Estrés oxidativo y nitrosativo

ESTRÉS OXIDATIVO Y NITROSATIVO EN PORCINOS

1. Radicales libres

2. Sistemas antioxidantes, protección contra el estrés oxidativo y nitrosativo

3. Estrés oxidativo/ nitrosativo y su interacción patológica (I)

4. Estrés oxidativo/ nitrosativo y su interacción patológica (II)

Guadalupe Edgar Beltrán-Rosas1 y Maximino MéndezMendoza2

1Médico Veterinario Zootecnista. Diplomado EAPP. Asesor en Porcinos. México. E-mail: beltran.mvz@gmail. com. 2Doctor en Ciencias Veterinarias. Profesor Investigador de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (México). E-mail: maxmm02@ yahoo.com.mx. Revisor: Stefan Edgar Cárdenas Cabello Catedrático de la Universidad Mayor de San Marcos (Perú).

Estrés oxidativo-nitrosativo y su interacción patológica

Los radicales libres participan en el proceso de envejecimiento y además pueden ser importantes iniciadores y mediadores en muchos tipos de enfermedades. Afectan en distinto grado al metabolismo maternal, fetal y neonatal, así como a la viabilidad de los espermatozoides. También al destete, una etapa especialmente delicada cargada de estrés.

El estrés oxidativo (EO) y el estrés nitrosativo (EN) están implicados en la etiopatogenia de numerosos trastornos16,32. Los radicales libres (RL) pueden ser importantes iniciadores y mediadores en muchos tipos de cáncer, enfermedades cardiacas, disfunciones endoteliales, arterosclerosis y otros desórdenes cardiovasculares, inflamación o inflamación crónica30,38, enfermedades del tracto intestinal, afectaciones degenerativas del cerebro, diabetes, enfermedad de los ojos, patologías de isquemia, posisquemia (p.e: daño a la piel, corazón, cerebro, riñones, hígado y al tracto intestinal). En condiciones normales los RL desempeñan un papel en la patogenia de la condición fisiológica, por ejemplo durante el proceso de envejecimiento, donde la producción de RL aumenta significativamente como resultado de función mitocondrial afectada o dañada, y en las etapas tempranas del desarrollo embrionario. Otros desórdenes asociados con los trastornos del metabolismo (metales en sangre), que son hereditarios, pueden dar como resultado una mala función de proteínas y una acumulación tóxica de metales en el cuerpo, almacenados en el hígado, cerebro y otros órganos30 . La producción excesiva de los RL y/o una deficiencia de antioxidantes (AO) naturales ha sido asociada con varias enfermedades en el caso de los porcinos (figura 1), incluyendo pleuroneumonía, septicemia y PRRS. En el caso de influenza los RL son producidos en exceso durante la respuesta inflamatoria siguiendo la entrada del virus en el organismo. De esta manera, el EO/EN inducido por la misma infección o ya establecido en el hospedador en el momento de la infección, podría participar en la patogenicidad del virus. Los resultados de prueba sugirieron que la gravedad del síndrome de la influenza y la reducción en el rendimiento de los animales pueden variar según el nivel de EO/EN en el momento de la infección, y esas respuestas del huésped podrían ser influenciadas por el pienso32 . ■ En caninos En ellos se ha observado la favorable evolución que presenta la miocardiopatía dilatada idiopática y la osteoartritis al tratamiento con AO, lo que corrobora su relación al EO/EN. ■ En pollos La presentación de la encefalomalacia nutricional en pollos Broiler corresponde a una disfunción peroxidativa por deficiencia de vitamina E. En tanto que una de las etiologías del síndrome ascítico, observado en aves de rápido crecimiento, es el daño celular provocado por las EO/EN. Esta afectación se originaría por una alteración en la cadena transportadora de electrones a nivel mitocondrial que impide una adecuada utilización del oxígeno. ■ En équidos La hepatosis dietética en cerdos también es descrita como un cuadro patológico mediado por los radicales libres, como ocurre con la esteatosis y la miodistrofia nutricional en equinos. Se ha sugerido que la enfermedad de neurona motora en esta especie, afección asociada a una deficiencia de vitamina E y un incremento de Cu en el tejido nervioso, es resultante de un daño oxidativo. ■ En bovinos lecheros Se ha observado que la mayoría de las afecciones asociadas con el estrés oxidativo están en estrecha relación con el periodo de preparto y lactancia temprana, etapas caracterizadas por importantes cambios en la fisiología de la hembra, y que conllevan a una gran demanda en requerimientos nutriciona-

les frecuentemente no satisfechos. Las alteraciones habitualmente descritas son: retención de placenta, edema de la glándula mamaria, mastitis, fiebre de leche, reducción de la inmunocompetencia y rendimiento reproductivo disminuido. En tanto la enfermedad del músculo blanco, la debilidad neonatal, la reducción de la función inmune tanto humoral como celular, infertilidad, abortos, quistes ováricos, metritis, degeneración testicular y desarrollo retardado, también poseen un componente estrechamente ligado con el desbalance prooxidante:antioxidante, como lo es la deficiencia de Se. La fragilidad vascular, los cambios degenerativos de la hemoglobina y la fragilidad de las membranas de los eritrocitos, que según su intensidad pueden conducir a cuadros de anemia, también corresponden a manifestaciones del desarrollo de un EO/EN16 .

ESTRÉS OXIDATIVO–NITROSATIVO EN EL METABOLISMO MATERNAL Y FETAL

Las hembras en gestación y en lactancia son particularmente susceptibles al daño oxidativo por la deficiencia de α-tocoferol y retinol. El EO/EN intensifica la peroxidación lipídica y contribuye a la síntesis mutagénica y carcinogénica de malondialdehído (MDA) en los órganos. En consecuencia, la producción de leche, desarrollo reproductivo, y la longevidad están comprometidas significativamente en las cerdas. El EO/EN es un factor clave en la fisiopatología de varios desórdenes, incluyendo complicaciones en la gestación.

El sistema de defensa antioxidante se ha comprobado que desempeña un papel muy importante en la reproducción animal32 .

El metabolismo maternal y fetal durante la gestación es mayor que en cualquier otro momento del ciclo vital, debido a la actividad mitocondrial exacerbada. Esta actividad metabólica regulada hormonalmente conduce, a la generación de sustancias oxidantes, lo que lleva a una alta liberación de RL19,55, que da como resultado un desequilibrio entre las concentraciones de los RL y los AO intra o extracelulares. Esto produce graves pérdidas económicas durante la producción19 .

Figura 1. Especies reactivas de oxígeno y estrés oxidativo. Fuente: Beltrán-Rosas (2021b).

Factores estresantes

Carga microbiana Mala higiene

Tipo de alimento Mitocondria

Células inflamatorias

Estructuras celulares

ERO

Santina oxidasa NADPH oxidasa

Daño al tejido (ej. peroxidación lipídica) Células

Neutrófilos Macrófagos

Células epiteliales

Células endoteliales

Daño mitocondria

Señalización proinflamatoria

Hipersecreción de moco Constricción bronquial

Estrés oxidativo

Daño en el ADN

Destino celular (crecimiento/muerte) Función fagocitaria alterada

Función esteroide alterada

Disminución muscular

En el desarrollo embrionario

La glucosa es el combustible principal para la mayoría de las células, y su importancia como sustrato energético ha llevado a una intensa investigación sobre sus metabolitos celulares y el mecanismo que controla su absorción. Se han realizado una gran cantidad de estudios sobre el metabolismo de la glucosa en embriones de preimplantación. La mayoría de los informes han demostrado que la presencia de glucosa en estos embriones de preimplantación temprana hasta la etapa de 8 células es perjudicial para el desarrollo adicional del embrión in vitro. Por otro lado, los estudios de absorción de nutrientes realizados en embriones porcinos han demostrado que consumen glucosa y producen lactato en todas las etapas de desarrollo32 . Se sabe que ciertos tipos de células sufren toxicidad por glucosa. Se ha sugerido que la glucosa puede inducir daño a través de la acción de los radicales libres generados por la autooxidación o por la inhibición de la hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), lo que conduce a la conversión de hipoxantina en xantina con la producción de los RL. Las altas concentraciones de los RL en el microambiente que rodea al embrión de preimplantación in vitro pueden alterar el equilibrio entre la formación de los RL y AO, lo que lleva al EO/EN, que generalmente se considera perjudicial para el desarrollo embrionario29 .

Gestación tardía y lactancia

Durante la gestación tardía y la lactancia de las cerdas, las tasas crecientes de digestión, absorción y movilización de tejidos para el crecimiento fetal, el desarrollo de la glándula mamaria y la producción de leche favorecen la sobreproducción de los RL y pueden causar EO/EN, en el cuerpo materno. Además, los estudios han confirmado que las cerdas sufren EO/EN elevado y sistémico durante la gestación tardía y la lactancia. Algunos estudios han informado de un daño elevado en el ADN durante la gestación y la lactancia en comparación con el observado durante la gestación temprana, y descubrieron que las concentraciones plasmáticas de α-tocoferol fueron menores en el día 110 de gestación (DG110) que durante el periodo de lactancia en cerdas muy prolíficas. Además, otros estudios han informado que las cerdas sufrieron un aumento del EO/EN durante el parto, la gestación tardía y la lactancia temprana, como indican sus niveles elevados de RL, 8-hidroxi-desoxiguanosina y ácido tiobarbitúrico. Además, se ha sugerido que el EO/EN es un agente causal en los trastornos relacionados con la gestación que predicen un riesgo elevado de síndrome metabólico en la vida posnatal y puede ser una vía común en la programación metabólica del desarrollo38: ■ La reabsorción embrionaria ■ La pérdida recurrente de la gestación ■ La preeclampsia ■ La restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) ■ La muerte fetal En el caso de RCIU, por la reducción en la biodisponibilidad de BH4 (6R)-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina; no solo es un factor esencial para la síntesis de óxido nítrico (NO•), sino además un antioxidante potente, y de NO• en los tejidos fetales y maternales, especialmente a nivel vascular. Esto puede contribuir a la resistencia a la insulina al final de gestación porque NO• media en el efecto estimulador de la insulina sobre la utilización y metabolismo de la glucosa en el músculo. Por esta razón se han desarrollado intervenciones nutricionales, como la administración de minerales quelados de mayor disponibilidad biológica que ha permitido mejorar el rendimiento reproductivo de las cerdas, en parte por el aumento de las funciones AO43 .

ESTRÉS OXIDATIVO - NITROSATIVO EN ESPERMATOZOIDES

Se ha indicado que los espermatozoides producen y exportan los RL al medio extracelular. La mayoría son producidos por las micotoxinas y son producto de la reducción monovalente del oxígeno molecular durante la fosforilación oxidativa. Los fosfolípidos realizan una esencial función en la promoción óptima de la fertilidad, ya que las bajas cantidades de este ácido graso en los lípidos se han correlacionado con reducciones en la concentración de espermatozoides. Sin embargo, se ha indicado que el alto contenido de ácidos grasos insaturados en sus membranas plasmáticas y su pequeño volumen de citoplasma facilita la producción de los RL, los cuales perjudican la actividad funcional de las células espermáticas, tales como: ■ Disminución de la motilidad ■ Disminución de la vitalidad ■ Pérdida en la capacidad de fusión espermatozoide-ovocito.

Añadir nutrientes AO a la dieta

La ingesta de nutrientes AO en la dieta puede mejorar la capacidad de defensa antioxidante endógena, que se ha considerado una forma plausible de prevenir el EO38. En las cerdas, los estudios acumulados han demostrado que los nutrientes antioxidantes de la dieta, como las vitaminas E, C, A, B1, B6, B12, ácido fólico, y minerales como el selenio, Mn, Cu o Fe, mejoran la capacidad de defensa AO y alivian el EO de manera efectiva, lo que es beneficioso para el tamaño de la camada y el crecimiento de los lechones38,43 .

Se ha demostrado que los RL inducen peroxidación de ácidos grasos poliinsaturados esterificados a fosfolípidos de membrana. Esto produce verdaderos agujeros en la membrana espermática que conduce a una pérdida de la viabilidad, motilidad y capacidad fecundante del espermatozoide. Además, los RL inactivan enzimas glucolíticas que traen como consecuencia un bloqueo en la biosíntesis de ATP y la consiguiente pérdida de la motilidad por falta de combustible necesario para la contracción de los microtúbulos flagelares de los espermatozoides. Sin embargo, se ha indicado paradójicamente, que los espermatozoides requieren una ligera producción intracelular de anión superóxido para mejorar el proceso de formación y la reacción acrosomal (13) .

ESTRÉS OXIDATIVO - NITROSATIVO EN EL METABOLISMO MATERNAL Y NEONATAL

Al nacer, el neonato se mueve del útero a un ambiente externo más rico en oxígeno que conduce a un estallido oxidativo10. El periodo neonatal en la vida del cerdo se acompaña de una alta morbilidad y mortalidad. Además, el aumento del tamaño de la camada en la producción porcina moderna ha llevado a tasas más altas de lechones con bajo peso al nacimiento (LBP); parecen tener una menor capacidad para generar una respuesta AO. Los recién nacidos en la transición de la respiración mediada por la madre a la respiración autónoma fuera del útero se ven expuestos repentinamente a los radicales libres derivados del O2 51. Esto los hace vulnerables a los efectos del EO en varios órganos, lo que potencialmente puede afectar a la vitalidad neonatal38 . Los resultados de diversas pruebas sugieren que los RL excesivos afectan a la cascada de la señal de insulina, que lleva a la resistencia a la misma. La resistencia a la insulina durante el periodo de periparto se demostró que tiene un efecto negativo en el consumo de alimento en la lactancia de las cerdas. Los hallazgos de numerosos estudios han demostrado que la sobreproducción de los RL ocurre durante el parto, lo cual puede provocar a un posparto de EO tanto en la madre como en el neonato. Los resultados indican que un parto espontáneo sin complicaciones puede llevar a la aparición del EO durante el periodo de posparto temprano en las cerdas, cuya intensidad está relacionada con la duración de la etapa de expulsión. Considerando que el EO es potencialmente dañino para las madres y los neonatos, su intensidad debería estar limitada al buscar acortar la duración del parto en las cerdas32 . Un desequilibrio óxido-reductivo afecta la señalización celular, la síntesis de proteínas y mejora la proteólisis que finalmente puede conducir a una barrera intestinal disfuncional y un potencial regenerativo subóptimo in vitro. En consecuencia, el desequilibrio óxido-reductivo observado y los efectos posteriores podrían explicar la absorción anormal y el metabolismo de los nutrientes, el crecimiento reducido y el desarrollo deteriorado del intestino delgado, el hígado y el músculo observados en LBP. Este desequilibrio óxido-reductivo parece persistir más allá del destete, se ha observado que la expresión de ARNm de ocludina, hemooxigenasa 1, catalasa, genes de tiorredoxina reductasa y expresión de proteína ocludina continuó siendo menor en cerdos con bajo peso durante el periodo de lactancia. Aparentemente, esto entra en conflicto con la observación de que los LBP que sobreviven a los primeros días críticos después del nacimiento muestran una morfología intestinal, capacidad digestiva, producción de citocinas, motilidad intestinal y permeabilidad comparable a los observados en los compañeros de camada con lechones de peso normal (LPN)51 .

La vitalidad de los lechones recién nacidos está asociada con la succión del calostro, que es importante para el crecimiento y el desarrollo. Durante la lactancia, el calostro y la leche no solo proporcionan recursos nutricionales e inmunológicos, sino que también contienen enzimas antioxidantes, como superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GSH-Px) que proporcionan protección antioxidante a los lechones neonatos38 .

ESTRÉS DEL DESTETE VS ESTRÉS OXIDATIVO - NITROSATIVO

En los sistemas de cría intensiva los lechones se destetan a edades mucho más tempranas (entre 3 y 5 semanas) que las que se esperarían en un entorno natural (alrededor de las 17 semanas)

(figura 2). Esta situación de destete temprano se considera uno de los periodos más críticos en la producción porcina, en el que los animales tienen que enfrentarse a múltiples factores estresantes2 . Además, la creciente incidencia de lechones supernumerarios y LBP ha planteado una necesidad urgente de estrategias innovadoras de cría. Además de la crianza cruzada, que complementa a los lechones y la lactancia dividida, los lechones pueden transferirse a un destete y criarse artificialmente51 . Desde un punto de vista práctico, es interesante clasificar el estrés según su duración y también según sus causas. Con respecto a la duración del estrés, puede ser: ■ Agudo: de corta duración, unos pocos minutos o varios días. ■ Crónico: dura semanas, meses o incluso años50 . Los factores estresantes tienen su importancia en provocar un error en el programa alimenticio, e incluso la supervivencia del lechón puede verse comprometida con los factores que limiten la ingesta de pienso8 . El destete es uno de los eventos más importantes en la vida de los cerdos que desafía la salud de los lechones4, 8, 10, 20, 27, 53. Les impone un tremendo estrés y se acompaña de cambios marcados en la fisiología, microbiología e inmunología gastrointestinal25, 27, ya que los lechones se ven obligados abruptamente a adaptarse a las interrupciones nutricionales o a un estrés nutricional8, 10, 20, 53, debido cambios abruptos en la composición de la dieta y a una menor ingesta de sustancias bioactivas51. Por lo tanto, los lechones tienen una fuerte reducción en el consumo de alimento inmediatamente después del destete25, lo que a menudo da como resultado un retraso en el crecimiento posterior. Un factor importante en este retraso en el crecimiento es el TGI subdesarrollado debido al destete temprano, lo que lleva a la incapacidad de digerir y absorber nutrientes de manera adecuada. Se han realizado muchos estudios que investigan diferentes estrategias y aditivos alimentarios, incluidos los ácidos grasos de cadena corta (AGCC), para facilitar la transición del destete de los lechones4 . Aproximadamente el 50 % de los cerdos destetados consumen su primer alimento dentro de las 24 h posteriores al destete. En aproximadamente el 10 % la anorexia de destete persiste hasta 48 h, y estos se correlacionan temporalmente con el control del crecimiento y los trastornos entéricos en los cerdos destetados. Se ha sugerido que la anorexia posterior al destete se relaciona positivamente con la arquitectura del intestino delgado debido a un periodo de atrofia de las vellosidades transitoria e hiperplasia de la cripta después del destete. La anorexia al destete se ha correlacionado con la hipertrofia de la cripta y las respuestas inflamatorias locales: la ingesta reducida, pero no la composición de la dieta, comprometen la estructura epitelial en

Figura 2. Mecanismos de disfunción de la barrera intestinal inducida por factores estresantes en la producción porcina: factor liberador de corticotropina (CRF por sus siglas en inglés: corticotropinreleasing factor). Los factores estresantes en la producción porcina tales como el destete, el mezclado de los animales/hacinamiento y las infecciones gastrointestinales (IG) desencadenan la activación de los receptores y CRF intestinales. La activación de los receptores de CRF mejora la activación e hiperplasia de los mastocitos intestinales y la liberación de mediadores de mastocitos que incluyen proteasas (por ejemplo, tripsina y cinasa) y factores de necrosis tumoral-α (TNF-α). Las proteasas de mastocitos y el TNF-α inducen aumentos en la permeabilidad del epitelio intestinal. Fuente: Moeser et al. (2017).

Ventana crítica del desarrollo gastrointestinal posnatal

Inmunidad materna Destete natural Desarrollo y funcionamiento normal de la barrera gastrointestinal

Nacimiento Destete precoz Desarrollo y funcionamiento de la barrera gastrointestinal comprometida

■ Incrementa la permeabilidad intestinal ■ Deprime sistema inmune ■ Incrementa el nº y actividades de mastocitos ■ Sistema nervioso entérico hiperactivo

2,4 a 4 semanas 12 a 14 semanas Adultos

el yeyuno de los cerdos alimentados con una dieta basada en harina de soja en comparación con los alimentos con un sustituto de leche25 .

Estrés inmunológico

En relación con el estrés inmunológico27,36,52, los lechones son extremadamente deficientes, dependen ampliamente de la leche de la cerda para la protección de la inmunidad, crecimiento y la supervivencia2,27 .

Estrés psicosocial

En el estrés psicosocial23,50-52 al destete los cerdos tienen que lidiar con la interrupción abrupta en la interacción social establecida con su madre y hermanos de camada, y el estrés al nuevo establecimiento2,51 , así como bebederos desconocidos para los lechones51, además de la nueva jerarquización social con cerdos desconocidos de diferentes camadas2,51 .

Estrés físico y medioambiental

El estrés medio ambiental10,20,23,25,36 y el estrés físico8,51 a veces están asociados a malas prácticas de manejo en granjas comerciales: el destete puede llevarse a cabo en condiciones de manejo variables que pueden afectar al crecimiento de los lechones y a la salud10, principalmente a través de diarreas2,10,25 .

Estrés microbiano

Con el estrés microbiano8, con una mayor exposición a patógenos y antígenos21,51, puede existir un aumento en la mortalidad12 . Todos los tipos de estrés están usualmente ligados unos con otros (figura 3)40,41, pueden alterar la homeostasis de la microflora intestinal y hacer que los lechones jóvenes sean más propensos a las infecciones del tracto gastrointestinal. Es por ello por lo que se sabe que la diarrea posterior al destete (DPD) es multifactorial23 .

Estrés del destete

El estrés del destete de los lechones suele ir acompañado de retraso del crecimiento25,47,52 y una barrera intestinal deteriorada52. Está asociado con la inducción de EO intestinal19,47,51,52, así que puede afectar a la integridad del epitelio intestinal9, lo que eventualmente induce la apoptosis del epitelio y la detención del ciclo celular en el intestino delgado de los lechones52 . Por lo tanto, los lechones con LBP tienen más dificultades para mantener un estado óxido-reductivo equilibrado cuando se exponen a estresores de destete, ya que tienen una menor capacidad antioxidante, en comparación con los LPN51, lo que provoca47: ■ Diarrea ■ Reducción del crecimiento ■ Reducción de la inmunidad en los LBP Las alteraciones de la estructura intestinal, como la atrofia de las vellosidades y la hiperplasia de la cripta, se encuentran comúnmente en los lechones después del destete. Sin embargo, una disminución en la relación de profundidad de las vellosidades y la profundidad de la cripta o un área reducida de la superficie de las vellosidades se considera perjudicial para la digestión y la absorción. Esto podría conducir a un crecimiento retardado en los lechones después del destete. En consecuencia, mantener la estructura y la función intestinal normal es esencial para el crecimiento y desarrollo de los lechones después del destete52 .

Figura 3. Factores estresantes en los lechones. Fuente: Beltrán-Rosas (2021a).

Estrés nutricional Estrés físico

Estrés medioambiental

Estrés inmunológico

Estrés psicosocial Estrés microbiano

Importancia de las reservas de la vitamina E

Por lo general, el aumento en la producción de RL por parte del organismo consume moléculas antioxidantes neutralizantes y mejora la producción de enzimas y moléculas antioxidantes. La capacidad antioxidante de la sangre disminuyó transitoriamente 12 días después del destete, lo que probablemente refleja el uso de reservas antioxidantes que se muestran, por la disminución de la vitamina E y, en menor medida, en las concentraciones plasmáticas de vitamina A. El lechón, al igual que otros mamíferos no puede sintetizar la vitamina E que debe proporcionar la dieta. Las vitaminas liposolubles E y A son absorbidas por el intestino en parte gracias a la acción de las lipasas. La leche contiene más contenido de grasa que el alimento inicial y los ácidos biliares cuya actividad se reduce después del destete, y así disminuye la absorción de vitaminas A y E. Además, la concentración de lípidos totales en la dieta influye en la absorción de vitaminas E por el intestino y, por lo tanto, se supone que la absorción de vitaminas A es mayor antes del destete. En consecuencia, el alto consumo de vitamina E para neutralización de moléculas pro-oxidantes, así como la reducción del suministro de vitamina E al organismo podría explicar la caída de vitamina E después del destete. Curiosamente, los lechones que mostraron el GDP menores entre los 26 y 47 días de edad tenían una concentración plasmática más baja de vitamina E, pero el mismo peso antes del destete, así como mayores concentraciones de HPO 5 días después del destete. Esto refuerza la importancia de las reservas de la vitamina E antes del destete10 .