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29-05-2012
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73° Congresso Internazionale Multisala SCIVAC
sostanza fluorescente o all’enzima in grado di catalizzare la reazione, oppure di metodi indiretti in cui si utilizza un secondo anticorpo (secondario, appunto) che legandosi al primo è respondabile della messa in evidenza della reazione.
TECNICA DI PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER L’ISTOLOGIA Il prelievo di campioni tissutali può essere effettuato in modi diversi (biopsia incisionale, biopsia escissionale, nodulectomia etc.). Di fondamentale importanza è la rapida fissazione del tessuto in formalina, in quanto fenomeni di autolisi legati ad una fissazione tardiva rendono impossibile un esame istopatologico accurato. Pertanto, se il campione risulta essere di grosse dimensioni, è consigliato procedere ad incisioni parallele della distanza di circa 1 cm l’una dall’altra. Inoltre, è consigliato sempre mantenere il rapporto tra volume di tessuto e volume di formalina non inferiore a 1:10. Nel caso si voglia procedere a frammentazione di un campione di grosse dimensioni, è utile indicare anche con un semplice disegno la localizzazione di ogni frammento, contrassegnandolo per esempio mediante uno o più fili di sutura. Tale metodica può essere utilizzata anche per l’indicazione dei margini di escissione. Si ricorda infatti che la sola descrizione macroscopica dei campioni inviati non ne permette l’identificazione dopo fissazione in formalina, in quanto fenomeni di retrazione tissutale si verificano conseguentemente a tale processo. D’altra parte, per campioni di dimensioni molto piccole (per esempio biopsie intestinali o nasali) può essere utile l’utilizzo di biocassette; in questo modo si evita il rischio che tali campioni risultino “dispersi” in un contenitore di formalina di grosse dimensioni e quindi non analizzabili. Si ricorda che è fondamentale per un accurato e preciso referto istopatologico avere il numero maggiore di informazioni anamnestiche, che comprendono anche esami di laboratorio o immagini fotografiche, radiologiche, ecografiche, tomografiche. Tali informazioni, infatti, permettono al patologo di effettuare una diagnosi “ad hoc” per il singolo caso, restringendo la lista delle diagnosi differenziali.
TECNICA DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER IMMUNOISTOCHIMICA I campioni bioptici da sottoporre a tecnica di immunoistochimica devono essere lavorati, seguendo le normali procedure per l’allestimento delle sezioni istologiche. Tali procedure comprendono: la fissazione, disidratazione e chiarificazione, inclusione in paraffina e taglio al microtomo. • Recupero degli Ag attraverso trattamenti enzimatici o ad alte temperature • Inibizione degli enzimi e di altre sostanze endogene che potrebbero cross-reagire • Incubazione con Ac primario • Sviluppo della colorazione (se metodica diretta) • Incubazione con Ac secondario • Sviluppo della colorazione (se metodica indiretta) I pattern di colorazione che si ottengono possono essere: nucleari; citoplasmatici o di membrana. I campi di applicazione dell’immunoistochimica sono sostanzialmente: • Marcatori di differenziazione (per es. linfociti B e T, cell mesenchimali o epiteliali, ecc) • Colorazioni speciali (per es. cellule follicolari dendritiche) • Marcatori di neoplasia • Marcatori di agenti infettivi • Fattori prognostici (ricerca di antigeni regolatori del ciclo cellulare, legati all’invasività, recettori ormonali, ecc). Anche tale metodica presenta dei limiti. Primariamente, per esempio, il campione deve essere correttamente fissato, in quanto fenomeni di autolisi alterano la normale conformazione degli antigeni tessutali. Inoltre, per quanto riguarda processi di natura neoplastica, l’espressione di determinati antigeni può essere presente in forma aberrante in cellule che in condizioni fisiologiche non rappresentano tale espressione o non essere espressi in cellule nelle quali normalmente sono presenti. Pertanto, in questi casi non è possibile determinare con certezza l’origine precisa degli elementi neoplastici. In conclusione, l’esame citologico, istopatologico e immunoistochimico devono essere visti come esami complementari e non sostitutivi l’uno dell’altro. Un approccio “a gradini” permette di arrivare ad una diagnosi accurata, ottenendo informazioni utili per un successivo approccio clinico alla patologia.
METODICA IMMUNOISTOCHIMICA L’immunoistochimica è un esame effettuato su sezioni di tessuto (isto) che serve per mettere in evidenza la presenza di determinati costituenti cellulari o tissutali, tramite l‘utilizzo di reazioni Ag-Ac (immuno) evidenziate con metodi enzimatici, fluorescenza, ecc (chimica).Il principio dell’immunoistochimica é quello di riconoscere un antigene mediante l’utilizzo di un anticorpo specifico prodotto da animali immunizzati contro quel determinato antigene. Poiché il complesso antigene-anticorpo che si forma nella reazione immune non é visibile, é necessario utilizzare dei marcatori che in maniera diretta o indiretta possono mettere in evidenza la formazione. Esistono, a tal scopo, due tecniche: immunofluorescenza che utilizza fluorocromi e immunoenzimatica che utilizza, invece, enzimi: Le sostanze fluorescenti maggiormente utilizzate in immunoistochimica sono: ficoeritrina, tetrametil rodamina, isotiocianato di fluoresceina, cianina e rosso texas. Le reazioni immunoenzimatiche possono essere: immunoperossidasi, immunofosfatasi, immunoglucosidasi e immunoβ-galattosidasi. Entrambe le tecniche possono avvalersi di metodi diretti in cui si utilizza un solo anticorpo (primario) legato alla
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