifica che con più probabilità potrebbe essere contaminata, in modo da simulare quanto più possibile la contaminazione naturale presumibile. Questo può essere fatto come segue: −

in profondità: per gli alimenti ritenuti omogenei (ad esempio prodotti alimentari macinati) o preparati mescolando diversi materiali (ad esempio insalata mista),

−

o in superficie: per simulare la contaminazione di una parte specifica nel processo (ad esempio,

salmone affumicato contaminato durante l'affettatura).

Livello di contaminazione Il livello di contaminazione atteso deve essere di 50 ufc/g, senza superare le 100 ufc/g.

2.2.5.

Condizioni di conservazione del prodotto alimentare inoculato 2.2.5.1. Introduzione

Le condizioni di incubazione applicabili durante il challenge test devono essere conformi alle condizioni cui più probabilmente è sottoposto il prodotto nel normale utilizzo fino al momento del consumo. Queste dovrebbero includere l'intervallo di temperatura in cui il prodotto è destinato ad essere trasportato, distribuito e depositato.

Questa è una parte critica di ogni challenge test. È compito dell'OSA e del laboratorio lavorare insieme per garantire che le condizioni utilizzate per l'incubazione siano realistiche, questi devono inoltre essere consapevoli che non sempre è mantenuta la corretta temperatura di stoccaggio lungo tutta la catena del freddo (dalla produzione al consumo). Pertanto il challenge test deve tener conto anche dell'abuso di temperatura.

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2.2.5.2. Durata e temperatura di stoccaggio A seconda delle informazioni disponibili sulle temperature di stoccaggio durante la lavorazione, distribuzione e vendita al dettaglio lungo la catena del freddo, selezionare le seguenti condizioni di conservazione (vedi tabella 2).

Tabella 2. Diagramma di flusso delle condizioni di incubazione Durata dello stoccaggio (incubazione) Fase della catena del freddo

Temperatura d'incubazione

Vita commerciale ≤ 21 giorni

Vita commerciale > 21 giorni

Dalla produzione fino all'arrivo nel banco vendita

Temperatura giustificata da informazioni dettagliate*

oppure se non nota

8 °C

Durata giustificata da informazioni dettagliate

oppure se non nota

un terzo della vita commerciale

7 giorni

Commercio al dettaglio: banco vendita

Temperatura giustificata da informazioni dettagliate*

oppure se non nota

Durata giustificata da 12 °C informazioni dettagliate

oppure se non nota

un terzo della vita commerciale

½ (un terzo della vita commerciale - 7 giorni)

Stoccaggio domestico

Temperatura giustificata da informazioni dettagliate*

oppure se non nota

Durata giustificata da 12 °C informazioni dettagliate

oppure se non nota

un terzo della vita commerciale

½ (un terzo della vita commerciale - 7 giorni)

* Temperatura giustificata da informazioni dettagliate: il 75° percentile delle osservazioni per il paese dove si svolge la fase della catena del freddo 2.2.6.

Misurazione delle caratteristiche fisico-chimiche

Misurare la caratteristiche fisico-chimiche (almeno il pH; [contenuto di NaCl, umidità] o aw), secondo i metodi standard.

2.2.7.

Analisi microbiologiche 2.2.7.1. Metodi di rilevazione

Secondo l'allegato I del Regolamento n. 2073/2005, il metodo di rilevazione di riferimento per L. monocytogenes è il metodo standard EN ISO 11290-1 modificato. Secondo l'articolo 5 dello stesso regolamento, l'uso di metodi di analisi alternativi è accettabile quando i metodi sono convalidati rispetto al metodo di riferimento e, se si tratta di un metodo di proprietà, certificato da una terza parte conformemente al protocollo stabilito dalla norma EN/ISO 16140 o ad altri standard accettati a livello internazionale. Altri metodi possono essere validati in accordo con protocolli accettati a livello internazionale e il loro uso autorizzato dall'autorità competente.

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2.2.7.2.Metodi di conteggio Secondo l'allegato I del regolamento n. 2073/2005, il metodo di riferimento per il conteggio di L. monocytogenes è il metodo standard EN ISO 11290-2, modificato. Secondo l'articolo 5 dello stesso regolamento, l'uso di metodi di analisi alternativi è accettabile quando i metodi sono convalidati rispetto al metodo di riferimento e, se si tratta di un metodo di proprietà, certificato da una terza parte conformemente al protocollo stabilito dalla norma EN/ISO 16140 o ad altri standard accettati a livello internazionale. Altri metodi possono essere validati in accordo con protocolli accettati a livello internazionale e il loro uso autorizzato dall'autorità competente.

Poiché il livello di contaminazione voluto è pari a 50 ufc/g (cfr. § 2.2.4.2.) il limite di conteggio dovrebbe essere basso, non superiore a 10 ufc/g quindi, in base alla norma EN ISO 11290-2, spandere con spatola 1 ml della sospensione iniziale su 3 piastre di Ø 90 mm, o su piastra grande di Ø140 millimetri (spread-plate method), o, se validato, disseminare per inclusione su una piastra di Ø 90 mm (pour-plate method) .

Al fine di ottenere un'incertezza1 di misura ancora più bassa, è altamente consigliato scegliere un metodo che consenta di raggiungere un livello di conteggio ancora più basso, ad esempio 5 ufc/g, spandendo con spatola 2 ml di sospensione iniziale su 6 piastre di Ø 90 mm, o su 2 grandi piastre di Ø 140 mm, oppure, se validato, disseminando per inclusione in 2 piastre di Ø 90 mm. Seminare 1 ml della diluizione 10-2 (o 0,1 ml di sospensione iniziale) è probabilmente inutile al "giorno 0".

Un basso limite di conteggio può essere ottenuto utilizzando anche la filtrazione, o un altro metodo, se convalidato. In deroga alla norma EN ISO 7218:2007, i risultati basati sulla conta di meno di 4 colonie sono espressi quantitativamente, (ad esempio il conteggio associato a 3 colonie dopo la semina di 2 ml di sospensione iniziale è pari a "1,5 ufc/g"), ma non dovrebbe accadere frequentemente al "giorno 0" (dati un livello di contaminazione voluto di 50 ufc/g e un limite di conta al di sotto del 10 ufc/g). Per le stesse ragioni i risultati al di sotto della soglia (0 colonie contate) dovrebbero essere rari al "giorno 0". Se si tratta della maggioranza (vale a dire 2 o 3 risultati su 3) il challenge test (per questo lotto) non è accettabile.

Una volta che ogni lotto è stato inoculato e numerato al "giorno 0", si consiglia di calcolare subito la deviazione standard tra i 3 log risultati al "giorno 0" (o tra i 2 log risultati se uno di loro è al di sotto del limite).

Se questa deviazione standard (dovuta all'incertezza di misura e alla contaminazione eterogenea) è pari o superiore a 0,3 log ufc/g, allora il challenge test non è accettabile.

Quando un challenge test non è accettabile, eseguire nuovamente l'esperimento su questo lotto (o uno simile), prestando grande attenzione all'omogeneità della contaminazione e alla precisione del metodo di conteggio (aumentare il numero di piastre, se necessario).

1

Questo stretto legame tra incertezza di misura e il numero delle colonie contate può essere dimostrato con

l'uso della norma ISO TS 19036:2006 e la sua modifica.

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La microflora associata presa in considerazione può essere una conta aerobica mesofila o di una specifica microflora del alimento (ad esempio i batteri lattici, Pseudomonas). I metodi utilizzati per la conta dovrebbero seguire le pertinenti norme CEN, ISO o le norme nazionali per il microrganismo e il tipo di alimento in questione.

2.2.8.

Calcolo del potenziale di crescita

Il potenziale di crescita è la differenza tra il log10 ufc/g alla fine della crescita e il log10 ufc/g della concentrazione iniziale.

Per ciascun lotto, calcolare la differenza tra la mediana dei log10 delle concentrazioni al "giorno finale" e la mediana dei log10 delle concentrazioni al "giorno 0" (log10 ufc/g). Si noti che la mediana è il risultato intermedio tra i tre. Se uno dei tre risultati è espresso come "inferiore al limite", ciò non impedisce il calcolo di una mediana, che è poi il più basso degli altri due risultati).

Poi scegliere come δ la massima differenza, tra i 3 lotti, tra il "giorno finale" e "giorno 0".

Esempi Un esempio dei risultati è riportato nella tabella 3. In questo esempio, si presume che i risultati di conteggio siano stati ottenuti: −

al "giorno 0" dalla semina di 2 ml della sospensione iniziale (10-1) (spandere con spatola su 6 piastre di Ø 90 mm o su 2 piastre grandi di Ø 140 mm, o per inclusione su 2 piastre di Ø 90 mm), in modo che il limite di conteggio sia di 5 ufc / g,

−

al "giorno finale" dalla semina di 2 ml della sospensione iniziale (spandere con spatola su 6 piastre di Ø 90 mm, o su 2 piastre grandi di Ø 140 mm, o per inclusione su 2 piastre di Ø 90 mm) e di 0,1 ml di sospensione iniziale di 10-1 su una piastra di Ø 90mm (o 1ml della diluizione 10-2 in una piastra di Ø 90 mm).

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Tabella 3. Primo esempio dei risultati ottenuti da un test sul potenziale di crescita.

Il limite di conteggio è di 5 ufc/g.

Lotti

Giorno

"giorno 0" 1 "giorno finale"

"giorno 0" 2 "giorno finale"

"giorno 0" 3 "giorno finale"

Concentrazione (ufc / g)

Concentrazione (log10 ufc/g) In grassetto: mediana

30

1,48

50

1,7

20

1,3

43

1,63

24

1,38

29

1,46

45

1,65

30

1,48

30

1,48

29

1,46

43

1,63

14

1,15

<5

< 0,7

25

1,4

20

1,3

52

1,72

38

1,58

81

1,91

Differenza tra la mediana della Potenziale di concentrazione al "giorno crescita finale" e la mediana della (δ) = massimo concentrazione al "giorno 0" delle differenze (log10 ufc/g)

1,46-1,48 =- 0,02

1,46-1,48 =- 0,02

0,42

1.72-1.30 = 0,42

In questo primo esempio, le deviazioni standard tra i 3 risultati al "giorno 0" sono 0,20 log10 ufc/g per il lotto 1; 0,10 log10 ufc/g per il lotto 2 e 0,07 log10 ufc/g per il lotto 3, non tenendo conto del risultato al di sotto della soglia). Quindi, tutti i risultati possono essere utilizzati. La massima differenza tra la mediana della concentrazione al "giorno finale" e la mediana della concentrazione al "giorno 0" (log10 ufc/g) di ogni lotto è il seguente: δ = 0,42 (log10 ufc/g).

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Un secondo esempio dei risultati è riportata nella tabella 4, con la stessa ipotesi (soglia a 5 ufc/g).

Tabella 4. Secondo esempio dei risultati ottenuti da un test sul potenziale di crescita.

Il limite di conteggio è di 5 ufc/g.

Lotti

Giorno

"giorno 0" 1 "giorno finale"

"giorno 0" 2 "giorno finale"

"giorno 0" 3 "giorno finale"

Differenza tra la mediana della Concentrazione Potenziale di concentrazione al "giorno finale" Concentrazione (log10 ufc/g) crescita e la mediana della (ufc / g) (δ) = massimo In grassetto: concentrazione al "giorno 0" delle differenze mediana (log10 ufc/g) 25

1,4

20

13

55

1 74

100

2

210

2 33

190

2,28

60

1 78

30

1 48

50

1,7

250

24

350

2,54

390

2 59

20

13

25

14

20

1,3

43

1 63

52

1,72

76

1 88

2.28-1.40 = 0.88

0,88

2.54-1.70 = 0.84

1.72-1.30 = 0.42

La deviazione standard tra i 3 risultati al "giorno 0" sono 0,23 log10 ufc/g per il lotto 1; 0,16 log10 ufc/g per il lotto 2 e 0,06 log10 ufc/g per il lotto 3. Quindi possono essere utilizzati tutti i risultati. In questo secondo esempio, la massima differenza tra la concentrazione mediana al "giorno finale" e la mediana della concentrazione al "giorno 0" (log10 ufc/g) di ogni lotto è il seguente: δ = 0,88 (log10 ufc/g).

2.2.9.

Estrapolazione dei risultati 2.2.9.1. Capacità di sostenere la crescita di L. monocytogenes

La prima domanda da risolvere è se l'alimento è o non è in grado di favorire la crescita di L. monocytogenes.

Se δ è pari o inferiore a 0,5 log10, allora si presume che l'alimento non sia in grado di favorire la crescita di L. monocytogenes.

Se δ è superiore a 0,5 log10, allora si presume che l'alimento sia in grado di favorire la crescita di L. monocytogenes.

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2.2.9.2. Utilizzo del valore del potenziale di crescita Nei casi in cui si presume che l'alimento sia in grado di favorire la crescita di L. monocytogenes, i valori δ (superiori a 0,5 log10) possono essere utilizzati per le previsioni di crescita (si veda l'esempio), come: concentrazione finale = concentrazione iniziale + δ oppure: concentrazione iniziale = concentrazione finale - δ In pratica, la concentrazione finale ottenuta dal primo calcolo può essere usata per determinare per un dato prodotto, con una concentrazione nota al "giorno 0", se la concentrazione prevista al "giorno finale" supererà o meno il limite di 100 ufc/g.

Allo stesso modo, la concentrazione iniziale ottenuta a partire dal secondo calcolo può essere usata per determinare un limite alla fine della produzione sufficientemente basso da garantire che il limite di 100 ufc/g non sia superato alla fine della vita commerciale.

2.2.9.3.

Esempi

Nel primo esempio del § 2.2.8 (Tabella 3): δ = 0,42 (log10 ufc/g) δ è inferiore a 0,5, quindi si presume che l'alimento non favorisca la crescita di L. monocytogenes.

Nel secondo esempio del § 2.2.8 (Tabella 4): δ = 0,88 (log10 ufc/g) δ è superiore a 0,5, quindi si presume che l’alimento favorisca la crescita di L. monocytogenes. Il valore δ può essere utilizzato per ulteriori calcoli.

Se la concentrazione iniziale di L. monocytogenes è di 1 log10 ufc/g: - Quale sarà la concentrazione alla fine della vita commerciale? (la concentrazione iniziale è la concentrazione massima di L. monocytogenes nei prodotti lavorati secondo i principi GHP e HACCP all'inizio della vita commerciale).

Quindi la concentrazione prevedibile di L. monocytogenes alla fine della vita commerciale, è la seguente: concentrazione finale = concentrazione iniziale + δ = 1 + 0,88 = 1,88 log10 ufc/g (= 76 ufc / g <100 ufc / g) - Qual è la concentrazione di L. monocytogenes che deve esserci all'inizio della vita commerciale al fine di rispettare il limite di 100 ufc/g? È possibile rispondere con un calcolo a ritroso:

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concentrazione iniziale = concentrazione finale - δ = 2 - 0,88 = 1,12 log10 ufc/g (= 13 ufc/g) 2.2.10.

Rapporto di prova

Includere nel verbale di prova, almeno le seguenti informazioni: ◊

Numero del rapporto,

◊

Informazioni in materia di piena identificazione del prodotto alimentare: o Identificazione dei lotti testati e la loro data di produzione, o Le caratteristiche del prodotto alimentare (pH, aw, microflora associata, ...), o La vita commerciale stabilita del prodotto,

◊

Giustificazione delle condizioni di stoccaggio (temperatura e durata),

◊

I dati relativi ai ceppi in esame: o Origine dei ceppi, o Condizioni nella preparazione dell'inoculo, o Concentrazione dell'inoculo,

◊

I dati relativi al challenge test: o Numeri di lotto per prodotto, o Numero di unità di prova, o Giornata di inoculazione, o Massa o volume delle unità di prova inoculate, o Volume dell'inoculo e metodo di contaminazione, o Condizioni di conservazione (tempo/temperatura) delle unità di prova, o Riferimenti dei metodi microbiologici (conteggio e rilevazione), o Limite del metodo di conteggio, o Caratteristiche fisico-chimiche del prodotto alimentare all'inizio e alla fine della prova, o Il livello di microflora associata all'inizio e alla fine della prova, o I dati grezzi e i calcoli, o Il potenziale di crescita e la sua interpretazione.

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3. Challenge test di valutazione del tasso di crescita massimo Come indicato negli obiettivi, questo esperimento è limitato a casi specifici, quando si prevede che le informazioni specifiche fornite da questa prova più completa possano essere utili.

3.1. Caratteristiche del prodotto Cfr. § 2.1.

3.2. Protocollo per un challenge test di valutazione del tasso di crescita massimo 3.2.1. Numero di lotti Cfr. § 2.2.1.

3.2.2. Scelta del ceppo Testare ogni lotto con 2 ceppi, separatamente.

Prima di effettuare il challenge test, utilizzare le curve di crescita in brodo per selezionare i 2 ceppi più veloci, tra quelli isolati dalla stessa matrice alimentare o da una simile e di un ceppo di riferimento (ATCC, NCTC, CIP o equivalente).

3.2.3. Preparazione dell'inoculo In questo caso la concentrazione iniziale di L. monocytogenes può essere superiore alla concentrazione prevista per il prodotto, che è generalmente bassa.

Prima della realizzazione del challenge test condurre una prima sperimentazione per determinare il tempo necessario a raggiungere la fase stazionaria.

Trapiantare ogni ceppo in un terreno [ad esempio Tryptone Soy Broth (TSB) o Brain Heart Infusion (BHI)] e ad una temperatura ottimale (37 °C) per la crescita di Listeria monocytogenes, per un tempo sufficiente a raggiungere l'inizio della fase stazionaria.

Eseguire un secondo trapianto in condizioni identiche.

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3.2.4.

Preparazione e inoculazione delle unità di prova

Preparare almeno il numero di unità di prova indicato nella tabella 5.

Tabella 5. Numero di unità di prova da allestire per ogni curva

Unità di prova Determinazione del µmax (curva di crescita)

da 10 a 15

Individuazione di L. monocytogenes nel prodotto alimentare prima del challenge test ("giorno 0") e conta alla fine ( "giorno finale")

3+3

Determinazione delle caratteristiche fisico-chimiche iniziali ( "giorno 0") e finali ( "giorno finale")

3*+3*

Conteggio della microflora associata o specifica

2 oppure da 10 a 15

* Una unità è sufficiente se l'OSA può dimostrare che i prodotti sono omogenei.

L'intero esperimento richiede il campionamento distruttivo per le procedure microbiologiche.

3.2.4.2. Preparazione e inoculazione delle unità di prova per la determinazione del µmax Alimento Vedere "alimento" nel § 2.2.4.2 Procedura di inoculazione Per ogni curva, inoculare l'unità di prova con un solo ceppo (non una miscela).

Vedere "Procedura di inoculazione" in § 2.2.4.2 Livello di contaminazione Il livello di contaminazione deve essere mirato a circa 100 ufc/g.

3.2.4.2. Individuazione di L. monocytogenes nel prodotto alimentare prima del challenge test ("giorno 0") e conteggio alla fine ("giorno finale") Preparare 6 unità di prova per verificare l'assenza di L. monocytogenes nel prodotto alimentare, i cosiddetti "campioni in bianco" non sono inoculati.

Se L. monocytogenes è rilevata nei "campioni in bianco" al "giorno 0", il challenge test non è valido, poiché i numeri esatti di partenza non possono essere conosciuti e non può essere calcolato un corretto tasso di crescita. I risultati dei conteggi dei "campioni in bianco" al "giorno finale" devono essere interpretati dal laboratorio.

3.2.4.3. Determinazione iniziale ("giorno 0") e finale ( "giorno finale") delle caratteristiche fisico-chimiche Preparare 6 unità di prova per determinare le caratteristiche fisico-chimiche: non inoculare con L. monocytogenes, ma iniettare invece soluzione fisiologica sterile.

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3.2.4. Conteggio della microflora associata Contare la microflora associata su ogni unità di prova non inoculata per ogni momento di campionamento o al "giorno 0" e al "giorno finale".

3.2.5. Condizioni di conservazione del prodotto alimentare inoculato In questo caso condurre il challenge test a una temperatura fissa, che deve essere preferibilmente in prossimità delle temperature scelte per la previsione (cfr. § 2.2.5 e § 3.2.10).

3.2.6. Misurazione delle caratteristiche fisico-chimiche Cfr. § 2.2.6 3.2.7. Metodi di rilevazione Cfr. § 2.2.7 3.2.8. Metodi di conteggio Secondo l'allegato I del regolamento n. 2073/2005, il metodo di riferimento per il conteggio di L. monocytogenes è il metodo standard EN ISO 11290-2, modificato. Secondo l'articolo 5 dello stesso regolamento, l'uso di metodi di analisi alternativi è accettabile quando i metodi sono convalidati rispetto al metodo di riferimento e, se è un metodo proprietario, questo è certificato da una terza parte conformemente al protocollo stabilito dalla norma EN/ISO 16140 o ad altri analoghi protocolli standard accettati a livello internazionale. Altri metodi possono essere validati in accordo con protocolli accettati a livello internazionale e il loro uso autorizzato dall'autorità competente.

La microflora associata presa in considerazione può essere la flora aerobica mesofila o una microflora specifica del alimento (per esempio batteri lattici, Pseudomonas). Per elencare questa flora, utilizzare metodi conformi con il regolamento (CE) n. 2073/2005. I metodi utilizzati devono seguire le norme CEN, ISO o norme nazionali per il microrganismo e il tipo di alimento in questione.

3.2.9. Calcolo del tasso di crescita massimo (µmax) Per interpretare i risultati utilizzando l'approccio semplificato suggerito nei prossimi due paragrafi è necessaria una conoscenza di base della microbiologia predittiva.

Una conoscenza avanzata della microbiologia predittiva è utile quando si usano altri modelli.

Calcolare i risultati del conteggio in base alla norma EN ISO 7218 e trasformarli in logaritmo in base 10 ufc/g (log10 ufc/g).

Il tasso di crescita di ogni curva (vale a dire tutti i punti sperimentali appartenenti a un lotto) può essere facilmente stimato con una regressione non lineare. Software come MicroFit (gratuito) possono essere utilizzati a tale scopo. Il software MicroFit (Figura 2) è basato sul modello Baranyi come modello primario.

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Figura 2. Utilizzo del software Microfit per estrapolare una curva di crescita Il software Microfit fornisce una tabella con i punti sperimentali e la curva estrapolata per regressione utilizzando il modello Baranyi. È in grado di estrarre anche i parametri di crescita della curva: N0 (logaritmo della concentrazione batterica iniziale), Nmax (logaritmo della concentrazione batterica finale), µmax (tasso di crescita massimo), t-lag (durata della fase di latenza ), t-d (tempo di moltiplicazione o di duplicazione).

Questo tempo di moltiplicazione è legato al tasso di crescita massimo dal rapporto t-d = ln2/µmax. (dove "ln" sta per logaritmo naturale). La durata della fase di latenza e il tempo di moltiplicazione sono espressi in unità di tempo (ad esempio giorni) e il tasso di crescita massimo è quindi espresso in giorni-1. I valori dei parametri sono presentati con il loro intervallo di confidenza. Il software presenta anche la somma dei quadrati residui (Residual Sum of Square - RSS) e la radice della media dei quadrati (Root Mean Square - RMS). RSS e RMS forniscono un'indicazione dell'accuratezza della calibrazione della curva.

Scegliere il valore massimo tra i 6 µmax ottenuti da ciascuna delle 6 curve di crescita per i calcoli successivi.

3.2.10.

Estrapolazione dei risultati

Conoscendo il valore di µmax ad una data temperatura (Tref), è possibile calcolare un altro µmax a un'altra temperatura (T). Così, da una curva di crescita basata sulla Tref, utilizzando Microfit il µmax stimato è indicato come µmax ref . Quindi, il calcolo del µmax nello stesso alimento (con le stesse caratteristiche fisico-chimiche) a un'altra temperatura T si ottiene utilizzando il modello secondario della radice quadrata (Ratkowsky et al.

1982; Zwietering et al., 1996). Se T e Tref sono entrambe inferiori a 25 ° C, si suggerisce la seguente formula semplificata: µmax = µmax ref ×

(T - Tmin )2 (T ref - T min )2

(con Tmin = temperatura minima di crescita di L. monocytogenes ≈ - 2°C)

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µmax ref e µmax possono essere espressi in log10 ufc/g per giorno dividendo i loro valori per 2.3 [=ln(10)] Possono essere utilizzati altri modelli secondari.

Quindi, ipotizzando un modello primario molto semplice (senza la fase di latenza né la fase stazionaria, che possono portare a risultati sottostimati o addirittura inutili): La crescita (espressa in log10) ottenuta a Tref durante un periodo di stoccaggio d1 (in giorni), è pari a µmaxref (espressa in log10 ufc/g al giorno) x d1 la crescita (in log10) ottenuta a una temperatura T durante un periodo di stoccaggio d2 (in giorni), è pari a µmax (espressa in log10 ufc/g al giorno) x d2 Possono essere utilizzati altri modelli primari.

La previsione può essere applicata a qualsiasi profilo di tempo-temperatura e in particolare per le condizioni a cui più probabilmente il prodotto è sottoposto nelle normali condizioni di utilizzo fino al suo consumo finale (cfr. § 2.2.5) Esempio: • Dati: - vita commerciale: 9 giorni, - Condizioni di stoccaggio: 4 °C per 3 giorni (d1) e 8 °C per 6 giorni (d2) Il challenge test è stato effettuato a Tref = 8 °C e ha permesso di stimare µ maxref = 0,78 ln ufc/g al giorno, trasformato in 0,34 log10 ufc/g al giorno.

Il secondo modello consente di prevedere µmax a T = 4 °C, con il suo intervallo di confidenza

µmax = µmax ref ×

(T - Tmin )2 ──────── (T ref - T min )2

La stima del punto è: µmax = 0.78 ×

[4 - (-2) ]2 ────── [8 - (-2) ]2

ln ufc/g per giorno = 0.28 ln ufc/g per giorno trasformato in 0.12 log10 ufc/g

per giorno Quindi, il tasso di crescita previsto a 4 ° C è 0,12 log10 ufc / g al giorno

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• Domanda 1: Qual’ è la crescita di L. monocytogenes prevista durante la vita commerciale?

La crescita nel corso della vita commerciale = [(µmax1 in log10 ufc/g al giorno) x d1] + [(µmax2 in log10 ufc/g al giorno) x d2] dove: Crescita =

(3 x 0,12)

+

d1 giorni

(6 x 0,34) = 2,40 log 10 ufc / g

d2 giorni

µmax1

µmax2

Questo calcolo non include la fase di latenza e la fase stazionaria (cioè si assume che tutto il comportamento simulato avvenga in crescita esponenziale) e, di conseguenza, i risultati possono essere (molto) sottostimati o addirittura inutili.

• Domanda 2: Quale concentrazione deve esserci all'inizio della vita commerciale al fine di rispettare il limite di 100 ufc/g? ◊

Concentrazione iniziale = concentrazione finale - crescita durante la vita commerciale

La concentrazione finale è il limite di 100 ufc/g (2 log10 ufc/g) 2 - 2,40 = -0,40 log10 ufc/g = 0,4 ufc/g

• Domanda 3: qual è la concentrazione di L. monocytogenes alla fine della vita commerciale se il livello di L. monocytogenes al 7° giorno è pari a 1,65 log10 ufc/g?

Il livello di L. monocytogenes al "giorno finale" sarà 1,65 + 0,34 x 2 = 3,33 log10 ufc/g. Per questo prodotto il limite di 100 ufc/g è superato.

3.2.11. Rapporto di prova Inserire nel verbale di prova, almeno le seguenti informazioni: ◊

Numero del referto,

◊

Informazioni che permettano l'identificazione univoca del prodotto alimentare: o Identificazione dei lotti testati e la loro data di fabbricazione,

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o Le caratteristiche del prodotto alimentare (pH, aw, microflora associata, ...), ◊

I dati relativi ai ceppi in esame: o Origine dei ceppi, o Condizioni di preparazione dell'inoculo, o Concentrazione dell'inoculo,

◊

I dati relativi al challenge test: o Numeri di lotto per prodotto, o Numero di unità di prova, o Giornata di inoculazione, o Massa o volume delle unità di prova inoculate, o Volume dell'inoculo e metodo di contaminazione, o Condizioni di conservazione (tempo/temperatura) delle unità di prova, o Riferimenti dei metodi microbiologici (conteggio e rilevazione), o Limite del metodo di conteggio, o Caratteristiche fisico-chimiche del prodotto alimentare all'inizio e alla fine della prova, o Livelli della microflora associata, o I dati grezzi e i calcoli, o µmax e sua interpretazione.

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4. Studi di conservabilità Per effettuare gli studi di conservabilità devono essere presi in considerazione i seguenti punti: il metodo di campionamento, le condizioni di conservazione e il metodo per il conteggio di L. monocytogenes.

4.1. Campionamento dell'alimento 4.1.1. Introduzione La procedura di campionamento, sotto la responsabilità dell'OSA e con la collaborazione del laboratorio che condurrà lo studio, deve essere rappresentativa della popolazione (tenendo conto della diversità della popolazione) e deve avere una buona precisione e ciò dipende dalle dimensioni della sotto-popolazione campionata.

Il capitolo 3, punto 3.1 dell'allegato I del regolamento (CE) n. 2073/2005 si riferisce alle relative norme ISO e linee guida del Codex Alimentarius (CAC / GL 50-2004 "orientamenti generali in materia di campionamento") che possono essere utilizzate come metodi di riferimento in assenza di norme più specifiche in materia di campionamento e di preparazione dei campioni di prova.

Quando le informazioni sulla struttura della popolazione non sono disponibili, il modo più obiettivo di estrazione è quello di fornire a tutte le unità della popolazione la stessa possibilità di essere selezionate. Il campionamento casuale semplice è raccomandato qualora si voglia valutare la proporzione delle unità al di sopra del limite di 100 ufc/g.

4.1.2. Il campionamento casuale semplice Questo metodo di campionamento si basa sul principio di equiprobabilità. Questo principio garantisce che ogni unità della popolazione abbia le stesse probabilità di essere selezionata. Per soddisfare questo principio, si presume che la dimensione del lotto (N) debba essere abbastanza grande rispetto alla dimensione (n) della sottopopolazione campionata: n / N <10%.

Un modo semplice per realizzare un campionamento casuale è quello di numerare le unità o il tempo di produzione e quindi utilizzare i numeri casuali per selezionare la sotto-popolazione campionata. Ad esempio, i numeri casuali possono essere ottenuti da un foglio di calcolo Excel, con la formula = RAND(), si veda la figura 3, o dalle tabelle dei numeri casuali.

Esempio di un metodo utilizzato per selezionare le unità in modo casuale Per individuare in modo casuale una ventina di unità alla fine della linea di produzione, il tempo è suddiviso in periodi di 5 minuti. Selezionando la funzione random in un foglio di calcolo Excel caricato con la sequenza di 5 minuti, ad ogni sequenza sarà attribuito un numero casuale. Questi numeri casuali sono quindi ordinati in ordine crescente e si sceglie la prima ventina. Quindi, la persona incaricata del campionamento estrarrà, alla fine della linea di produzione, le venti unità in coincidenza dei tempi prescelti.

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Figura 3. Esempio di un campionamento casuale da un foglio di calcolo Excel Questo metodo di campionamento dovrebbe essere ripetuto per diversi lotti/giorni (stesso prodotto, lavorato in condizioni simili) per ottenere dati rappresentativi.

4.2. Condizioni di stoccaggio Cfr. § 2.2.5.

4.3. Analisi microbiologiche Alla fine del periodo di magazzinaggio, analizzare tutte le unità utilizzando il metodo quantitativo al fine di quantificare se il livello di 100 Listeria monocytogenes per grammo è superato o meno.

Secondo l'allegato I del regolamento n. 2073/2005, il metodo di riferimento per il conteggio di L. monocytogenes è il metodo standard EN ISO 11290-2 modificato. Secondo l'articolo 5 dello stesso regolamento, l'uso di metodi di analisi alternativi è accettabile quando i metodi sono convalidati rispetto al metodo di riferimento e se è un metodo proprietario, questo è certificato da una terza parte conformemente al protocollo stabilito dalla norma EN/ISO 16140 o ad altri analoghi protocolli standard accettati a livello internazionale. Altri metodi possono essere validati in accordo con protocolli accettati a livello internazionale e il loro uso autorizzato dall'autorità competente.

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Il limite di rilevazione del conteggio dovrebbe essere di 10 ufc/g, in modo da essere in grado di quantificare con precisione il livello di contaminazione di L. monocytogenes alla fine del periodo di magazzinaggio.

4.4. Calcolo In una pratica routinaria di controllo (per valutare l'accettabilità di un lotto, per esempio) il criterio definito dal Regolamento n. 2073/2005 è "n = 5, c = 0, m = M = 100 ufc/g al momento del consumo". Tuttavia, tali controlli non rientrano negli obiettivi del presente documento.

L'interpretazione degli studi di conservabilità, che consistono nella convalidazione che il limite di 100 ufc/g non è superato al momento del consumo, sono un caso diverso. Come descritto di seguito, si suggerisce che tale interpretazione possa essere facilitata dalla valutazione della quota (con il suo relativo intervallo di confidenza) di unità superiori a 100 ufc/g alla fine della vita commerciale, dopo un periodo di conservazione che rifletta le prevedibili condizioni di distribuzione e di stoccaggio.

Dalla sotto-popolazione (di dimensione n) campionata a caso da un lotto (di dimensione N), dedurre semplicemente la stima della proporzione di unità superiori a 100 ufc/g alla fine della vita commerciale, utilizzando la proporzione p = r / n (dove r è il numero di unità superiore a 100 ufc/g, ed n la dimensione della sotto-popolazione campionata).

Per calcolare l'intervallo di confidenza associato alla stima percentuale utilizzare un programma di calcolo.

Quelli liberamente disponibili su Internet sono numerosi, per esempio: http://www.causascientia.org/math_stat/ProportionCI.html. Questo programma di calcolo propone due metodi, uno basato sull'intervallo di confidenza centrale e l'altro sull'intervallo di confidenza minore. Gli intervalli di confidenza dati da ciascun metodo possono essere leggermente diversi ma rimangono dello stesso ordine di grandezza.

La seguente tabella illustra la stima percentuale (p), con i relativi intervalli di confidenza, della sottopopolazione campionata, dopo il periodo di conservazione, per tre valori di r (numero di unità > 100 L. monocytogenes per grammo).

La tabella 6 evidenzia l'importanza di estrarre dalla linea di produzione un numero sufficiente di unità, e/o di raccogliere i risultati precedentemente ottenuti, per stimare la percentuale di unità superiori a 100 ufc/g con un intervallo di confidenza ridotto.

Tabella 6. Esempio di stima percentuale di unità > 100 L. monocytogenes / g dopo il periodo di conservazione n

r

p

CI

numero di unità analizzate

numero di unità > 100 ufc / g

percentuale stimata

intervallo di confidenza al 95%

0%

[ 0% – 16% ]

0%

[ 0% – 4% ]

5%

[ 1% – 24% ]

1%

[ 0.2% – 5% ]

10%

[ 3% – 30% ]

2%

[ 0.6% – 7% ]

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Più unità sono analizzate più è stretto l'intervallo di confidenza; per esempio, si può dedurre da questa tabella che il limite superiore dell'intervallo di confidenza per "2 unità superiori a 100 ufc/g su 100 unità ", è inferiore a quello ottenuto per " 0 unità superiori a 100 ufc/g su 20 unità ".

Per avere un gran numero di unità analizzate è possibile raccogliere i risultati di più prove ripetute, effettuate su un alimento pronto al consumo ottenuto dallo stesso processo.

4.5 Rapporto di prova Includere nel referto di analisi, almeno le seguenti informazioni: ◊

Numero del referto,

◊

Informazioni che permettano la piena identificazione del prodotto alimentare: o Identificazione dei lotti testati e la loro data di fabbricazione, o Le caratteristiche del prodotto alimentare (pH, aw, microflora associata, ...), o La vita commerciale stabilita per il prodotto,

◊

Giustificazione delle condizioni di magazzinaggio (temperatura e durata),

◊

Dati relativi agli studi di conservabilità condotti: o Numeri di lotto, o Numero delle unità di prova, o Giorni di campionamento, o Data di stoccaggio (inizio), o Condizioni di stoccaggio (tempo - temperatura) delle unità di prova, o Metodo di conteggio- limite di rilevazione, o Stima percentuale delle unità al di sopra del limite di 100 ufc/g alla fine dello studio di conservabilità con il relativo intervallo di confidenza.

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BIBLIOGRAFIA AFNOR (2004). Lignes directrices pour l'élaboration d'un protocole de test de vieillissement pour la validation de la durée de vie microbiologique -Denrées périssables, réfrigérées.[Guidelines for the design of an ageing test protocol for the validation of a microbiological lifetime -Chilled perishable goods] AFNOR NF V01-003. Association Française de Normalisation, Paris AFNOR (2007). Lignes directrices pour la réalisation des tests de croissance [Guidelines for implementation of challenge tests]. AFNOR NF V01-009. Association Française de Normalisation, Paris Commission Regulation (EC) No. 2073/2005 of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs Food safety authority of Ireland (2005). Guidance note No. 18 – Determination of product shelf life EFSA (2007). Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards on a request from the European Commission on Request for updating the former SCVPH opinion on Listeria monocytogenes risk related to ready-to-eat foods and scientific advice on different levels of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods and the related risk for human illness. The EFSA Journal 599:1-42. http://www.efsa.europa.eu/EFSA/Scientific_Opinion/biohaz_op_ej599_listeria_en.pdf ISO 7218 (2007). Microbiology of food and animal feeding stuffs --General requirements and guidance for microbiological examinations, ISO, Geneva ISO 11290-1 (1996) / Amendment 1 (2004). Modification of the isolation media and the haemolysis test, and inclusion of precision data, ISO, Geneva ISO 11290-2 (1998) / Amendment 1 (2004). Modification of the enumeration medium, ISO, Geneva ISO 16140 (2003). Microbiology of food and animal feeding stuffs --Protocol for the validation of alternative methods, ISO, Geneva ISO TS 19036 (2006). Microbiology of food and animal feeding stuffs --Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations, ISO, Geneva Université de Liège (2007). Laboratoire national de référence en microbiologie des denrées. Protocole de mise en oeuvre des challenge tests relatifs à Listeria monocytogenes. 21 novembre 2007.

Approuvé par le Comité Scientifique de l'Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire en Belgique

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